Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina

Summary

Este protocolo descreve o projeto, a criação e a aplicação de fosfatases reguladas por rapamicina. Este método fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas.

Abstract

As tirosina fosfatases são uma importante família de enzimas que regulam funções fisiológicas críticas. Eles são frequentemente desregulados em doenças humanas, tornando-os alvos importantes de estudos biológicos. Ferramentas que permitem a regulação da atividade da fosfatase são fundamentais na dissecação de sua função. As abordagens tradicionais, como a superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos ou dominantes, ou a regulação negativa usando siRNA, carecem de controle temporal. Os inibidores da fosfatase geralmente têm baixa especificidade e só permitem que os pesquisadores determinem quais processos são afetados pela inibição da fosfatase.

Desenvolvemos uma abordagem quimiogenética, o sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite a regulação alostérica de um domínio catalítico da fosfatase que permite um controle temporal rígido da ativação da fosfatase. O sistema RapR consiste em um domínio iFKBP inserido em um sítio alostérico na fosfatase. A dinâmica estrutural intrínseca do domínio RapR interrompe o domínio catalítico, levando à inativação da enzima. A adição de rapamicina medeia a formação de um complexo entre iFKBP e uma proteína FRB co-expressa, que estabiliza iFKBP e restaura a atividade do domínio catalítico da fosfatase.

Este sistema fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas. Os recursos exclusivos deste sistema permitem a identificação de eventos transitórios e a interrogação de vias de sinalização individuais a jusante de uma fosfatase. Este protocolo descreve diretrizes para o desenvolvimento de uma RapR-fosfatase, sua caracterização bioquímica e a análise de seus efeitos na sinalização a jusante e na regulação da morfodinâmica celular. Ele também fornece uma descrição detalhada de uma estratégia de engenharia de proteínas, ensaios in vitro que analisam a atividade da fosfatase e experimentos de imagem de células vivas que identificam alterações na morfologia celular.

Introduction

As proteínas tirosina fosfatases são uma família crítica de proteínas envolvidas em uma infinidade de eventos de sinalização celular. Eles demonstraram desempenhar um papel fundamental na regulação da proliferação, migração e apoptose celular ^1,2,3. Consequentemente, a desregulação das proteínas tirosina fosfatases leva a uma variedade de doenças e distúrbios debilitantes 4,5,6,7. O estudo da função fisiológica das tirosina fosfatases e seu papel no desenvolvimento dessas patologias tem sido historicamente dificultado pela falta de ferramentas necessárias para investigar os meandros da sinalização da fosfatase⁸.

Tradicionalmente, as fosfatases são estudadas usando métodos que não possuem a especificidade desejada e/ou não fornecem controle temporal de sua atividade. Essas limitações críticas das ferramentas disponíveis tornam difícil dissecar papéis específicos das fosfatases nas vias de sinalização. A superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos e dominantes ou a regulação negativa da expressão da fosfatase fornecem especificidade, mas carecem de controle temporal e muitas vezes podem desencadear mecanismos compensatórios que mascararão a verdadeira função da enzima.

Os inibidores farmacológicos permitem a regulação temporal das fosfatases. No entanto, muitos inibidores da fosfatase são notoriamente inespecíficos devido à composição bem conservada do sítio ativo nas tirosina fosfatases⁹. Além disso, devido a restrições de projeto, os inibidores direcionados ao sítio catalítico exibem baixa permeabilidade à membrana celular¹⁰. Outra limitação dos inibidores é que eles permitem apenas o exame dos efeitos da inativação da fosfatase¹¹. Assim, há necessidade de ferramentas que permitam a ativação específica e temporalmente regulável de fosfatases. Essas ferramentas permitirão aos pesquisadores identificar os efeitos diretos da ativação da fosfatase, separando-os de múltiplas cascatas de sinalização paralela frequentemente ativadas por estímulos biológicos. É importante ressaltar que o controle temporal rígido da atividade permite a identificação de eventos transitórios induzidos por uma fosfatase e separa os efeitos da atividade aguda e prolongada da fosfatase. A combinação de regulação temporal com análise mutacional permitirá uma dissecação detalhada de papéis específicos de domínios individuais da fosfatase e interrogação de sua sinalização a jusante¹².

Para resolver a falta de recursos desejados nas ferramentas existentes, o grupo Karginov desenvolveu o sistema Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. O sistema RapR utiliza um domínio de comutação projetado, iFKBP, que permite a regulação alostérica da proteína de interesse (POI). A inserção do domínio iFKBP em uma posição alostericamente acoplada ao sítio catalítico do POI o torna suscetível à regulação pela rapamicina. Na ausência de rapamicina, o iFKBP interrompe o sítio catalítico devido à dinâmica estrutural intrinsecamente alta do iFKBP e, portanto, inativa o POI. A adição de rapamicina induz a interação de iFKBP com a proteína co-expressa FRB (Figura 1). Isso causa estabilização do domínio do switch, o que consequentemente restaura a estrutura e a função do domínio catalítico do POI. Como tal, a ferramenta permite a ativação específica e temporalmente regulável do POI.

Figura 1: Esquema do sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. O RapR permite a ativação alostérica da proteína de interesse com a adição de rapamicina. Essa figura foi modificada de Fauser et ^al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 inserível; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Src homologia-2 proteína tirosina fosfatase contendo domínio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A ferramenta RapR pode ser aplicada a diferentes famílias de proteínas. Pode ser usado para regular proteínas quinases, bem como fosfatases^12,14. Este protocolo se concentrará na aplicação da ferramenta RapR para controlar a fosfatase Shp2. Shp2 é uma proteína tirosina fosfatase onipresente que está envolvida em processos de sinalização como proliferação, migração, imunomodulação e diferenciação 1,16,17,18. A desregulação do Shp2 tem sido associada a vários cânceres sólidos, leucemia mieloide e distúrbios do desenvolvimento ^5,7. No entanto, o Shp2 foi vítima das mesmas deficiências de ferramenta descritas acima. Para combater essas limitações, o RapR-Shp2, um construto Shp2 específica e temporalmente regulável, foi desenvolvido e caracterizado¹².

Antes do desenvolvimento de RapR-Shp2, sabia-se que Shp2 estava envolvido na migração celular 19,20,21. No entanto, seu papel específico na sinalização envolvida nesse processo era desconhecido. Também não se sabia em que escala de tempo o Shp2 regula a migração das células e quais mudanças morfodinâmicas específicas ele induz em diferentes momentos de sua ativação. Além disso, não ficou claro se a ativação aguda e prolongada de Shp2 causará efeitos diferentes. Usando RapR-Shp2, verificou-se que a ativação aguda de Shp2 induz disseminação celular transitória, aumento de saliências, polarização celular e migração. Vias específicas a jusante de Shp2 que regulam mudanças morfodinâmicas distintas também foram identificadas¹². Este protocolo fornece detalhes para o projeto e caracterização de RapR-Shp2, que pode ser usado para orientar o desenvolvimento e aplicação de outras fosfatases RapR.

Protocol

1. Desenho de RapR-fosfatases

1. Planeamento
   NOTA: Usando RapR-Shp2 como exemplo, este protocolo detalha as etapas importantes para a criação de uma tirosina fosfatase regulada por rapamicina. O protocolo descrito é otimizado para Shp2 e modificações adicionais podem ser necessárias para se adequar a propriedades específicas de fosfatases individuais.
   1. Para garantir que a atividade catalítica de Shp2 seja puramente controlada pela rapamicina e não por mecanismos endógenos, introduza uma mutação na fosfatase para mantê-la em uma conformação constitutivamente ativa. No caso de Shp2, introduza a mutação D61A.
      NOTA: Se uma mutação ativadora não for introduzida para uma PTPase específica, sua variante RapR funcionará como um sistema controlado por AND regulado por sinais endógenos e rapamicina.
   2. Identifique os locais de inserção do iFKBP no domínio catalítico da fosfatase usando a estrutura cristalina para guiar a seleção conforme descrito anteriormente¹³. Se uma estrutura não estiver disponível, execute o alinhamento da sequência de aminoácidos com o domínio catalítico da fosfatase Shp2 para identificar os locais de inserção (Figura 2A). Certifique-se de que o local de inserção esteja localizado em um loop flexível que esteja estruturalmente acoplado ao bolso catalítico, mas posicionado longe do bolso para evitar o impedimento estérico da ligação do substrato pelo iFKBP.
      NOTA: Mais detalhes da inserção são discutidos na Discussão.
   3. Considere o tipo de sequência de ligante a ser usada entre o domínio iFKBP inserido e a fosfatase de interesse. A escolha da sequência ideal do vinculante é extremamente importante para o sucesso da ferramenta RapR e é discutida mais adiante na Discussão (Figura 2B).

Figura 2: Esquema de considerações ao projetar RapR-fosfatase. (A) Alinhamento de Shp2 (roxo), PTP1B (verde) e PTP-PEST (rosa) com os locais de inserção conservados destacados. (B) Representação da inserção do ligante entre Shp2 e iFKBP. (C) Domínio fosfatase de Shp2 em bege com locais de inserção indicados em azul. Essa figura foi modificada de Fauser et ^al.12. Abreviaturas: Shp2 = Src homologia-2 proteína tirosina fosfatase contendo domínio; iFKBP = FKBP12 inserível; PTP = proteína tirosina fosfatase; RapR = regulado por rapamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Criação da RapR-fosfatase

1. Inserção de iFKBP na fosfatase de interesse usando mutagênese sítio-dirigida modificada
   1. Gere um "megaprimer" de codificação iFKBP via PCR.
      1. Projete primers para síntese de "megaprimer" que contenham 20-25 nucleotídeos recozimento na extremidade 5 'ou 3' do iFKPB, uma sequência de ligação que conectará o iFKPB à fosfatase de interesse e 28-32 nucleotídeos correspondentes ao local de inserção (Figura 3). Confirmar se o produto resultante contém o iFKPB ladeado por fragmentos de recozimento antes e depois do local de inserção na fosfatase em causa.
      2. Sintetize o iFKBP contendo "megaprimer" via PCR (10 μL de tampão polimerase 5x, 1 μL de DNA molde 50 ng/μL contendo iFKBP, 2 μL de 10 mM dNTP, 0,5 μL de um estoque de 100 μM de cada primer "megaprimer" [direto e reverso], 35 μL de água, 1 μL de DNA polimerase). Divida esta reação de PCR em 2 reações separadas de 25 μL antes de executar a PCR. Execute o ciclo de PCR de acordo com as recomendações do fabricante da DNA polimerase ou o seguinte ciclo de PCR padrão: (i) 98 °C por 2 min, (ii) 98 °C por 30 s, (iii) 55-70 °C por 30 s, (iv) 72 °C por 30 s, (v) repita as etapas ii-iv 25x, (vi) 72 °C por 2 min.
      3. Purifique o "megaprimer" usando eletroforese em gel de agarose. Carregue o conteúdo de PCR da etapa anterior em um gel de agarose a 1% e aplique 120 V por aproximadamente 30 min. Procure o "megaprimer" de 400 nucleotídeos no gel, excise o fragmento e purifique usando um kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).
         NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   2. Mutagênese dirigida ao local modificada
      1. Preparar a reacção de mutagénese dirigida ao local modificada utilizando um plasmídeo contendo o gene da fosfatase de interesse como molde (5 μL de tampão polimerase 5x, 2 μL de molde 50 ng/μL, 2 μL de 10 mM dNTP, 10 μL de "megaprimer" extraído, 2,5 μL de água, 2,5 μL de DMSO, 1 μL de ADN polimerase).
         NOTA: A adição de DMSO na mistura de reação reduz a temperatura de recozimento²².
      2. Execute o seguinte ciclo de PCR: etapa inicial de desnaturação a 98 °C por 3 min, seguida por 18 ciclos de etapas consecutivas de incubação a 98 °C por 30 s, 65 °C por 20 s, 60 °C por 20 s, 55 °C por 20 s, 50 °C por 20 s, 72 °C por 18 min. Execute o ciclo durante a noite (o tempo de ciclo é de 7 h). Quando o ciclo estiver concluído, armazene a reação de PCR a 4 °C.
         NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
      3. Após a conclusão do ciclo, adicionar 1 μL de enzima DpnI e incubar a 37 °C durante 1 h.
         NOTA: DpnI irá digerir o modelo residual, aumentando o rendimento do produto recém-sintetizado.
      4. Transforme o produto digerido em DH5α células competentes seguindo as instruções do fabricante. Plaquear a transformação em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado para seleção (carbenicilina para a construção pcDNA RapR-Shp2). Incubar a 37 °C durante a noite. Depois que as colônias crescerem, armazene as placas LB a 4 ° C por até 1 mês.
         NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Isolamento da construção de DNA desejada contendo RapR-fosfatase
   1. Realize uma triagem de PCR de colônias bacterianas²³. Como nem todas as colônias cultivadas em uma placa LB conterão o plasmídeo desejado, certifique-se de fazer a triagem antes do isolamento do DNA do plasmídeo.
      NOTA: Use primers para a tela que irá recozer para o modelo e no gene iFKBP. A triagem pode ser feita usando o mastermix da polimerase Taq (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Assim que as colônias positivas forem identificadas, inocule uma colônia positiva em 3 mL de caldo LB, incluindo o antibiótico adequado, incube e agite a 37 ° C durante a noite.
   3. Extrair o ADN do plasmídeo da cultura líquida seguindo as instruções do fabricante para o kit de extracção do ADN do plasmídeo (ver Tabela de Materiais)
      NOTA: Recomenda-se sequenciar a construção RapR PTPase recém-criada antes de continuar a avaliação in vitro .

Figura 3: Esquema do design do primer e a estratégia de clonagem de mutagênese dirigida ao local modificada .A etapa 1 é a síntese do iFKBP contendo "megaprimer" com "extremidades pegajosas" recozimento no local de inserção da fosfatase de interesse, e a etapa 2 é a inserção do "megaprimer" na fosfatase de interesse. Essa figura foi modificada a partir de Karginov et ^al.13. Abreviatura: iFKBP = FKBP12 inserível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Avaliação da RapR-PTPase por ensaio de atividade in vitro

NOTA: Este protocolo é usado para avaliar a regulação da atividade da RapR-PTPase projetada. Abaixo é descrita a análise de Shp2 imunoprecipitado usando um fragmento N-terminal fosforilado de paxilina como substrato. Um substrato diferente pode precisar ser selecionado para uma PTPase específica de interesse.

1. Dia 1
   1. Placa de 800.000 HEK293T células/poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio DMEM suplementado com suplemento de L-glutamina (concentração final de 2 mM) e 10% de FBS em volume. Colocar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite.
2. Dia 2
   1. Uma vez que as células estejam ~ 60-80% confluentes, transfecte-as de acordo com o protocolo do fabricante do regente de transfecção preferido (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Exemplo de um protocolo de transfecção: Adicione 1 μg de DNA de plasmídeo (pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-flag-RapR-Shp2, cada) a 200 μL de DMEM sem soro e 6 μL de reagente de transfecção e incube a mistura em temperatura ambiente por 15 min. Adicione 100 μL de mistura de transfecção por poço de células. Inclua amostras transfectadas com construções Shp2 negativas constitutivamente ativas e dominantes como controles. Incubar durante a noite em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ .
3. Dia 3
   1. Preparação de Sepharose Proteína-G
      NOTA: Prepare as pontas da pipeta cortadas antes de manusear a Sepharose. As pontas cortadas devem ser usadas em todas as etapas em que a Sepharose é manuseada. A sepharose precisa ser completamente ressuspensa em todas as etapas antes da pipetagem.
      1. Ressuspenda e leve a quantidade apropriada de Proteína-G Sepharose para um tubo de 1,5 mL. Para cada poço em uma placa de 6 poços, use 10 μL de Proteína-G Sepharose. Para uma placa completa de 6 poços, use 60 μL de Sepharose.
      2. Lave a Sepharose com 1 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais). Microcentrífuga por 1 min a 2.000 × g e remova cuidadosamente o tampão de lise. Repita 2x.
      3. Ressuspenda a Sepharose em 380 μL de tampão de lise. Adicione BSA a uma concentração final de 1 mg / mL e anticorpo (0,5 μL para cada amostra IP, anticorpo anti-Flag [ver Tabela de Materiais]). Inverter em um rotador a 4 °C por 1,5 h.
         NOTA: A quantidade ideal de anticorpos deve ser determinada experimentalmente para cada anticorpo utilizado.
   2. Prepare as células para a imunoprecipitação.
      1. Adicionar uma quantidade adequada de rapamicina (solução-mãe 1 mM em etanol) a uma concentração final de 1 μM ou adicionar o mesmo volume de etanol (controlo negativo) às amostras. Incubar durante 1 h numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ .
      2. Coloque a placa de 6 poços com células no gelo e lave suavemente as células com 3 mL de PBS frio. Aspirar o PBS e adicionar 300 μL de tampão de lise (com 1 μM de rapamicina para a amostra de fosfatase ativada ou um volume equivalente de etanol na amostra de controlo negativo) e raspar com um raspador de células. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mL e microcentrífuga por 10 min a 1.000 × g a 4 °C.
      3. Transfira 20 μL do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL para verificar os níveis de expressão. Adicione 20 μL de tampão Laemmli 2x com 5% de β-mercaptoetanol a cada tubo a ser usado para verificar a expressão e incubar a 95–100 °C por 5 min. Utilizar o sobrenadante restante para a imunoprecipitação no passo 3.3.3.3.
   3. Imunoprecipitação de RapR-Shp2
      1. Lave a Proteína-G Sepharose da etapa 3.3.1.3. com 1 mL de tampão de lise. Microcentrífuga por 1 min a 2.000 × g a 4 °C de cada vez e aspire cuidadosamente o tampão de lise. Repita esta etapa 2x.
      2. Usando pontas cortadas, ressuspenda a Sepharose em tampão de lise (50 μL por amostra, portanto, para uma placa de 6 poços, ressuspenda em 300 μL de tampão de lise). Pipete 50 μL da mistura de Sepharose suspensa em um novo tubo separado de 1,5 mL para cada amostra.
         NOTA: Haverá Sepharose ressuspensa na solução tampão de lise que sobrou devido ao volume da Sepharose.
      3. Adicionar o sobrenadante restante das células preparadas do passo 3.3.2.3 em cada tubo de Sepharose. Gire a 4 °C por 1,5–2 h.
   4. Ensaio de atividade da fosfatase
      NOTA: O substrato Shp2 deve ser preparado fosforilando fragmento N-terminal purificado de paxilina usando quinase Src constitutivamente ativa seguindo o protocolo de reação de quinase descrito anteriormente¹².
      1. No final do passo 3.3.3.3, preparar a solução de fosfo-paxilina. Por amostra, adicione solução de fosfo-paxilina (concentração final de 3 μg / mL) a 40 μL de tampão imidazol total (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar rapamicina à concentração final de 1 μM à alíquota da solução de fosfo-paxilina para as amostras de RapR-Shp2 ativadas e um volume equivalente de etanol à solução para as amostras não ativadas.
      2. Ajuste o agitador de aquecimento para 32 °C.
         NOTA: Outras fosfatases podem precisar de uma temperatura diferente para uma atividade ideal.
      3. Lave Sepharose com amostras da etapa 3.3.3.3 2x com 0,5 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais). Lave as amostras 2x com 0,5 mL de tampão de lavagem. Cada tampão deve ter rapamicina a 1 μM para amostras ativadas ou um volume equivalente de etanol para amostras não ativadas. Remova o máximo de tampão possível após a lavagem final.
         NOTA: Uma vez alcançada esta etapa, pode ser útil usar uma pipeta para remover as quantidades finais de tampão lenta e cuidadosamente para garantir que nenhuma Sepharose seja aspirada. Qualquer tampão restante influenciará a concentração de fosfo-paxilina e levará a uma leitura imprecisa.
      4. Adicione 40 μL da mistura preparada de tampão fosfo-paxilina imidazol a cada amostra, com ou sem rapamicina (dependente da amostra). Agite muito suavemente para misturar e coloque imediatamente no agitador de aquecimento e incube por 40 min a 32 °C. Ajuste o agitador de aquecimento para um mínimo de 1,000 rpm para garantir que a amostra esteja totalmente agitada durante a incubação.
      5. Pare a reação adicionando 40 μL de 2x Laemmli Buffer a cada amostra. Incubar as amostras a 95–100 °C durante 5 min. Resfrie as amostras.
      6. Carregue 15 μL de cada amostra (incluindo as amostras de lisado da etapa 3.3.2.3.) em um gel de poliacrilamida SDS com gradiente de 4 a 15% e execute um protocolo padrão de western blot usando membranas de PVDF.
      7. Blot usando um anticorpo anti-Flag para detectar a construção RapR-Shp2, anti-mCherry para detectar mCherry-FRB e paxilina anti-pY118 ou anti-pY31 para detectar a fosforilação da paxilina.
         NOTA: As manchas ocidentais resultantes devem ser semelhantes às da Figura 4.

4. Análise da atividade de RapR-Shp2 em células vivas

NOTA: Este protocolo é usado para determinar a capacidade do RapR-Shp2 de desfosforilar substratos endógenos e induzir a sinalização a jusante. Outras RapR-PTPases exigirão análise de seus substratos e vias específicas.

1. Dia 1
   1. Placa de 198.000 células A431/poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina (concentração final de 2 mM). Colocar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite.
2. Dia 2
   1. Infecte células com construções adenovirais que expressam RapR-Shp2 e FRB adicionando o adenovírus diretamente ao meio já existente no prato. Deixe o adenovírus nas células em uma incubadora de 37 °C e CO₂ a 5% durante a noite. Use células infectadas com FRB apenas como controle negativo.
      NOTA: As quantidades de adenovírus precisarão ser determinadas caso a caso, dependendo do título.
3. Dia 3
   1. Privar as células A431 incubando em DMEM com 0,5% de FBS por 4 h antes do experimento.
   2. Adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μM ou o mesmo volume de etanol (controle negativo) às células por 2 a 4 h.
      NOTA: A incubação pode ser diferente para outras fosfatases.
   3. Coloque a placa de 6 poços com células no gelo e lave suavemente as células com 3 mL de PBS frio. Aspire o PBS, adicione 300 μL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais) e raspe vigorosamente com um raspador de células. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mL e microcentrífuga por 5 min a 2.000 × g a 4 °C.
   4. Transfira 250 μL de cada amostra para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 250 μL de tampão Laemmli 2x com β-mercaptoetanol a 5% e incube a 95–100 °C por 5 min.
   5. Carregue 25 μL de cada amostra em um gel SDS-PAGE com gradiente de 4 a 15% e execute um protocolo padrão de western blot usando membranas de PVDF.
   6. Avalie a desfosforilação mediada por RapR-Shp2 de EGFR e PLCγ usando anticorpos anti-pY992 EGFR e anti-pY783 PLCγ. Avalie a ativação a jusante da MAP quinase Erk1/2 avaliando sua fosforilação nos resíduos pT202/pY204.
      NOTA: As manchas ocidentais resultantes devem ser semelhantes às da Figura 5.

5. Análise de alterações morfodinâmicas induzidas pela ativação de RapR-Shp2 em células HeLa usando imagens de células vivas

NOTA: Este protocolo é usado para determinar o efeito da ativação de RapR-Shp2 na formação de saliências celulares, espalhamento celular e migração.

1. Dia 1
   1. Colocar 700.000 células HeLa em uma placa de cultura de células de 35 mm e colocá-las em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO₂ . Deixe as células aderirem ao prato (~ 2–3 h).
   2. Transfectar as células de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção preferido (ver Tabela de Materiais).
      1. Exemplo de protocolo de transfecção: Adicione 0,5 μg de DNA (plasmídeos pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-Venus-RapR-Shp2, cada) a 100 μL de DMEM livre de soro e 6 μL de reagente de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Adicione a mistura de transfecção às células e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO₂ . Use células transfectadas com pcDNA-mCherry-FRB apenas como controle negativo.
   3. Cubra uma lamínula de vidro redonda de 25 mm # 1,5 com fibronectina (5 mg / L) incubando por 1 h a 37 ° C.
2. Dia 2
   1. Lave a lamínula de vidro revestida com PBS.
   2. Coloque as células HeLa transfectadas na lamínula de vidro revestida em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina (concentração final de 2 mM) para atingir 30% de confluência 4 h antes da imagem.
   3. Duas horas após o revestimento, troque suavemente o meio na placa por um meio Leibovitz L-15 pré-aquecido sem soro por 2 h.
   4. Manchar as células com a coloração da membrana plasmática CellMask Deep Red de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Coloque a lamínula em uma câmara de célula de imagem limpa (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 1 mL de meio L-15 pré-aquecido e cubra com 1 mL de óleo mineral pré-aquecido para evitar a evaporação. Manter a câmara a 37 °C até à obtenção de imagens.
   6. Faça a imagem das células a 37 °C usando um estágio aquecido.
      1. Selecione os canais adequados para imagens da construção RapR e CellMask para imagens de epifluorescência. Para seguir este protocolo, use a objetiva 40x referenciada (consulte a Tabela de Materiais) e os seguintes conjuntos de filtros: filtros de excitação 514/10 e emissão 540/21 para imagens Venus-RapR-Shp2, filtros de excitação 561/10 e emissão 595/40 para imagens mCherry-FRB e filtros de excitação 640/20 e emissão 655LP para imagens CellMask Deep Red. Use um espelho policrônico multibanda para todos os canais fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais).
      2. Capture imagens a cada 2 minutos por 4 a 4,5 h.
         NOTA: Mudanças morfodinâmicas mais rápidas exigirão aquisições mais frequentes.
      3. Após 1 hora de imagem, adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μM para estimular RapR-Shp2.

6. Análise de imagem

NOTA: Este protocolo descreverá a criação de máscaras de células com base em . Arquivos de pilha TIF coletados de experimentos de imagem ao vivo. Em seguida, ele descreverá como criar uma macro no ImageJ para analisar as máscaras, o que resultará em uma planilha da área da célula que é analisada em busca de alterações ao longo do tempo. Por fim, a atividade protrusiva e retrativa celular será analisada usando Metamorph.

1. Gere uma máscara binária de imagens CellMask usando a função MovThresh do pacote de software^{CellGeo 24}.
2. Copie a pasta MovThresh para a pasta de análise de imagem.
3. Copie a CellMask ou outras imagens de canal de marcador de membrana para a pasta MovThresh .
   1. Se várias células foram criadas em uma única posição, corte as imagens para gerar arquivos contendo apenas uma única célula antes de criar a máscara no MatLab.
4. Certifique-se de que o diretório esteja definido corretamente para a pasta MovThresh no MatLab.
5. Execute o MovThresh.
6. Importe pilhas de imagens uma de cada vez.
7. Selecione Curva suavizada e execute Relimitar.
8. Salve como Mask_Image Número em uma nova pasta chamada Máscaras.
9. Depois que todas as pilhas de imagens forem convertidas em máscaras, abra as pilhas de imagens no software ImageJ²⁵.
   1. Análise de área celular no ImageJ
      1. Abra todas as pilhas de imagens de máscara no ImageJ.
      2. Ajuste as medidas definidas para a área.
      3. Clique em Plugins | Macros | Registro.
      4. Clique em Processar | Binário | Tornar binário.
         1. Selecione a opção padrão .
            NOTA: Não clique em nada extra durante a gravação da macro. Se forem incluídas etapas adicionais, é recomendável reiniciar a partir da etapa 6.9.1.3.
      5. Clique em Analisar | Analisar partículas.
         1. Desmarque todas as caixas, exceto Resumo.
      6. Conclua a gravação e clique em Criar a Macro.
      7. Clique em Executar para cada pilha de imagens depois de selecioná-la e salve a tabela de resultados para cada pilha de imagens. A opção padrão será salva como um arquivo csv.
      8. Salve a macro e reutilize para análises futuras (opcional).
   2. Processamento de dados da área em uma planilha
      1. Para cada célula analisada, calcule a média da área da célula a partir de imagens tiradas antes da ativação com rapamicina.
      2. Divida todos os valores de área pela área média da célula que precede a adição de rapamicina.
      3. Calcule o valor médio de cada ponto de tempo para todas as células com imagem e determine os intervalos de confiança de 90%. Plote os dados.
   3. Análise da atividade protrusiva celular
      1. Copie a pasta ProActive para a pasta de análise de imagem.
      2. Copie as pilhas de imagens mascaradas do MovThresh para a pasta ProActive recém-criada.
      3. Abra o MatLab e defina o diretório para a pasta Proactive.
      4. Execute o ProActive.
      5. Importe os arquivos de pilha de imagens de células mascaradas para a GUI ProActive.
      6. Defina o tipo de atividade. A análise de atividade protrusiva gerará dados de área ganha ; a análise da atividade retrativa gerará dados de área perdida ; e a atividade total gerará dados gerais de mudança de área (perdidos e ganhos).
      7. Defina a área para Definir normalização.
      8. Curva suave usando os valores de limite sugeridos ou usando a média para relimitar cada ponto de tempo. Isso calcula a média dos limites em uma janela específica, minimizando inconsistências no limite entre os pontos de tempo.
      9. Clique em Arquivo | Salvar como | Resultados (.mat)
         1. Se estiver processando todos os três tipos de atividade de área, nomeie os arquivos de dados processados da seguinte maneira: ProResultData #, RetResultData # ou ResultData #.
            NOTA: Inclua o espaço antes do número e numere os dados começando em 1.
      10. Repita a partir da etapa 6.9.3.6. para todas as pilhas de imagens mascaradas importadas.
      11. Depois que todas as células forem processadas, feche a GUI do ProActive.
      12. Abra DataToFileTotalArea no editor Matlab para processar arquivos "ResultData" de atividade total.
      13. Altere o número de células para corresponder a quantos arquivos de resultados foram gerados. Se 7 células foram processadas nas etapas 6.9.3.5 a 6.9.3.10, certifique-se de que as três primeiras linhas do script sejam as seguintes:
          filename='Dados do Resultado ';
          células = 1:7;
          lag = 1;
      14. Clique em Executar e repita isso para DataToFileProtArea e DataToFileRetArea para processar dados protrusivos e retráteis, respectivamente. Esta análise produzirá três arquivos de texto "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" e "AllCellsRet.txt"
      15. Abra os arquivos .txt em uma planilha e normalize como na seção 6.9.2. Calcule o valor médio de cada ponto de tempo para todas as células com imagem e determine intervalos de confiança de 90%. Plote os dados.
          NOTA: Os gráficos resultantes das etapas acima devem ser semelhantes aos da Figura 6.

Results

A Figura 4 demonstra os resultados que podem ser esperados do ensaio de atividade da fosfatase à base de paxilina. Neste experimento, a atividade da fosfatase Shp2 negativa constitutivamente ativa e dominante foi comparada com a do RapR-Shp2 ativo e inativo usando fosfo-paxilina como leitura. As construções Shp2 foram imunoprecipitadas e submetidas ao ensaio de atividade conforme descrito no protocolo. As leituras de fosfo-paxilina para Shp2 constitutivamente ativo e RapR-Shp2 ativo foram semelhantes, indicando que o RapR-Shp2 ativo não foi afetado negativamente pela introdução do domínio RapR e manteve a atividade total uma vez ativado. Shp2 negativo dominante e RapR-Shp2 inativo também foram semelhantes, indicando que o construto RapR-Shp2 não tem atividade quando inativo. Isso indica o design bem-sucedido de uma RapR-fosfatase. O fosfo-substrato usado para este ensaio pode diferir com base na fosfatase de interesse.

A Figura 5, semelhante à Figura 4, compara RapR-Shp2 constitutivamente ativo, dominante negativo e ativo e inativo. Este experimento foi conduzido sem imunoprecipitação dos construtos. Em vez disso, foi projetado para caracterizar os efeitos de sinalização a jusante da construção RapR-Shp2 dentro das células. Aqui, as construções Shp2 foram expressas em células HEK293T. O efetor a jusante ERK1 / 2 mostrou aumentar na fosforilação em resposta à ativação de RapR-Shp2, assim como na amostra constitutivamente ativa. O RapR-Shp2 inativo não induziu essa mudança. Isso indica que a sinalização a jusante de Shp2 é preservada com a incorporação do domínio RapR. Da mesma forma, os fosfo-substratos conhecidos EGFR e PLCγ foram desfosforilados em resposta à ativação de RapR-Shp2 em células A431.

Finalmente, a Figura 6 apresenta os resultados da ativação de RapR-Shp2 na morfodinâmica de células HeLa. Uma vez que o RapR-Shp2 foi ativado, as células mostraram um aumento na atividade protrusiva, bem como na área celular. Isso indica que a ativação de RapR-Shp2 é suficiente para induzir mudanças morfodinâmicas nas células HeLa e pode permitir que os pesquisadores investiguem vias de sinalização específicas a jusante responsáveis por esse efeito.

Figura 4: Resultados do ensaio de atividade à base de paxilina: Constitutivamente ativo, dominante negativo e RapR-Shp2 foram imunoprecipitados e sujeitos ao ensaio de atividade usando o protocolo descrito. Os níveis de pY31 paxilina em CA e RapR-Shp2 foram semelhantes, indicando que a construção RapR-Shp2 teve atividade semelhante em comparação com CA Shp2 uma vez ativado. A amostra RapR-Shp2 não ativada não teve atividade, semelhante à amostra DN, indicando que não estava "vazando". Essa figura foi modificada de Fauser et ^al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatase contendo domínio de homologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente ativo; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados do ensaio de lisado de células inteiras: Constitutivamente ativo, dominante negativo e RapR-Shp2 foram expressos em HEK293T células e o protocolo de lisado de células inteiras foi concluído. Quando inativo, o RapR-Shp2 não ativou ERK1/2 por fosforilação, semelhante à amostra DN Shp2. Isso indica que o RapR-Shp2 não tem atividade quando inativo. Uma vez ativado, o nível de fosforilação de ERK1/2 foi semelhante ao da amostra CA Shp2, indicando ativação bem-sucedida e sinalização a jusante de Shp2. Da mesma forma, as células A431 que expressam RapR-Shp2 mostraram diminuições na fosforilação de EGFR e PLCγ, ambos substratos conhecidos de Shp2. Essa figura foi modificada de Fauser et ^al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatase contendo domínio de homologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente ativo; ERK = quinase regulada por sinal extracelular; GAPDH = gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; EGFR = receptor do fator de crescimento epidérmico; PLCγ = fosfolipase C gama; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise de dados de área celular e atividade protrusiva com base em imagens ao vivo: As células HeLa foram transfectadas com RapR-Shp2 e submetidas ao protocolo de imagem ao vivo descrito. Os dados foram analisados conforme descrito no protocolo de análise de dados. Uma vez ativadas (indicadas pela linha cinza vertical), as células HeLa mostraram aumentos na atividade protrusiva celular e na área celular. Nas amostras negativas que expressavam apenas FRB, essa atividade não estava presente. Isso indica que a ativação do RapR-Shp2 induz mudanças morfodinâmicas rápidas dentro das células HeLa e estimula a disseminação e a protrusão celular. Essa figura foi modificada de Fauser et ^al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo fornece etapas detalhadas para o desenvolvimento, caracterização e aplicação de fosfatases quimiogeneticamente controladas. A ferramenta RapR-Shp2 depende de um interruptor regulado por rapamicina inserido no domínio catalítico Shp2. A força desta ferramenta é a especificidade e o controle temporal rígido da atividade da fosfatase. A ferramenta é aplicável a outras fosfatases e, em combinação com a tecnologia RapR-TAP descrita anteriormente, permite a reconstrução de vias de sinalização individuais a jusante²⁶. Os recursos exclusivos da abordagem RapR permitiram aos pesquisadores identificar eventos transitórios induzidos pela ativação de Shp2 e dissecar vias de sinalização específicas a jusante que regulam processos morfodinâmicos individuais.

Vários fatores críticos influenciam o design de uma fosfatase RapR. Uma estrutura cristalina bem resolvida do domínio catalítico da fosfatase de interesse é muito útil para orientar a seleção do local de inserção para iFKBP. No entanto, devido à alta semelhança estrutural entre as tirosina fosfatases, o alinhamento das sequências de aminoácidos dos domínios catalíticos pode fornecer informações suficientes para a identificação do local de inserção, conforme ilustrado pelo alinhamento de Shp2 para PTP1B e PTPPest (Figura 2). Para RapR-Shp2, Val406, localizado no local acoplado ao loop WPD catalítico crítico através de uma fita β, foi escolhido como o local de inserção mais ideal. O mesmo local de inserção pode resultar em regulação bem-sucedida de outras PTPases, como foi demonstrado para PTP1B e PTP-PEST¹² (Figura 2A).

Se a fosfatase de interesse for uma proteína multidomínio, as informações estruturais sobre a organização dos domínios ajudarão a evitar a interferência em outras funções da PTPase. Outro fator que influencia o design da RapR-PTPase ideal é quantos aminoácidos devem ser substituídos por iFKBP inserido. Alças de inserção maiores e mais flexíveis na PTPase podem exigir encurtamento adicional para garantir uma regulação rígida da atividade catalítica pelo iFKBP. Da mesma forma, o comprimento e a composição dos ligantes que conectam o iFKBP à PTPase afetarão a eficiência da regulação. Ligantes curtos compostos de um único resíduo de Gly fornecerão uma regulação mais rígida, mas podem reduzir a atividade máxima da enzima se introduzirem distorção estrutural persistente, mesmo quando o iFKBP está ligado à rapamicina e ao FRB. Os ligantes Gly-Ser-Gly de comprimento médio fornecem mais flexibilidade, mas podem não ser rígidos o suficiente para algumas PTPases. Ligantes longos compostos de Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly ajudarão a prevenir a formação de estruturas secundárias não intencionais que podem influenciar a regulação da PTPase. RapR-Shp2 foi testado com todos os três tipos de ligantes; um ligante Gly-Ser-Gly foi considerado o mais ideal.

Um aspecto crítico que determina o desenvolvimento bem-sucedido de ferramentas RapR é o estabelecimento de um ensaio robusto de fosfatase e a presença de controles apropriados. A comparação da atividade da RapR-fosfatase com a atividade das versões dominante-negativa e constitutivamente ativa do POI fornece uma avaliação do vazamento da construção RapR e da extensão da ativação. Além disso, a falta de desfosforilação pela fosfatase constitutivamente ativa ou fosforilação reduzida pelo mutante negativo dominante indicará condições de reação inadequadas.

Para o ensaio de fosfatase, as condições de reação exigirão otimização para cada PTPase. O ajuste da temperatura, do tempo de reação e das condições do tampão dependerá da PTPase de interesse. A agitação vigorosa das amostras é fundamental para garantir uma mistura suficiente da PTPase ligada à Sepharose e seu substrato. Por fim, se o ensaio de fosfatase descrito não for ideal para a PTPase específica de interesse, uma reação de fosfatase usando p-nitrofenil fosfato como substrato pode ser usada como um ensaio alternativo²⁷.

Em experimentos de imagem de células vivas, vários critérios devem ser levados em consideração ao preparar uma amostra. O protocolo delineado usa meio L-15 baseado em tampão HEPES, que não é sensível à concentração de CO₂ . Se o uso de um meio à base de bicarbonato for desejado, o HEPES deve ser suplementado para manter o pH da amostra ou uma câmara de imagem ambiental que suplemente o CO₂ deve ser usada. O protocolo recomenda a aplicação de uma camada de óleo mineral sobre a amostra para evitar a evaporação e simplificar a adição de rapamicina. Outras configurações usando uma câmara de imagem ambiental ou uma câmara fechada podem ser usadas, mas a adição de rapamicina pode ser mais desafiadora. Ao adicionar rapamicina às células durante a imagem, certifique-se de que o estágio não mude e as células não sejam perturbadas. Quaisquer movimentos adicionais da amostra durante o processo de imagem obstruirão a coleta de dados. A intensidade da iluminação e o tempo de exposição devem ser mantidos baixos para reduzir a fototoxicidade, especialmente para imagens de longo prazo. A eficiência de transfecção adequada das células também é crítica. Uma proporção de 1:1 de FRB para DNA RapR-Shp2 fornece expressão adequada, mas para novas construções, essa proporção exigirá ajustes. Para garantir uma ativação eficiente, o FRB deve ser expresso em um nível mais alto do que a fosfatase RapR.

Uma limitação das ferramentas baseadas em RapR é a incapacidade de desativar rapidamente. A mudança de meio remove a rapamicina extracelular, mas a desativação das construções RapR pode levar horas devido à ligação muito forte da rapamicina à construção RapR. A inativação rápida pode ser alcançada pela adição de um inibidor do sítio ativo da PTPase. No entanto, os potenciais efeitos fora do alvo do inibidor podem dificultar a interpretação dos resultados. Além disso, mesmo em combinação com um inibidor de PTPase, a abordagem RapR não pode ser usada para experimentos de ativação/inativação cíclica. Outra limitação do sistema RapR é a falta de controle espacial. As construções RapR são expressas globalmente e, portanto, ativadas em toda a célula. Uma solução potencial é a aplicação de rapamicina enjaulada que pode ser liberada quase pela luz ultravioleta localmente na célula^28,29. Além disso, a ferramenta RapR pode ser modificada para obter a ativação da fosfatase de interesse em um complexo proteico específico ou em um local subcelular específico. Ao anexar um parceiro de ligação ou uma etiqueta subcelular ao FRB, a RapR-PTPase será direcionada para a proteína ou local específico na célula. Por fim, a rapamicina é um imunossupressor bem caracterizado via inibição do mTOR e pode influenciar a sinalização celular, potencialmente interrompendo a sinalização da PTPase de interesse. Para superar essa preocupação, análogos não imunossupressores da rapamicina (iRap e AP21967) representam uma boa alternativa. Ambos os compostos demonstraram regular as construções RapR¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverwashs 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
Tubos de 1.5 mL	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			Para 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL de glicerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g azul de bromofenol, pH final 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell	Chamber invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µ m filtrado estéril
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Publicado em 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competente células	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzima	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Reagentes de Cleland
EGTA	Acros	409910250
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Reagente de transfecção	Promega	E2692	reagente de transfecção
Kit de extração de gel	Thermo Scientific	K0692	Kit de extração de gel GeneJET
Gel Verde Ácido Nucleico Mancha	GoldBio	G-740-500
Corante de carregamento de gel roxo 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Células	ATCC	CRL-11268
Células HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Software de processamento	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Tampão			25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Tampão			de lise20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R atualização 2022b foi usada para executar as funções CellGeo
Microscopia Metamorfo Software de Automação e Análise de Imagem	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Óleo Mineral	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Géis	96-308
Mini-PROTEAN TGX 12 poços	Bio-Rad	4561085
Grau de Biologia Molecular Água	Corning	46-000-CV
Espelho Polichroic Multiband	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objetivo	Olympus	N/A
PBS sem Ca e Mg	Corning	21-031-CV
Tubos de PCR	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubos e Tampas, Tira Rígida Tampas de Cúpula Anexadas Individualmente
Phusion Plus DNA Polimerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
Membranas de PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF / Sanduíches de papel de filtro
Rapamicina	Fisher	AAJ62473MF
0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sódio	Corning	25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	para eletroforese
Tampão			20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoetanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Anticorpos
Anti-EGFR	Sinalização celular	2232
Anti-ERK 1/2 Anticorpo	Sinalização celular	9102
Anti-bandeira	Anticorpo Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Anticorpo	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Anticorpo	Clontech	632380
Anti-mCherry Anticorpo	invitrogen	M11217
Anti-paxilina Anticorpo	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-fosfo-EGFR Y992 Anticorpo	Sinalização celular	2235
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204	Anticorpo Celular Sinalização	9101
Anti-fosfo-paxilina Y31 Anticorpo	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-fosfo-PLC&gama; Y783 Anticorpo	Celular Sinalização	14008
Anti-PLCγ	Sinalização de Células de Anticorpo	5690