Artigo de método

Preparação de biblioteca de cDNA ultrassensível para sequenciamento de próxima geração de microRNAs de pequenas vesículas extracelulares

DOI:

10.3791/67154

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13 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As vesículas extracelulares (EVs) contêm microRNAs específicos da célula que regulam as células receptoras, cuja identificação pode lançar luz sobre sua função e papel como biomarcadores. Nosso protocolo otimizado de preparação de biblioteca de cDNA apresenta códigos de barras exclusivos que permitem multiplexação de amostras e processamento aprimorado de EVs de baixa entrada enquanto usam códigos de barras de índice duplo de extremidade emparelhada para compatibilidade com sequenciadores Illumina.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudos recentes demonstram que pequenas vesículas extracelulares (sEVs), encontradas em todos os biofluidos, desempenham papéis críticos na comunicação intercelular canalizando proteínas, DNA e RNAs. MicroRNAs (miRNAs) que são empacotados em sEVs surgiram como reguladores críticos de entrega em células receptoras. Como os sEVs secretados por células normais e doentes carregam diferentes cargas de miRNA, estudos recentes de perfil de sEV-miRNA sugerem que eles podem ajudar a identificar novos biomarcadores circulantes. No entanto, sEVs específicos de células/doenças circulando em diversos biofluidos, uma vez isolados, fornecem baixas quantidades de miRNA, que geralmente são difíceis de quantificar usando metodologias espectrométricas convencionais. O sequenciamento de próxima geração (NGS) de RNA não codificante pequeno, que permite a amplificação de sequências de miRNA clonadas, oferece uma oportunidade valiosa para avaliar as cargas de miRNA de sEVs. Infelizmente, os procedimentos comerciais de preparação de bibliotecas de cDNA geralmente requerem entradas de RNA bem acima das quantidades não quantificáveis disponíveis de sEVs isolados.

Assim, considerando a robustez e as capacidades de multiplexação de nosso procedimento de preparação de biblioteca de cDNA existente (ou seja, inicialmente otimizado para a análise de RNA de baixa entrada, altamente degradado e fixado em parafina fixada em formalina (FFPE), procuramos avaliar sua aplicabilidade para a análise de miRNAs sEV. É importante ressaltar que, levando em consideração as recentes melhorias técnicas de agrupamento de chips de sequenciamento, procuramos adaptar nossa abordagem de código de barras de transcrição dentro de um fluxo de trabalho de preparação de biblioteca de cDNA compatível com índice duplo e emparelhado para aprimorar nossos recursos de sequenciamento e multiplexação. Usando RNA extraído de 8,4 × 109 sEVs em 16 repetições, e de quantidades decrescentes de sEVs de 1010 sEVs para tão baixo quanto 2,5 × 107 sEVs, avaliamos a reprodutibilidade e sensibilidade desta metodologia. Os dados demonstram que os códigos de barras de DNA 16 3 'adenilados permitem a detecção altamente reprodutível e sensível de perfis de sEV-miRNA em repetições usando até 3,15 pg de pequenos RNAs não codificantes totais ou 1,35 pg de miRNAs.

Introdução

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Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são partículas nanométricas (~ 30-200 nm de diâmetro) derivadas de células envoltas por uma membrana de bicamada fosfolipídica, que é herdada de sua célula de origem e que protege robustamente suas cargas moleculares 1,2. É bem aceito que praticamente todas as células produzem e liberam sEVs no compartimento intercelular, que por sua vez podem ser detectados na maioria dos biofluidos (ou seja, sangue, urina, saliva, etc) 2 , 3 , 4 . Estudos recentes demonstraram que as cargas moleculares encapsuladas de forma estável (ou seja, DNA, RNA, proteínas, lipídios, etc.) 5 , 6 , 7 de sEVs, uma vez em contato ou entregues às células receptoras, medeiam a comunicação intercelular8. Os esforços de pesquisa atuais têm se concentrado em melhorar o isolamento de sEVs específicos de células de diversos biofluidos, para identificar e monitorar com precisão essas cargas moleculares 9,10. Considerando que os sEVs contêm pequenos RNAs não codificantes e particularmente microRNAs (miRNAs), que mantêm sua função reguladora após a entrega celular, muitos estudos têm se concentrado em avaliar a utilidade dos miRNAs como biomarcadores que podem revelar a condição de sua célula de origem 11,12,13.

Os microRNAs (miRNAs) representam uma grande classe (~ 2.000 conhecidos em humanos) de pequenos RNAs não codificantes com tamanhos variando entre 19 e 25 nucleotídeos (nt), que se ligam a sítios complementares imperfeitos nas regiões 3 'não traduzidas de seus alvos de mRNA e direcionam sua degradação e / ou repressão pós-transcricional14,15. Funcionalmente, os miRNAs têm sido descritos para controlar muitos processos biológicos, e a desregulação de sua expressão tem sido associada a alterações em processos moleculares, bioquímicos e fisiológicos que contribuem para a iniciação e desenvolvimento de doenças, incluindo o câncer 16,17,18. É importante ressaltar que estudos mostraram que as células doentes e particularmente as células cancerígenas, não apenas expressam diferencialmente miRNAs em comparação com as células normais18, mas que seu empacotamento em sEVs também difere19,20.

Enquanto vários estudos se concentram em estabelecer os processos moleculares e as vias que direcionam o empacotamento de sEVs em células normais e doentes 19,21,22, os estudos de biomarcadores estão atualmente focados na identificação de pequenas assinaturas de RNA e/ou miRNA não codificantes distinguíveis que são empacotadas e secretadas por células doentes/cancerígenas específicas por meio de sEVs. O isolamento direcionado de sEVs específicos de células doentes de diversos biofluidos humanos e a avaliação de suas cargas moleculares multiômicas podem, portanto, permitir o desenvolvimento de ensaios diagnósticos e prognósticos para detecção não invasiva de diversas doenças humanas e cânceres23 , 24 , 25 , 26 . Embora os miRNAs sEV sejam os transcritos não codificantes mais estudados, outras pequenas espécies de RNA não codificantes (ou seja, isoformas de miRNA (isomiRs), piwiRNAs, fragmentos de RNA de transferência (tRFs), rRNAs, RNAs não codificantes órfãos (oncRNAs)...) também estão sendo avaliados quanto à sua potencial utilidade como biomarcadores sEV circulantes, com ênfase específica na detecção de diferentes cânceres 27,28,29,30,31,32.

Vantajosamente, a análise de sequenciamento de próxima geração (NGS) de pequenos transcritos de RNA não codificante (incluindo miRNAs), seguindo sua preparação de código de barras e biblioteca de cDNA, é ideal para a exploração de pequenas espécies de RNA não codificantes conhecidas e / ou desconhecidas contidas em sEVs circulantes, que podem estar associadas a doenças27. De fato, o NGS de RNA pequeno sEV fornece uma abordagem de alto rendimento para a descoberta de pequenos transcritos de RNA não codificantes específicos de células que, de outra forma, permaneceriam desconhecidos, se avaliados globalmente com tecnologias específicas de alvo (ou seja, PCR multiplex, microarrays, painéis personalizados, etc.) 32,33,34. Considerando que otimizamos anteriormente um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA ultrassensível e altamente reprodutível, que desenvolvemos para a análise de RNAs embebidos em parafina (FFPE) fixados em formalina altamente degradados e de baixa concentração35,36, procuramos adaptá-lo para a análise de pequenos RNAs e miRNAs não codificantes encapsulados em sEVs 37,38,39,40.

Com a descontinuação do instrumento Illumina HiSeq2500, que nos proporcionou anos de análise de miRNA de índice duplo de extremidade única de alta qualidade de cargas sEV37,40, procuramos explorar a reprodutibilidade e sensibilidade de nosso protocolo quando adaptado a instrumentos de sequenciamento atualizados usando química de índice duplo de extremidade emparelhada. Com a intenção de manter os recursos de multiplexação do protocolo original, mantivemos os 16 códigos de barras existentes para a preparação de transcritos de cDNA de RNA pequeno antes de integrá-los à química de índice duplo de extremidade emparelhada. Usando apenas um par de códigos de barras i5 e i7, permitimos a preparação de uma robusta biblioteca de cDNA baseada em laboratório, onde o processamento e a análise simultâneos de até 16 amostras individuais melhoram a reprodutibilidade analítica do RNA sEV de baixa entrada. Assim, apresentamos os processos bioquímicos, os códigos de barras atualizados, PCR e primers de marcadores de tamanho e etapas de isolamento necessárias para gerar bibliotecas de cDNA altamente reprodutíveis usando quantidades ultrabaixas de miRNAs isolados de sEVs de plasma humano.

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Protocolo

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1. Todos os reagentes e oligonucleótidos são preparados do seguinte modo:

NOTA: Todos os nucleotídeos usados neste protocolo são detalhados na Figura 1 e no Arquivo Suplementar 1 nas concentrações usadas para implementar este protocolo. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter sequências de primers.

  1. Prepare uma solução estoque de coquetel calibrador, que será usada em cada ligadura individual como controle para as diferentes reações enzimáticas:
    1. Ressuspenda o oligonucleotídeo transportador (0,5 μM) (Arquivo Suplementar 1) com água livre de RNase.
    2. Combine os 10 calibradores (10 μL cada, Arquivo Suplementar 1) em um único tubo de 1,5 mL para atingir um estoque de 100 μM, dilua-o usando o oligonucleotídeo transportador para atingir a solução de 0,0052 nM e armazene a -20 °C.
  2. Ressuspenda cada um dos 17 adaptadores 3' adenilados exclusivos (16 experimentais e 1 adaptador de código de barras de teste) (Figura 1A) com água livre de nuclease a uma concentração de 50 μM.
    NOTA: Cada adaptador é aliquotado em tubos individuais contendo 2.5 μL para armazenamento a -80 °C por até 2 anos, para evitar ciclos de congelamento e descongelamento do estoque maior.
  3. Ressuspenda os diferentes oligonucleotídeos de RNA experimentais, incluindo o transportador de extração de RNA (Arquivo Suplementar 1), o transportador de ligação de RNA 3' (Arquivo Suplementar 1), o teste de ligação de RNA (Arquivo Suplementar 1) e a ligação 3' (Arquivo Suplementar 1; adaptador 19 nt-3' e adaptador 24 nt-3') e ligação 5' (Arquivo Suplementar 1; adaptador 5'adaptador-19 nt-3'adaptador e 5'adaptador-24 nt-3'adaptador) marcadores de tamanho de DNA, para 250 ng/μL.
  4. Diluir o adaptador 5' purificado por HPLC a 100 μM com água isenta de nuclease (Figura 1A).
  5. Ressuspenda os primers RT e primeiro PCR 5' e 3' RT/PCR a 100 μM com água livre de nuclease (Figura 1B).
  6. Ressuspenda os oligonucleotídeos i7 e i5 da PCR 5' e 3' da PCR a 100 μM com água livre de nuclease (Figura 1B).
    NOTA: Alíquota de cada primer de DNA para até 10 experimentos e armazene a -80 °C.
  7. Prepare o corante de carregamento de gel de poliacrilamida (PAA), misture e alíquota de 1 mL em tubos e armazene a -80 ° C.
    1. Prepare uma solução de 0,5 M Na2H2 EDTA adicionando 18,6 g de Na2H2 EDTA a 50 mL de água livre de nuclease. Adicione pellets de NaOH lentamente à solução preparada de Na2H2 EDTA para atingir um pH de 8,0. Completar o volume até 100 ml utilizando ddH2O para obter uma solução-mãe 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Pese 15 mg de azul de bromofenol em um tubo de 15 mL, ressuspenda o pó em 600 μL de água livre de nuclease, adicione 14,25 mL de formamida deionizada. Finalmente, adicione 150 μL de uma solução 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Aliquotar a solução final de PAA em tubos de 1 ml e conservar a -80 °C.
    3. Prepare o corante de carregamento de gel de agarose 5x.
      1. Pese e dissolva 1,86 g de Na2H2-EDTA em 50 mL de água livre de RNase e ajuste o pH para 8,0 adicionando pellets de NaOH. Adicione água sem RNase a 100 mL para obter uma solução de 50 mM Na2H2 EDTA.
      2. A 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA, adicione 20 mg de azul de bromofenol, 20 mg de xileno cianol FF e 2 g de Ficoll tipo 400. Vortex o tubo contendo os três corantes para misturar e adicionar mais 5 mL de 50 mM Na2H2 EDTA. Alíquota individual de tubos de 1 mL de 5x gel de agarose carregando corante e armazene a -80°C.

2. Preparação das amostras de ARN EV

  1. Após o isolamento dos sEVs, avaliar sua morfologia usando microscopia eletrônica de transmissão (MET; Figura 2), concentração usando Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA; Figura 3) e distribuição de proteínas de superfície usando nanoimagem de super-resolução (Figura 4) ou tecnologia de quantificação sEV equivalente.
  2. Alíquota de um número equivalente de sEVs em diferentes tubos, adicionar RNase-A (12,5 μg/mL) e incubar a 37 °C por 1 h.
  3. Inicie a extração de pequenos RNAs não codificantes, incluindo miRNAs, de sEVs usando o kit de extração de RNA pequeno e inicie o isolamento da fase de RNA.
  4. Separe a fase aquosa inferior do tampão de lise de RNA, adicione-o a um novo tubo e, em seguida, adicione 4 ng de oligonucleotídeo transportador de RNA (Arquivo Suplementar 1) a cada amostra de RNA, antes de realizar o isolamento da coluna seguindo as instruções do fabricante.
  5. Aspire cada amostra de RNA individual a 9,5 μL para iniciar o protocolo de preparação da biblioteca de cDNA.

3. Configure as ligações do adaptador de código de barras de 3' com 16 amostras de RNA e 1 amostra de teste

  1. Identifique 16 amostras individuais de sEV-RNA, alicotando-as em 9,5 μL de água livre de nuclease em tubos de microcentrífuga siliconizados de 1,5 mL e coloque-os no gelo pelo menos 10 minutos antes de iniciar os experimentos.
  2. Prepare o tampão de RNA ligase 10x (sem ATP) fresco antes do experimento.
    1. Em um tubo siliconizado de 1,5 mL, combine 343 μL de água bidestilada livre de nuclease (ddH2O), 500 μL de 1 M Tris pH 7,5, 100 μL de 1 M MgCl2, 50 μL de 20 mg / mL de albumina sérica bovina e 7 μL de 14 M 2-mercaptoetanol.
    2. Misture a solução sacudindo o tubo, centrifugue por 2 s a 2.000 × g à temperatura ambiente (RT) em uma centrífuga de mesa e, em seguida, coloque no gelo.
      NOTA: Todas as etapas que descrevem uma "centrífuga por 2 s" são todas feitas com uma microcentrífuga em RT com uma velocidade não superior a 2.000 × g.
  3. Descongele o coquetel calibrador de 0.0052 nM colocando o tubo no gelo por 10 min.
  4. Prepare o Ligation Master Mix para 18 reações em um tubo siliconizado de 1,5 mL combinando 40 μL de tampão de RNA ligase 10x, 10 μL de coquetel calibrador de 0,0052 nM e 40 μL de ddH2O livre de nuclease.
  5. Agite e gire o tubo de 1,5 mL e coloque-o no gelo.
  6. Adicione 4,5 μL do Ligation Master Mix a cada uma das 16 amostras de RNA sEV aliquotadas individualmente e a reação de ligação de teste contendo 100 ng de oligonucleotídeo de teste de ligação de RNA (Arquivo Suplementar 1) previamente aliquotado e com volume de 9,5 μL. Mexa para misturar e girar os tubos antes de colocá-los de volta no gelo.
  7. Transferir as 16 amostras e testar a reação para um bloco de calor durante 1 minuto a 90 °C e transferir de volta para o gelo.
  8. Transfira individualmente 4 μL de 50% de PEG para cada tubo, agite para misturar e gire os tubos antes de colocá-los de volta no gelo.
  9. Descongele alíquotas de 2.5 μL de cada um dos 17 adaptadores com código de barras de 3' (16 experimentais (#1 a #16) e adaptador de teste (#17)) e coloque no gelo para descongelar.
  10. Transfira 1 μL de cada um dos 17 adaptadores para as 16 amostras correspondentes contendo sEV-RNA e uma amostra de teste, com Ligation Master Mix (ou seja, 4,5 μL) e 50% de PEG (ou seja, 4 μL).
    NOTA: Todas as soluções e reações são misturadas sacudindo os tubos e girando-os, em vez de pipetar as soluções para cima e para baixo, para evitar a perda de material.
  11. Prepare a enzima de ligação K227Q truncada de RNA ligase 2 T4 diluída adicionando 10 μL da enzima com 10 μL de ddH2O livre de nuclease em um novo tubo siliconizado de 1,5 mL.
  12. Transfira 1 μL da enzima de ligação K227Q truncada de RNA ligase 2 T4 diluída para cada um dos 17 tubos (16 amostras de RNA experimental e 1 de teste). Não pipete para cima e para baixo, troque as pontas entre cada tubo, mantenha os tubos no gelo, sacuda a mistura, centrifugue e coloque os tubos no gelo.
  13. Coloque as ligaduras em gelo fresco em um suporte de tubo em um balde de gelo na câmara fria, durante a noite por até 18 h.

4. Isolamento PAGE do adaptador 3' ligado a pequenos RNAs

  1. Coloque os 17 tubos em um bloco de calor a 90 ° C por 1 min para desativar a RNA Ligase 2 T4 e coloque no gelo por 2 min para esfriar.
  2. Combine 1 μL de GlycoBlue e 26 μL de NaCl livre de nuclease 5 M em um tubo novo e transfira 1,2 μL desta solução de precipitação para cada um dos 17 tubos.
  3. Adicione 63 μL de etanol 100% a cada um dos 17 tubos, feche, sacuda e gire para baixo por 2 s antes de colocá-los de volta no gelo.
  4. Combine o conteúdo dos 16 tubos de RNA sEV em um único tubo siliconizado de 1,5 mL, mantendo o tubo de ligação de RNA de teste separado.
  5. Inverter o tubo que contém as amostras combinadas 3x para misturar, centrifugar brevemente durante 2 s e colocar no gelo durante 60 min para precipitar.
  6. Prepare um gel grande (16 x 20 cm2) de poliacrilamida a 15% (PAGE) da seguinte forma:
    1. Siliconize (ou seja, usando solução à base de silicone) e funda as placas de vidro curtas e longas com espaçadores de 0,1 cm.
    2. Prepare a mistura de gel PAGE a 15% combinando 9 mL de diluente do sistema, 18 mL de concentrado do sistema, 3 mL de tampão do sistema, 240 μL de APS (9%) e 12 μL de TEMED em um tubo cônico de 50 mL.
    3. Transfira rapidamente a solução entre as placas de vidro usando uma pipeta de 30 mL. Antes de polimerizar o gel, adicione um pente de 14 poços (0,1 cm de espessura) e coloque o gel em pé por 30 min em RT.
  7. Recupere o tubo com as amostras de RNA combinadas do gelo e centrifugue-o a 16.000 × g por 60 min a 4 ° C.
  8. Enquanto isso, termine de configurar o PAGE de 15% removendo suavemente o pente, limpando os poços com H2O livre de nuclease com um frasco de esguicho acima de uma pia, antes de secar e configurar o PAGE de 15% no aparelho de gel, onde os reservatórios superior e inferior são preenchidos com solução de 0.5x Tris-Borate EDTA (TBE), antes de uma pré-corrida de 30 min a 450 V.
  9. Remova o tubo da centrífuga (Etapa 4.6) e seque cuidadosamente o pellet de RNA usando uma pipeta Pasteur com uma ponta sem filtro de 10 μL em sua extremidade conectada a um sistema de vácuo, sem perturbar o pellet.
  10. Ressuspenda o pellet de RNA contendo as 16 ligações de RNA precipitadas em 20 μL de ddH2O livre de nuclease e adicione 20 μL de solução de carga de gel de PAA. Agite o tubo para misturar, centrifugue por 2 s e coloque no gelo.
  11. Substitua 0,5x TBE do aparelho de gel por 0,5x TBE novo.
  12. Configure um tubo com escada de tamanho de RNA de 20 pb, dois tubos com cada um dos dois marcadores de tamanho de DNA curto de ligação de 3' (Arquivo Suplementar 1) e um tubo contendo o oligonucleotídeo de teste de ligação de RNA (ou seja, ligado com adaptador de código de barras # 17).
  13. Para cada um dos tubos (ou seja, escada, oligos de DNA curto de ligação 3 'e teste de ligação de RNA), adicione 20 μL de solução de carregamento de gel PAA.
  14. Colocar o tubo de amostra de ARN ligado 16 e o tubo de ensaio de ligação de ARN 1 a 90 °C durante 1 min e voltar a colocar no gelo.
  15. Substitua o tampão TBE 0,5x dos reservatórios inferior e superior (ou seja, adicione tampão abaixo do nível do poço para que não haja contaminação cruzada entre os poços durante o carregamento) e carregue a escada nas extremidades do gel, a ligação de teste de RNA, os dois marcadores curtos de tamanho de DNA em ambos os lados do poço contendo as 16 ligações combinadas de RNA com código de barras 3' (consulte a Figura 5).
  16. Execute o gel PAGE a 15% com todas as amostras por 90 min a 450 V (~35 mA) em condições resfriadas (ou seja, com ventiladores soprando ar nas placas de vidro).
  17. Remova 15% PAGE do vidro e borrife levemente com solução de SYBR Gold (10 μL de SYBR Gold em 25 mL de 0,5x TBE) e deixe descansar inclinado por 5 min no escuro.
  18. Coloque o gel em um transiluminador de luz azul (Figura 5) e alinhe os oligonucleotídeos de DNA curtos do marcador de tamanho do adaptador 19 nt-3 'e os oligonucleotídeos de DNA curtos do marcador de tamanho do adaptador 24 nt-3' com uma régua e excise a área do gel contendo as construções de miRNA ligadas (a Figura 6 exibe a ligação 3' e a construção resultante). Separadamente, excisar a banda superior da ligadura do teste de ARN, que também será utilizada para uma ligadura de teste 5' no dia seguinte.
  19. Coloque os dois pedaços de gel excisados separados (ou seja, para 16 amostras de RNA e para ligação de teste) em diferentes tubos de quebra de gel de 0,5 mL colocados em tubos siliconizados de 1,5 mL, centrifugue a 16.000 × g por 3 min em RT e, em seguida, ressuspenda os dois conjuntos de pedaços de gel fragmentados com 300 μL de solução de NaCl 400 mM, feche os tubos, e selá-los com parafilme.
  20. Coloque os tubos em um agitador com agitação a 1.100 rpm a 4 °C, durante a noite (16-17 h).

5. Ligadura do adaptador 5'

  1. Transfira dois géis fragmentados separados e suas soluções (16 x 3' amostras com código de barras (códigos de barras # 1 a # 16) e RNA de teste com código de barras 3' (código de barras # 17)) para dois tubos de filtro separados de 5 μm, cada um definido em tubos siliconizados de 1,5 mL, sele-os com parafilme e centrifugue por 5 min a 2.300 × g em RT.
  2. Adicione 950 μL de etanol 100% a cada solução filtrada, feche os tubos, inverta para misturar, gire para baixo por 2 s, sele os tubos com parafilme e coloque-os em gelo por 1 h.
  3. Prepare um estoque de DMSO aquoso a 50% combinando 1 mL de água livre de nuclease com 1 mL de DMSO, embrulhe o tubo em papel alumínio e armazene em RT no escuro.
  4. Prepare um gel PAGE a 15% e execute-o com antecedência, seguindo as etapas descritas na seção 4.6.
  5. Centrifugue os tubos contendo as amostras de RNA 16 ligadas a 3' e a ligação de RNA de teste a 16.000 × g por 60 min a 4 °C para precipitar os RNAs ligados.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem tocar nos pellets de RNA e seque a vácuo.
  7. Ressuspenda o pellet ligado 3 'de 16 amostras de RNA e teste o RNA em 8 μL de ddH2O livre de nuclease sem pipetagem para cima e para baixo. Agite levemente os tubos para misturar, centrifugue por 2 s (2.000 × g) em RT e coloque os tubos no gelo.
  8. Prepare o tampão 10x RNA Ligase (com ATP) misturando 500 μL de 1 M Tris (pH 7,5), 100 μL de 1 M MgCl2, 50 μL de 20 mg / mL de BSA acetilada, 200 μL de 10 mM ATP, 7 μL de 2-mercaptoetanol 14 M e 143 μL de água livre de RNase em um tubo de 1,5 mL.
  9. Adicione 2 μL de tampão 10x RNA ligase (ou seja, com ATP), 1 μL de adaptador 100 μM 5' e 4 μL de DMSO aquoso a 50% a cada tubo. Agite para misturar, gire por 2 s em RT, depois configure o tubo a 90 ° C por 1 min para desnaturar o RNA e coloque-o de volta no gelo.
  10. Adicione 3 μL de DMSO a 50%, agite para misturar, gire para pellet, adicione 3 μL de T4 RNA Ligase a cada tubo, agite os tubos, centrifugue por 2 s em RT e coloque os tubos no agitador a 37 ° C por 75 min.
    NOTA: Não pipete para cima e para baixo.
  11. Prepare a escada de DNA de 20 nt e dois tubos separados contendo os oligonucleotídeos de DNA longos do marcador de tamanho de ligação 5' (Arquivo Suplementar 1; adaptador 5'adapter-19 nt-3' e adaptador 5'adapter-24 nt-3') e adicione 20 μL de PAA a cada um dos tubos.
  12. Quando a ligação do adaptador 5 'estiver concluída, adicione 20 μL de PAA a cada uma das duas ligações (ou seja, 16 amostras de RNA e teste de RNA), misture agitando, gire para baixo e ajuste a 90 ° C por 1 min, após o que coloque os tubos de volta no gelo.
  13. Esvazie os reservatórios superior e inferior do aparelho de gel e adicione uma solução fresca de 0,5x TBE abaixo do nível dos poços do reservatório superior.
  14. Carregue a escada na extremidade do gel, a amostra de RNA de teste ligada 5', os dois oligonucleotídeos de DNA longos com marcadores de tamanho (ou seja, adaptador 5'-adaptador 19 nt-3' e adaptador 5' adaptador-24 nt-3') em poços ao redor do poço onde as amostras de RNA 16 ligadas 5' serão carregadas (a Figura 6 exibe a ligação 5' e a construção resultante). Execute o gel por 90 min a 450 volts.
  15. Quando a corrida estiver concluída, remova o gel do aparelho e do vidro e borrife-o com uma solução de SYBR Gold (ou seja, 10 μL de SYBR Gold em 25 mL de 0,5x TBE) e deixe-o descansar no escuro por 5 min.
  16. Usando o adaptador 5 'adaptador-19 nt-3' e ambos os marcadores de tamanho do adaptador 5'- adaptador-24 nt-3' oligonucleotídeos de DNA longos como guias de tamanho, excise diretamente a seção do gel contendo as amostras de RNA 16 ligadas 5' (Figura 7).
    NOTA: A ligação de RNA de teste é avaliada no gel para demonstrar que a ligação do adaptador 5' permite um deslocamento equivalente em tamanho aos marcadores de tamanho. A ligação do RNA de ensaio não é excisada do gel; apenas as 16 amostras de RNA combinadas ligadas.
  17. Transfira o pedaço de gel excisado contendo as 16 amostras de RNA ligadas para um tubo de quebra de gel de 0,5 mL colocado em um tubo de 1,5 mL, gire a 16.000 × g por 3 min em RT e, em seguida, adicione 300 μL de NaCl 300 mM e 1 μL de primer RT / PCR 100 μM 3 '(Figura 1B) aos pedaços de gel triturados no tubo.
  18. Selar o tubo com parafilme e colocar num agitador agitando a 1.100 rpm a 4 °C, durante a noite (17-18 h) numa câmara frigorífica.

6. Transcrição reversa dos pequenos RNAs e miRNAs não codificantes ligados a 5' e 3' ligados com código de barras

  1. Pipetar a solução do tubo que contém o gel triturado para um tubo filtrante de 5 μm inserido num tubo siliconizado sem RNase de 1,5 ml e centrifugar brevemente para permitir que a solução passe pelo filtro.
  2. Adicione 950 μL de etanol 100% a esta solução filtrada, inverta o tubo para misturar, gire por 2 s e coloque no gelo por 60 min.
  3. Precipitar o pellet de RNA por centrifugação do tubo a 16.000 × g a 4 °C durante 1 h.
  4. Recupere o tubo, remova o sobrenadante cuidadosamente sem tocar no pellet e seque o pellet a vácuo antes de ressuspendê-lo em 5,6 μL de H2O livre de nuclease.
  5. Configure a reação RT adicionando 3 μL de 5x tampão de primeira fita, 4,2 μL de 10x dNTPs (cada um a 2 mM) e 1,5 μL de ditiotreitol (DTT) ao tubo. Mexa para misturar e gire por 2 s.
  6. Configure a reação a 90 °C por 30 s exatamente e depois transfira o tubo para um bloco a 50 °C por 2 min.
  7. Inicie a reação RT adicionando 0,75 μL de enzima transcriptase reversa à solução, agite para misturar e ajuste a 50 ° C por 35 min.
  8. Transfira o tubo a 95 ° C por 1 min para desnaturar a enzima e as fitas de cDNA / RNA, em seguida, adicione 95 μL de H2O livre de RNase, agite o tubo para misturar e coloque-o no gelo por 2 min. Este tubo contém cDNA gerado a partir das 16 amostras de RNA, cada uma com código de barras separadamente em 3 '.

7. Realize o teste PCR e amplificação em larga escala

  1. Prepare um tampão de PCR 10x fresco combinando 304 μL de H2O livre de nuclease, 125 μL de 2 M KCl, 50 μL de 1 M Tris pH 8,0, 10 μL de 1 M MgCl2, 5 μL de 1% Triton X-100 e 6 μL de 1 M 2-mercaptoetanol em um tubo que pode ser armazenado em gelo.
  2. Monte uma reação de PCR piloto/teste para o cDNA produzido na etapa 6.8 (acima) combinando 67 μL de H2O livre de nuclease com 10 μL de tampão PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 0,5 μL de 100 μM 5 'PCR primer, 0,5 μL de 100 μM 3' PCR primer, 10 μL de cDNA Stock Library, e 2 μL de Taq polimerase 50x em um tubo de PCR fresco.
    NOTA: Antes de realizar as amplificações de PCR, configure o instrumento estabelecendo dois arquivos diferentes da seguinte forma: Para o arquivo # 1: 94 ° C por 45 s, 50 ° C por 85 s e 72 ° C por 60 s por 12 ciclos e 4 ° C; e para o arquivo # 2: 94 ° C por 45 s, 50 ° C por 85 s e 72 ° C por 60 s por 2 ciclos e 4 ° C.
  3. Para a reação de PCR piloto/teste, coloque o tubo de PCR contendo os 100 μL da reação de PCR no termociclador e execute o arquivo # 1.
  4. Quando o arquivo # 1 estiver concluído, abra o tubo de PCR e transfira 12 μL da reação para uma microcentrífuga de 1,5 mL contendo 3 μL de corante de carregamento de gel 5x. Feche o tubo e escreva "12 ciclos" na tampa.
  5. Pegue o tubo de PCR, coloque-o no termociclador e inicie o File#2.
  6. Quando o arquivo # 2 estiver concluído, transfira 12 μL da reação de PCR para um tubo de 1,5 mL contendo 3 μL de corante de carregamento de gel 5x e escreva "14 ciclos" em sua tampa.
  7. Repita as amplificações de PCR mais quatro vezes sucessivas (ou seja, dois ciclos de PCR cada), enquanto transfere 12 μL de produto de PCR no final de cada amplificação e, por sua vez, obtenha quatro tubos diferentes, marcados com 16, 18, 20 e 22 ciclos.
  8. Carregue a escada de tamanho de 20 nt e cada um dos produtos amplificados por PCR em uma agarose a 2,5% e passe o gel em 0,5x TBE por 30 min a 120 V.
  9. Identifique o ciclo ideal de amplificação por PCR (Figura 8A), com base na proporção e presença de dímeros de primer (banda inferior) e o cDNA amplificado (banda superior).
    NOTA Considerando que a entrada total de RNA com 16 amostras pode ser inferior a 1 ng, espera-se que os dímeros de primer gerem um produto mais rápido e em maiores quantidades do que o cDNA purificado. Assim, o ciclo de PCR adequado é geralmente selecionado entre 18 e 22 ciclos. Na Figura 8A, o ciclo de PCR adequado para esta biblioteca é 20. Na Figura 8B, o tamanho da construção de PCR é detalhado.
  10. Uma vez identificado o ciclo de amplificação de PCR adequado, defina uma PCR negativa (sem cDNA) e quatro reações de PCR positivas de 100 μL (ou seja, cada uma contendo 12 μL de cDNA).
    1. Para simplificar a preparação das reações de PCR, configure um PCR Master Mix (ou seja, para 4,5 reações) em um tubo de 1,5 mL combinando 292,5 μL de H2O livre de nuclease, 45 μL de tampão PCR 10x, 45 μL de 10x dNTPs, 3,25 μL de primer 3' RT/PCR (Figura 1B) e 2,25 μL de primer PCR 5' (Figura 1B). Inverta este tubo para misturar e gire para coletar no fundo do tubo.
    2. Transfira 86 μL do PCR Master Mix para cada um dos quatro tubos de PCR de 0,5 mL.
    3. Adicione 12 μL de biblioteca de cDNA (armazenado em gelo), depois 2 μL de Taq polimerase 50x titânio em cada um dos 4 tubos de PCR e misture pipetando para cima e para baixo.
    4. Prepare o tubo de reação de PCR sem modelo adicionando 77 μL de H2O livre de nuclease, 10 μL de tampão PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 0,5 μL de primer PCR 5', 0,5 μL de primer PCR 3' e 2 μL de 50x Taq polimerase a um tubo de PCR separado e pipetando para cima e para baixo para misturar.
    5. Configure os tubos de PCR no termociclador usando o ciclo de PCR identificado na etapa 7.9 e defina um novo programa no termociclador para amplificar conforme necessário.
  11. Prepare um gel de agarose a 2,5% com 0,5x TBE e brometo de etídio e transfira 12 μL de cada tubo de PCR para tubos individuais contendo 3 μL de corante de carga de gel 5x.
  12. Prepare a escada de 20 nt combinando 3 μL de escada com 9 μL de H2O livre de nuclease e 3 μL de corante de carga de gel.
  13. Carregue o gel, execute-o por 30 min a 120 V e verifique se a amplificação da PCR é semelhante entre as quatro reações diferentes e se o controle sem modelo está vazio ( Figura 8C ).
  14. Combine as quatro reações de PCR entre dois tubos de microcentrífuga siliconizados de 1,5 mL (ou seja, dois tubos contendo 90 μL de produto) e adicione 18 μL de NaCl 5 M e 800 μL de etanol 100% em cada um dos dois tubos.
    1. Inverter os tubos para misturar e armazená-los a -20 °C para precipitar durante a noite.

8. Purificação da Biblioteca amplificada por PCR

  1. Centrifugar os dois tubos contendo as reações mistas de PCR positiva a 16.000 × g durante 60 min a 4 °C.
  2. Após 60 min, remova o sobrenadante, seque a vácuo os grânulos de DNA e ressuspenda-os em 19,5 μL de tampão 1x e, em seguida, adicione 0,5 μL de enzima PmeI.
  3. Configure os digestores de PmeI a 37 ° C por 2 h para remover qualquer um dos marcadores de tamanho de DNA que correram nos poços adjacentes (ou seja, adaptador 19 nt-3 ', adaptador 24 nt-3') ou transportadores de RNA (ou seja, transportador de extração de RNA, transportador de ligação de RNA pós-3 ') contaminantes potenciais (ou seja, consulte os locais PmeI incluídos nos primers de RNA e DNA no Arquivo Suplementar 1)
  4. Execute os dois digestores em três poços diferentes de um gel de agarose a 2,5% usando 0,5x TBE para evitar o acúmulo de excesso de dímeros de primer em um único poço e criar um esfregaço.
    1. Adicione 3 μL de corante de carregamento de gel 5x a cada um dos digestos, combine os dois digestos e, em seguida, carregue 16,5 μL em três poços adjacentes separados.
    2. Carregue a escada de tamanho de DNA de 20 nt nos poços finais do gel e execute o gel por 90 min a 150 V (Figura 8D).
  5. Para purificar as bibliotecas de DNA, excise as bandas superiores de PCR das três pistas adjacentes do gel e transfira-as para um novo tubo de 1,5 mL.
  6. Purifique a biblioteca amplificada de PCR usando um kit de extração de gel, seguindo as instruções do fabricante, e quantifique o produto de DNA purificado usando um fluorômetro, seguindo as instruções do fabricante.

9. Amplificação final de PCR para adicionar códigos de barras compatíveis com o sequenciador

  1. Prepare uma nova mistura de tampão de PCR 10x como a descrita na etapa 7.1.
  2. Configure as reações de PCR incluindo um controle negativo (sem amplicons) e três reações de PCR usando 0,75 ng do produto de PCR purificado da primeira amplificação de PCR em cada um dos três tubos da seguinte forma:
    1. Configure três reações de PCR individuais misturando 75 μL de ddH2O, 10 μL de tampão PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL de 5' 2ºprimer PCR ( ou seja, primer i503 (Figura 1B)), 1 μL de 3' PCR2º primer (ou seja, primer i702 (Figura 1B)), 1 μL de produto PCR (ou seja, primer i503 (Figura 1B)), 1 μL de produto PCR (ou seja, 0,75 ng de1º produto de PCR purificado por gel) e 2 μL de titânio Taq polimerase.
    2. Configure o controle de PCR negativo (ou seja, sem molde de DNA) misturando 76 μL de ddH2O, 10 μL de tampão PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL de 5' 2ºprimer PCR (ou seja, primer i503 (Figura 1B)), 1 μL de 3' PCR2º primer (ou seja, primer i702 (Figura 1B)), e 2 μL de Taq Polimerase.
    3. Configure as quatro reações de PCR (ou seja, um controle negativo, três positivos) em um termociclador programado da seguinte forma: 72 ° C por 3 min, 95 ° C por 30 s e 95 ° C por 10 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s por 9 ciclos e, em seguida, 72 ° C por 5 min e uma retenção final a 10 ° C.
  3. Uma vez concluídos os ciclos de PCR, pegue 10 μL da mistura de reação e adicione 3 μL de corante de carga e avalie os produtos em um gel de agarose a 2,5%, conforme exibido na Figura 9A, junto com a escada de 20 nt.
  4. Após a validação do tamanho do produto de PCR (ou seja, banda de PCR superior rodando a 164 pb, conforme exibido na Figura 9B e Figura 6 para tamanho e detalhes sobre a construção final) e distribuição de banda, combine os produtos de PCR em dois tubos adicionando a cada 135 μL de produto de PCR (ou seja, 90 μL + 45 μL), 13,5 μL de NaCl 5 M, e 650 μL de etanol a 100%, e precipitar a -20 °C durante a noite.
  5. No dia seguinte, gire os dois tubos de PCR a 16.000 × g por 60 min a 4 ° C.
  6. Seque cada pellet, ressuspenda com 19,5 μL de tampão 1x PmeI e adicione 0,5 μL de PmeI por 2 h a 37 ° C em um agitador para eliminar ainda mais qualquer um dos marcadores de tamanho que correram nos poços adjacentes (ou seja, adaptador 19 nt-3 ', adaptador 24 nt-3') ou contaminantes transportadores de RNA (ou seja, transportador de extração de RNA, transportador de ligação de RNA pós-3 ').
  7. Montar os produtos digeridos em três poços de gel de agarose a 2,5% e separar a 150 V durante 90 min.
  8. Extirpar a banda superior, que funciona a 164 pb (Figura 9C), e purificar o produto de DNA usando um kit de isolamento de DNA e quantificar com um fluorômetro.
  9. Execute o produto final de PCR em um chip de DNA para validar o tamanho, a concentração e a pureza da biblioteca antes das diluições e análises usando um sequenciador.
  10. Transfira o arquivo de dados FASTQ para o pipeline RNAworld para corte do adaptador, desmultiplexação, alinhamento ao genoma humano, antes das análises de miRNA, conforme descrito anteriormente41. Como alternativa, usando o Script apresentado no Supplemental File 3, demultiplexe as leituras do arquivo FASTQ e processe ainda mais usando um pipeline analítico de RNA pequeno de sua escolha.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conforme detalhado no protocolo acima, descrevemos o processamento simultâneo de até 16 amostras individuais de RNA de pequenas vesículas extracelulares (sEV) (ou seja, para análise de pequenos RNAs e miRNAs não codificantes), que são analisados juntos em uma única biblioteca, após passar por 3' código de barras. Os sEVs selecionados para nossas análises foram isolados por ultracentrifugação, conforme descrito anteriormente37,40, de 45 mL de plasma coletado de mu...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvemos um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA para sequenciamento de próxima geração (NGS) reprodutível e sensível de RNAs não codificantes, incluindo microRNAs (miRNAs) eficientemente isolados de pequenas vesículas extracelulares (sEVs). Considerando que uma quantidade limitada de pequenos RNAs e miRNAs não codificantes pode ser recuperada de sEVs globalmente ou seletivamente isolados, buscamos otimizar nosso procedimento de preparação de biblioteca de cDNA que permita ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. é um fundador não empregado da EValuate Diagnostics, Inc com uma pequena porcentagem de participação acionária na empresa. Os demais autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer ao laboratório do Dr. Thomas Tuschl por seu apoio e por fornecer acesso à tecnologia original desenvolvida em seu laboratório, além de nos conceder acesso ao pipeline RNAworld.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1% Triton X-100InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoetanolSigmaO3445I-100 
Escada de 20 nt Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Albumina de Soro BovinoSigmaB8894-5ML 
50x Taq de titânioLaboratórios Clontech 
Persulfato de AmônioFisher Scientific 7727-54-0
Transiluminador de luz azul - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Sistema de eletroforese em gel vertical com placas de vidro e pentesGIBCOV16
Dimetil sulfóxido (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrífuga 5424REUA científico4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerEUA científico4053-8223Q
Tubo de filtro com Filtro de 5 mmIST Engineering Inc.5388-50
Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Siliconizados Fisherbrand 1.5 mLFisher Scientific02-681-320
Tubo de Quebra de Gel 0.5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Aparelho de eletroforese em gel 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT com bandejas de gel e pentesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequenciador Illumina20047256
Jersey-Cote (solução à base de silício)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga pessoal de rotor duploUSA scientific2641-0016
Modelo V16 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida, óculos, pentes e espaçadoresCiências da Vida Ciore
IDTDefinido durante o pedido
Sistema de mini eletroforese Owl EasyCast B2 - com bandejas de gel e pentesB2Thermofisher Scientific
 Fluorômetro Qiagen28704
QubitThermofisher ScientificQ33238
Enzima de restrição PmeI e 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Transcriptase reversa- Superscript IIIThermoFisher12574026
Água livre de RNase AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf 5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titanium Taq PolimeraseTakara639208
T4 RNA Ligase 1 NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 T227Q truncada NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Themocycler com tampa aquecidaApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8,0AmbionAM9855G
sistema UltraPure Sequagel concentrado, diluente e tampãoNational DiagnosticsEC-833
639208 Oligonucleotídeos 21070010 Kit de extração de gel Qiaquick da Kit de transcrição reversa

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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