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Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

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DOI:

10.3791/67141

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12 de julho de 2024

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1Florida Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos e ferramentas para visualizar o cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial usando um repórter de cálcio geneticamente codificado expresso na linha germinativa do nematóide modelo C. elegans.

Resumo

O cálcio é uma importante molécula de sinalização durante a transição oócito-embrião (OET) e embriogênese inicial. O nematóide hermafrodita Caenorhabditis elegans oferece várias vantagens exclusivas para o estudo do OET, pois é transparente e possui uma gônada ordenada que produz um oócito maduro a cada ~ 23 min a 20 ° C. Modificamos o indicador de cálcio geneticamente codificado jGCaMP7s para indicar fluorescentemente o momento da fertilização dentro de um organismo vivo. Denominamos este repórter de "CaFE" para cálcio durante a fertilização em C. elegans. O repórter CaFE foi projetado em um locus de porto seguro em uma única cópia, não tem impacto significativo na fisiologia ou fecundidade e produz um sinal robusto após a fertilização. Aqui, uma série de protocolos é apresentada para utilizar o repórter CaFE como uma ferramenta in vivo para dissecar o OET e a embriogênese. Incluímos métodos para sincronizar vermes, examinar os efeitos do knockdown de RNAi, montar vermes para imagens e visualizar cálcio em oócitos e embriões. Além disso, apresentamos a geração de linhagens de vermes adicionais para auxiliar nesse tipo de análise. Demonstrando a utilidade do repórter CaFE para visualizar o momento da fertilização, relatamos que a ovulação dupla ocorre quando o ipp-5 é alvo do RNAi e que apenas o primeiro oócito sofre fertilização imediata. Além disso, a descoberta de transientes de cálcio unicelular durante o início da embriogênese é relatada aqui, demonstrando que o repórter CaFE persiste no desenvolvimento inicial. É importante ressaltar que o repórter CaFE em vermes é simples o suficiente para ser usado para incorporação em aulas de laboratório de pesquisa de graduação baseadas em cursos (CURE). O repórter CaFE, juntamente com a gônada ordenada e a facilidade do RNAi em vermes, facilita a investigação sobre a dinâmica célula-célula necessária para regular a fertilização interna e a embriogênese inicial.

Introdução

A fertilização marca o início de um novo ciclo de vida, mas definir o momento preciso da fertilização é um desafio. Uma característica conservada da fertilização é uma onda de cálcio através do oócito imediatamente após a fusão do espermatozóide1. Embora a natureza da onda de cálcio, em termos de frequência e velocidade, seja diferente entre as espécies, quase todos os organismos exibem um aumento transitório no cálcio intracelular após a fertilização. A onda de cálcio desempenha um papel crítico em um bloqueio à polispermia, ativação do óvulo e outros eventos celulares importantes2. Como a onda de cálcio se inicia no local da fusão espermática, o cálcio serve como um marcador para a fertilização3.

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo ideal para estudar o desenvolvimento inicial. Os vermes são hermafroditas transparentes que são geneticamente tratáveis4. Mais importante para o estudo da fertilização, os adultos de C. elegans produzem continuamente oócitos usando uma gônada estritamente ordenada5. De fato, os oócitos são as únicas novas células produzidas, pois o soma é pós-mitótico na idade adulta6. A Figura 1 destaca a gônada, que consiste em 2 tubos simétricos em forma de U de oócitos em desenvolvimento. O oócito mais próximo da espermateca (órgão de armazenamento de espermatozoides) é denominado oócito -1. Este projeto de linha de montagem da gônada do verme ovula um oócito maduro na espermateca a cada ~ 23 min a 20 ° C em adultos jovens7. O embrião recém-fertilizado então se move para um útero compartilhado antes de ser colocado através de uma única vulva.

Técnicas anteriores para visualizar o cálcio durante a fertilização em C. elegans dependiam da microinjeção de corantes sensíveis ao cálcio 3,8. Para visualizar mais facilmente a onda de cálcio após a fusão espermatozóide-óvulo, um indicador de cálcio geneticamente codificado baseado em jGCaMP7s foi inserido em cópia única em um locus de porto seguro usando repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) 7 , 9 . O repórter foi denominado CaFE para cálcio durante a fertilização em C. elegans. O repórter não mostra defeitos significativos na fisiologia ou fecundidade.

Aqui, são apresentados protocolos para visualização da onda de cálcio nos oócitos e embriões de C. elegans usando o repórter CaFE. Combinado com a miríade de ferramentas disponíveis na comunidade de vermes, como interferência de RNA (RNAi) e marcadores de gônadas mCherry, o repórter do CaFE facilita a investigação sobre a regulação de eventos internos de fertilização, particularmente a competência de fertilização e o momento da fertilização. Além disso, o repórter CaFE persiste no desenvolvimento inicial e é uma ferramenta única para investigar a embriogênese.

Protocolo

1. Manutenção de C. elegans

  1. Preparação de placas de meio de crescimento de nematóides (NGM)
    1. Combine 3 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de bactopeptona, 20 g de ágar e 1 L de água deionizada em um frasco de 4 L (consulte a Tabela de Materiais). Cubra a parte superior do frasco com papel alumínio antes de autoclavar.
    2. Autoclave para esterilizar usando configurações de ciclo de esterilização líquida. Recomenda-se um ciclo de esterilização definido em 121 °C por 30 min.
    3. Deixe a mistura esfriar até ~50 °C, aproximadamente 20 min à temperatura ambiente (RT).
    4. Adicione 25 mL de estéril 1 M KH2PO4 (dissolvido em água, pH = 6), 1 mL de estéril 1 M CaCl2 (dissolvido em água), 1 mL de estéril 1 M MgSO4 (dissolvido em água) e 1 mL de colesterol 5 mg/mL (dissolvido em etanol 100%), girando suavemente após cada adição (ver Tabela de Materiais).
    5. Usando uma técnica estéril, transfira uma porção da mistura para um béquer estéril de 300 mL para facilitar o despejo. Despeje a mídia quente para cobrir o fundo do prato.
      NOTA: Aproximadamente 10 mL por placa em placas de Petri estéreis de 60 mm x 15 mm (consulte a Tabela de Materiais) produzirão 100 placas. Alternativamente, placas de Petri estéreis de 35 mm x 10 mm podem ser usadas, onde ~ 4 mL por placa produzirá ~ 250 placas.
    6. Deixe as placas NGM secarem em RT por pelo menos 1 dia antes de semear com bactérias. Armazene as placas de cabeça para baixo a 4 °C para uso futuro.
  2. Preparação bacteriana do gramado OP50
    1. Faça o Caldo Luria (LB) combinando 5 g de extrato de levedura, 10 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl e 1 L de água deionizada em um frasco de 2 L (consulte a Tabela de Materiais). Usando uma placa de agitação e uma barra de agitação, misture até dissolver.
    2. Alíquota LB em garrafas e autoclave usando configurações de ciclo de esterilização líquida. Recomenda-se um ciclo de esterilização definido em 121 °C por 30 min. Se estiver usando um recipiente com tampa de rosca, afrouxe a tampa de rosca um quarto de volta para ventilação adequada durante o ciclo de autoclave.
    3. Deixe o caldo esfriar até RT antes de usar.
    4. Utilizando a técnica estéril, inocular 50 ml de LB num balão Erlenmeyer de 250 ml com bactérias OP50 e crescer durante a noite a 37 °C com agitação.
    5. Usando técnica estéril, transfira 300 μL de cultura saturada para o centro de uma placa NGM de 60 mm x 15 mm. Para placas de 35 mm x 10 mm, recomenda-se 100 μL de cultura saturada.
    6. Deixe as placas secarem em RT por 1-3 dias até que a mancha bacteriana OP50 não seja mais líquida. Certifique-se de que as placas estejam secas e livres de contaminação antes de usar. Armazene as placas a 4 °C para uso futuro. Armazenar as placas de cabeça para baixo reduz a condensação na superfície da placa.
  3. Construção de picareta de minhoca
    1. Afrouxe o colar prateado em direção à cabeça da alça da picareta sem-fim (consulte a Tabela de Materiais) desaparafusando suavemente para que as quatro seções se separem.
    2. Corte 1,5 polegadas (aproximadamente o comprimento do polegar) de fio de platina (consulte a Tabela de Materiais) usando uma tesoura e coloque-a no meio das quatro seções; cerca de uma polegada ficará para fora da alça.
    3. Segure o fio no centro enquanto aperta o colarinho; As quatro seções se juntarão no meio e manterão o fio de platina no lugar.
    4. Molde cuidadosamente o fio usando um alicate de ponta chata. Uma forma de arco-íris ou arco tende a funcionar melhor para escolher.
    5. Crie cerca de um "pé" de 2-3 mm na extremidade do fio, apertando repetidamente com o alicate de ponta chata. Use este "pé" para pegar as minhocas e manter o "pé" plano na superfície da placa.
      NOTA: Apertar com muita força cortará o fio de platina. Evite criar bordas afiadas usando o alicate de ponta chata (ou equivalente) para evitar perfurar as minhocas ou as placas.
  4. Manuseio de worms
    1. Segure o picareta de minhoca semelhante a um lápis e esterilize o "pé" colocando o fio na chama de uma lâmpada de etanol a 95% até que fique laranja brilhante.
    2. Coloque uma placa semeada OP50 no stage de um escopo de dissecação e remova a tampa. Toque suavemente o "pé" da picareta em uma área do gramado bacteriano e use um movimento suave para coletar bactérias no fundo. As bactérias que estão presas ao picareta (chamadas de "gosma") atuarão como uma cola para pegar vermes.
    3. Mova uma placa de minhocas para o estágio do escopo de dissecação e remova a tampa, evitando que a palheta toque em outras superfícies. Toque rápida e suavemente o "pé" da picareta em uma minhoca para pegá-la. Essa técnica permite que vários vermes sejam movidos entre as placas simultaneamente.
    4. Toque suavemente o "pé" da palheta na parte não semeada de uma nova placa para transferir os vermes; Normalmente, esta é a mesma placa que teve a bactéria retirada dela na seção 1.4.2.
    5. Esterilize o picareta entre cada placa e/ou cepa de minhoca para evitar contaminação e permitir que o picareta esfrie após a esterilização.
      NOTA: Tocar em um verme irá estressar ou matar o animal. A picareta de minhoca esfriará depois de tocar no gramado bacteriano para pegar "gosma" para transferência de minhoca.
  5. Manter os vermes a 20 °C em placas NGM (passo 1.1) semeadas com a bactéria OP50 Escherichia coli (passo 1.2). Passagem de vermes 2 a 3 vezes por semana, transferindo vários adultos para placas frescas (60 mm x 15 mm) usando uma picareta de minhoca (etapas 1.3-1.4) para evitar a fome, que pode alterar a fisiologia.
    NOTA: As cepas de C. elegans e bactérias OP50 estão disponíveis no Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

2. Sincronização do desenvolvimento de C. elegans

  1. Sincronize os vermes com a idade usando uma postura de ovos cronometrada (descrita aqui). Se um grande número de vermes for necessário para uma sala de aula ou outra finalidade, execute a sincronização do alvejante conforme descrito em Golden et al.10.
  2. Transfira os vermes adultos para uma nova placa OP50 semeada usando um palito de fio de platina (descrito na seção 1). O número de vermes é ditado pela necessidade experimental. Os vermes do dia 1 põem aproximadamente 3 ovos por hora. Portanto, 10 vermes gerarão aproximadamente 30 ovos em 1 h. De preferência, use minhocas no primeiro dia da idade adulta (Dia 1).
  3. Após aproximadamente 1 h, retire os vermes adultos do prato, deixando apenas os ovos.
    NOTA: Deixar um worm para trás inadvertidamente é um erro comum. Os vermes que permanecerem continuarão a botar ovos e interromper a sincronização. Os vermes amadurecem em adultos do Dia 1 aproximadamente 72 h após serem colocados quando incubados a 20 ° C.

3. Montagem de vermes para imagens

  1. Ao criar imagens de eventos de fertilização, use adultos do Dia 1 para maximizar as oportunidades de visualização.
    NOTA: Nos adultos do Dia 1, um oócito é fertilizado a cada ~ 23 min. No entanto, a ovulação diminui com a idade, e um hermafrodita típico para de botar ovos após o dia 4.
  2. Prepare uma solução de agarose a 3% em água misturando 3 g de agarose em 100 mL de água. Aqueça a solução de agarose usando um micro-ondas até que a agarose esteja totalmente dissolvida. Para reutilizar uma solução solidificada, aqueça até dissolver totalmente. Após vários usos, gere uma nova solução.
  3. Coloque uma lâmina de microscópio em branco para aquisição de imagens entre duas outras lâminas de microscópio que tenham uma única camada de fita de laboratório no eixo longo da lâmina (consulte a Tabela de Materiais). A fita cria um espaçador para a almofada de agarose, permitindo uma distribuição uniforme e uma largura uniforme. Certifique-se de que as três lâminas estejam em uma fileira com os lados longos se tocando: duas lâminas com fita adesiva que flanqueiam uma lâmina de microscópio em branco.
    1. Solte a solução aquecida de agarose a 3% (~ 100-150 μL) no centro da lâmina do microscópio que está entre as lâminas com fita adesiva usando uma pipeta de 1 mL.
    2. Coloque rapidamente uma nova lâmina de microscópio na gota de agarose, garantindo que a nova lâmina fique perpendicular à lâmina com a gota de agarose e apoiada nas lâminas adjacentes com fita adesiva.
    3. Separe delicadamente as lâminas. Evite rasgar a almofada.
    4. Prepare as almofadas de agarose frescas a cada dia de imagem. Recomenda-se fazer várias almofadas ao se preparar para a imagem, mas evite expor mais de uma almofada ao mesmo tempo. As almofadas expostas secarão rapidamente.
  4. Usando uma pipeta de 20 μL, adicione uma pequena gota (~ 7 μL) de 1 mM de levamisol em tampão M9 no centro da almofada de agarose para paralisar os vermes. Use uma solução estoque de 100 mM de levamisol esterilizada por filtro para fazer a solução de trabalho de 1 mM.
    1. Para fazer o tampão M9, combine 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH4Cl e 1 L de água deionizada em um recipiente adequado (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Autoclave a solução usando as configurações do ciclo de esterilização líquida e deixe a solução esfriar até RT antes de usar. Se estiver usando um recipiente com tampa de rosca, afrouxe a tampa de rosca cerca de um quarto de volta para ventilação adequada. Recomenda-se um ciclo de esterilização definido em 121 °C por 30 min.
  5. Escolha pelo menos 5 vermes sincronizados e toque suavemente o "pé" na gota de levamisol para transferir todos os vermes. Use pelo menos 5 vermes por lâmina, pois a orientação do corpo pode fazer com que o intestino obscureça a linha germinativa, bloqueando a visualização da onda de cálcio no oócito.
    NOTA: Certifique-se de que os vermes sejam transferidos rapidamente, pois o levamisol evaporará se deixado na almofada de agarose por mais de 5 min.
  6. Cubra cuidadosamente a almofada de agarose com uma lamínula. Verifique a localização dos vermes, pois a lamínula pode causar a dispersão dos vermes desde a colocação inicial. Rotule a lâmina do microscópio com detalhes apropriados, como o nome da cepa do verme (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de que a imagem seja feita o mais rápido possível após a montagem dos vermes, pois a exposição prolongada ao levamisol é tóxica.

4. Imagem de cálcio durante a fertilização em  C. elegans

  1. Localize os vermes usando uma objetiva de baixa potência, como 4x, no microscópio de sua escolha. Use iluminação de campo claro.
  2. Use no mínimo uma objetiva de ar de 20x para visualizar claramente a onda de cálcio nos oócitos. Use uma objetiva de imersão de 40x ou mais.
  3. Dependendo do sistema usado, a intensidade de excitação normalmente é um valor fixo. Para uma visualização ideal dos repórteres fluorescentes, ajuste o ganho ou o tempo de exposição.
    NOTA: A luz contínua de alta intensidade danificará a amostra e é prejudicial à saúde do verme. Se desejar, desligue o laser enquanto aguarda um evento de fertilização para evitar a iluminação contínua de GFP. Veja as características de um evento de fertilização nas seções 4.8 - 4.9.
  4. Certifique-se de que o canal GFP de 488 nm esteja configurado para uma potência de laser em que o sinal do repórter CaFE seja facilmente visível.
    1. Para um confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2, detecte o repórter CaFE com uma potência de laser de 30% para o canal GFP e um ganho de 75. O tamanho do orifício para o confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2 é de 30 μm.
    2. Para o disco giratório confocal Andor Dragonfly usando a câmera Zilla, detecte o repórter CaFE com uma potência de laser de 30% para o canal GFP. O tamanho do orifício para o confocal do disco giratório Andor Dragonfly é de 40 μm.
    3. Ajuste as configurações do laser e o tempo de exposição para cada amostra examinada.
  5. Se o uso do EAG28 (CaFE; PH-mCherry) ou EAG25 (CaFE; H2B-mCherry), certifique-se de que o canal vermelho esteja definido para uma potência de laser em que o sinal mCherry seja facilmente visível, além do canal GFP.
    1. Para o confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2, detecte o repórter mCherry com uma potência de laser de 15 para o canal RFP e um ganho de 130.
    2. Para o disco giratório confocal Andor Dragonfly usando a câmera Zyla, detecte o repórter mCherry com uma potência de laser de 30% para o canal RFP.
    3. Ajuste as configurações do laser e o tempo de exposição para cada amostra examinada.
  6. Defina a taxa de quadros ou quadros por segundo (fps) o mais rápido que o sistema permitir.
    NOTA: O repórter CaFE é normalmente observado a aproximadamente 1 fps para o confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2 e 10 fps para o disco giratório Andor Dragonfly confocal com a câmera Zyla.
  7. Selecione o lapso de tempo ou o protocolo de série temporal e ajuste as configurações desejadas. Adquira imagens de lapso de tempo por 30 minutos ou menos, com a opção de repetições definida como '1'.
    NOTA: Se o evento de fertilização ocorrer antes que o intervalo de tempo seja concluído, pare o vídeo para preservar o tamanho do arquivo.
  8. Localize os vermes na lâmina e selecione um verme onde a gônada proximal seja visível. O intestino e a gônada se torcem dentro do verme. Como tal, um braço de gônada é frequentemente obscurecido pelo intestino, impedindo a visualização da fertilização. Se o oócito -1 estiver obscurecido, selecione outro verme para visualização. Para aumentar a probabilidade de o verme selecionado ter um braço de gônada visível, monte um mínimo de 5 minhocas por lâmina. Use adultos no início do dia 1 para visualizar a fertilização.
  9. Examine cada -1 oócito nos braços das gônadas do verme para determinar se um evento de fertilização é iminente.
    NOTA: Antes da fertilização, durante a maturação meiótica, o núcleo do oócito -1 migrará para a parte posterior do oócito e o envelope nuclear se dissolverá. Esses eventos são visíveis nos canais Nomarksi e GFP usando o repórter CaFE, e tais eventos indicam que a ovulação ocorrerá nos próximos ~ 10 minutos.
  10. Após a quebra do envelope nuclear, o citoesqueleto do oócito -1 mais proximal se reorganizará, assumirá uma aparência arredondada e se separará do oócito -2. Neste ponto, a ovulação ocorrerá em breve. Comece a gravar o vídeo imediatamente se esses eventos forem observados. Grave vídeos em um ambiente de campo amplo.
    NOTA: Se o movimento do núcleo ou o arredondamento do oócito não for visível após 20 minutos, é improvável que ocorra um evento de ovulação. Concentre-se em um verme diferente e/ou prepare um novo slide.

5. Quantificação de transientes de cálcio na fertilização de C. elegans

  1. Quantifique transientes de cálcio de vídeos de fertilização usando o software do sistema de microscópio como Nikon NIS Elements (descrito aqui). ImageJ/FIJI também são adequados para análise de imagens11.
  2. Para quantificar a mudança na fluorescência dos vídeos de fertilização, use os seguintes valores de sinal: o sinal no tempo 0, o sinal do quadro de interesse e o sinal de linha de base.
  3. Identifique o tempo e o quadro que capta a primeira explosão de fluorescência que ocorre no oócito -1. Defina esse quadro como tempo 0.
  4. Para obter o sinal do quadro de interesse, desenhe a região de interesse (ROI) para abranger as seguintes áreas: o oócito -1 antes da fertilização, a espermateca e o oócito recém-fertilizado no útero. O sinal exibido no ROI é denominado F1.
    NOTA: Certifique-se de que o ROI cubra toda a área trafegada pelo oócito. O ROI deve ser idêntico em todos os quadros da gravação de lapso de tempo que está sendo analisada.
  5. Defina uma área em branco da imagem sem fluorescência usando as mesmas dimensões do ROI definido na etapa 5.4 para calcular o sinal de fundo em cada quadro. Subtraia o sinal de fundo de cada quadro.
  6. Para obter o sinal de linha de base (F0), posicione o quadro em um mínimo de 15 quadros antes do tempo 0. Usando o mesmo ROI da etapa 5.4, observe o sinal em cada quadro até o tempo 0. Calcule a média dos sinais (com subtração de fundo) do quadro inicial até o tempo 0 para calcular o sinal de linha de base.
  7. Calcular a variação da fluorescência (ΔF) utilizando a seguinte fórmula: figure-protocol-1. F1 é definido em cada quadro como o sinal no ROI sem o sinal de fundo. F0 é o sinal fluorescente de linha de base médio de ≥15 quadros antes do tempo 0, conforme calculado na seção 5.6.
  8. Determine a taxa de mudança entre os quadros subtraindo a mudança na fluorescência entre 2 quadros e dividindo pelo tempo.

6. RNAi em C. elegans

  1. Preparar placas de RNAi
    1. Prepare as placas de acordo com a etapa 1.1 e adicione os seguintes reagentes adicionais para permitir o knockdown do gene via RNAi na etapa 6.1.4.
    2. Adicione 1 mL de isopropil filtrado estéril 1 M β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) (dissolvido em água deionizada) para uma concentração final de 1 mM IPTG no meio (ver Tabela de Materiais).
    3. Adicione 1 mL de ampicilina filtrada estéril a 100 mg / mL (dissolvida em água deionizada) para uma concentração final de 100 μg / mL de ampicilina no meio (consulte a Tabela de Materiais). Em alternativa, utilizar carbenicilina12 40 μg/ml.
    4. Agite suavemente, mas completamente, para misturar e despejar as placas conforme descrito nas etapas 1.1.4 - 1.1.5.
  2. Preparação de cultura saturada de RNAi
    1. Calcule a quantidade de cultura saturada multiplicando o número de placas de RNAi semeadas necessárias por 300 μL ao usar placas de 60 mm x 15 mm ou por 100 μL ao usar placas de 35 mm x 10 mm.
    2. Usando uma técnica estéril, cultive as bactérias de RNAi desejadas em LB (descritas nas etapas 1.2.1-1.2.3) contendo 100 μg / mL de ampicilina durante a noite a 37 ° C até saturar. Inclua uma cepa bacteriana contendo o vetor vazio L4440 como controle negativo e uma cepa bacteriana contendo um controle positivo de RNAi (por exemplo, ovo-5) para verificar se o RNAi está funcionando. Além disso, inclua uma condição "em branco" contendo apenas LB para verificar se não há contaminação no LB padrão.
    3. Adicionar IPTG filtrado estéril a uma concentração final de 1 mM à cultura saturada durante a noite para indução da expressão de dsRNA e incubar durante pelo menos 2 h 30 min a 37 °C antes da semeadura. Alternativamente, dilua a cultura saturada durante a noite fora da fase logarítmica antes de induzir com IPTG.
      NOTA: O IPTG está incluído nas placas e na cultura saturada para a expressão ideal de dsRNA.
    4. Usando técnica estéril, transfira 300 μL da cultura induzida para o centro de uma placa de RNAi de 60 mm x 15 mm (solidificada). Como alternativa, use 100 μL de cultura saturada para uma placa de 35 mm x 10 mm.
    5. Deixe as placas secarem em RT por 1-3 dias até que a mancha bacteriana de RNAi não seja mais líquida. Certifique-se de que as placas estejam secas e livres de contaminação antes de usar. Armazene as placas a 4 °C de cabeça para baixo para uso futuro.
      NOTA: Use placas de RNAi o mais rápido possível para um knockdown ideal, pois a eficácia do RNAi diminui com o tempo. Descarte se > 1 mês de idade.
  3. Conforme descrito na seção 2, sincronize os vermes em placas de RNAi.
    1. Verifique os vermes 1-2 dias após a sincronização da postura de ovos quanto a atrasos no desenvolvimento.
    2. Alguns RNAi podem causar defeitos de desenvolvimento quando o knockdown começa na postura dos ovos. Se necessário, coloque vermes nas placas de RNAi em um estágio posterior, como L3.
  4. Conforme descrito nas seções 3 e 4, monte os vermes e prepare-se para a imagem usando qualquer sistema de microscópio equipado para detectar fluorescência GFP.

7. Imagem de cálcio durante o início da embriogênese em C. elegans

  1. Sincronize worms conforme descrito na seção 2. Use a cepa EAG28, que combina o repórter CaFE e um marcador de domínio de homologia pleckstrina-mCherry destacando o limite da membrana plasmática. Alternativamente, para visualizar embriões fertilizados ex utero, corte suavemente o verme ao longo do útero usando uma agulha de seringa estéril para liberar os embriões.
  2. Prepare vermes ou embriões para imagem conforme descrito na seção 3 e siga as mesmas instruções descritas na seção 4 para definir os parâmetros de imagem.
  3. Centralize a área de interesse no útero do verme para visualizar embriões ou um ovo posto.
    1. Para embriões no útero, certifique-se de que o útero não esteja atrás do intestino, que o útero não esteja apinhado e que as células individuais do embrião estejam claras no plano focal.
    2. Para ovos ex utero, certifique-se de que os estágios das células não ultrapassem o estágio de vírgula do ciclo de vida do verme.
  4. Selecione o lapso de tempo ou o protocolo de série temporal e ajuste as configurações desejadas.
    1. Para uma visualização ideal dos transientes de cálcio embrionário, aumente as configurações de tempo para filmes prolongados. Lembre-se de que a exposição constante ao laser prejudicará o embrião por longos períodos de tempo.
  5. Capture vídeos ou imagens concentrando-se nas células dos embriões no estágio celular desejado.
  6. Use uma objetiva de imersão de 40x ou mais para obter imagens, embora os transientes sejam prontamente detectados usando uma objetiva de ar de 20x.

Resultados

Usando os protocolos descritos neste manuscrito, os padrões dinâmicos de sinalização de cálcio na fertilização e embriogênese foram observados em C. elegans.

Uma sequência típica de fertilização em vermes contendo o repórter CaFE é mostrada na Figura 2. Para facilitar a análise, foi utilizada a cepa EAG28 que combina o repórter CaFE com um transgene13 de domínio de homologia de pleckstrin (PH-mCherry). O marcador PH-mCherry localiza-se na membrana plasmática e permite uma visualização mais fácil dos limites celulares, particularmente no braço da gônada. A cepa EAG28 foi criada pelo cruzamento da cepa EAG16 contendo o repórter CaFE com a cepa repórter OD70 PH-mCherry13. Em C. elegans, a ovulação e a fertilização ocorrem simultaneamente. O tempo 0 de fertilização é considerado o primeiro quadro em que um sinal de fluorescência é detectado no oócito ovulante (Figura 2). Uma explosão brilhante de fluorescência ocorre no local da fusão dos espermatozoides assim que a borda dianteira do oócito entra na espermateca, o órgão de armazenamento de espermatozoides7. O sinal aparece antes que a ovulação esteja completa. A onda de cálcio é bifásica, com uma rápida explosão inicial seguida por uma onda de fluorescência do ponto de entrada em direção ao pólo oposto. Todo o oócito torna-se fluorescente em <30 s.

Observe que o repórter CaFE está em uma única cópia e, portanto, o sinal não é tão brilhante quanto outros transgenes. O lapso de tempo Z-stack não é recomendado durante a ovulação, a menos que um confocal de disco giratório esteja disponível e otimizado. As imagens da pilha Z podem ser obtidas antes ou depois de um filme para capturar mudanças 3D na morfologia das gônadas. Embora as imagens aqui tenham sido tiradas com um microscópio confocal, os transientes também foram observados usando microscopia de fluorescência de campo amplo, que é mais comum e acessível do que a confocal. Usando um confocal de varredura a laser, a taxa de quadros é de aproximadamente 1 fps. Usando um disco giratório confocal, a taxa de quadros é de 10 fps ou mais rápida. O sinal de fundo do repórter CaFE é suficiente para iluminar os oócitos em maturação no braço da gônada. Após a fertilização, um aumento de 1,5-2x na intensidade do sinal de GFP é normalmente observado.

Existem vários métodos alternativos para quantificação. Por exemplo, o software de análise de imagem Imaris, criado pela Oxford Instruments (a mesma empresa-mãe do microscópio confocal de disco giratório Andor Dragonfly), tem a capacidade de quantificar o sinal em cada quadro apenas do oócito em trânsito, em vez de um ROI maior. No entanto, o software Imaris não é gratuito. Além disso, uma estratégia detalhada de análise de imagem para medir as ondas de cálcio no oócito foi descrita em detalhes excelentes por Takayama, Fujita e Onami e usa o ImageJ, que está disponível gratuitamente14. Alternativamente, os quimógrafos para ilustrar a onda de sinal fluorescente em um único oócito requerem uma manipulação de imagem mais extensa do que a descrita aqui, mas são descritos em Takayama e Onami3.

Uma vantagem distinta de C. elegans é sua capacidade de derrubar a expressão de quase qualquer gene, alimentando os vermes com bactérias que expressam dsRNA para desencadear RNAi endógeno15,16. Para uma expressão ideal de dsRNA, tanto as placas de RNAi quanto a cultura de RNAi saturada contêm IPTG. O dsRNA é produzido expressando o gene de interesse com promotores flanqueadores. Aqui, usamos a biblioteca Ahringer que tem como alvo a maior parte do genoma do verme por meio do uso de 16.256 cepas bacterianas17. Como alternativa, um ORFeome de ~ 11.000 clones de RNAi foi criado pelo laboratório Vidal usando o sistema Gateway e está disponível para compra por meio do Horizon Discovery18.

Para demonstrar a utilidade do repórter CaFE em combinação com RNAi, examinamos a ovulação prematura. Uma deleção parcial no ipp-5 induz um evento de ovulação dupla em que tanto o oócito -1 quanto o oócito -2 entram na espermateca durante a mesma ovulação19. O IPP-5 é uma fosfatase que atua no IP3 e diminui efetivamente os níveis do segundo mensageiro IP3. Descobrimos que o knockdown de RNAi do ipp-5 provoca um fenótipo de ovulação dupla semelhante ao mutante.

A análise do repórter de CaFE durante a ovulação dupla induzida pelo knockdown do RNAi ipp-5 revelou novos aspectos do OET. Primeiro, um sinal de cálcio foi observado imediatamente após a entrada na espermateca no oócito -1 principal, mas não no oócito -2 final (Figura 3). Embora 2 oócitos sejam ovulados, o oócito -1 ainda é o único oócito que mostra sinais de maturação adequada, em particular, a quebra do envelope nuclear (NEBD). Esses dados sugerem que, embora o oócito -2 esteja na presença de espermatozoides, ele não é competente para ser fertilizado, pois ainda não amadureceu adequadamente. Em segundo lugar, o oócito -2 exibe uma onda de cálcio atrasada, normalmente quando o oócito sai da espermateca para o útero. Embora a maturação do oócito seja normalmente um pré-requisito para a ovulação, esses dados sugerem que a maturação do oócito e a competência para a fertilização ainda podem ocorrer após a ovulação. A visualização da onda de cálcio atrasada durante o knockdown do ipp-5 destaca as vantagens do repórter CaFE para interrogar a competência e o tempo de fertilização.

Além disso, descobrimos que o repórter CaFE é detectável em ovos postos e revela transientes de cálcio unicelular durante o início da embriogênese em C. elegans. Embriões de EAG28 adultos sincronizados do Dia 1 (CaFE; PH-mCherry) foram fotografados usando os protocolos das seções 1-5 com o disco giratório Andor Dragonfly confocal usando a câmera Zyla (Figura 4). Os transientes de cálcio estão confinados a células únicas e levam menos tempo do que a onda de cálcio de fertilização para serem concluídos (~ 9 s, n = 11). No entanto, a onda de cálcio durante a embriogênese não parece ser bifásica. Transientes de cálcio não foram observados antes do estágio de 8 células. Notavelmente, o cálcio não se localiza no sulco de clivagem em C. elegans, como é visto em muitos outros organismos, incluindo humanos e Xenopus 20,21,22. Transientes de cálcio unicelular foram observados bem após a gastrulação (~ 200 min após a fertilização) e em ovos postos. Um único embrião exibe vários transientes de cálcio ao longo do tempo, mas em células diferentes e normalmente uma célula de cada vez. Observe que a exposição contínua à estimulação a laser danificará os embriões. Recomenda-se uma potência mais baixa de LED/laser ou exposição descontínua. No entanto, como as ondas de cálcio são relativamente curtas em ~ 9 s, não recomendamos mais lento do que 2 s entre os eventos de estimulação com LED/laser.

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Figura 1: Braço da gônada de C. elegans . Imagem de um braço de gônada da cepa do verme EAG25, mostrando o repórter CaFE GFP (verde) e o marcador histona 2B-mCherry (vermelho), que destaca os núcleos na linha germinativa. O oócito proximal é denotado pelo -1 diretamente antes da espermateca, onde os espermatozoides são armazenados (seta). O embrião localizado mais próximo da espermateca, mas dentro do útero, é o embrião mais recente. A imagem foi tirada usando o confocal de varredura a laser Nikon ECLIPSE Ti2. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Visualização da onda de cálcio durante a fertilização. Imagens de séries temporais de fluorescência refletindo cálcio intracelular durante a fertilização na cepa de vermes EAG28. A cepa EAG28 contém o repórter CaFE (verde) e uma fusão de domínio de homologia pleckstrina-mCherry (amarelo), que destaca as membranas plasmáticas. O tempo 0 indica o primeiro quadro retratando um claro aumento no sinal fluorescente no oócito. O tempo 24,4 s reflete o primeiro quadro mostrando a fluorescência total do oócito. As imagens de séries temporais foram tiradas usando o disco giratório Andor Dragonfly confocal com uma câmera Zyla. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Ondas de cálcio durante um evento de ovulação dupla induzido por RNAi ipp-5 . Imagens de lapso de tempo de ondas sequenciais de cálcio do oócito -1 e do oócito -2 em uma cepa EAG16 (CaFE em verde GFP) exposta ao RNAi ipp-5 . O quadro de -40,0 s inclui rótulos para o oócito -1 (-1), -2 oócito (-2), espermateca (*) e +1 embrião (+1). O tempo 0 s exibe o aumento inicial da fluorescência da onda de cálcio do oócito -1. O tempo 4,5 s mostra a onda de cálcio se espalhando em direção ao pólo oposto no oócito -1. O tempo 70,5 s exibe fluorescência de células inteiras no oócito -1 acompanhado pelo oócito -2 no sinal GFP basal; Ambos os oócitos estão na espermateca. O oócito -1 fertilizado e o oócito -2 não fertilizado entram no útero no tempo 158,3 s. Aos 219,3 s, o oócito -2 exibe uma onda de cálcio fluorescente tardia. As imagens foram tiradas usando o confocal de disco giratório Andor Dragonfly com uma câmera Zyla. Barra de escala = 30 μM Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Transientes de cálcio unicelular no início da embriogênese. (A) Embriões no útero e (B) ex utero (ovo posto) exibiram um sinal fluorescente em uma única célula durante a embriogênese. As imagens foram tiradas usando o confocal de disco giratório Andor Dragonfly com uma câmera Zyla. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Uma ferramenta simples com um protocolo robusto é uma combinação potente para lidar com questões científicas difíceis. Aqui, métodos para a visualização do cálcio como um proxy facilmente detectável para a fertilização são apresentados usando o repórter CaFE. Este mesmo repórter persiste no início da embriogênese e também permite a visualização de transientes de cálcio mais adiante no desenvolvimento. A sinalização de cálcio serve como um segundo mensageiro crítico que demarca grandes mudanças na função celular, particularmente para a biologia do desenvolvimento. No oócito, a primeira fase de explosão da onda de cálcio marca não apenas o momento da fertilização, mas também o local da fusão dos espermatozoides3. Em C. elegans, o eixo A-P também é determinado pelo local de fusão espermática23. Portanto, a capacidade de visualizar o cálcio em oócitos e embriões permite a investigação de questões complexas que são centrais para a biologia celular e do desenvolvimento.

O método descrito aqui com o repórter CaFE deve ser simples o suficiente para novatos em nematóides. Métodos anteriores para detectar ondas de cálcio em oócitos de C. elegans dependiam da injeção de corante 3,8,14. Embora esses estudos tenham sido importantes e esclarecedores, a injeção de corante é trabalhosa e o equipamento de injeção não está disponível em todos os laboratórios.

Os protocolos apresentados aqui foram otimizados para vermes saudáveis. Para maximizar a chance de sucesso, certifique-se de que não haja contaminação no meio do verme ou no gramado de bactérias do qual os vermes se alimentam. Não exponha os vermes a condições de estresse, como temperatura, pois elas afetarão a ovulação e a fertilização. Além disso, os controles para eficácia do RNAi devem ser incluídos em todos os experimentos, pois a eficácia diminui com o tempo. Use um controle positivo para a eficácia do RNAi, como o ovo-5, que gera embriões, mas nenhuma progênie viável, pois a formação da casca do ovo está comprometida24. Além disso, os parâmetros de captura de imagem devem ser otimizados para cada sistema de microscopia. Nossas especificações estão incluídas aqui como referência, mas desvios são esperados. Embora este sistema detecte prontamente o cálcio citoplasmático como um proxy para a fertilização, ele não representa necessariamente um evento de fusão espermatozóide-oócito genuíno.

A ampla gama de ferramentas e mutantes distribuídos gratuitamente na comunidade de worms aumenta a utilidade do repórter CaFE. O repórter é integrado ao genoma do verme e é facilmente cruzado com outras cepas mutantes ou repórter de C. elegans 25. Relata-se aqui a criação de EAG25 expressando o repórter CaFE com um marcador histona H2B-mCherry para visualizar núcleos (Figura 1) e EAG28 com o repórter CaFE e um marcador de domínio de homologia pleckstrina-mCherry, que destaca a periferia celular (Figura 2)13,26. Ambas as cepas auxiliam na visualização das células na linha germinativa e durante a embriogênese. Além disso, a facilidade de RNAi em
C. elegans, quando usado com o repórter CaFE, revelou novos insights sobre a competência de fertilização. Como mostrado na ovulação dupla induzida pelo knockdown do RNAi ipp-5 na Figura 3, a presença de espermatozóides e um oócito ovulado é insuficiente para estimular um evento de fertilização.

Esses resultados indicam que outro sinal, ou a ausência de um inibidor, deve existir para permitir que o oócito seja fertilizado. O oócito ovulado prematuramente exibe um transiente de cálcio retardado quando o oócito se move para o útero. Essa onda tardia de cálcio sugere que o oócito -2 ovulado prematuramente pode desenvolver competência de fertilização com o tempo. Prevemos que os estudos sobre o momento da fertilização, particularmente no que diz respeito à sinalização e regulação célula-célula, serão auxiliados pelo uso do repórter CaFE. Além disso, o repórter CaFE persiste na embriogênese e exibe transientes de cálcio unicelular. Essa sinalização embrionária de cálcio também foi relatada nas primeiras 24 horas de desenvolvimento do peixe-zebra27. O papel dos transientes de cálcio é desconhecido, mas a presença sugere um evento de sinalização celular durante o desenvolvimento que ainda não foi explorado. Notavelmente, os transientes de cálcio não foram observados em zigotos recém-fertilizados. Portanto, o cálcio não se localiza no sulco de clivagem, como foi documentado em vários outros organismos, incluindo Xenopus e humanos20 , 21 , 22 .

É importante ressaltar que o repórter CaFE é fácil o suficiente para ser usado por alunos de graduação com treinamento mínimo. Projetamos e executamos um laboratório CURE (experiência de pesquisa de graduação baseada em curso) de 1 crédito para estudantes de biologia com as cepas e protocolos descritos aqui. Ao longo de um semestre, a turma se reunia uma vez por semana por 3 h ou duas vezes por semana por 1 h 30 min cada. Os alunos tiveram a opção de trabalhar sozinhos ou em grupos de 2. Cada aluno / par selecionou um gene diferente para estudar a partir de uma lista selecionada. Eles realizaram RNAi contra o gene escolhido na cepa EAG28 e examinaram os vermes quanto aos efeitos na fecundidade, fertilização e / ou morfologia das gônadas. Com base em seus resultados e em sua leitura de fundo usando literatura primária, os alunos desenvolveram hipóteses que poderiam testar em experimentos subsequentes. Esse design iterativo foi fundamental para aumentar o envolvimento dos alunos28. Os alunos obtiveram experiência autêntica em pesquisa e adquiriram habilidades em organismos modelo, telas genéticas e microscopia de fluorescência. Dada a facilidade de uso do repórter CaFE, os alunos sem experiência em pesquisa conseguiram ter sucesso. Posteriormente, os alunos expressaram esmagadoramente uma preferência pelo formato CURE em vez das aulas de laboratório tradicionais, com muitos alunos expressando o desejo de continuar com a pesquisa. Juntas, essas ferramentas e protocolos auxiliam tanto na educação quanto na pesquisa sobre os processos iniciais de desenvolvimento.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes ou financeiros.

Agradecimentos

O KSKG foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver (R15HD111986). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa do NIH (P40 OD4010440). Agradecemos à WormBase.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgarFisher ScientificDF0140-07-42 kg; O pó dissolve mais facilmente do que os flocos
AgaroseMidSciBE-A125500 g
Lâmpada de álcoolFisher ScientificS13475Use com 95% de etanol
Cloreto de amônio (NH4Cl)Fisher ScientificAAA1500030250 g
AmpicilinaFisher ScientificBP1760-55 g
AMSCO 400 Series Small Steam SterilizerSteris HealthcareN/A
Bacto-peptonaFisher ScientificBP1420-500500 g
Bacto-triptonaFisher ScientificDF0123-17-3500 g
Cloreto de cálcio (CaCl2)Fisher ScientificC69-500500 g
ColesterolThermo ScientificA11470.1850 g
Libélula 200 disco giratório confocalOxford Instruments AndorN/AUsado com microscópio Leica
Lâminas de Microscópio Citogênicas Superfrost da Fisherbrand FisherScientific22-035-900144 lâminas por pacote
Alicate de Ponta Chata, Mandíbula LisaHome Depot305530604Certifique-se de que os alicates estão de mandíbula lisa
Isopropil β- d-1-tiogalactopiranosídeo ( IPTG)Fisher ScientificBP1755-1010 g; fita de laboratório sem dioxano
Fisher Scientific15-901-10Rfita de 0,5 polegada é usada para colar lâminas de microscópio
LevamisolFisher ScientificAC18787010010 g
Sulfato de magnésio (MgSO4)Fisher ScientificM63-500500 g
Vidro de cobertura do microscópioFisher Scientific12541016pacote de 1 oz
Nikon ECLIPSE Ti2 laser scanning confocalNikonN/A
Nikon NIS Elements softwareNikonN/AConfocal
OP50 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Platinum WireTriTechPT-9010
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500500 g
de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificAA1159436500 g
de cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS271-500500 g
de fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na2HPO4)Fisher ScientificS471-33 kg
Microscópio estéreoLeicaKL300 LED
Petri estéril (35 mm x 10 mm)CellTreat229638960 placas de Petri por caixa
Placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm)CellTreat229665500 placas de Petri por caixa
Cepa EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1uCaenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG16Criado por Kim Guisbert
Lab Cepa EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PIE-1U; ujIs113 II.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG25Criado por Kim Guisbert
Lab Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG28Criado por Kim Guisbert
Lab Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)JIM113Criado por E. Preston - Murray Lab
Cepa OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OD70Criado por Audhya/Oegema - Greenstein Lab
Tritech Worm Pick HandleTriTechTWPH1
Extrato de leveduraIBI ScientificIB49160500 g

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