Artigo de método

Design e Desenvolvimento Guiados por Estrutura de Novos Inibidores da Ciclofilina A e Derivados do Ganoderiol-F: Uma Abordagem In-Silico

DOI:

10.3791/67145

⸱

23 de junho de 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenho guiado por estrutura da interação de ligação proteína-ligante entre Sangliferina A e Ciclofilina A/Ganoderiol-F, essencial para a descoberta de novos medicamentos. A estabilidade do complexo ligante-receptor foi avaliada por meio de simulação de dinâmica molecular.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O eixo ciclina Ds-CDKs (Ciclofilina A (Cyp /Ganoderiol F)) desempenha um papel crítico no câncer por meio de vários processos, como controlar a proliferação e inibir células cancerígenas. Derivados do ganoderiol F podem servir como alvos oncogênicos para múltiplos tipos de câncer. Este estudo demonstrou que o design e desenvolvimento guiados por estrutura de novos inibidores de Cyp A e derivados de Ganoderiol F podem ser empregados para selecionar posições calculadas para maior eficácia em inibidores químicos e sua interação com os receptores escolhidos. Para essa abordagem, diversas aplicações de software foram utilizadas para alcançar interações moleculares ótimas. No total, 117 novas moléculas de ligante inibidor da ciclofilina foram construídas usando o software Chemsketch. Os arquivos PDB convertidos dos novos ligantes inibidores do Cyp A foram preparados para introdução ao receptor enzimático Sanglifehrin A. Interações de acoplamento ligante-proteína foram realizadas usando o software AutoDock 4.2.6 para revelar as melhores interações geométricas. As confirmações de acoplamento foram realizadas usando o software PyMOL 2.5. Por fim, ligações de hidrogênio foram detectadas usando softwares Chimera e Maestro. O complexo acoplado ao receptor de ligante selecionado foi submetido à simulação de dinâmica molecular. O processo de simulação MD demonstrou a estabilidade do complexo e indicou que o ligante escolhido pode ser utilizado como inibidor de medicamentos para células cancerígenas. Nos resultados, os aminoácidos ativos no local de ligação foram identificados como Arginina 55 em movimento de 1,53Å, Asparagina (Asn), Glicina (Gly), Treonina (Thr), Lisina (Lys), Isoleucina (Iso), Histidina (Hid), Fenilalanina (Phe) e Cisteína (Cys), com o maior número de ligantes de ligantes de ligantes de ligantes de hidrogênio de 45 hidroximangiferônica. Isso se conectou com o receptor 1nmk na coordenada da grade X 38,86, Y de 10,987 e Z de 40,734. A avaliação do complexo receptor-ligante 1nmk na simulação de dinâmica molecular (MD) no campo de força CHARMM 36 da versão do Gromac possui graus ótimos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A ciclofilina A é um inibidor forte da Cyp A humana. A ciclofilina é um inibidor robusto que não prejudica o sistema imunológico, possui melhores qualidades farmacológicas e reduz a inibição do transportador. O prognóstico ruim tem sido associado à superexpressão de ciclofilinas, uma família de proteínas com atividade de isomerasepeptidil-prolina 1. Ciclofilinas foram relatadas como superexpressas em diversos tipos de câncer, incluindo carcinoma hepatocelular. No carcinoma hepatocelular (CCH), as ciclofilinas são cruciais tanto para a resistência quanto para a proliferação de medicamentoscontra o câncer 2. A inibição adquire informações essenciais para identificar novos imunossupressores baseados em derivados de quinoxalina por meio do uso de acoplamento molecular em nível atômico e simulação de MD para determinar o local preciso de ligação do DC838 ao CypA 3.

Além disso, pesquisas in vivo mostraram que a ciclofilina DC838 previne a proliferação de células do baço de camundongo induzida por concanavalina. Diversos estudos relataram uma série de inibidores macrocíclicos da ciclofilina sintetizados com base na Sangliferina A (SFA), uma substâncianatural 4. A otimização inicial do composto revelou que o grupo hidroxila do resíduo de tirosina m5, os estereocentros em C14 e C15, e o tripeptídeo de ácido valine5m5tirosina5piperazico no núcleo da Sangliferina eram fatores essenciais que influenciavam a potência docomposto 5. A unidade C185C21 dieno do SFA poderia ser substituída por um grupo estirilo para criar compostos potentes que mostram um modo de ligação inovador, no qual a metade estireno interage com a Arginina (Arg)556 do Cip A por meio de uma interação de empilhamento. Inibidores da ciclofilina não imunossupressores são eficazes no tratamento do vírus da hepatite C. CiclosporinaA1, alisporivir e a maioria das outras ciclosporinas são inibidores fortes de MRP2, MDR1, OATP1B1 e outros transportadores cruciaisde medicamentos 7,8.

Por outro lado, o Ganoderiol F purificado de Ganoderma leucocontextum retarda a progressão do ciclo celular ao inibir as ciclinas CDK4/CDK6 9, e as quinases dependentes de ciclina (CDKs) são fundamentais no controle do ciclo celular dos mamíferos. A ciclina D-CDK4/CDK6 e a ciclina E-CDK2 são os atores críticos no controle do Ganoderiol F na progressão do ciclo celular. Portanto, o Ganoderiol F pode ser usado como um possível inibidor do CDK4/CDK6 no tratamento do câncerde mama 10,11. A FA inibe a fase G1 do ciclo celular, o que impede o crescimento de macrófagos dependentes de M-CSF sem afetar a viabilidadecelular 12. O imunossupressor inibe a proliferação ao desativar a atividade do CDK2. No contexto do câncer, o papel da Ciclina D-CDK4/6, junto com outras Ciclinas e CDKs, está bem estabelecido. O câncer é caracterizado pela desregulação anormal da via ciclina-CDK. Especificamente, quando a célula está pronta para iniciar a síntese de DNA, CDK4 media a passagem pela fase G1 em conjunto com as ciclinas do tipo D. Esse processo está crucialmente ligado ao desenvolvimento e progressão do câncer9.

O sítio ativo do Cipete A é caracterizado pela arginina catalítica invariante (Arg55) e uma mistura altamente conservada de resíduos hidrofóbicos, aromáticos e polares, como Arg55, Glutamina (Gln), Glicina (Gly) e Treonina (Thr)1,13,14. O local ativo da família das ciclofilinas também é composto por Alanina (Ala) e Asparagina (Asn)1. Enquanto isso, o sítio ativo da SFA consiste nos aminoácidos Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala e Asn, que formam um bolsão hidrofóbico que envolve a metade de ácidos piperazina da SFA. Em contraste com o Cyp A não ligado, o linker entre a macrociclo e a bicicleta de spinning do SFA força o Trp121 a realinhar suas cadeiaslaterais 16.

1nmk é selecionado como um código PDB específico da Sanglifehrin A, conforme mencionado em estudosanteriores 17. A SFA, uma substância natural imunossupressora, foi descoberta pela primeira vez em Streptomyces sp. A92-3081 5,18. A SFA apresenta altas afinidades com o Cyp A e possui uma estrutura distinta em comparação com a CsA, empregando um método único para suprimir o sistema imunológico. A complexa estrutura molecular da SFA compreende um macrociclo de 22 membros com um cabo de nove carbonos na posição 23, terminando em uma metade espiro-bicíclica altamente substituída. Estudos in vitro com fibroblastos pulmonares humanos fibróticos e amostras de pacientes com fibrose pulmonar idiopática demonstraram que a SFA aumenta a produção de ciclofilina B e inibe a secreção de colágeno tipoI 19,20. No total, 20 sangliferinas diferentes foram usadas para isolar a SFA (C16). Sua afinidade por ciclofilinas é aproximadamente 60 vezes maior do que a dos outros membros do grupo SFA em um experimento de ligação competitiva semcélulas. Por exemplo, a SFA reduz significativamente a quantidade de IL-12p70 bioativa, a principal fonte de IL-12 liberada pelas células dendríticas, inibindo assim a atividade das células dendríticas. Este estudo sugere que a SFA é um novo medicamento imunossupressorpotente 1.

Neste protocolo, novas estruturas de ligantes para Ganoderiol F/Cyp A eram geradas usando métodos in silico com o software Chemsketch e depois convertidas em arquivos PDB usando software compatível. A concepção de ligação proteína-ligante é uma questão significativa no processo de descoberta e design defármacos 21,22. As interações ligante-receptor foram acopladas usando o software AutoDock 4.2.6. Sistemas de acoplamento computacional normalmente geram várias configurações potenciais de complexo proteína-ligante. Um ou alguns candidatos com menor ligação de energia ao receptor 1nmk podem ser selecionados para a próxima etapa do projeto do medicamento, garantindo ensaios eficazes de design in silico. O software Quimera foi utilizado para identificar o ligando ideal para ligação ao hidrogênio. Por fim, simulações de dinâmica molecular (MD) foram realizadas no complexo ligante-receptor para medir sua estabilidade. Esse método é descrito no protocolo abaixo.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Geração in silico de ligantes e preparações de ligantes no software ChemSketch

NOTA: Este software será usado para desenhar a estrutura de um ligante/molécula, ou seja, edição molecular.

  1. Desenhe o ligante/estrutura conforme indicado no processo de desenho seguido no software, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 1).
  2. Pressione f9 para limpar a estrutura após desenhar a estrutura completa.
  3. Clique em Arquivo e depois Salvar como. (Navegue até a pasta, por exemplo, a molécula 1 será salva na pasta 1, e assim por diante).
  4. Mude o tipo Salvar Como para mdl molfiles, depois clique em Salvar (não precisa especificar um nome de arquivo; use o nome padrão fornecido pelo software, por exemplo, noname).
    NOTA: Um arquivo será criado na pasta, e cada arquivo terá o formato mdl de um ligando de estrutura 2D.
  5. Repita os passos acima para todas as moléculas.

2. Conversão do formato de arquivo (Open Babel software)

NOTA: O software converte formatos de arquivo. Aqui, o arquivo .mol será convertido para o formato .pdb, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 2).

  1. No lado esquerdo, no formato de entrada, selecione mol--mdl mol format no menu suspenso. De forma semelhante, no lado direito, no formato de saída, selecione pdb--formato banco de dados de proteínas.
  2. No formato de entrada (do lado esquerdo), clique em ... (o botão de navegar).
  3. Navegue até a pasta (por exemplo, pasta 1), clique no arquivo Chemsketch que acabou de desenhar e abra-a .
  4. No formato de saída, clique em ....
  5. Uma janela padrão vai se abrir. Digite 1.pdb aqui para nomear o arquivo. Para a estrutura 1, digite 1.pdb e clique em Salvar. Repita essa etapa para molécula/estrutura 2, tipagem 2.pdb , e assim por diante.
  6. Por fim, no meio da interface do software, clique em Converter. Isso converterá as coordenadas do formato mol mdl para o formato PDB.
    NOTA: Agora, mais um arquivo será adicionado à pasta. Cada arquivo terá 1 arquivo pdb de ligando que será usado nas próximas etapas.
  7. Clique com o botão direito no arquivo recém-criado, selecione Abrir com e então escolha o Bloco de Notas.
  8. Repita os mesmos passos para todas as moléculas.
    NOTA: O AutoDock 4.2.6 aparecerá na área de trabalho após a instalação das ferramentas MGL 1.5.7.
  9. Prepare o arquivo de entrada 1nmk.pdb conforme descrito abaixo.
  10. No arquivo 1nmk.pdb, remova todos os ligantes externos visitando o site pdb.org e selecionando a estrutura 1nmk. Procure os ligantes sob o título de molécula pequena na estrutura 1nmk, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 3).
  11. Encontre o ligando chamado SFM, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 4), e abra o arquivo 1nmk. Baixe o arquivo PDB 1nmk no site do PDB. Localize o resíduo de terminação (TER.), conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 5).
  12. Exclua os resíduos dos ligantes externos (SFM) na estrutura 1nmk, começando pelo resíduo após o TER e terminando antes do resíduo listado antes do final. Salve o arquivo PDB 1nmk modificado no sistema.
    NOTA: O arquivo PDB 1nmk estará pronto, e a preparação do arquivo do sítio de coordenadas ativas do receptor está na Tabela 1.
  13. Abra o arquivo 1nmk e localize o Arg no aminoácido número 55.
  14. Encontre as coordenadas x, y e z, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 6).

3. Preparação dos parâmetros de acoplamento usando o software AutoDock 4.2.6.

  1. Abra o software de ferramentas AutoDock 4.2.6 a partir da área de trabalho.
  2. Selecione o AutoDock 4.2.6 4.0 para preparação do receptor 1nmk, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 7).
  3. Abra o menu Arquivo , selecione Ler Moléculas, navegue até a pasta, selecione 1nmk e pressione Abrir.
  4. Aperte Editar, escolha Hidrogênio e clique em Adicionar. Selecione apenas Polar e pressione OK. (Arquivo Suplementar 1, Captura de Tela 8).
  5. Pressione Editar, escolha Cobranças e então selecione Cobranças Kollman.
  6. Aperte Editar, escolha Átomos e então selecione Atribuir tipo de ad4 (escolha qualquer um deles).
  7. Abra o menu Arquivo , escolha Salvar e digite pdbqt. Uma janela vai se abrir. Navegue pela pasta 1, digite o nome do arquivo 1nmk.pdbqt e clique em Salvar.
  8. Selecione do Atom e então adicione conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 9). Marque as caixas para os nós de ordenação, salve coordenadas de transformação, escreva todos os registros e então clique em OK.
  9. Abra o ligante, selecione entrada e depois Abrir. Navegue até a pasta 1, mude o tipo de arquivo para todos os arquivos, selecione 1.pdb e clique em Abrir. Uma pequena janela aparecerá fornecendo informações sobre o ligando selecionado, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 10).
  10. Abra o ligante, depois a Árvore de Torção e então Detecte a Raiz, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 11).
  11. Abra o ligante, depois a saída, e então salve como pdbqt. Navegue até a pasta 1, digite o nome do arquivo 1. pdbqt e clique em Salvar, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 12).
    NOTA: Todos os arquivos de ligando pdbqt serão preparados.
  12. Abra a Grada, selecione Macromolécula, escolha 1nmk e depois selecione Molécula. Um aviso aparecerá; clique em OK, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 13). Navegue até a pasta 1, digite o nome do arquivo 1nmk.pdbqt, clique em Salvar e, quando uma janela de substituição se abrir, clique em Sim, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 14).
  13. Abra a Grade e então defina os tipos de mapa, escolha Ligando, clique em 1 e selecione Ligando, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 15).
  14. Prepare o arquivo de sítios coordenados ativos do receptor GPF conforme mostrado na Tabela 1.
    NOTA: O arquivo GPF representa o sítio coordenado ativo do receptor (Tabela 1).
  15. Clique em Grade, depois vá até a Grade Box, escolha Centro, escolha um átomo e insira a caixa de Grade Central (Arquivo Suplementar 1, Captura de Tela 16).
    1. Escolha Arquivo, depois Fechar, salvando as configurações atuais.
    2. Escolha Grade, depois Saída e salve como GPF. Vá para a pasta 1 e digite o nome do arquivo 1nmk.gpf.
    3. Escolha Docking > Macromolécula > defina o nome do arquivo rígido, navegue até a pasta 1 e clique em 1nmk.pdbqt, depois Abrir, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 17).
    4. Escolha Docking, encontre 1 e selecione ligando (Arquivo Suplementar 1, Captura de Tela 18). Uma janela com parâmetros padrão será aberta. Aceite os parâmetros padrão, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 19).
    5. Depois, escolha Docking, vá em Parâmetros de Busca, selecione Algoritmo Genético, que abre uma janela com parâmetros padrão, e então escolha Aceitar, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 20).
    6. Escolha Docking, depois Output, Lamarckian GA, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 21).
    7. Vá até a pasta 1, digite o nome do arquivo " 1nmk.dpf" e clique em Salvar, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 22).
      NOTA: Feche a janela do software do AutoDock 4.2.6, reabra e repita o processo para a próxima molécula. Além disso, o 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf e 1nmk.dpf estarão prontos para a etapa do processo de acoplamento.

4. Cygwin-I (Processo de acoplamento)

NOTA: Para criar arquivos GLG e DLG , execute o algoritmo. O algoritmo (AutoGrid) roda neste terminal Cygwin. No Cygwin, navegue até a pasta. Por exemplo, se a pasta 1 estiver localizada no drive C, ela deve conter uma pasta chamada "project", seguida por outra pasta chamada "molecules" e, em seguida, todas as pastas dentro dela. Siga estes passos.

  1. Abra o terminal Cygwin .
  2. Digite cd c:/ e pressione Enter. Depois digite CD project e pressione Enter.
  3. Digite moléculas cd e pressione Enter, depois digite cd 1 e pressione Enter. Agora a pasta 1 está no terminal Cygwin.
  4. Digite ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & e pressione Enter, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 23).
    NOTA: Em "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &", -l é um l menor menos.
  5. Digite cauda -f 1nmk.glg e pressione Enter, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 4).
  6. Se o AutoGrid for concluído com sucesso, feche essa janela do Cygwin, abra uma nova janela do Cygwin e repita o processo acima para a molécula 2.
  7. Repita essa etapa para todas as moléculas e execute o algoritmo (AutoDock 4.2.6).
    NOTA: Para o AutoDock 4.2.6, repita o processo de navegação até a pasta e, quando a pasta for acessada, digite e pressione Enter para o AutoDock 4.2.6.
  8. Digite ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & e pressione Enter, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 24).
    NOTA: No passo acima, "-l" é uma letra minúscula "L" com sinal negativo.
  9. Tipo cauda -f 1nmk.dlg
    NOTA: Se o AutoDock 4.2.6 estiver completo, feche a janela do Cygwin e repita o processo para a molécula 2.
  10. Siga este procedimento de Cygwin para todas as moléculas.
  11. Depois de criar arquivos DLG para moléculas, vá para a pasta 1 e abra o arquivo DLG no WordPad. Pressione Ctrl + F, digite e pressione Enter três vezes para alcançar a tabela RMSD, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 25).
  12. Abra uma janela do Microsoft Excel ou anote a página abaixo e crie três colunas: Não., Min. Binding Energy, e Run.
  13. Anote os dados de acordo com a tabela RMSD no arquivo de log. A energia de ligação está no topo da mesa, junto com a sequência em que foi observada. Faça isso com todas as moléculas.
    NOTA: A molécula com menor energia de ligação é considerada melhor que as outras.
  14. Crie outra planilha listando os detalhes (número de série, energia mínima de ligação e corrida) das 20 principais moléculas.
    NOTA: O procedimento a seguir será realizado apenas para as 20 moléculas principais.

5. Cygwin-ii

  1. Abra o terminal Cygwin, digite cd c:/ e pressione Enter.
  2. Digite CD projetar e pressione Enter, digite moléculas cd e pressione Enter.
  3. Digite cd (número da pasta da molécula superior selecionada) e pressione Enter.
    NOTA: O número deve corresponder à pasta no terminal Cygwin.
  4. Digite grep '^docked' 1nmk.dlg |corte -c9- > 1nmk_run.pdbqt e pressione Enter. Diferente do AutoGrid e do AutoDock, nenhuma mensagem de conclusão bem-sucedida aparecerá para isso e pressione Enter, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 26).
  5. Pressione Enter, e o arquivo será criado.
  6. Digite corte -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb e pressione Enter. O arquivo será criado, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 27).
  7. Feche a janela do Cygwin.
    NOTA: Para visualizar a interação de ligantes e receptores após o acoplamento usando o software PyMOL 2.5
    1. Abra o software PyMOL 2.5, depois abra o arquivo e selecione receptor.
    2. Abra o arquivo, então selecione a configuração de ligando escolhida, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 28).
    3. No PyMOL 2.5, selecione Ocultar Molécula e Ocultar Receptor. No menu Receptor , selecione Mostrar Superfície, como mostrado na Figura 1A.
      NOTA: Para visualizar a ligação de hidrogênio no complexo receptor ligante-1nmk, o software UCSF Chimera será usado em 20 ligantes com menor energia de ligação.

6. Software da UCSF Chimera para visualização de ligação H-link e análise de resultados

  1. Abra o UCSF Chimera, depois selecione Arquivo, depois Abrir, e navegue até a unidade c:/, depois Projeto, Moléculas), selecione 1nmk.pdb e abra.
  2. Selecione a unidade onde as moléculas estão localizadas e então abra a proteína no programa UCSF.
  3. Selecione Residue, depois escolha UNL Zoom.
  4. Selecione Zona, depois pressione OK, depois selecione Ação, depois escolha Rótulo, selecione Resíduos e escolha Nome + Especificador.
  5. Selecione Ferramentas, depois escolha Análise de Estrutura, e então escolha Encontrar H-Bond, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 29).
  6. Abra a janela padrão e marque as caixas para ligações H coloridas que não atendam a critérios precisos, e encontre apenas as ligações H selecionadas.
  7. Selecione Selecionar Limpar para iniciar uma nova pesquisa, depois Dê zoom e procure pelas linhas de cor azul/laranja , que representam as ligações H, como mostrado na Figura 3.
  8. Verifique quantos títulos devem ser contados.
    NOTA: O zoom deve mostrar as interações das ligações H com Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, Isoleucina 15623, Histidina 5424, Fenilalanina (Phe)53, Cisteína (Cys)52, Gly72, Asn71 e Hid70, e indicar se elas estão dentro do sítio ativo da proteína, conforme mostrado na Figura 3A - D.
  9. Note o número de ligações H e o número de moléculas.
  10. Coloque o mouse sobre a linha que mostra a ligação H, indicando interações com Arg55 e Metionina, Gln, Gly e Thr.
  11. Pressione a tecla Imprimir Tela .
  12. Abra a aplicação Paint, cole a Figura Suplementar e salve-a na pasta nomeada.
    NOTA: Para mostrar claramente as ligações H e os aminoácidos do local ativo, a estrutura 2D dos ligantes e receptores escolhidos deve ser a seguinte:

7. Preparação do diagrama de interação de ligantes para confirmação de acoplamento e mostrar a ligação H

  1. Abra o software AutoDock 4.2.6.
    1. Selecione Análise e abra Macromolécula, depois escolha 1nmk, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 30).
    2. Selecione Análise e abra o Docking, depois escolha Abrir, navegue até o arquivo dlg.pdb e selecione-o, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 31).
    3. Selecione Análise e abra o Docking, depois escolha Escrever o Ligando de Rastreamento Virtual do AutoDock e salvá-lo como um arquivo PDB, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 32).
  2. Abra o software PyMOL 2.5 conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 33).
    1. Abra o arquivo salvo dlg.pdb e depois abra o arquivo 1nmk.pdb.
    2. Abrir Arquivo, selecionar Exportar Molécula, depois Salvar, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 34).
    3. Abra o software Maestro, abra o Arquivo e depois escolha Importar Estrutura conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 35).
    4. Importe o Diagrama de Interação de Ligantes, salve a estrutura 2D, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 2.

8. Simulação MD

NOTA: Para abrir o GROMACS no Linux, siga estes passos

  1. Baixe o Ubuntu 20.04.6.
    1. Ative o aplicativo Windows Features no PC. E então escolha o Subsistema Windows para Linux e pressione OK.
    2. Siga esses códigos e pressione Enter para instalar o GROMACS:
      1. Digite sudo apt-get update e pressione Enter, depois digite sudo apt-get upgrade e pressione Enter.
      2. Digite sudo apt-get install gcc e pressione Enter, e digite sudo apt-get install cmake e pressione Enter.
      3. Digite sudo apt-get install built-essential e pressione Enter, depois digite sudo apt-get install liDevfftwtw3-d e pressione Enter.
      4. Digite sudo apt-get install GROMACS e pressione Enter, depois pressione shift + Ctrl + T.
    3. Abra a pasta no PC do computador pessoal e nomee-a GROMACS, como mostrado no Arquivo Suplementar 1 (Captura de Tela 36).
    4. Abra a pasta GROMACS e pressione Shift + Ctrl + Direita para entrar no Linux.
      NOTA: As simulações usaram o modelo da água e a versão 4.0 do GROMACS, versão multicore Win64, que incorporava o campo de força CHARMM 36. O intervalo de tempo foi definido para 2 fs, escolhendo a distância de corte de 1,0 a 1,2 nm.

9. Criação de topologia de ligantes usando módulos GROMACS pdb2gmx (Arquivo Suplementar 1, Captura de Tela 37)

  1. Crie o arquivo lig.gro, extraia o ligando da estrutura proteica digitando grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb e pressionando Enter, depois renomeie "UNL" para "LIG" no arquivo.
  2. Abra lig.pdb no PyMOL 2.5, remova átomos indesejados pressionando selecionar os átomos e pressionar delete o átomo. Clique em salvar para salvar a versão limpa como lig_clean.pdb.
  3. Abra o arquivo limpo no Avogadro para adicionar hidrogênio usando a ferramenta Build e salve como lig.mol2. Edite o topo do arquivo em um editor de texto para garantir que o nome do resíduo esteja definido como LIG.
  4. Digite perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 e pressione Enter.
  5. Gerar a topologia do ligante usando CGenFF: enviar lig_fix. mol2, processar a entrada e baixar lig_fix.pdb. Ative o ambiente Python e execute python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff e pressione Enter.
    NOTA: Esta etapa gerará quatro arquivos de ligantes (lig.prm, lig.itp, lig.top e lig_ini.pdb).
  6. Gerar o arquivo ligand.gro , digitar gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro e pressionar Enter.
  7. Separe a proteína salvando apenas os átomos não ligantes em prot_clean.pdb e garanta que os átomos de UNL estejam listados no topo do complexo combinado.

10. Criando topologia de proteínas em módulos pdb2gmx do GROMACS (Arquivo Suplementar 1, Captura de Tela 38).

  1. Prepare a topologia de proteínas, tipo gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter e pressione Enter .
  2. Crie o complexo de proteína e ligante após adicionar o arquivo lig.gro ao final do arquivo pro.gro . Depois, digite gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic e pressione Enter.
  3. Gerar solvato usando o modelo de carga pontual específica da água para manter o equilíbrio, tipo gmx solvato -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top e pressione Enter.
  4. Crie arquivos de íons, digite gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr e pressione Enter. Digite gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutro, e pressione Enter, depois escolha o grupo 15 para adicionar íons.
  5. Gerar minimização de energia em.gro.
  6. Digite gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr e pressione Enter, e digite gmx mdrun -v -deffnm em e pressione Enter.
    NOTA: O sistema solvado será minimizado de energia usando um máximo de 50.000 passos com um critério de convergência de força de 1.000,0 kJ/mol/nm.
  7. Crie os arquivos de índice, digite gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, pressione Enter.
  8. Digite gmx gênerostr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 e pressione Enter.
  9. Gerar o arquivo index.ndx , digitar gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx e pressionar Enter.
  10. Gerar o arquivo nvt.gro de equilíbrio NVT, digitar gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr e pressione Enter. Depois, digite gmx mdrun -deffnm nvt e pressione Enter.
    NOTA: O equilíbrio do sistema foi realizado a uma temperatura de 27,35 °C (300,5 K) para o conjunto do número de átomos (N), volume (V) e temperatura (V) (NVT) do sistema para 100 ps.
  11. Atualize o arquivo de topologia topol.top para incluir a topologia do ligante e parâmetros para formar NPT.
  12. Gerar equilíbrio NPT.
  13. Crie equilíbrio NPT de segunda fase, digite gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr e pressione Enter, e digite gmx mdrun -deffnm npt e pressione Enter.
    NOTA: NVT equilibrado refere-se ao número de partículas, volume e temperatura, enquanto NPT equilibrado refere-se à estabilidade para o número de partículas, pressão e temperatura. Os arquivos NVT.mdp e NPT.mdp são necessários para produzir os resultados da simulação MD conforme segue.

11. Liberar as restrições de posição e executar a simulação de dinâmica molecular de produção para coletar dados

  1. Digite gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr e pressione Enter. Depois, digite gmx mdrun -deffnm md_0_10 e pressione Enter.
  2. Submeta o sistema a uma simulação MD de 1 ns para testar a estabilidade do complexo.
    NOTA: O desvio quadrático médio da raiz (RMSD) quantifica o desvio estrutural médio dos átomos em relação a uma estrutura de referência, e o desvio quadrático médio da flutuação (FMSD) mede as flutuações atômicas médias em torno de suas posições médias. Os dois valores são necessários para finalizar as execuções de simulação MD.
  3. Realizar análises estruturais, incluindo RMSD, FMSD, ligações H e energia livre.
  4. Desenhe os gráficos de análise usando qtgrace_v026_win7 software e o arquivo md_0_10.gro para mostrar a caixa de trajetória usando o software VMD.

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Resultados

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Como mencionado na introdução, estudos in vivo e in vitro demonstram a importância dos inibidores da ciclofilina na simplificação da estrutura da Sanglifehrin, reduzindo assim a proliferação do baço de camundongos ao interferir no ciclo celular5 do camundongo. Além disso, a Ciclofilina A, juntamente com derivados do Ganoderiol F, desempenha papéis vitais no dobramento de proteínas, respostas imunes e sinalização celular por meio de sua atividade ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma nova substância natural imunossupressora chamada SFA ou receptor molecular 1nmk foi extraída de Streptomyces. A análise de acoplamento molecular foi usada para determinar as energias de ligação dos ligantes construídos com a proteína alvo. Os resultados mostraram que, de todos os ligantes projetados, o SFA difere estruturalmente do CsA e apresenta considerável afinidade com o CypA 16. A Cyp A, que possui atividade de isomerase cis-trans peptidil-proli...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Referências

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