É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina

1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

6 de setembro de 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o projeto, a criação e a aplicação de fosfatases reguladas por rapamicina. Este método fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas.

Resumo

As tirosina fosfatases são uma importante família de enzimas que regulam funções fisiológicas críticas. Eles são frequentemente desregulados em doenças humanas, tornando-os alvos importantes de estudos biológicos. Ferramentas que permitem a regulação da atividade da fosfatase são fundamentais na dissecação de sua função. As abordagens tradicionais, como a superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos ou dominantes, ou a regulação negativa usando siRNA, carecem de controle temporal. Os inibidores da fosfatase geralmente têm baixa especificidade e só permitem que os pesquisadores determinem quais processos são afetados pela inibição da fosfatase.

Desenvolvemos uma abordagem quimiogenética, o sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite a regulação alostérica de um domínio catalítico da fosfatase que permite um controle temporal rígido da ativação da fosfatase. O sistema RapR consiste em um domínio iFKBP inserido em um sítio alostérico na fosfatase. A dinâmica estrutural intrínseca do domínio RapR interrompe o domínio catalítico, levando à inativação da enzima. A adição de rapamicina medeia a formação de um complexo entre iFKBP e uma proteína FRB co-expressa, que estabiliza iFKBP e restaura a atividade do domínio catalítico da fosfatase.

Este sistema fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas. Os recursos exclusivos deste sistema permitem a identificação de eventos transitórios e a interrogação de vias de sinalização individuais a jusante de uma fosfatase. Este protocolo descreve diretrizes para o desenvolvimento de uma RapR-fosfatase, sua caracterização bioquímica e a análise de seus efeitos na sinalização a jusante e na regulação da morfodinâmica celular. Ele também fornece uma descrição detalhada de uma estratégia de engenharia de proteínas, ensaios in vitro que analisam a atividade da fosfatase e experimentos de imagem de células vivas que identificam alterações na morfologia celular.

Introdução

As proteínas tirosina fosfatases são uma família crítica de proteínas envolvidas em uma infinidade de eventos de sinalização celular. Eles demonstraram desempenhar um papel fundamental na regulação da proliferação, migração e apoptose celular 1,2,3. Consequentemente, a desregulação das proteínas tirosina fosfatases leva a uma variedade de doenças e distúrbios debilitantes 4,5,6,7. O estudo da função fisiológica das tirosina fosfatases e seu papel no desenvolvimento dessas patologias tem sido historicamente dificultado pela falta de ferramentas necessárias para investigar os meandros da sinalização da fosfatase8.

Tradicionalmente, as fosfatases são estudadas usando métodos que não possuem a especificidade desejada e/ou não fornecem controle temporal de sua atividade. Essas limitações críticas das ferramentas disponíveis tornam difícil dissecar papéis específicos das fosfatases nas vias de sinalização. A superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos e dominantes ou a regulação negativa da expressão da fosfatase fornecem especificidade, mas carecem de controle temporal e muitas vezes podem desencadear mecanismos compensatórios que mascararão a verdadeira função da enzima.

Os inibidores farmacológicos permitem a regulação temporal das fosfatases. No entanto, muitos inibidores da fosfatase são notoriamente inespecíficos devido à composição bem conservada do sítio ativo nas tirosina fosfatases9. Além disso, devido a restrições de projeto, os inibidores direcionados ao sítio catalítico exibem baixa permeabilidade à membrana celular10. Outra limitação dos inibidores é que eles permitem apenas o exame dos efeitos da inativação da fosfatase11. Assim, há necessidade de ferramentas que permitam a ativação específica e temporalmente regulável de fosfatases. Essas ferramentas permitirão aos pesquisadores identificar os efeitos diretos da ativação da fosfatase, separando-os de múltiplas cascatas de sinalização paralela frequentemente ativadas por estímulos biológicos. É importante ressaltar que o controle temporal rígido da atividade permite a identificação de eventos transitórios induzidos por uma fosfatase e separa os efeitos da atividade aguda e prolongada da fosfatase. A combinação de regulação temporal com análise mutacional permitirá uma dissecação detalhada de papéis específicos de domínios individuais da fosfatase e interrogação de sua sinalização a jusante12.

Para resolver a falta de recursos desejados nas ferramentas existentes, o grupo Karginov desenvolveu o sistema Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. O sistema RapR utiliza um domínio de comutação projetado, iFKBP, que permite a regulação alostérica da proteína de interesse (POI). A inserção do domínio iFKBP em uma posição alostericamente acoplada ao sítio catalítico do POI o torna suscetível à regulação pela rapamicina. Na ausência de rapamicina, o iFKBP interrompe o sítio catalítico devido à dinâmica estrutural intrinsecamente alta do iFKBP e, portanto, inativa o POI. A adição de rapamicina induz a interação de iFKBP com a proteína co-expressa FRB (Figura 1). Isso causa estabilização do domínio do switch, o que consequentemente restaura a estrutura e a função do domínio catalítico do POI. Como tal, a ferramenta permite a ativação específica e temporalmente regulável do POI.

figure-introduction-1
Figura 1: Esquema do sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. O RapR permite a ativação alostérica da proteína de interesse com a adição de rapamicina. Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 inserível; FRB = domínio de ligação FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Src homologia-2 proteína tirosina fosfatase contendo domínio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A ferramenta RapR pode ser aplicada a diferentes famílias de proteínas. Pode ser usado para regular proteínas quinases, bem como fosfatases12,14. Este protocolo se concentrará na aplicação da ferramenta RapR para controlar a fosfatase Shp2. Shp2 é uma proteína tirosina fosfatase onipresente que está envolvida em processos de sinalização como proliferação, migração, imunomodulação e diferenciação 1,16,17,18. A desregulação do Shp2 tem sido associada a vários cânceres sólidos, leucemia mieloide e distúrbios do desenvolvimento 5,7. No entanto, o Shp2 foi vítima das mesmas deficiências de ferramenta descritas acima. Para combater essas limitações, o RapR-Shp2, um construto Shp2 específica e temporalmente regulável, foi desenvolvido e caracterizado12.

Antes do desenvolvimento de RapR-Shp2, sabia-se que Shp2 estava envolvido na migração celular 19,20,21. No entanto, seu papel específico na sinalização envolvida nesse processo era desconhecido. Também não se sabia em que escala de tempo o Shp2 regula a migração das células e quais mudanças morfodinâmicas específicas ele induz em diferentes momentos de sua ativação. Além disso, não ficou claro se a ativação aguda e prolongada de Shp2 causará efeitos diferentes. Usando RapR-Shp2, verificou-se que a ativação aguda de Shp2 induz disseminação celular transitória, aumento de saliências, polarização celular e migração. Vias específicas a jusante de Shp2 que regulam mudanças morfodinâmicas distintas também foram identificadas12. Este protocolo fornece detalhes para o projeto e caracterização de RapR-Shp2, que pode ser usado para orientar o desenvolvimento e aplicação de outras fosfatases RapR.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Desenho de RapR-fosfatases

  1. Planeamento
    NOTA: Usando RapR-Shp2 como exemplo, este protocolo detalha as etapas importantes para a criação de uma tirosina fosfatase regulada por rapamicina. O protocolo descrito é otimizado para Shp2 e modificações adicionais podem ser necessárias para se adequar a propriedades específicas de fosfatases individuais.
    1. Para garantir que a atividade catalítica de Shp2 seja puramente controlada pela rapamicina e não por mecanismos endógenos, introduza uma mutação na fosfatase para mantê-la em uma conformação constitutivamente ativa. No caso de Shp2, introduza a mutação D61A.
      NOTA: Se uma mutação ativadora não for introduzida para uma PTPase específica, sua variante RapR funcionará como um sistema controlado por AND regulado por sinais endógenos e rapamicina.
    2. Identifique os locais de inserção do iFKBP no domínio catalítico da fosfatase usando a estrutura cristalina para guiar a seleção conforme descrito anteriormente13. Se uma estrutura não estiver disponível, execute o alinhamento da sequência de aminoácidos com o domínio catalítico da fosfatase Shp2 para identificar os locais de inserção (Figura 2A). Certifique-se de que o local de inserção esteja localizado em um loop flexível que esteja estruturalmente acoplado ao bolso catalítico, mas posicionado longe do bolso para evitar o impedimento estérico da ligação do substrato pelo iFKBP.
      NOTA: Mais detalhes da inserção são discutidos na Discussão.
    3. Considere o tipo de sequência de ligante a ser usada entre o domínio iFKBP inserido e a fosfatase de interesse. A escolha da sequência ideal do vinculante é extremamente importante para o sucesso da ferramenta RapR e é discutida mais adiante na Discussão (Figura 2B).

figure-protocol-1
Figura 2: Esquema de considerações ao projetar RapR-fosfatase. (A) Alinhamento de Shp2 (roxo), PTP1B (verde) e PTP-PEST (rosa) com os locais de inserção conservados destacados. (B) Representação da inserção do ligante entre Shp2 e iFKBP. (C) Domínio fosfatase de Shp2 em bege com locais de inserção indicados em azul. Essa figura foi modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: Shp2 = Src homologia-2 proteína tirosina fosfatase contendo domínio; iFKBP = FKBP12 inserível; PTP = proteína tirosina fosfatase; RapR = regulado por rapamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Criação da RapR-fosfatase

  1. Inserção de iFKBP na fosfatase de interesse usando mutagênese sítio-dirigida modificada
    1. Gere um "megaprimer" de codificação iFKBP via PCR.
      1. Projete primers para síntese de "megaprimer" que contenham 20-25 nucleotídeos recozimento na extremidade 5 'ou 3' do iFKPB, uma sequência de ligação que conectará o iFKPB à fosfatase de interesse e 28-32 nucleotídeos correspondentes ao local de inserção (Figura 3). Confirmar se o produto resultante contém o iFKPB ladeado por fragmentos de recozimento antes e depois do local de inserção na fosfatase em causa.
      2. Sintetize o iFKBP contendo "megaprimer" via PCR (10 μL de tampão polimerase 5x, 1 μL de DNA molde 50 ng/μL contendo iFKBP, 2 μL de 10 mM dNTP, 0,5 μL de um estoque de 100 μM de cada primer "megaprimer" [direto e reverso], 35 μL de água, 1 μL de DNA polimerase). Divida esta reação de PCR em 2 reações separadas de 25 μL antes de executar a PCR. Execute o ciclo de PCR de acordo com as recomendações do fabricante da DNA polimerase ou o seguinte ciclo de PCR padrão: (i) 98 °C por 2 min, (ii) 98 °C por 30 s, (iii) 55-70 °C por 30 s, (iv) 72 °C por 30 s, (v) repita as etapas ii-iv 25x, (vi) 72 °C por 2 min.
      3. Purifique o "megaprimer" usando eletroforese em gel de agarose. Carregue o conteúdo de PCR da etapa anterior em um gel de agarose a 1% e aplique 120 V por aproximadamente 30 min. Procure o "megaprimer" de 400 nucleotídeos no gel, excise o fragmento e purifique usando um kit de extração de gel (consulte a Tabela de Materiais).
        NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
    2. Mutagênese dirigida ao local modificada
      1. Preparar a reacção de mutagénese dirigida ao local modificada utilizando um plasmídeo contendo o gene da fosfatase de interesse como molde (5 μL de tampão polimerase 5x, 2 μL de molde 50 ng/μL, 2 μL de 10 mM dNTP, 10 μL de "megaprimer" extraído, 2,5 μL de água, 2,5 μL de DMSO, 1 μL de ADN polimerase).
        NOTA: A adição de DMSO na mistura de reação reduz a temperatura de recozimento22.
      2. Execute o seguinte ciclo de PCR: etapa inicial de desnaturação a 98 °C por 3 min, seguida por 18 ciclos de etapas consecutivas de incubação a 98 °C por 30 s, 65 °C por 20 s, 60 °C por 20 s, 55 °C por 20 s, 50 °C por 20 s, 72 °C por 18 min. Execute o ciclo durante a noite (o tempo de ciclo é de 7 h). Quando o ciclo estiver concluído, armazene a reação de PCR a 4 °C.
        NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
      3. Após a conclusão do ciclo, adicionar 1 μL de enzima DpnI e incubar a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: DpnI irá digerir o modelo residual, aumentando o rendimento do produto recém-sintetizado.
      4. Transforme o produto digerido em DH5α células competentes seguindo as instruções do fabricante. Plaquear a transformação em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado para seleção (carbenicilina para a construção pcDNA RapR-Shp2). Incubar a 37 °C durante a noite. Depois que as colônias crescerem, armazene as placas LB a 4 ° C por até 1 mês.
        NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  2. Isolamento da construção de DNA desejada contendo RapR-fosfatase
    1. Realize uma triagem de PCR de colônias bacterianas23. Como nem todas as colônias cultivadas em uma placa LB conterão o plasmídeo desejado, certifique-se de fazer a triagem antes do isolamento do DNA do plasmídeo.
      NOTA: Use primers para a tela que irá recozer para o modelo e no gene iFKBP. A triagem pode ser feita usando o mastermix da polimerase Taq (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Assim que as colônias positivas forem identificadas, inocule uma colônia positiva em 3 mL de caldo LB, incluindo o antibiótico adequado, incube e agite a 37 ° C durante a noite.
    3. Extrair o ADN do plasmídeo da cultura líquida seguindo as instruções do fabricante para o kit de extracção do ADN do plasmídeo (ver Tabela de Materiais)
      NOTA: Recomenda-se sequenciar a construção RapR PTPase recém-criada antes de continuar a avaliação in vitro .

figure-protocol-2
Figura 3: Esquema do design do primer e a estratégia de clonagem de mutagênese dirigida ao local modificada .A etapa 1 é a síntese do iFKBP contendo "megaprimer" com "extremidades pegajosas" recozimento no local de inserção da fosfatase de interesse, e a etapa 2 é a inserção do "megaprimer" na fosfatase de interesse. Essa figura foi modificada a partir de Karginov et al.13. Abreviatura: iFKBP = FKBP12 inserível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Avaliação da RapR-PTPase por ensaio de atividade in vitro

NOTA: Este protocolo é usado para avaliar a regulação da atividade da RapR-PTPase projetada. Abaixo é descrita a análise de Shp2 imunoprecipitado usando um fragmento N-terminal fosforilado de paxilina como substrato. Um substrato diferente pode precisar ser selecionado para uma PTPase específica de interesse.

  1. Dia 1
    1. Placa de 800.000 HEK293T células/poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio DMEM suplementado com suplemento de L-glutamina (concentração final de 2 mM) e 10% de FBS em volume. Colocar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
  2. Dia 2
    1. Uma vez que as células estejam ~ 60-80% confluentes, transfecte-as de acordo com o protocolo do fabricante do regente de transfecção preferido (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Exemplo de um protocolo de transfecção: Adicione 1 μg de DNA de plasmídeo (pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-flag-RapR-Shp2, cada) a 200 μL de DMEM sem soro e 6 μL de reagente de transfecção e incube a mistura em temperatura ambiente por 15 min. Adicione 100 μL de mistura de transfecção por poço de células. Inclua amostras transfectadas com construções Shp2 negativas constitutivamente ativas e dominantes como controles. Incubar durante a noite em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 .
  3. Dia 3
    1. Preparação de Sepharose Proteína-G
      NOTA: Prepare as pontas da pipeta cortadas antes de manusear a Sepharose. As pontas cortadas devem ser usadas em todas as etapas em que a Sepharose é manuseada. A sepharose precisa ser completamente ressuspensa em todas as etapas antes da pipetagem.
      1. Ressuspenda e leve a quantidade apropriada de Proteína-G Sepharose para um tubo de 1,5 mL. Para cada poço em uma placa de 6 poços, use 10 μL de Proteína-G Sepharose. Para uma placa completa de 6 poços, use 60 μL de Sepharose.
      2. Lave a Sepharose com 1 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais). Microcentrífuga por 1 min a 2.000 × g e remova cuidadosamente o tampão de lise. Repita 2x.
      3. Ressuspenda a Sepharose em 380 μL de tampão de lise. Adicione BSA a uma concentração final de 1 mg / mL e anticorpo (0,5 μL para cada amostra IP, anticorpo anti-Flag [ver Tabela de Materiais]). Inverter em um rotador a 4 °C por 1,5 h.
        NOTA: A quantidade ideal de anticorpos deve ser determinada experimentalmente para cada anticorpo utilizado.
    2. Prepare as células para a imunoprecipitação.
      1. Adicionar uma quantidade adequada de rapamicina (solução-mãe 1 mM em etanol) a uma concentração final de 1 μM ou adicionar o mesmo volume de etanol (controlo negativo) às amostras. Incubar durante 1 h numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 .
      2. Coloque a placa de 6 poços com células no gelo e lave suavemente as células com 3 mL de PBS frio. Aspirar o PBS e adicionar 300 μL de tampão de lise (com 1 μM de rapamicina para a amostra de fosfatase ativada ou um volume equivalente de etanol na amostra de controlo negativo) e raspar com um raspador de células. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mL e microcentrífuga por 10 min a 1.000 × g a 4 °C.
      3. Transfira 20 μL do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL para verificar os níveis de expressão. Adicione 20 μL de tampão Laemmli 2x com 5% de β-mercaptoetanol a cada tubo a ser usado para verificar a expressão e incubar a 95–100 °C por 5 min. Utilizar o sobrenadante restante para a imunoprecipitação no passo 3.3.3.3.
    3. Imunoprecipitação de RapR-Shp2
      1. Lave a Proteína-G Sepharose da etapa 3.3.1.3. com 1 mL de tampão de lise. Microcentrífuga por 1 min a 2.000 × g a 4 °C de cada vez e aspire cuidadosamente o tampão de lise. Repita esta etapa 2x.
      2. Usando pontas cortadas, ressuspenda a Sepharose em tampão de lise (50 μL por amostra, portanto, para uma placa de 6 poços, ressuspenda em 300 μL de tampão de lise). Pipete 50 μL da mistura de Sepharose suspensa em um novo tubo separado de 1,5 mL para cada amostra.
        NOTA: Haverá Sepharose ressuspensa na solução tampão de lise que sobrou devido ao volume da Sepharose.
      3. Adicionar o sobrenadante restante das células preparadas do passo 3.3.2.3 em cada tubo de Sepharose. Gire a 4 °C por 1,5–2 h.
    4. Ensaio de atividade da fosfatase
      NOTA: O substrato Shp2 deve ser preparado fosforilando fragmento N-terminal purificado de paxilina usando quinase Src constitutivamente ativa seguindo o protocolo de reação de quinase descrito anteriormente12.
      1. No final do passo 3.3.3.3, preparar a solução de fosfo-paxilina. Por amostra, adicione solução de fosfo-paxilina (concentração final de 3 μg / mL) a 40 μL de tampão imidazol total (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar rapamicina à concentração final de 1 μM à alíquota da solução de fosfo-paxilina para as amostras de RapR-Shp2 ativadas e um volume equivalente de etanol à solução para as amostras não ativadas.
      2. Ajuste o agitador de aquecimento para 32 °C.
        NOTA: Outras fosfatases podem precisar de uma temperatura diferente para uma atividade ideal.
      3. Lave Sepharose com amostras da etapa 3.3.3.3 2x com 0,5 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais). Lave as amostras 2x com 0,5 mL de tampão de lavagem. Cada tampão deve ter rapamicina a 1 μM para amostras ativadas ou um volume equivalente de etanol para amostras não ativadas. Remova o máximo de tampão possível após a lavagem final.
        NOTA: Uma vez alcançada esta etapa, pode ser útil usar uma pipeta para remover as quantidades finais de tampão lenta e cuidadosamente para garantir que nenhuma Sepharose seja aspirada. Qualquer tampão restante influenciará a concentração de fosfo-paxilina e levará a uma leitura imprecisa.
      4. Adicione 40 μL da mistura preparada de tampão fosfo-paxilina imidazol a cada amostra, com ou sem rapamicina (dependente da amostra). Agite muito suavemente para misturar e coloque imediatamente no agitador de aquecimento e incube por 40 min a 32 °C. Ajuste o agitador de aquecimento para um mínimo de 1,000 rpm para garantir que a amostra esteja totalmente agitada durante a incubação.
      5. Pare a reação adicionando 40 μL de 2x Laemmli Buffer a cada amostra. Incubar as amostras a 95–100 °C durante 5 min. Resfrie as amostras.
      6. Carregue 15 μL de cada amostra (incluindo as amostras de lisado da etapa 3.3.2.3.) em um gel de poliacrilamida SDS com gradiente de 4 a 15% e execute um protocolo padrão de western blot usando membranas de PVDF.
      7. Blot usando um anticorpo anti-Flag para detectar a construção RapR-Shp2, anti-mCherry para detectar mCherry-FRB e paxilina anti-pY118 ou anti-pY31 para detectar a fosforilação da paxilina.
        NOTA: As manchas ocidentais resultantes devem ser semelhantes às da Figura 4.

4. Análise da atividade de RapR-Shp2 em células vivas

NOTA: Este protocolo é usado para determinar a capacidade do RapR-Shp2 de desfosforilar substratos endógenos e induzir a sinalização a jusante. Outras RapR-PTPases exigirão análise de seus substratos e vias específicas.

  1. Dia 1
    1. Placa de 198.000 células A431/poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina (concentração final de 2 mM). Colocar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
  2. Dia 2
    1. Infecte células com construções adenovirais que expressam RapR-Shp2 e FRB adicionando o adenovírus diretamente ao meio já existente no prato. Deixe o adenovírus nas células em uma incubadora de 37 °C e CO2 a 5% durante a noite. Use células infectadas com FRB apenas como controle negativo.
      NOTA: As quantidades de adenovírus precisarão ser determinadas caso a caso, dependendo do título.
  3. Dia 3
    1. Privar as células A431 incubando em DMEM com 0,5% de FBS por 4 h antes do experimento.
    2. Adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μM ou o mesmo volume de etanol (controle negativo) às células por 2 a 4 h.
      NOTA: A incubação pode ser diferente para outras fosfatases.
    3. Coloque a placa de 6 poços com células no gelo e lave suavemente as células com 3 mL de PBS frio. Aspire o PBS, adicione 300 μL de tampão de lise (consulte a Tabela de Materiais) e raspe vigorosamente com um raspador de células. Transfira as amostras para tubos de 1,5 mL e microcentrífuga por 5 min a 2.000 × g a 4 °C.
    4. Transfira 250 μL de cada amostra para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 250 μL de tampão Laemmli 2x com β-mercaptoetanol a 5% e incube a 95–100 °C por 5 min.
    5. Carregue 25 μL de cada amostra em um gel SDS-PAGE com gradiente de 4 a 15% e execute um protocolo padrão de western blot usando membranas de PVDF.
    6. Avalie a desfosforilação mediada por RapR-Shp2 de EGFR e PLCγ usando anticorpos anti-pY992 EGFR e anti-pY783 PLCγ. Avalie a ativação a jusante da MAP quinase Erk1/2 avaliando sua fosforilação nos resíduos pT202/pY204.
      NOTA: As manchas ocidentais resultantes devem ser semelhantes às da Figura 5.

5. Análise de alterações morfodinâmicas induzidas pela ativação de RapR-Shp2 em células HeLa usando imagens de células vivas

NOTA: Este protocolo é usado para determinar o efeito da ativação de RapR-Shp2 na formação de saliências celulares, espalhamento celular e migração.

  1. Dia 1
    1. Colocar 700.000 células HeLa em uma placa de cultura de células de 35 mm e colocá-las em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO2 . Deixe as células aderirem ao prato (~ 2–3 h).
    2. Transfectar as células de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção preferido (ver Tabela de Materiais).
      1. Exemplo de protocolo de transfecção: Adicione 0,5 μg de DNA (plasmídeos pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-Venus-RapR-Shp2, cada) a 100 μL de DMEM livre de soro e 6 μL de reagente de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Adicione a mistura de transfecção às células e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO2 . Use células transfectadas com pcDNA-mCherry-FRB apenas como controle negativo.
    3. Cubra uma lamínula de vidro redonda de 25 mm # 1,5 com fibronectina (5 mg / L) incubando por 1 h a 37 ° C.
  2. Dia 2
    1. Lave a lamínula de vidro revestida com PBS.
    2. Coloque as células HeLa transfectadas na lamínula de vidro revestida em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina (concentração final de 2 mM) para atingir 30% de confluência 4 h antes da imagem.
    3. Duas horas após o revestimento, troque suavemente o meio na placa por um meio Leibovitz L-15 pré-aquecido sem soro por 2 h.
    4. Manchar as células com a coloração da membrana plasmática CellMask Deep Red de acordo com o protocolo do fabricante.
    5. Coloque a lamínula em uma câmara de célula de imagem limpa (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 1 mL de meio L-15 pré-aquecido e cubra com 1 mL de óleo mineral pré-aquecido para evitar a evaporação. Manter a câmara a 37 °C até à obtenção de imagens.
    6. Faça a imagem das células a 37 °C usando um estágio aquecido.
      1. Selecione os canais adequados para imagens da construção RapR e CellMask para imagens de epifluorescência. Para seguir este protocolo, use a objetiva 40x referenciada (consulte a Tabela de Materiais) e os seguintes conjuntos de filtros: filtros de excitação 514/10 e emissão 540/21 para imagens Venus-RapR-Shp2, filtros de excitação 561/10 e emissão 595/40 para imagens mCherry-FRB e filtros de excitação 640/20 e emissão 655LP para imagens CellMask Deep Red. Use um espelho policrônico multibanda para todos os canais fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais).
      2. Capture imagens a cada 2 minutos por 4 a 4,5 h.
        NOTA: Mudanças morfodinâmicas mais rápidas exigirão aquisições mais frequentes.
      3. Após 1 hora de imagem, adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μM para estimular RapR-Shp2.

6. Análise de imagem

NOTA: Este protocolo descreverá a criação de máscaras de células com base em . Arquivos de pilha TIF coletados de experimentos de imagem ao vivo. Em seguida, ele descreverá como criar uma macro no ImageJ para analisar as máscaras, o que resultará em uma planilha da área da célula que é analisada em busca de alterações ao longo do tempo. Por fim, a atividade protrusiva e retrativa celular será analisada usando Metamorph.

  1. Gere uma máscara binária de imagens CellMask usando a função MovThresh do pacote de softwareCellGeo 24.
  2. Copie a pasta MovThresh para a pasta de análise de imagem.
  3. Copie a CellMask ou outras imagens de canal de marcador de membrana para a pasta MovThresh .
    1. Se várias células foram criadas em uma única posição, corte as imagens para gerar arquivos contendo apenas uma única célula antes de criar a máscara no MatLab.
  4. Certifique-se de que o diretório esteja definido corretamente para a pasta MovThresh no MatLab.
  5. Execute o MovThresh.
  6. Importe pilhas de imagens uma de cada vez.
  7. Selecione Curva suavizada e execute Relimitar.
  8. Salve como Mask_Image Número em uma nova pasta chamada Máscaras.
  9. Depois que todas as pilhas de imagens forem convertidas em máscaras, abra as pilhas de imagens no software ImageJ25.
    1. Análise de área celular no ImageJ
      1. Abra todas as pilhas de imagens de máscara no ImageJ.
      2. Ajuste as medidas definidas para a área.
      3. Clique em Plugins | Macros | Registro.
      4. Clique em Processar | Binário | Tornar binário.
        1. Selecione a opção padrão .
          NOTA: Não clique em nada extra durante a gravação da macro. Se forem incluídas etapas adicionais, é recomendável reiniciar a partir da etapa 6.9.1.3.
      5. Clique em Analisar | Analisar partículas.
        1. Desmarque todas as caixas, exceto Resumo.
      6. Conclua a gravação e clique em Criar a Macro.
      7. Clique em Executar para cada pilha de imagens depois de selecioná-la e salve a tabela de resultados para cada pilha de imagens. A opção padrão será salva como um arquivo csv.
      8. Salve a macro e reutilize para análises futuras (opcional).
    2. Processamento de dados da área em uma planilha
      1. Para cada célula analisada, calcule a média da área da célula a partir de imagens tiradas antes da ativação com rapamicina.
      2. Divida todos os valores de área pela área média da célula que precede a adição de rapamicina.
      3. Calcule o valor médio de cada ponto de tempo para todas as células com imagem e determine os intervalos de confiança de 90%. Plote os dados.
    3. Análise da atividade protrusiva celular
      1. Copie a pasta ProActive para a pasta de análise de imagem.
      2. Copie as pilhas de imagens mascaradas do MovThresh para a pasta ProActive recém-criada.
      3. Abra o MatLab e defina o diretório para a pasta Proactive.
      4. Execute o ProActive.
      5. Importe os arquivos de pilha de imagens de células mascaradas para a GUI ProActive.
      6. Defina o tipo de atividade. A análise de atividade protrusiva gerará dados de área ganha ; a análise da atividade retrativa gerará dados de área perdida ; e a atividade total gerará dados gerais de mudança de área (perdidos e ganhos).
      7. Defina a área para Definir normalização.
      8. Curva suave usando os valores de limite sugeridos ou usando a média para relimitar cada ponto de tempo. Isso calcula a média dos limites em uma janela específica, minimizando inconsistências no limite entre os pontos de tempo.
      9. Clique em Arquivo | Salvar como | Resultados (.mat)
        1. Se estiver processando todos os três tipos de atividade de área, nomeie os arquivos de dados processados da seguinte maneira: ProResultData #, RetResultData # ou ResultData #.
          NOTA: Inclua o espaço antes do número e numere os dados começando em 1.
      10. Repita a partir da etapa 6.9.3.6. para todas as pilhas de imagens mascaradas importadas.
      11. Depois que todas as células forem processadas, feche a GUI do ProActive.
      12. Abra DataToFileTotalArea no editor Matlab para processar arquivos "ResultData" de atividade total.
      13. Altere o número de células para corresponder a quantos arquivos de resultados foram gerados. Se 7 células foram processadas nas etapas 6.9.3.5 a 6.9.3.10, certifique-se de que as três primeiras linhas do script sejam as seguintes:
        filename='Dados do Resultado ';
        células = 1:7;
        lag = 1;
      14. Clique em Executar e repita isso para DataToFileProtArea e DataToFileRetArea para processar dados protrusivos e retráteis, respectivamente. Esta análise produzirá três arquivos de texto "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" e "AllCellsRet.txt"
      15. Abra os arquivos .txt em uma planilha e normalize como na seção 6.9.2. Calcule o valor médio de cada ponto de tempo para todas as células com imagem e determine intervalos de confiança de 90%. Plote os dados.
        NOTA: Os gráficos resultantes das etapas acima devem ser semelhantes aos da Figura 6.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A Figura 4 demonstra os resultados que podem ser esperados do ensaio de atividade da fosfatase à base de paxilina. Neste experimento, a atividade da fosfatase Shp2 negativa constitutivamente ativa e dominante foi comparada com a do RapR-Shp2 ativo e inativo usando fosfo-paxilina como leitura. As construções Shp2 foram imunoprecipitadas e submetidas ao ensaio de atividade conforme descrito no protocolo. As leituras de fosfo-paxilina para Shp2 constitutivamente ativo e RapR-Shp2 ativo foram se...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este protocolo fornece etapas detalhadas para o desenvolvimento, caracterização e aplicação de fosfatases quimiogeneticamente controladas. A ferramenta RapR-Shp2 depende de um interruptor regulado por rapamicina inserido no domínio catalítico Shp2. A força desta ferramenta é a especificidade e o controle temporal rígido da atividade da fosfatase. A ferramenta é aplicável a outras fosfatases e, em combinação com a tecnologia RapR-TAP descrita anteriormente, permite a reconstrução de vias ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Dra. Jordan Fauser por sua contribuição para o desenvolvimento do RapR-Shp2 e protocolos associados. O trabalho foi apoiado por um prêmio 5R35GM145318 do NIGMS, um prêmio R33CA258012 do NCI e um prêmio P01HL151327 do NHLBI.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#1.5 Glass Coverwashs 25 mm RoundWarner Instruments64-0715
Tubos de 1.5 mLUSA Scientificcc7682-3394
2x Laemmli BufferPara 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL de glicerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g azul de bromofenol, pH final 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldadoBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 CellsATCCCRL-1555
AgarsoseGoldBiotechA-201
Attofluor CellChamber invitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µ m filtrado estéril
Brig 35,30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/APublicado em 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a competente célulasNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
DNA LadderGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI EnzimaNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Reagentes de Cleland
EGTAAcros409910250
Fibronectina de plasma bovinoSigmaF1141
FuGENE(R) 6 Reagente de transfecçãoPromegaE2692reagente de transfecção
Kit de extração de gelThermo ScientificK0692Kit de extração de gel GeneJET
Gel Verde Ácido Nucleico ManchaGoldBioG-740-500
Corante de carregamento de gel roxo 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T CélulasATCCCRL-11268
Células HeLaATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ Software de processamentoN/AN/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Tampão25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
Tampãode lise20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLABMathWorksN/AR atualização 2022b foi usada para executar as funções CellGeo
Microscopia Metamorfo Software de Automação e Análise de ImagemN/AN/A
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Óleo MineralSigmaM5310
MiniPrep KitGene Géis96-308
Mini-PROTEAN TGX 12 poçosBio-Rad4561085
Grau de Biologia Molecular ÁguaCorning46-000-CV
Espelho Polichroic MultibandChroma Technology89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objetivoOlympusN/A
PBS sem Ca e MgCorning21-031-CV
Tubos de PCRlabForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubos e Tampas, Tira Rígida Tampas de Cúpula Anexadas Individualmente
Phusion Plus DNA PolimeraseThermo ScientificF630S
PrimersIDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
Membranas de PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF / Sanduíches de papel de filtro
RapamicinaFisherAAJ62473MF
0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sódioCorning25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1para eletroforese
Tampão20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-MercaptoetanolFisher ChemicalO3446I-100
Anticorpos
Anti-EGFRSinalização celular2232
Anti-ERK 1/2 AnticorpoSinalização celular9102
Anti-bandeiraAnticorpo Millipore-SigmaF3165
Anti-GAPDH AnticorpoinvitrogenAM4300
Anti-GFP AnticorpoClontech632380
Anti-mCherry AnticorpoinvitrogenM11217
Anti-paxilina AnticorpoThermo FischerBDB612405
Anti-fosfo-EGFR Y992 AnticorpoSinalização celular2235
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204 Anticorpo Celular Sinalização9101
Anti-fosfo-paxilina Y31 AnticorpoMillipore-Sigma05-1143
Anti-fosfo-PLC&gama; Y783 AnticorpoCelular Sinalização14008
Anti-PLCγ Sinalização de Células de Anticorpo5690
Imidazol Pré-moldados Choice de lavagem

Referências

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Regulação pela RapamicinaFerramentas QuimiogenéticasAtivação de FosfataseRegulação AlostéricaFosfatase SHIP-2Células HEK-293TEnsaio de ImunoprecipitaçãoWestern BlotMorfodinâmica Celular
Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.