Artigo de método

Preparação de biblioteca de cDNA ultrassensível para sequenciamento de próxima geração de microRNAs de pequenas vesículas extracelulares

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

Neste artigo

Resumo

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As vesículas extracelulares (EVs) contêm microRNAs específicos da célula que regulam as células receptoras, cuja identificação pode lançar luz sobre sua função e papel como biomarcadores. Nosso protocolo otimizado de preparação de biblioteca de cDNA apresenta códigos de barras exclusivos que permitem multiplexação de amostras e processamento aprimorado de EVs de baixa entrada enquanto usam códigos de barras de índice duplo de extremidade emparelhada para compatibilidade com sequenciadores Illumina.

Resumo

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Estudos recentes demonstram que pequenas vesículas extracelulares (sEVs), encontradas em todos os biofluidos, desempenham papéis críticos na comunicação intercelular canalizando proteínas, DNA e RNAs. MicroRNAs (miRNAs) que são empacotados em sEVs surgiram como reguladores críticos de entrega em células receptoras. Como os sEVs secretados por células normais e doentes carregam diferentes cargas de miRNA, estudos recentes de perfil de sEV-miRNA sugerem que eles podem ajudar a identificar novos biomarcadores circulantes. No entanto, sEVs específicos de células/doenças circulando em diversos biofluidos, uma vez isolados, fornecem baixas quantidades de miRNA, que geralmente são difíceis de quantificar usando metodologias espectrométricas convencionais. O sequenciamento de próxima geração (NGS) de RNA não codificante pequeno, que permite a amplificação de sequências de miRNA clonadas, oferece uma oportunidade valiosa para avaliar as cargas de miRNA de sEVs. Infelizmente, os procedimentos comerciais de preparação de bibliotecas de cDNA geralmente requerem entradas de RNA bem acima das quantidades não quantificáveis disponíveis de sEVs isolados.

Assim, considerando a robustez e as capacidades de multiplexação de nosso procedimento de preparação de biblioteca de cDNA existente (ou seja, inicialmente otimizado para a análise de RNA de baixa entrada, altamente degradado e fixado em parafina fixada em formalina (FFPE), procuramos avaliar sua aplicabilidade para a análise de miRNAs sEV. É importante ressaltar que, levando em consideração as recentes melhorias técnicas de agrupamento de chips de sequenciamento, procuramos adaptar nossa abordagem de código de barras de transcrição dentro de um fluxo de trabalho de preparação de biblioteca de cDNA compatível com índice duplo e emparelhado para aprimorar nossos recursos de sequenciamento e multiplexação. Usando RNA extraído de 8,4 × 109 sEVs em 16 repetições, e de quantidades decrescentes de sEVs de 1010 sEVs para tão baixo quanto 2,5 × 107 sEVs, avaliamos a reprodutibilidade e sensibilidade desta metodologia. Os dados demonstram que os códigos de barras de DNA 16 3 'adenilados permitem a detecção altamente reprodutível e sensível de perfis de sEV-miRNA em repetições usando até 3,15 pg de pequenos RNAs não codificantes totais ou 1,35 pg de miRNAs.

Introdução

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Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são partículas nanométricas (~ 30-200 nm de diâmetro) derivadas de células envoltas por uma membrana de bicamada fosfolipídica, que é herdada de sua célula de origem e que protege robustamente suas cargas moleculares 1,2. É bem aceito que praticamente todas as células produzem e liberam sEVs no compartimento intercelular, que por sua vez podem ser detectados na maioria dos biofluidos (ou seja, sangue, urina, saliva, etc) 2 , 3 , 4 . Estudos rec....

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Protocolo

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1. Todos os reagentes e oligonucleótidos são preparados do seguinte modo:

NOTA: Todos os nucleotídeos usados neste protocolo são detalhados na Figura 1 e no Arquivo Suplementar 1 nas concentrações usadas para implementar este protocolo. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter sequências de primers.

  1. Prepare uma solução estoque de coquetel calibrador, que será usada em cada ligadura individual como controle para as diferentes reações enzimáticas:
    1. Ressuspenda o oligonucleotídeo transportador (0,5 μM) (

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Resultados

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Conforme detalhado no protocolo acima, descrevemos o processamento simultâneo de até 16 amostras individuais de RNA de pequenas vesículas extracelulares (sEV) (ou seja, para análise de pequenos RNAs e miRNAs não codificantes), que são analisados juntos em uma única biblioteca, após passar por 3' código de barras. Os sEVs selecionados para nossas análises foram isolados por ultracentrifugação, conforme descrito anteriormente37,40, de 45 mL de plasma coletado de mu.......

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Discussão

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Desenvolvemos um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA para sequenciamento de próxima geração (NGS) reprodutível e sensível de RNAs não codificantes, incluindo microRNAs (miRNAs) eficientemente isolados de pequenas vesículas extracelulares (sEVs). Considerando que uma quantidade limitada de pequenos RNAs e miRNAs não codificantes pode ser recuperada de sEVs globalmente ou seletivamente isolados, buscamos otimizar nosso procedimento de preparação de biblioteca de cDNA que permita .......

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Divulgações

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O.L. é um fundador não empregado da EValuate Diagnostics, Inc com uma pequena porcentagem de participação acionária na empresa. Os demais autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao laboratório do Dr. Thomas Tuschl por seu apoio e por fornecer acesso à tecnologia original desenvolvida em seu laboratório, além de nos conceder acesso ao pipeline RNAworld.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1% Triton X-100InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoetanolSigmaO3445I-100 
Escada de 20 nt Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Albumina de Soro BovinoSigmaB8894-5ML 
50x Taq de titânioLaboratórios Clontech 
Persulfato de AmônioFisher Scientific 7727-54-0
Transiluminador de luz azul - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Sistema de eletroforese em gel vertical com placas de vidro e pentesGIBCOV16
Dimetil sulfóxido (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrífuga 5424REUA científico4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerEUA científico4053-8223Q
Tubo de filtro com Filtro de 5 mmIST Engineering Inc.5388-50
Tubos de Microcentrífuga de Baixa Retenção Siliconizados Fisherbrand 1.5 mLFisher Scientific02-681-320
Tubo de Quebra de Gel 0.5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Aparelho de eletroforese em gel 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT com bandejas de gel e pentesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequenciador Illumina20047256
Jersey-Cote (solução à base de silício)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga pessoal de rotor duploUSA scientific2641-0016
Modelo V16 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida, óculos, pentes e espaçadoresCiências da Vida Ciore
IDTDefinido durante o pedido
Sistema de mini eletroforese Owl EasyCast B2 - com bandejas de gel e pentesB2Thermofisher Scientific
 Fluorômetro Qiagen28704
QubitThermofisher ScientificQ33238
Enzima de restrição PmeI e 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Transcriptase reversa- Superscript IIIThermoFisher12574026
Água livre de RNase AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf 5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titanium Taq PolimeraseTakara639208
T4 RNA Ligase 1 NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 T227Q truncada NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Themocycler com tampa aquecidaApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8,0AmbionAM9855G
sistema UltraPure Sequagel concentrado, diluente e tampãoNational DiagnosticsEC-833
639208 Oligonucleotídeos 21070010 Kit de extração de gel Qiaquick da Kit de transcrição reversa

Referências

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  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-22....

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