Modelo de Coma Isquêmico Cerebral Induzido por Oclusão Modificada de Quatro Vasos

Resumo

Este protocolo descreve o processo de indução de um modelo de coma isquêmico cerebral usando um método modificado de oclusão de quatro vasos.

Resumo

O coma causado por isquemia cerebral é a complicação mais grave da isquemia cerebral. A oclusão de quatro vasos pode estabelecer um modelo de coma isquêmico cerebral para pesquisa de doenças e desenvolvimento de medicamentos. No entanto, o método de oclusão de quatro vasos comumente usado envolve principalmente a inserção de uma caneta de eletrocoagulação no forame pterigóideo bilateral da primeira vértebra cervical atrás do pescoço para eletrocoagular as artérias vertebrais. Esse processo acarreta o risco de eletrocoagulação incompleta, sangramento e danos ao tronco encefálico e à medula espinhal. Vinte e quatro horas após a cirurgia, os ratos reanestesiados são submetidos à ligadura da artéria carótida na frente do pescoço. Duas cirurgias expõem os ratos a um risco maior de infecção e aumentam o período experimental. Neste estudo, durante um único procedimento cirúrgico, uma incisão cervical anterior foi usada para localizar o local-chave onde a artéria vertebral penetra na primeira vértebra cervical. As artérias vertebrais bilaterais foram eletrocauterizadas em condições visuais, enquanto as artérias carótidas comuns bilaterais foram separadas para colocar nós soltos. Quando os membros dos ratos começaram a se contorcer, as artérias carótidas comuns bilaterais foram rapidamente ligadas para induzir o coma isquêmico. Este método pode evitar o risco de infecção causada por duas operações cirúrgicas e é fácil de realizar com uma alta taxa de sucesso, fornecendo uma referência útil para profissionais relevantes.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico isquêmico é a lesão cerebral mais comum na prática clínica, sendo responsável por aproximadamente 75% dos casos de doenças cerebrovasculares. A isquemia pode levar a lesões cerebrais secundárias graves e doenças ^1,2, e o coma é o sintoma mais grave causado por lesão cerebral hipóxica isquêmica. É também o caminho final para muitas condições críticas³. O coma é uma doença crítica e grave na prática clínica de difícil manejo⁴. Quanto mais tempo durar o coma, maior será o perigo potencial. O despertar imediato é o objetivo principal na prevenção da deterioração e progressão da condição. Embora a injeção de naloxona tenha uma ampla gama de aplicações clínicas na promoção da vigília, ela ainda apresenta alguns efeitos colaterais⁵. Portanto, o desenvolvimento de medicamentos seguros e eficazes para promover a vigília é um problema urgente que precisa ser abordado. O estabelecimento de um modelo de coma isquêmico cerebral simples e fácil de operar é essencial para elucidar a patogênese do coma isquêmico e para o desenvolvimento de medicamentos ^6,7,8.

O objetivo deste estudo é apresentar um modelo de indução de coma isquêmico global por meio de eletrocoagulação de artérias vertebrais bilaterais (AV) e ligadura temporária de artérias carótidas comuns (ACC) bilaterais, que seja simples e de fácil utilização para iniciantes. O protocolo anterior envolvia a exposição do forame pterigóideo bilateral da primeira vértebra cervical posterior durante a primeira operação e a queima elétrica do forame pterigóideo para bloquear os AVs bilaterais. Uma segunda operação foi realizada 24 h depois para induzir o coma isquêmico total por ligadura dos CCAs bilaterais 9,10,11,12. No entanto, devido à invisibilidade, existe o risco de eletrocoagulação incompleta, sangramento, lesão do tronco encefálico e da medula espinhal, bem como um período experimental prolongado. Portanto, é necessário abordar essas questões.

Aqui, apresentamos um método aprimorado para modelar o coma isquêmico. O procedimento principal envolve fazer uma incisão anterior mediana no pescoço, realizar a ressecção elétrica dos AVs bilaterais em condições visuais e ligar brevemente os CCAs bilaterais durante uma única operação para bloquear o suprimento de sangue para todo o cérebro, causando inibição rápida do eletroencefalograma (EEG) e levando ao coma. Este método também induz um breve coma contínuo após a reperfusão. Este procedimento é fácil de executar, amigável para iniciantes e reduz o risco de infecção por trauma secundário em animais, encurtando assim o período experimental.

O protocolo é adequado para o estudo do coma isquêmico global causado por parada cardíaca. Também é ideal para o estudo da demência isquêmica, principalmente porque a área do cérebro do hipocampo é extremamente sensível à isquemia; Assim, a isquemia cerebral transitória pode levar a danos ou mesmo perda de neurônios hipocampais¹³, resultando em disfunção cognitiva. Portanto, o protocolo pode fornecer uma referência para os profissionais que estudam isquemia cerebral, coma isquêmico e demência isquêmica.

Protocolo

O protocolo experimental foi conduzido de acordo com os requisitos do Comitê de Uso de Animais de Laboratório e Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade de Foshan (número de registro: 2023-643656). Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) (200 g ± 20 g, 6-8 semanas de idade) foram utilizados para este estudo. Todos os dados de pesquisa com animais foram escritos de acordo com as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de eletrodos de EEG

1. Injetar 0,05mg/kg de atropina por via subcutânea 15 min antes da anestesia para evitar obstrução respiratória e asfixia causada por secreções. Administrar uma injeção intramuscular de 20 mg/kg de zoletil e 5 mg/kg de xilazina para anestesiar os ratos¹⁴. Use uma pinça para prender os dedos do rato para confirmar a anestesia profunda.
2. Remova o cabelo da cabeça do rato com um barbeador de cabelo. Fixe a cabeça do rato em um dispositivo estereotáxico cerebral usando barras de ouvido não penetrantes. Use bolas de algodão estéreis para aplicar etanol e iodopovidona três vezes no local da cirurgia para desinfetar a pele.
3. Corte a pele da cabeça do rato ao longo da sutura decapitada com uma lâmina cirúrgica. Remova o músculo que cobre o crânio e exponha completamente o crânio. Use cotonetes estéreis para parar o sangramento durante todo o processo.
4. Seque a superfície do crânio com uma bola de lavagem de orelha para ajudar o cimento dental a aderir firmemente ao crânio. Marque a posição de instalação da haste do crânio (Diâmetro 1.2 mm, Comprimento 3 mm) com um marcador preto (Figura 1, etapa 1). As posições específicas são o ponto da fontanela anterior e quatro outros locais.
5. Use a agulha de uma seringa de 10 mL para girar e perfurar quatro áreas em sequência. Insira quatro unhas do crânio no crânio em sequência, garantindo o contato com o córtex cerebral (Figura 1, etapas 2-3).
   NOTA: Use cotonetes estéreis para absorver o sangue em caso de sangramento para evitar a ferrugem das unhas ósseas.
6. Enrole o fio de prata do eletrodo de EEG ao redor da unha do crânio. Incorpore o eletrodo eletromiográfico no músculo e fixe-o com uma sutura 6-0.
7. Misture a resina da base da prótese com pó de dentadura autoajustável e fixe o eletrodo no crânio. Use uma bola de lavagem de ouvido para soprar ar na superfície do cimento dental para acelerar a cura.
8. Injete 10.000 unidades de penicilina para prevenir infecções. Alojar cada rato em uma gaiola separada para evitar rasgos mútuos e danos aos eletrodos. Injetado por via subcutânea 0,2 mg/kg de meloxicam por três dias consecutivos para aliviar a dor pós-operatória. Aguarde 3 dias para a recuperação de feridas de rato e fixação do eletrodo (Figura 1, etapa 4).

2. Processo cirúrgico do modelo de coma isquêmico cerebral

1. Três dias depois, reanestesiar os ratos e colocá-los em decúbito dorsal. Use bolas de algodão estéreis para desinfetar o local da cirurgia por meio de três aplicações repetidas de iodo seguidas de um enxágue/lenço umedecido com álcool. Faça uma incisão de cerca de 2-3 cm de comprimento com um bisturi da margem superior do esterno longitudinalmente ao longo do meio do pescoço (Figura 1, passo 5).
2. Separe sem rodeios o tecido subcutâneo e o músculo esterno-hióideo, expondo totalmente a traqueia e os músculos longos do pescoço em ambos os lados da traqueia¹⁵.
   NOTA: Evite estimular a traqueia durante todo o procedimento.
3. Separe sem rodeios os músculos longos do pescoço do nível da glândula tireoide para baixo, expondo a primeira e a segunda vértebras cervicais. Expanda a área do pescoço com um dilatador de tecido de rato, expondo totalmente o local da cirurgia.
4. Use uma pinça fina para separar cuidadosamente os músculos e tecidos visíveis no espaço intervertebral cervical, expondo o local característico onde a artéria vertebral entra na primeira vértebra cervical. Pode-se observar que a artéria vertebral passa pela primeira vértebra cervical (Figura 1, passo 6).
   NOTA: Colocar uma seringa de 1 mL sob o pescoço fornece um espaço de manipulação cirúrgica mais claro.
5. Pré-aqueça a caneta de eletrocoagulação e insira-a na área por 3-5 s para garantir que a artéria vertebral seja eletrocoagulada e cortada. Separe os músculos e a fáscia ao longo da borda interna do músculo esternocleidomastóideo, exponha e libere os CCAs bilaterais e dê um nó solto.
   NOTA: A caneta de eletrocoagulação deve ser pré-aquecida; caso contrário, não pode coagular rapidamente a artéria vertebral, levando ao sangramento. Ambas as artérias vertebrais são eletrocoaguladas e nós soltos são amarrados ao redor dos CCAs.
6. Aperte rapidamente o primeiro nó solto para bloquear o fluxo sanguíneo no CCA quando os ratos recuperarem a consciência e exibirem espasmos nos membros, enquanto o detector de EEG detecta sinais ativos de EEG e EMG. Os ratos lutarão por alguns segundos e depois perderão gradualmente a consciência (Figura 1, etapa 7).
7. Depois de liberar a fixação, observe que os membros do rato estão rígidos, o reflexo de endireitamento desaparece, mas a respiração é mantida. Nesse ponto, o eletromiograma (EMG) apresenta uma linha reta, e o EEG é rapidamente suprimido, indicando que o modelo de isquemia cerebral induzida por 4-VO foi bem-sucedido¹⁶.
   NOTA: A depressão respiratória ocorre em alguns ratos durante a ligadura bilateral da CCA. A estimulação mecânica rápida pode restaurar a respiração espontânea em alguns ratos.
8. De acordo com o "método de amarração de controle de agulha¹⁶", amarre o CCA com uma agulha de seringa de 0.5 mm de diâmetro usando fio de náilon 6-0 a cerca de 1.5 cm de distância da bifurcação do CCA, ICA e ECA. Puxe a agulha com cuidado; este segundo nó fará com que a artéria carótida se estreite (Figura 1, passo 8).
   NOTA: A ligadura usada para estenose CCA precisa ser feita de material de nylon, que é estável. O fio de nylon não é afetado pelo sangue e não engrossa; caso contrário, pode causar estenose extrema da ACC em ratos e aumentar a taxa de mortalidade.
9. Após 30 min de isquemia, desatar o primeiro nó, e a ACC sofrerá reperfusão, mas o segundo nó resultará em estenose da ACC, induzindo coma sustentado (Figura 1, passo 9). Feche o tecido subcutâneo com suturas de monofilamento absorvíveis e a pele com suturas de monofilamento não absorvíveis.

3. Recuperação de animais

1. Coloque os ratos em almofadas de isolamento e injete 10.000 unidades de penicilina para prevenir infecções. Injetar 0,2 mg/kg de meloxicam por via subcutânea durante três dias consecutivos para aliviar a dor pós-operatória.
2. Após 60 minutos de reperfusão, certifique-se de que os ratos se recuperem gradualmente.

Resultados

Devido à inflamação e outros estímulos causados pela implantação de eletrodos, o EEG pode ser instável, então os ratos precisam se recuperar por 3 dias. Ratos com EEG e EMG normais após 3 dias podem ser incluídos para a preparação do modelo de coma. Quando os ratos foram anestesiados, a atividade do EEG e EMG foi ligeiramente suprimida, mas prosseguiu suavemente. Não houve alteração significativa na atividade do EEG e EMG após a eletrocoagulação bloqueando os AVs bilaterais. Após cerca de 30 minutos, a droga foi metabolizada, os ratos recuperaram gradualmente a consciência e a atividade do EEG e EMG aumentou. Quando os ratos exibiam espasmos nos membros, enquanto os sinais de EEG e EMG estavam ativos e não mais em linha reta, o CCA foi rapidamente ligado. Nesse momento, todos os quatro vasos sanguíneos responsáveis pelo suprimento de sangue para o cérebro foram bloqueados, resultando em isquemia cerebral global. As atividades de EEG e EMG foram rapidamente inibidas, quase formando uma linha reta, e o rato não lutou mais, e os globos oculares pareciam cinza e branco (Figura 2A). Se os ratos não puderem ser induzidos ao coma, isso significa que o modelo falhou.

Após 30 min, o primeiro fio de ligadura dos ACCs foi liberado para reperfusão, mas o segundo fio de ligadura colocado à frente dos ACCs manteve o nível de perfusão baixo, induzindo coma contínuo nos ratos por cerca de 60 min. Com a compensação gradual e a perfusão sanguínea do corpo, os ratos foram acordando gradativamente (Figura 2B). O EEG e o EMG dos ratos se recuperaram quase completamente após acordar.

Figura 1: Diagrama de posição da artéria vertebral por eletrocoagulação. As etapas 1-3 descrevem o protocolo para implantar os eletrodos e a etapa 4 testa se os eletrodos estão funcionando corretamente. As etapas 5-6 detalham o procedimento de incisão cirúrgica na frente do pescoço e nas artérias vertebrais bilaterais (AVs) para eletrocoagulação. Setas e arcos amarelos indicam os principais locais para eletrocoagulação. Fios de seda são usados para simular a passagem da artéria vertebral pela coluna, fornecendo uma indicação mais clara da localização característica da artéria vertebral eletrocoagulada. As etapas 7-9 descrevem os protocolos para ligadura das artérias carótidas comuns (ACCs) bilaterais para induzir o coma. Todos os procedimentos seguem as diretrizes de uso de animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O eletroencefalograma (EEG) e o eletromiograma (EMG) mudam do coma para a recuperação. (A) Forma de onda de EEG, EMG e níveis de atividade em ratos durante o coma isquêmico cerebral. (B) Diagrama de EEG, EMG e níveis de atividade em ratos em transição do coma para o despertar. Todo o processo dura aproximadamente 90 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A oclusão de quatro vasos induz lesão cerebral isquêmica e hipóxica global, que pode simular coma agudo, parada cardíaca, asfixia, choque, arritmia grave e outras condições clínicas críticas causadas por isquemia cerebral na prática clínica. Enquanto isso, a oclusão de quatro vasos pode causar danos principalmente no hipocampo^17,18, que é a principal área funcional do cérebro responsável pela memória cognitiva 19,20,21. Portanto, a oclusão de quatro vasos também pode ser usada para simular um modelo de demência vascular^22,23. Em resumo, o modelo de isquemia cerebral global induzida por oclusão de quatro vasos tem sido amplamente utilizado para simular as doenças clínicas acima mencionadas.

Em 1979, Pulsinelli et ^al.10 alcançaram isquemia e reperfusão cerebral global bloqueando as artérias carótidas comuns bilaterais e as artérias vertebrais bilaterais. Desde então, o modelo tornou-se gradualmente um método clássico de preparação reconhecido internacionalmente para modelos globais de isquemia cerebral 24,25,26. No entanto, esse método apresenta alguns problemas, como diferenças individuais no processo transverso e forame da primeira vértebra cervical, incluindo forames pequenos, irregulares e curvos, resultando em eletrocoagulação incompleta. Além disso, a eletrocoagulação de longo prazo ou a corrente elétrica excessiva podem representar um risco de danificar o tronco encefálico e a medula espinhal. A eletrocoagulação insuficiente da artéria vertebral pode levar a sangramento significativo e outros problemas 15,16,27.

Portanto, os estudiosos têm feito melhorias contínuas para garantir a integridade da eletrocoagulação da artéria vertebral e reduzir a variabilidade do modelo^28,29. Devido à invisibilidade da eletrocoagulação da artéria vertebral através do forame vertebral, Todd et ^al.30 expuseram totalmente a artéria vertebral e a queimaram sob visão direta perfurando o forame do atlas, aumentando assim a precisão da eletrocoagulação. No entanto, este método cirúrgico é altamente invasivo e pode danificar a coluna cervical. A parede fina do forame pterigóideo pode facilmente danificar a artéria vertebral, causando sangramento maciço e resultando em uma taxa de mortalidade relativamente alta. Sugio et ^al.12 visualizaram a artéria vertebral e a cortaram permanentemente inserindo uma agulha elétrica nos forames intervertebrais esquerdo e direito da segunda vértebra cervical. Toda et ^al.31 e Lu et ^al.27 expuseram a artéria vertebral entre o primeiro e o segundo processos transversos fora da articulação atlas com base nessa estrutura anatômica e realizaram eletrocoagulação. Esses pesquisadores resolveram o problema da instabilidade na eletrocoagulação quando a artéria vertebral não era visível, expondo-a atrás do pescoço e realizando a eletrocoagulação.

No entanto, os ratos submetidos a cirurgia no abdômen e nas costas ainda tinham um risco aumentado de infecção, então alguns estudiosos tentaram operar pela frente do pescoço. Sun Wei et ^al.15 alcançaram isquemia-reperfusão cerebral global separando a artéria vertebral da região anterior do pescoço, ligando ou clipando as pequenas artérias e clipando a ACC de forma contínua ou intermitente. Esta etapa requer uma operação meticulosa, pois a artéria vertebral é difícil de separar devido à sua natureza sutil. Além disso, pequenos grampos arteriais são difíceis de prender com precisão a artéria vertebral. Se a separação não for clara e limpa o suficiente, isso levará a uma fixação ou ligadura incompleta, o que sem dúvida aumenta a instabilidade do modelo.

Este estudo fornece um método simples e viável para a eletrocoagulação da artéria vertebral. O passo principal não é separar a artéria vertebral, mas localizar o forame transverso onde a artéria vertebral cruza e entra na primeira vértebra cervical. Esta é a entrada para a artéria vertebral, que tem uma característica curva, permitindo que os novatos a localizem rapidamente. Após pré-aquecer a caneta de eletrocoagulação, insira-a na posição curva para coagular rapidamente a artéria vertebral, com duração de 3-5 s para garantir a oclusão completa. Tanto a eletrocoagulação da artéria vertebral quanto a ligadura da ACC foram realizadas em uma operação, reduzindo o risco de infecção e a duração do experimento.

Também descobrimos que a morte do animal modelo foi causada principalmente pelo bloqueio de todos os quatro vasos sanguíneos responsáveis pelo suprimento sanguíneo cerebral e não estava relacionada ao número de operações cirúrgicas. No entanto, a conclusão de todas as operações em uma cirurgia realmente encurtou o período experimental. Além disso, o método modificado também pode ser usado para preparar o modelo global de isquemia-reperfusão cerebral. O modelo de coma de isquemia cerebral induzida por oclusão de quatro vasos também pode simular o modelo de "síndrome do encarceramento" na medicina tradicional chinesa³². Portanto, o modelo introduzido neste estudo também pode fornecer uma referência para os praticantes da medicina tradicional chinesa.

Na literatura ^{anterior16,33,34}, a ligadura da estenose da ACC foi realizada 30 min após a isquemia. No entanto, após 30 min de isquemia, alguns ratos apresentaram leve consciência devido à compensação. A estimulação mecânica pode fazer com que esses ratos acordem, levando à falha do modelo de coma. Portanto, em nosso estudo, o tratamento da estenose CCA foi realizado imediatamente após o início do coma. Neste momento, a profundidade do coma era profunda, dificultando o estímulo dos ratos a acordarem, garantindo a estabilidade do modelo. O CCA estava em um estado clampeado durante este tratamento, e o tratamento da estenose não afetaria o fluxo sanguíneo.

Além disso, na incisão cervical de ratos, observou-se que as artérias vertebrais em três intervalos espinhais poderiam ser bloqueadas por eletrocautério ou ligadura. No entanto, há um sinal característico de entrada da artéria vertebral na primeira coluna, tornando-a muito adequada para o bloqueio do eletrocautério. Devido à falta de marcadores característicos entre a segunda e a terceira vértebras, bem como entre a terceira e a quarta vértebras, a ligadura de sutura é mais adequada. No entanto, há uma desvantagem de ligadura insuficiente. Portanto, neste estudo, optou-se pelo eletrocautério para cortar a artéria vertebral entre a primeira e a segunda vértebras.

Além disso, deve-se notar que o sucesso deste modelo está intimamente relacionado ao peso dos ratos. Foi relatado que ratos com peso entre 180-200 g são mais adequados para induzir o coma. Neste estudo, verificou-se também que ratos com peso inferior a 180 g dificilmente conseguem suportar os danos de quatro vasos sanguíneos simultaneamente, levando a uma elevada taxa de mortalidade. Por outro lado, se o peso for maior que 220 g, o rato acordará rapidamente e não permanecerá em coma por tempo suficiente para atender ao padrão do modelo.

Além disso, o diâmetro do orifício usado para estreitar o CCA é outro fator que afeta a duração do coma em ratos. Estudos mostraram que um diâmetro de orifício de 0,6 mm pode induzir coma contínuo em ratos por 6-8 h com uma alta taxa de sobrevivência. Um diâmetro de orifício de 0,45 mm causou estenose arterial extrema em ratos, levando à falha de recuperação de ratos gravemente feridos, enquanto um diâmetro de 0,7 mm resultou em coma com duração de 1-3 h, mas com diferenças individuais significativas¹⁶.

No entanto, no experimento preliminar, um diâmetro de orifício de 0,6 mm não poderia induzir coma por mais de 60 min, enquanto um diâmetro de 0,5 mm poderia induzir coma por 1-2 h. Isso difere do estudo de Xiaobing Jia et al., que pode ser devido a diferenças nos anestésicos e métodos de modelagem. Mais estudos são necessários no futuro para elucidar essas diferenças.

Em conclusão, este estudo apresenta um método simples, viável e amigável para iniciantes para oclusão de quatro vasos. Ele serve como uma referência valiosa para os profissionais que estudam o coma isquêmico cerebral ou isquemia cerebral global.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de fotoeletrodos de microfibra de 16 canais	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0 Sutura cirúrgica	Nantong Holycon Medical Devices Co., Ltd.	B-104
6-0 Sutura cirúrgica	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
eletrodo EEG	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
Caneta de eletrocoagulação	CONPUVON Company	465
Lunion Stage Automatic Sleep Staging	System Shanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.	1336
Broca de crânio portátil em miniatura	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
Penicilina sódica	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
ratos SD	SPF (Pequim) Biotechnology Co., Ltd.	180-220g
prego do crânio	globalebio, ltd	/
instrumento estereotáxico	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA