Artigo de método

Um modelo de camundongo de cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas e impulsionadas por mecanotransdução

DOI:

10.3791/67156

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29 de novembro de 2024

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1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo explicará como estabelecer um modelo murino de cicatrizes hipertróficas que aumenta a sinalização de mecanotransdução para simular cicatrizes semelhantes às humanas. Este método envolve o aumento da tensão mecânica em uma incisão de cicatrização em um camundongo e o uso de um dispositivo especializado para criar tecido cicatricial excessivo e reprodutível para análises histológicas e bioinformáticas detalhadas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cicatrização hipertrófica (HTS) é um processo anormal de cicatrização de feridas que resulta na formação excessiva de tecido cicatricial. Na última década, demonstramos que a mecanotransdução - a conversão de estímulos mecânicos em respostas celulares - leva à cicatrização excessiva de cicatrizes fibróticas. Um modelo de camundongo para avaliar cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas seria uma ferramenta essencial para examinar várias terapêuticas e sua capacidade de reduzir cicatrizes e melhorar a cicatrização. Especificamente, nosso laboratório desenvolveu um modelo de ferida murina que aumenta a tensão mecânica para promover HTS semelhante ao humano. Este protocolo utiliza dispositivos de carga biomecânica, feitos de expansores palatinos modificados de 13 mm, cujos braços são colocados em ambos os lados da incisão e distraídos gradualmente para aplicar tensão contínua no leito da ferida durante a cicatrização. Ao longo de quase duas décadas de uso, este modelo foi significativamente avançado para melhorar a eficácia e a reprodutibilidade. Usando o modelo HTS murino, cicatrizes fibróticas dérmicas significativas podem ser induzidas a serem histologicamente comparáveis às cicatrizes hipertróficas humanas. Este modelo murino fornece um ambiente para desenvolver produtos biológicos envolvidos no tratamento de HTS e condições relacionadas à mecanotransdução, como resposta a corpos estranhos.

Introdução

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A cicatrização de feridas, o processo pelo qual o corpo tenta reparar o tecido danificado e reconstruir a barreira da pele, pode resultar em cicatrização atípica se seus processos de hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação forem irregulares1. A cicatrização hipertrófica (HTS) é um exemplo de cicatrização irregular de feridas, caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular e tecido conjuntivo no local da lesão, resultando na formação de uma área de tecido cicatricial aumentada 1,2,3. Áreas do corpo que sofrem repetidos estímulos mecânicos de estiramento, como ao redor das articulações ou na face, são mais propensas a desenvolver HTS e fibrose 4,5,6,7,8,9,10. Nós e outros mostramos que o estiramento mecânico em um leito de ferida promove a formação de HTS por meio da ativação de vias de mecanotransdução - a conversão de estímulos mecânicos em respostas celulares 9,11.

O HTS não envolve apenas processos biológicos complexos, mas também traz desafios sociais, médicos e econômicos significativos para as pessoas afetadas. Os indivíduos afetados podem lutar contra a autoestima e a depressão, especialmente quando as cicatrizes estão em áreas visíveis como rosto e mãos 1,9,10,12. Artigos de revisão científica indicam que a prevalência de SHT varia entre 32% e 72% nos Estados Unidos10,13. A gravidade dessas preocupações estéticas, especialmente nos casos de queimaduras graves na região facial, é ressaltada pelo crescente número de casos de transplante facial completo para melhorar a aparência10. Essas cicatrizes também podem causar prejuízos funcionais por restringir o movimento 6,14, e a intervenção cirúrgica é frequentemente necessária para extirpar cicatrizes e restaurar a mobilidade10. O custo do tratamento HTS pode ser substancial, incluindo despesas com cirurgia, tratamentos, fisioterapia ou mesmo cuidados de longo prazo 1,10. Somente nos Estados Unidos, o custo anual do tratamento da HTS ultrapassa US$ 4 bilhões10.

Considerando a difusão da HTS e as medidas extremas tomadas para lidar com suas complicações, as terapias convencionais (por exemplo, excisão cirúrgica, injeções de corticosteróides e laserterapia) permanecem altamente variáveis 1,2,15,16,17. Embora esses tratamentos possam oferecer alívio em alguns casos, eles podem ser insuficientes devido à natureza complexa da patologia cicatricial. Fatores como diferenças genéticas entre os indivíduos e uma compreensão incompleta dos mecanismos que impulsionam a HTS fazem com que as estratégias terapêuticas permaneçam clinicamente insatisfatórias 18,19,20. O futuro da terapia HTS parece estar em novas abordagens inovadoras que visam os condutores mecanicistas celulares do HTS, como a mecanotransdução11,21, que demonstramos extensivamente para impulsionar a cicatrização fibrótica excessiva 5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. Especificamente, havíamos desenvolvido anteriormente um modelo murino que aumenta a tensão mecânica da ferida para promover o HTS9 semelhante ao humano. No entanto, após quase duas décadas de uso, o modelo foi significativamente avançado para melhorar a eficácia e a reprodutibilidade. Este protocolo permitirá que os pesquisadores utilizem melhor um modelo de camundongo HTS atualizado e otimizado para explorar as populações de células e os fatores por trás de cicatrizes excessivas. O objetivo geral deste método é fornecer aos pesquisadores um protocolo projetado para produzir cicatrizes hipertróficas semelhantes às humanas em camundongos.

Protocolo

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A aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona (IACUC) foi obtida para todos os experimentos (número de controle: 2021-0828). Este protocolo usa camundongos machos C57BL/6J de 15 semanas de idade, embora possa ser aplicado a outras idades e cepas 9,26.

1. Criando o dispositivo de carregamento biomecânico HTS

NOTA: A modificação dos expansores palatinos no dispositivo HTS pode ocorrer a qualquer momento antes do experimento.

  1. Pegue o expansor palatino não modificado e apresente ao núcleo do makerspace ou núcleo de fabricação com especificações de acordo com a Figura 1A, B.
    NOTA: Se nenhum núcleo de makerspace ou fabricação estiver disponível, continue com as etapas a seguir.
  2. Use uma ferramenta de dobra de arame Mini Universal Bender (MUB) para alterar o expansor palatino para estar em conformidade com as especificações da Figura 1A,B.
  3. Coloque o dispositivo sobre uma superfície conforme mostrado na Figura 1A1.
  4. Dobre os braços 90° para cima para a parte superior dos braços e 90° para baixo para a parte inferior dos braços quando o dispositivo estiver plano com o MUB, conforme visto na Figura 1A2. Consulte a Figura 1A3 para obter a aparência do dispositivo quando apoiado em uma superfície, onde os braços agora estão perfeitamente paralelos ao corpo do dispositivo.
  5. Dobre cada braço de volta para a página 90° ao longo do eixo da linha pontilhada, conforme visto na Figura 1A4. Consulte a Figura 1A5 para o dispositivo após a dobra.

2. Depilação e incisão inicial no 0º dia de pós-operatório (DPO 0)

NOTA: Limpe e autoclave vários conjuntos de instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia (por exemplo, tesoura de dissecação, bisturi, pinça Adson, chave de agulha). Prepare suturas esterilizadas 5-0 para uso e tenha um marcador cirúrgico à mão.

  1. Limpe o espaço operacional com spray de etanol a 70%.
  2. Coloque uma almofada de aquecimento a 35 °C na mesa de preparação pré-cirúrgica. Prenda uma almofada absorvente sobre a almofada de aquecimento. Coloque outra almofada absorvente sobre a almofada anterior (para coletar o cabelo raspado). Prenda o cone (ou cones) de anestesia na almofada absorvente.
    NOTA: [Opcional] Se um extrator de fumaça de bancada estiver disponível, coloque o cone próximo ao espaço de trabalho e ligue a sucção.
  3. Coloque o camundongo na câmara de indução anestésica com isoflurano a 1-3% e fluxo de oxigênio de 2 L/min até que os camundongos respirem calmamente (2-3 min).
  4. Insira o nariz de cada camundongo na abertura do cone do nariz, permitindo a inalação de anestesia composta por 1-3% de isoflurano com 2 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a um beliscão do dedo do pé. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos do rato.
  5. Use um barbeador elétrico para raspar os pelos do dorso na área, conforme visto na Figura 1C.
  6. Aplique a pasta depilatória com o dedo enluvado ou cotonete na pele, cobrindo a área depilada. Após 45 s, limpe a pasta com gaze e depois com um cotonete embebido em álcool. Limpe o dorso com outro cotonete embebido em álcool para remover a pasta depilatória, deixando para trás uma mancha sem pelos (Figura 1C).
    NOTA: É fundamental usar uma quantidade moderada de pasta, remover a pasta imediatamente e limpar o mouse após a remoção da pasta para evitar queimaduras dérmicas pela pasta depilatória. A pele murina é fina, tornando-a suscetível a queimaduras químicas rápidas que podem ter efeitos prejudiciais tanto na saúde do camundongo quanto na qualidade experimental.
  7. Marca de orelha do mouse para identificação.
  8. Ao remover o cabelo, coloque o mouse de volta na gaiola para evitar a exposição excessiva ao isoflurano. Monitore o mouse.
  9. Remova a almofada absorvente superior coberta com cabelo para ter uma superfície de trabalho pré-cirúrgica limpa.
  10. Configure uma área de trabalho cirúrgico separada. Coloque uma almofada de aquecimento ajustada a 35 °C na mesa cirúrgica. Prenda uma almofada absorvente sobre a almofada de aquecimento. Prenda o cone (ou cones) de anestesia na almofada absorvente.
  11. Coloque um camundongo na câmara de indução de anestesia com 2-4% de isoflurano e 2 L/min de fluxo de oxigênio até que o camundongo respire calmamente (2-3 min).
  12. Retire o mouse da câmara de indução e coloque-o na superfície de operação. Insira o nariz de cada camundongo na abertura do cone do nariz, permitindo a inalação de anestesia composta por 1-3% de isoflurano com 2 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia adequada pela falta de reação a um beliscão do dedo do pé. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos do rato.
  13. Injete 0,05 mg / kg de buprenorfina de liberação sustentada no ombro por via subcutânea usando uma agulha 21 G para tratamento pós-cirúrgico da dor.
  14. Desinfete o dorso do camundongo com três rodadas alternadas de esfoliante à base de iodo/clorexidina e cotonete com álcool. Com a caneta de marcação cirúrgica e uma régua, marque uma linha de 2 cm na linha média dorsal onde será feita a incisão de espessura total, conforme mostrado na Figura 1D.
  15. Use um bisturi ou tesoura de dissecção (preferência cirúrgica) para fazer a incisão da linha média dorsal de espessura total através da área marcada.
    NOTA: Tenha cuidado para não cortar o tecido subjacente (por exemplo, músculo), como visto na Figura 1D.
  16. Usando suturas 5-0 em um padrão simples interrompido, feche a incisão dividindo a ferida como mostrado na Figura 1D. Use pelo menos 5 suturas uniformemente espaçadas.
  17. Corte uma gaze Telfa em um pedaço de 3 cm x 1 cm. Coloque-o no centro de um curativo adesivo de espuma e coloque o curativo adesivo no dorso do camundongo de forma que a gaze cubra a incisão, conforme mostrado na Figura 1D. Coloque um curativo cortado ao meio no abdômen e enrole circunferencialmente até encontrar o curativo dorsal.
  18. Após a conclusão do curativo, coloque o camundongo em uma gaiola estéril separada e monitore-o até que ele se recupere totalmente do anestésico.
  19. Repita o procedimento com todos os camundongos, independentemente do grupo experimental. Deixe a incisão cicatrizar nos próximos 4 dias antes da próxima etapa.

3. Colocação do dispositivo de carregamento biomecânico HTS (POD 4)

NOTA: Limpe e autoclave os dispositivos HTS e vários conjuntos de instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia (por exemplo, tesoura de dissecação, bisturi, pinça Adson, chave de agulha, grampeador de pele, grampos de pele). Prepare suturas esterilizadas 5-0 para uso. [Opcional] Se um extrator de fumaça de bancada estiver disponível, coloque o cone próximo ao espaço de trabalho e ligue a sucção.

  1. Prepare a área de cirurgia conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2.
  2. Anestesie o mouse e forneça analgesia seguindo as etapas 2.11-2.13.
  3. Use a pinça ou a chave de agulha para separar o curativo do abdômen do mouse, trabalhando a ferramenta de um lado para o outro contra o lado ventral. Deixando a ferramenta entre o envoltório e a pele para elevar o curativo da pele, use uma tesoura para cortar o curativo.
    NOTA: Tenha cuidado para não cortar a pele do rato, arrancar o curativo ou perturbar a incisão de cicatrização.
  4. Limpe o dorso com um cotonete embebido em álcool. Examine a incisão em busca de deiscência da ferida ou sinais de infecção.
  5. Certifique-se de que o dispositivo HTS não esteja estendido/expandido e esteja em sua forma mais reduzida, conforme mostrado na Figura 1B. Cubra levemente os braços do dispositivo com cola médica.
  6. Com uma mão, torne a pele do dorso do camundongo ligeiramente esticada na direção transversal. Com a outra mão, coloque o dispositivo HTS no dorso do mouse de forma que a incisão fique equidistante de cada braço do dispositivo HTS, centralizando assim o dispositivo sobre a incisão. Certifique-se de que a pele entre os braços do dispositivo HTS esteja uniformemente esticada. Segure o dispositivo no lugar até que a cola seque (~30 s), conforme mostrado na Figura 2A.
    NOTA: Manter a pele uniformemente esticada é importante para garantir que quantidades iguais de tensão sejam colocadas na incisão com o dispositivo. Deixe as suturas intactas durante este processo, pois o processo de colocação do dispositivo adiciona tensão mecânica à pele, o que pode reabrir a incisão de cicatrização. As suturas permanecem no lugar até o primeiro dia de alongamento para garantir que a ferida permaneça fechada.
  7. Prenda quatro suturas ao redor de cada braço e através da pele, conforme mostrado na Figura 2B. Durante a sutura, certifique-se de que a agulha saia da pele em direção à incisão.
    NOTA: Inserir a agulha pelo lado da incisão do dispositivo às vezes pode rasgar a incisão devido à força necessária para perfurar a pele.
  8. Agora coloque três grampos de pele ao redor dos braços e através da pele, prendendo o dispositivo HTS à pele, conforme mostrado na Figura 2B.
  9. Enfaixe o mouse seguindo as etapas 2.17 e 2.18.
  10. Repita o procedimento com todos os camundongos, independentemente do grupo experimental.
    NOTA: Todos os ratos recebem a mesma preparação; no entanto, eles são atribuídos aleatoriamente em cada grupo experimental (por exemplo, controle, alongamento) para garantir uma distribuição imparcial de camundongos no projeto experimental. Especificamente, os camundongos de controle e alongamento terão o dispositivo conectado ao dorso. Os dispositivos dos mouses de controle permanecerão intocados, enquanto os mouses stretch passarão pelas próximas etapas.

4. Alongamento inicial do dispositivo de carregamento biomecânico HTS (POD 5)

NOTA: Limpe e autoclave vários conjuntos de instrumentos cirúrgicos (por exemplo, tesoura de dissecação, bisturi, pinça Adson, chave de agulha) antes da cirurgia. [Opcional] Se um extrator de fumaça de bancada estiver disponível, coloque o cone próximo ao espaço de trabalho e ligue a sucção.

  1. Atribua aleatoriamente cada mouse via brinco ao grupo desejado. Para camundongos de controle, basta remover as suturas da incisão e trocar os curativos das feridas (etapas 1-6 e 8-9). Se desejar, remova o dispositivo no momento do alongamento e tire uma foto com um instrumento de medição para escala para rastrear o tamanho da cicatriz.
  2. Prepare a área cirúrgica, anestesiar o mouse e remover o curativo executando as etapas 3.1-3.4.
    NOTA: Tenha cuidado para não arrancar o curativo ou perturbar a incisão de cicatrização. Se um braço do dispositivo HTS se desprendeu da pele, cole levemente de volta no lugar e adicione um grampo de pele ou sutura, dependendo do tamanho do descolamento.
  3. Remova as suturas da ferida com tesoura de dissecção ou outro método de sua escolha.
  4. Insira a chave do dispositivo HTS no dispositivo e gire para expandir o dispositivo até que a pele esteja esticada, mas sem risco de rasgá-la, conforme visto na Figura 2C.
    NOTA: Essa distração inicial pode levar cerca de 4 a 8 voltas completas da chave, pois a pele pode ficar solta entre os braços do dispositivo.
  5. Enfaixe o mouse executando as etapas 2.17 e 2.18.

5. Trecho subsequente do dispositivo de carregamento biomecânico HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

NOTA: Limpe e autoclave vários conjuntos de instrumentos cirúrgicos (por exemplo, tesoura de dissecação, bisturi, pinça Adson, chave de agulha) antes da cirurgia. [Opcional] Se o extrator de fumaça de bancada estiver disponível, coloque o cone próximo ao espaço de trabalho e ligue a sucção.

  1. Para camundongos de controle, basta trocar os curativos das feridas (etapas 1 a 5 e, em seguida, etapas 13 a 14). Se desejar, remova o dispositivo no momento do alongamento e tire uma foto da cicatriz com um instrumento de medição para escala para rastrear o tamanho da cicatriz.
  2. Prepare a área cirúrgica, anestesiar o mouse e remover o curativo seguindo as etapas 3.1-3.4.
    NOTA: Se um braço de um dispositivo HTS se desprendeu da pele, cole-o no lugar e adicione um grampo de pele ou sutura, dependendo do tamanho do descolamento.
  3. Insira a chave do dispositivo HTS no dispositivo e gire para expandir o dispositivo até que a pele esteja esticada, mas sem risco de rasgá-la.
    NOTA: Isso pode levar aproximadamente 4 voltas ou ~ 2 mm de distração total. Se o dispositivo atingiu a extensão máxima e não pode ser estendido mais, execute as etapas 5.4 a 5.7 para retirar e reconectar um novo dispositivo. Caso contrário, enfaixe o mouse executando as etapas 2.17 e 2.18.
  4. Se o dispositivo atingir a extensão máxima, remova o dispositivo do dorso do mouse removendo os grampos com um removedor de grampos ou tesoura abrindo as pontas dos grampos. Em seguida, remova as suturas e remova cuidadosamente o dispositivo.
  5. Limpe o dispositivo com bisturi, compressas embebidas em álcool e toalhas de papel. Mergulhe o dispositivo em etanol a 70% por ~ 20 min para ajudar na limpeza. Em seguida, use a chave para contrair o dispositivo em sua forma mais fina.
  6. Reconecte o dispositivo HTS seguindo as etapas 3.5 a 3.8.
  7. Enfaixe o mouse seguindo as etapas 2.17 e 2.18.

6. Colheita do tecido HTS (POD 19)

NOTA: A coleta de tecido pode ocorrer em qualquer ponto do processo. Coletamos tecido após apenas 4 dias de alongamento para examinar os primeiros pontos no tempo; no entanto, o tecido é colhido de forma mais consistente no POD 19 (2 semanas após o início da cepa). Limpe e autoclave vários conjuntos de instrumentos cirúrgicos (por exemplo, tesoura de dissecação, bisturi, pinça Adson) antes da cirurgia. Para obter fotos da cicatriz ao longo do tempo, o dispositivo pode ser removido antes de cada etapa de alongamento para tirar uma foto da cicatriz antes de reaplicar o dispositivo e reiniciar a tensão mecânica. [Opcional] Se um extrator de fumaça de bancada estiver disponível, coloque o cone próximo ao espaço de trabalho e ligue a sucção. O extrator de fumaça de bancada pode ser desligado quando o gás isoflurano não estiver mais sendo usado.

  1. Prepare a área cirúrgica, anestesiar o mouse e remover o curativo seguindo as etapas 3.1-3.4.
  2. Sacrifique o camundongo por luxação cervical.
    NOTA: Tome cuidado para não puxar a pele e rasgar o dorso do camundongo.
  3. Use uma tesoura de dissecação ou um removedor de grampos de pele para remover os grampos de pele. Corte as suturas. Remova suavemente o dispositivo HTS, tomando cuidado para não rasgar a pele.
  4. Usando um bisturi ou uma tesoura, corte a pele ao redor da cicatriz HTS. Preservar a pele para análise histológica da maneira desejada.
    NOTA: Se a pele for usada para análise transcriptômica ou de proteínas (por exemplo, qPCR, western blot, análise de célula única), certifique-se de extirpar apenas o tecido cicatricial HTS para minimizar a quantidade de tecido saudável circundante. Isso garantirá que a análise capture apenas o tecido cicatricial.
  5. Raspe os dispositivos HTS com um bisturi. Coloque os dispositivos em um béquer com etanol a 70% para amolecer qualquer adesivo ou lenço restante.
    NOTA: Após a imersão em etanol a 70%, os dispositivos podem exigir mais limpeza, raspagem e limpeza antes da autoclavagem.

7. Medindo a largura média da cicatriz

NOTA: Isso foi feito com o software de análise de imagens ImageJ, e as informações foram registradas em uma planilha.

  1. Abra imagens no ImageJ. Trace as bordas da cicatriz com a ferramenta de polígono . Clique em analisar | medir para medir esta área.
    NOTA: A cicatriz pode ser identificada por sua descoloração e falta de folículos pilosos.
  2. Meça o comprimento da cicatriz de ponta a ponta usando a ferramenta de segmento . Clique em analisar | medir para medir esse comprimento.
  3. Meça o comprimento de 1 cm ou qualquer outra unidade padronizada de comprimento na imagem, usando a ferramenta de segmento . Clique em analisar | medir para medir esse comprimento.
  4. Usando a planilha, pegue a área da cicatriz (em pixels; px) e divida-a pelo comprimento da cicatriz (comprimento px ). Esse resultado fornece a largura média da cicatriz em pixels.
  5. Divida esse resultado pela unidade padrão medida de comprimento (comprimento px). O resultado será a largura média da cicatriz na unidade da unidade padrão de comprimento (por exemplo, cm) usada para o experimento.

Resultados

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Para demonstrar claramente o uso efetivo do protocolo HTS e identificar resultados "positivos" bem-sucedidos, o modelo foi estabelecido conforme mostrado na Figura 3A. No estudo representativo, havia dois grupos: Sem controle de estiramento (n = 6) e grupo HTS de estiramento mecânico (n = 6), onde níveis semelhantes aos humanos de tensão mecânica foram induzidos através da incisão para gerar um HTS, visto na Figura 3B, C. Dentro do plano experimental dado na Figura 3A-C, foi tirada uma fotografia macroscópica da cicatriz nos PODs 5, 9, 15 e 19. As cicatrizes foram traçadas com ImageJ e analisadas quanto à largura média das cicatrizes nos diferentes momentos (Figura 3D). As larguras médias das cicatrizes foram representadas graficamente em relação ao tempo e entre os grupos na Figura 3E. Após a aplicação de esforço mecânico no DPO 5, onde as cicatrizes não foram significativamente diferentes entre o Stretch e o Controle, o Grupo Stretch exibiu cicatrizes significativamente mais largas do que o Controle, atingindo um pico de largura de 0,99 mm no DPO 9 (p = 0,045). Essa largura de cicatriz significativamente maior em comparação com o controle continuou no DPO 15 (p = 0,043) e 19 (p = 0,045). Recomenda-se que a fotografia macroscópica seja tirada apenas nos dias em que o dispositivo HTS precisa ser removido (ou seja, o dispositivo HTS atingiu a expansão máxima e precisa ser recolocado ou durante o explante), pois o dispositivo bloqueia a fotografia adequada da cicatriz. Neste protocolo, imagens e análises de largura de cicatriz em vários pontos de tempo fornecem uma visão mais clara da progressão da ferida do modelo para o leitor.

A análise do tecido HTS pode ser feita de várias maneiras, como coloração IHC para marcadores fibróticos, coloração H & E e tricrômico para examinar as áreas histológicas da cicatriz, coloração picrosirius red para avaliar a arquitetura de colágeno das cicatrizes e outros métodos para análise de feridas - todos os quais têm sido usados pelo laboratório historicamente6, 8,21,24,25,27,28 (Figura 4). A Figura 4 mostra as características histológicas do tecido HTS, como tecido cicatricial elevado (Figura 4A), perda de estruturas anexiais e folículos pilosos (Figura 4B), alinhamento das fibras colágenas na direção da carga mecânica (Figura 4C) e verticilos de colágeno (Figura 4F). A Figura 4 também demonstra a coloração imuno-histoquímica da densidade de mastócitos e vasculatura do HTS murino e a compara com o tecido HTS humano (Figura 4D, E, G, H). Além disso, a análise da cicatriz HTS pode ser feita com análise de célula única se o tecido for colhido, preparado e levado para um núcleo de bioinformática imediatamente após a excisão.

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Figura 1: Preparação do dispositivo HTS e do dorso do camundongo. (A) Processo de modificação de um expansor palatino de 13 mm para criar o dispositivo HTS, (1) mostrando a estrutura inicial do expansor, (2) flexão dos braços 90° para cima para os braços e para baixo para os braços inferiores quando o dispositivo fica plano, (3) resultado da flexão inicial, onde os braços agora estão perfeitamente paralelos ao corpo do dispositivo, (4) flexão dos braços para formar o dispositivo final com medições; Os braços devem ser dobrados 90° na página, conforme visto no dispositivo final (5). (B) O dispositivo HTS totalmente montado de vários ângulos, tanto não estendidos quanto estendidos. (C) Etapas sequenciais para preparar o dorso do camundongo: (1) estado inicial com pelo, (2) após o barbear e (3) pós-aplicação de pasta depilatória. (D) Procedimento para criar a incisão dorsal: (1) marcar o local da incisão com uma diretriz de 2 cm, (2) fazer a incisão, (3) suturar a ferida, (4) aplicar a gaze Telfa e (5) fixar com curativo adesivo. (E) Fotografia macroscópica da (1) incisão e (2) após a sutura da incisão fechada. Abreviatura: HTS = cicatriz hipertrófica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Posicionamento e alongamento do dispositivo HTS. (A) Ilustração do posicionamento correto do dispositivo HTS no dorso do camundongo, garantindo o alinhamento adequado com o local da incisão. A imagem à esquerda mostra o posicionamento do dispositivo visto de uma posição posterior. A imagem à direita mostra o posicionamento do dispositivo visto lateralmente. (B) Ilustração da fixação do dispositivo HTS: (1) colocação inicial, (2) localização das suturas, (3) localização dos grampos da pele. (C) Demonstração de alongamento do dispositivo HTS com a chave do dispositivo HTS rotulada: (1) configuração inicial, (2) aplicação de tensão, (3) o estado expandido final projetado para aplicar tensão mecânica consistente na incisão de cicatrização para promover a formação de cicatrizes hipertróficas, 2 mm de expansão aplicada. (D) Fotografia bruta da aplicação de tensão ao dispositivo HTS, com a chave do dispositivo HTS rotulada. (E) Fotografia bruta do rato totalmente enfaixado. Abreviatura: HTS = cicatriz hipertrófica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Aplicação de esforço mecânico para desenvolver cicatrizes. (A) Linha do tempo do procedimento experimental desde a criação da incisão (DPO 0) até a aplicação do esforço mecânico (DPO 4) e durante o período de alongamento (DPO 5 a DPO 19), culminando no explante tecidual (DPO 19). (B) Ilustração dos dois grupos: grupos Sem Controle de Estiramento e Alongamento Mecânico HTS. (C) Esquema transversal que descreve a diferença na resposta tecidual entre os grupos No Stretch Control e Stretch HTS. (D) Imagens macroscópicas representativas de cicatrizes dos grupos No Stretch Control e Stretch HTS nos dias pós-operatórios (DPO 5, 9, 15 e 19), com as cicatrizes hipertróficas traçadas em uma linha pontilhada amarela. (E) Análise quantitativa da largura média da cicatriz ao longo do tempo, demonstrando diferenças significativas no desenvolvimento da cicatriz entre os grupos Sem Alongamento e Alongamento, com barras de erro representando o desvio padrão. As diferenças significativas são marcadas com asteriscos (*). A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de duas vias. Valores de *p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Abreviaturas: HTS = cicatriz hipertrófica; DPO = dia de pós-operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Histologia da cicatriz. Esta histologia de cicatriz murina foi colhida após 2 semanas de estresse mecânico em nosso trabalho publicado anteriormente9,26. (A) A imagem maior mostra a imagem histológica H & E da seção transversal da cicatriz, enquanto o canto inferior direito é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando como a região da cicatriz é elevada. (B) A imagem maior mostra a imagem histológica H & E da seção transversal da cicatriz, enquanto o canto inferior direito é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando como a região da cicatriz demonstra uma perda de estruturas anexiais e folículos pilosos. (C) A imagem maior mostra a imagem vermelha picrosirius da seção transversal da cicatriz, enquanto a parte inferior direita é a imagem histológica tricrômica da seção transversal da cicatriz, mostrando fibras colágenas alinhadas na direção da carga mecânica. (D) A imagem maior mostra imagens de imuno-histoquímica de CD117 em tecido HTS murino, enquanto o canto inferior direito é de imagens de imuno-histoquímica de CD117 em tecido humano, demonstrando densidade de mastócitos comparável ao tecido HTS humano. (E) A imagem maior mostra imagens de imuno-histoquímica CD31 da vasculatura em tecido HTS murino, enquanto o canto inferior direito é imagem de imuno-histoquímica CD117 em tecido humano, demonstrando densidade de mastócitos comparável ao tecido HTS humano. (F) Verticilos de colágeno, vistos em cicatrizes hipertróficas humanas maduras na imagem no canto inferior direito, também são vistos em cicatrizes murinas carregadas após 24 semanas na região circulada em imagens murinas de H & E. (G) Imagens macroscópicas representativas de cicatrizes de um grupo Controle (Incisão + Sem Alongamento), um grupo Controle de Estiramento (Sem Incisão + Estiramento) e um grupo Alongamento HTS. (H) Mostra imuno-histoquímica comparando o grupo Controle (Incisão + Sem Alongamento) e o grupo Stretch HTS. Usando uma co-coloração para marcadores fibróticos pEPF, aSMA e YAP com DAPI, há um aumento nos marcadores fibróticos no grupo HTS. A-F foram adaptados de Aarabi, S. et al.9. G,H foram adaptados de Mascharak, S. et al. Reproduzido com permissão da FASEB26. Abreviaturas: HTS = cicatriz hipertrófica; H&E = hematoxilina e eosina; pEPF = Fibroblasto Engrailed-positivo; aSMA = actina do músculo liso alfa; YAP = proteína associada a Yes; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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O modelo de camundongo HTS é um método econômico e altamente reprodutível para induzir HTS via mecanotransdução e desenvolver terapias potenciais. Embora haja uma curva de aprendizado inicial para usar efetivamente o modelo, o protocolo pode, com a prática, ser realizado por qualquer pesquisador sem treinamento cirúrgico. O uso desse modelo permite que os pesquisadores entendam melhor a formação de HTS e o papel da mecanotransdução na cicatrização de feridas, o que pode levar a melhorias tangíveis no tratamento de feridas do paciente. A demonstração em vídeo que acompanha este protocolo reduzirá idealmente a curva de aprendizado para os pesquisadores e facilitará a implementação suave desse modelo em estudos futuros. No entanto, há uma série de etapas críticas no protocolo que podem se beneficiar de mais explicações para aumentar a clareza para os usuários.

Progredindo cronologicamente desde o início do protocolo, o primeiro passo fundamental é fechar a incisão cirúrgica no dia 0 do pós-operatório (DPO 0). É imprescindível que a incisão seja fechada completamente com as camadas de pele em perfeita aposição29. Isso é para garantir que a incisão cicatrize adequadamente e não abra quando o dispositivo for colocado e a tensão for induzida na ferida. Se a ferida se abrir (deiscência), o animal não deve ser usado para experimentação adicional.

Ao colocar o dispositivo HTS no POD 4, é crucial garantir quantidades iguais de tensão no dorso do mouse. Com a colocação adequada do dispositivo, a tensão exercida será uniforme ao longo de toda a incisão, mitigando o risco de aplicação de força variável que pode resultar em resultados experimentais abaixo do ideal (cicatrizes não uniformes). Se o dispositivo estiver conectado incorretamente, partes da incisão não receberão igualmente a média de 2 mm de distração em dias alternados para induzir HTS. A expansão do dispositivo deve eliminar a folga na pele e torná-la esticada. Simultaneamente, deve-se tomar cuidado para evitar a extensão excessiva do dispositivo, o que pode causar deiscência da ferida. Se os dispositivos forem usados para várias rodadas de experimentos, a engrenagem rotativa na qual a chave é colocada para expandir e contrair o dispositivo pode se soltar. Se isso acontecer, um novo dispositivo deve ser feito e o dispositivo antigo descartado.

Quando a tensão é iniciada no DPO 5, qualquer terapia destinada à prevenção de cicatrizes deve começar a ser administrada. Terapias como pomadas tópicas são geralmente administradas em dias alternados quando a tensão é iniciada ao ser espalhada sobre o local da incisão. Os hidrogéis são colocados de forma semelhante sobre o local da incisão. As terapias sistêmicas podem ser injetadas na corrente sanguínea através da veia da cauda ou retroorbitalmente.

É aconselhável raspar e/ou aplicar levemente pasta depilatória no dorso do camundongo ao redor da cicatriz no POD 19 ou antes de fotografar a cicatriz. Isso melhora a visibilidade e a análise subsequente do tamanho da cicatriz com o ImageJ. Além disso, ao usar pasta depilatória, prefira menos pasta e menos tempo. A superexposição do dorso do camundongo à pasta pode causar queimaduras químicas que podem interferir no processo de cicatrização da ferida. A pele do camundongo é mais fina que a pele humana e é mais propensa a queimaduras químicas30.

O modelo de camundongo HTS é inerentemente limitado, pois não utiliza pele humana e, portanto, não pode recapitular totalmente o HTS humano. No entanto, tem um número significativo de vantagens logísticas sobre outros modelos animais; executado corretamente, este modelo HTS de mouse é confiável, barato e de fácil execução. Biologicamente, o HTS é induzido por meio de aumentos físicos na sinalização mecânica. Outros modelos de HTS em coelhos induzem HTS na orelha ou no dorso usando lesão térmica e química 30,31,32. A pele do lado ventral da orelha de coelho não envolve muitas células além das células da pele durante a cicatrização, como os condrócitos 1,30. Outro método é um modelo HTS de queimadura em pele suína33, mas pode ser logisticamente desafiador em termos de custo e manuseio. O modelo suíno é provavelmente o mais semelhante na recapitulação do HTS humano; no entanto, é um método caro para coletar resultados iniciais. Um modelo final de HTS é o xenoenxerto de pele humana excisada em camundongos, mas isso pode desencadear uma resposta imune e não explora a formação de novas cicatrizes34.

Os métodos acima de indução de HTS em modelos animais não desencadeiam adequadamente a resposta natural de cura do corpo da mesma forma que as cicatrizes humanas de HTS se formam. Em contraste, o modelo HTS de camundongo baseado em mecanotransdução emprega tensão mecânica para iniciar cicatrizes hipertróficas, espelhando de perto o HTS humano 1,9,21. Este método se baseia no processo fisiológico de sinalização de mecanotransdução para capturar a biomecânica do tecido subjacente e os impulsionadores da população celular por trás da fibrose. Este modelo é ideal para estudar alvos biológicos para inibir ou mesmo induzir vias de mecanotransdução, potencialmente levando à descoberta de novas terapias translacionais.

Divulgações

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Os autores não têm interesses conflitantes ou outros conflitos associados ao conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Prêmios de Projeto Translacional Interdisciplinar de Regeneração de Tecidos e Órgãos Dentários, Orais e Craniofaciais, apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (U24 DE026914) (GCG) e pela Bolsa de Pesquisa Translacional da Fundação de Cirurgia Plástica (837107) (KC).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100 mL PYREX Copo de grifoMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta mini aparadorAesculap
AutoClip SystemFine Surgical Instruments12020-00
Cotonetes de álcool isopropílico da marca BDFisher Scientific13-680-63
Buprenorfina SR (0,5 mg/mL)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 fêmeas (6– 8 semanas de idade)The Jackson Laboratory000664
gaze estéril CovidienFisher Scientific2187
Almofadas não aderentes Covidien TelfaTMFisher Scientific, Covidien1961
Régua cirúrgica odontológicaDoWell Dental ProductsS1070
Creme depilatório (Loção Removedora de Pêlos Nair)Church& Dwight, CVS339823
Solução de etanol a 70%Fisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft CooperationMicrosoft.comprograma de software 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netprograma de software 
Sistema de anestesia por inalaçãoVetEquip922130
Tesoura de íris 4½ in. inoxidávelMcKesson43-2-104
Isoflurano, USPDechra Produtos Veterinários17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Só é necessário se não houver espaço para fabricante ou oficina de fabricação disponível 
Expansor Palatino Rápido Leone - 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004A chave necessária para expandir e controlar o dispositivo virá com este produto na caixa
Campo repelente de líquidos 75 x 90 cm com furo adesivo 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Porta-agulhas 5 pol. com mandíbulas serrilhadasMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comprograma de software 
Pomada oftálmica PuralubeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comprograma de software 
Marcador cirúrgico de peleMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191curativo adesivo de espuma 
Almofada de aquecimento Thermo-peepK& H, Pinça de Tecido Amazon
4¾ in. inoxidável 1 x 2 dentesMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB

Referências

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