Artigo de método

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

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DOI:

10.3791/67165

⸱

20 de setembro de 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Resumo

Os biomateriais regenerativos são projetados para facilitar as interações célula-material para orientar o reparo de tecidos e órgãos danificados. Esses materiais são projetados para emular as propriedades biofísicas do tecido nativo, fornecendo orientação fenotípica e morfológica celular que contribui para a restauração do nicho do tecido regenerativo. O colágeno, uma proteína da matriz extracelular prevalente, é um componente comum desses biomateriais regenerativos devido à sua biocompatibilidade e outras propriedades favoráveis. O presente estudo descreve um método novo e direto para a fabricação de colágeno nanofibrilar projetado com padrão de fibrila direcionada. Através da manipulação da tensão de cisalhamento, temperatura e pH, a fibrilogênese e o alinhamento do colágeno são controlados com precisão sem a necessidade de equipamentos especializados. Essa abordagem permite a criação de biomateriais de colágeno nanofibrilar que imitam a estrutura nativa de tecidos exibindo características anisotrópicas ou isotrópicas. A flexibilidade na padronização de nanofibrilas de colágeno não apenas facilita o estudo da padronização em nanoescala no comportamento celular, mas também oferece diversas possibilidades para aplicações de engenharia de tecidos padronizados.

Introdução

O objetivo da medicina regenerativa é melhorar a regeneração e a cicatrização dos tecidos por meio da aplicação de terapias projetadas. Uma abordagem envolve a fabricação de construções de biomateriais que emulam de perto a composição e a estrutura dos tecidos nativos. Ao projetar essas construções, uma consideração crítica é a matriz extracelular subjacente nativa (MEC), que fornece pistas instrucionais para proliferação, migração e diferenciação celular, impulsionando a regeneração do tecido 1,2. A MEC nativa é predominantemente composta por colágeno fibrilar 3,4. Em tecidos altamente organizados, como músculo esquelético e tendão, esses ECMs exibem um padrão alinhado, que é fundamental para apoiar a transmissão de força através do tecido, bem como a função motora 5,6.

A utilidade do colágeno como biomaterial para aplicações de engenharia de tecidos vai além de sua extensa prevalência em tecidos nativos, pois também apresenta boa biocompatibilidade, biodegradabilidade e afinidade celular 7,8,9. Avanços recentes no desenvolvimento de biomateriais à base de colágeno se concentraram no refinamento das propriedades biofísicas para melhor orientar as pistas mecânicas e bioquímicas que são essenciais para a regeneração específica do tecido. A criação de biomateriais de colágeno com estrutura fibrilar in vitro é relativamente simples, pois as moléculas de colágeno solúveis em ácido são capazes de se auto-montar em nanofibrilas quando expostas a temperaturas quentes e pH neutro10,11. No entanto, sem manipulação guiada, essas fibrilas se formarão em redes aleatórias, tornando-as inadequadas para aplicações de engenharia de tecidos anisotrópicos. As técnicas capazes de produzir fibrilas alinhadas incluem eletrofiação e fiação úmida, juntamente com outras técnicas de extrusão de solução12,13, liofilização14, fabricação eletroquímica ou magnética15,16, deposição de fluxo de cisalhamento17, cristalização induzida por fluxo18, extrusão em gel19, alinhamento induzido por deformação20 e alinhamento guiado por força por meio da manipulação de fluidos fluxo 21,22. No entanto, muitos desses métodos não são altamente compatíveis com o colágeno, produzem alinhamento em microescala, mas não em nanoescala, requerem etapas adicionais de pós-processamento para induzir alinhamento e estabilidade ou requerem equipamentos e reagentes altamente especializados, tornando sua adoção generalizada desafiadora.

O presente estudo apresenta um método fácil baseado em cisalhamento para a fabricação de colágeno nanofibrilar, com padrão de fibrila alinhado ou orientado aleatoriamente, sem a necessidade de equipamentos especializados, como bombas de seringa ou eletrospinners. Esta técnica capitaliza a dependência do pH da fibrilogênese do colágeno. A aplicação de força de cisalhamento ao colágeno monomérico ácido dentro de um tampão neutralizante promove a fibrilogênese alinhada ao longo da direção do cisalhamento. Da mesma forma, o colágeno pode ser induzido a sofrer fibrilogênese na ausência de cisalhamento, o que produz fibrilas com padrões aleatórios. As tiras de colágeno 3D resultantes, compostas por colágeno nanofibrilar alinhado ou padronizado aleatoriamente, podem servir como ferramentas para estudar os efeitos da padronização em nanoescala no comportamento celular. Além disso, eles oferecem diversas possibilidades para aplicações de engenharia de tecidos anisotrópicos e isotrópicos 23,24,25,26,27. O padrão pode ser personalizado para corresponder à estrutura do tecido nativo de interesse. As tiras de colágeno também podem ser combinadas em feixes de vários tamanhos para servir como uma terapia projetada transplantada em diversos tamanhos e formas de lesões.

Protocolo

1. Preparação do colágeno dialisado ( Figura 1)

  1. Corte o tubo de diálise em um comprimento de aproximadamente 3 polegadas. Use tubos com as seguintes especificações: largura plana de 32 mm, diâmetro inflado de 20 mm e tamanho de poro de 4,8 nm.
  2. Reidrate o tubo de diálise em água ultrapura.
  3. Prenda uma extremidade do tubo com um clipe de tubo de diálise.
  4. Transfira 5-6 mL de colágeno de cauda de rato tipo I (concentração: 9-10 mg / mL em ácido acético 0,02 N) para o tubo usando uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de 18 G. Prenda a outra extremidade do tubo para fechar.
  5. Coloque uma camada de 0,5-1 cm de espessura de flocos de polietilenoglicol (PEG) no fundo de um prato de vidro e, em seguida, coloque o tubo de diálise cheio de colágeno em cima da camada de PEG.
    NOTA: Um prato de vidro de 13 polegadas x 9 polegadas x 2 polegadas normalmente pode acomodar uma fileira de 4-5 tubos cheios de colágeno. O tamanho do prato pode ser ajustado com base no volume de colágeno necessário.
  6. Adicione mais flocos de PEG para cobrir completamente o tubo e coloque a bandeja em uma geladeira a 4 °C.
  7. A cada 10-15 min, remova os flocos de PEG úmidos da superfície do tubo de diálise e cubra novamente o tubo com uma nova camada de PEG seco. Retorne o prato à geladeira a 4 °C.
  8. Repita a etapa 1.7 mais duas vezes e, após 30-35 min, enxágue os flocos de PEG úmidos com água da torneira.
  9. Enxágue o tubo mais uma vez com água ultrapura e seque o tubo com um lenço de papel.
  10. Solte uma extremidade do tubo e transfira o colágeno dialisado (concentração final: ~ 30 mg / mL) para tubos de microcentrífuga. Gire brevemente as bolhas de ar no colágeno usando uma minicentrífuga (2.000 x g, ≤30 s, temperatura ambiente [RT]) e armazene a 4 ° C para uso posterior.
  11. Um dia antes do uso, coloque o colágeno em seringas.
    1. Usando uma agulha de calibre 16, retire ~ 1 mL de colágeno dialisado em uma seringa de 1 mL.
      NOTA: O colágeno é uma substância viscosa. A cabeça da agulha pode precisar ser pré-carregada com colágeno antes de extrair mais colágeno. Remova a cabeça da agulha e expulse grandes bolsas de ar conforme necessário
    2. Retire a agulha e envolva a cabeça da seringa com parafilme.
    3. Guarde a seringa cheia de colágeno na vertical a 4° C durante a noite para permitir que pequenas bolhas de ar estourem.

2. Preparação de lascas de vidro (Figura 1)

CUIDADO: Utilize proteção para os olhos nesta parte do protocolo.

NOTA: Lâminas de vidro hidrofóbicas especialmente revestidas são usadas para experimentos de cultura de células. As corrediças devem ser manuseadas pelas bordas para evitar a remoção do revestimento da superfície. Execute o procedimento de corte de vidro em uma superfície de corte adequada.

  1. Meça e marque as dimensões desejadas do chip de vidro usando um marcador permanente
    1. Se estiver criando andaimes de 8 tiras, marque incrementos de aproximadamente 1 cm ao longo da borda longa do slide. Ajuste as dimensões conforme necessário com base no tamanho desejado do andaime.
  2. Usando uma borda reta (ou seja, uma borda de placa de 6 poços), deslize o cortador de vidro ao longo do comprimento da primeira medição para marcar o vidro.
  3. O slide quebrará ao longo da linha marcada por conta própria ou virará o slide sobre um lenço de papel (lado hidrofóbico para baixo) e aplicará pressão manualmente na região marcada.
  4. Marque o lado revestido da lâmina de vidro hidrofóbico usando uma caneta marcadora de etanol.
  5. Enxágue o chip de vidro em água ultrapura para remover a poeira residual do vidro.
  6. Seque as aparas de vidro usando um bico de bancada para ar pressurizado ou empilhando-as em ângulo na capela de exaustão.
  7. Repita conforme necessário para o número necessário de fichas. Armazene os chips em RT. Para obter melhores resultados de cultura de células, use chips preparados dentro de 7 dias.

3. Preparação de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS)

  1. Encha uma garrafa de vidro com 500 mL de água ultrapura.
  2. Adicione 10 comprimidos de PBS ao frasco.
    NOTA: Este protocolo pressupõe que a proporção de comprimidos para 1x PBS é de 1 comprimido por 500 mL. Ajuste o número de comprimidos conforme necessário se estiver usando um tamanho ou marca de tablet diferente.
  3. Adicione um barra de agitação ao frasco e coloque em uma placa de agitação até que os comprimidos estejam dissolvidos.
  4. No dia da fabricação do hidrogel, transfira o volume necessário de 10x PBS para tubos cônicos de 50 mL.
  5. Coloque os tubos cheios de PBS em banho-maria a 37 °C por pelo menos 15 minutos antes da fabricação do colágeno.

4. Fabricação de nanofibrilas de colágeno alinhadas (Figura 2)

  1. Retire uma seringa de colagénio do frigorífico e coloque uma agulha cega de 22 G.
  2. Coloque uma lâmina de vidro na tampa de uma placa de 4 poços.
  3. Cubra a lâmina com PBS 10x a 37 °C aquecido o suficiente para submergi-la (30-50 mL).
  4. Segurando a seringa em um ângulo de aproximadamente 30-45°, extrude manualmente tiras finas de colágeno no chip de vidro usando uma velocidade de ~340 mm/s e uma taxa de fluxo de ~3.2 mL/min.
    NOTA: Complete a extrusão de colágeno dentro de 30-60 s após a adição do PBS aquecido para garantir que o PBS não esfrie excessivamente.
  5. Aguarde 1-2 minutos para permitir que o colágeno complete a fibrilogênese ou até que o colágeno fique com uma cor branca opaca.
  6. Use uma pinça para cortar as tiras de colágeno no comprimento. Certifique-se de que as tiras sejam longas o suficiente para que 3-5 mm possam ser dobradas sob cada extremidade do chip.
  7. Uma de cada vez, coloque suavemente as tiras de colágeno longitudinalmente (paralelas à região marcada) sobre uma lasca de vidro preparada. Coloque as bordas sob o chip.
  8. Continue colocando tiras de colágeno até que as dimensões desejadas sejam alcançadas.
  9. Posicione o hidrogel de colágeno recém-formado em dois poços de uma placa de 12 poços. Isso permite o fluxo de ar durante o processo de secagem e evita que as extremidades da cauda do colágeno adiram a superfícies indesejadas.
  10. Deixe os hidrogéis na bancada secarem por 1-3 h ou até que os cristais de sal PBS cubram 50% -90% da superfície do hidrogel.
    NOTA: O tempo de secagem varia de acordo com o tamanho do hidrogel e a presença de excesso de líquido.
  11. Mergulhe cada hidrogel em 1x PBS por cerca de 30-60 s ou até que os cristais de sal sejam dissolvidos.
  12. Enxugue suavemente o excesso de PBS com um lenço de papel.
  13. Colocar os hidrogéis de volta na placa do poço e deixar secar num exaustor durante a noite.
  14. Armazene os hidrogéis secos em RT por cerca de 1 semana.

5. Fabricação de nanofibrilas de colágeno aleatórias (Figura 3)

  1. Retire uma seringa de colagénio do frigorífico e coloque uma agulha cega de 22 G.
  2. Extrude colágeno a ~ 3,2 mL / min em um chip de vidro seco. Extrude colágeno suficiente para obter dimensões semelhantes aos hidrogéis de colágeno alinhados. Evite o acúmulo de bolhas de ar conforme necessário.
  3. Faça a extrusão de colágeno adicional para envolver as bordas do chip de vidro. Isso minimiza o risco de descolamento acidental.
  4. Use uma pinça para submergir o colágeno extrudado em um tubo de 50 mL de PBS 10x aquecido.
  5. Aguarde 45-60 s para que o colágeno complete a fibrilogênese ou até que o colágeno fique com uma cor branca opaca.
  6. Enxugue suavemente o excesso de PBS com um lenço de papel.
  7. Conclua as etapas 4.9-4.14 para enxaguar e secar os hidrogéis

6. Esterilização e reidratação

NOTA: Conclua todas as etapas a seguir em um gabinete de biossegurança

  1. Esterilize os hidrogéis de colágeno e a placa do poço circundante em etanol a 70% por 15 min.
    1. Eleve brevemente os hidrogéis na metade da esterilização usando uma pinça para garantir que a parte inferior do chip de vidro e o hidrogel estejam em contato com o etanol.
  2. Remova o etanol e deixe os hidrogéis secarem ao ar por 10 min.
  3. Lave os hidrogéis 3 vezes em PBS 1x estéril, por 10 min cada, para remover o etanol residual e reidratar os hidrogéis. Os hidrogéis estão agora prontos para uso (cultura de células, etc.). Os hidrogéis podem ser deixados brevemente no PBS após a etapa final de lavagem se não estiverem imediatamente prontos para uso.

Resultados

Este protocolo descreve uma técnica de extrusão baseada em cisalhamento simples para a fabricação de hidrogéis de colágeno compostos por nanofibrilas orientadas alinhadas (Figura 2) ou aleatoriamente (Figura 3). A padronização de nanofibrilas depende do controle preciso das forças de cisalhamento, que é alcançada por meio da modulação combinada da velocidade da seringa e da taxa de extrusão de colágeno. Os valores ideais para induzir o alinhamento das fibrilas foram previamente determinados como uma velocidade de seringa de 340 mm/s e uma taxa de extrusão de colágeno de 3,2 mL/min28,29. Esse equilíbrio é crítico não apenas para a formação de nanofibrilas alinhadas, mas também para garantir a funcionalidade dos hidrogéis em macroescala. Se essa proporção estiver desalinhada, existe o risco de fabricar hidrogéis que não são padronizados conforme o esperado, bem como hidrogéis contendo tiras de colágeno muito finas (<0,5 mm de diâmetro), grossas (>1,5 mm de diâmetro) ou onduladas para uso. Por exemplo, um movimento de seringa muito rápido, juntamente com uma taxa de extrusão muito lenta, resulta em tiras finas, enquanto a proporção oposta produz tiras grossas ou onduladas (Figura 4A-D), dependendo do grau de desequilíbrio na proporção. Essas diferenças nas propriedades macroscópicas podem criar variabilidade suficiente de tira para tira para influenciar a deposição celular e a adesão local.

Após a extrusão e montagem do colágeno, a fabricação do hidrogel passa por uma fase inicial de secagem, geralmente de 1 a 3 h, antes de passar por uma etapa de lavagem em 1x PBS (Figura 2 e Figura 3). Alcançar resultados topográficos ideais depende de um equilíbrio delicado entre o tempo e a intensidade da etapa de lavagem. A lavagem insuficiente ou atrasada resulta em topografia de fibra interrompida, denotada pelas impressões de cristais de sal PBS nas fibrilas. Em contraste, a lavagem excessiva ou prematura do colágeno pós-fabricação resulta em uma camada dissolvida de colágeno que cobre as características topográficas (Figura 4E, F).

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) confirma a presença de orientação nanofibrilar alinhada ou aleatória dentro dos hidrogéis de colágeno. Tanto nos hidrogéis alinhados quanto nos aleatórios, as nanofibrilas exibem diâmetros de fibrilas entre 30-50 nm29. Qualitativamente, é evidente que os hidrogéis alinhados contêm nanofibrilas uniaxialmente alinhadas (Figura 5). Esse alinhamento foi previamente quantificado usando a análise de transformada rápida de Fourier 2D, na qual o gráfico de alinhamento exibe dois picos distintos espaçados 180° para hidrogéis alinhados, contrastando com hidrogéis orientados aleatoriamente que exibem apenas picos de baixa frequência28.

Imagens de campo claro de mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos ilustram que a orientação nanotopográfica anisotrópica das fibrilas de colágeno promove o alinhamento celular (Figura 6). Esses hidrogéis de colágeno nanopadronizados demonstraram induzir o alinhamento celular não apenas em mioblastos26, mas também em outros tipos de células, como células endoteliais23,24.

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Figura 1: Ilustração esquemática do colágeno de ultra-alta densidade e preparação de lâminas de vidro cortado. (AF) Processo de diálise de colágeno: (A) preparação do tubo de diálise em tiras de 3 polegadas e fixação do primeiro clipe, (B) carregamento de colágeno de estoque de alta densidade no tubo e fixação do segundo clipe, (C) encapsulamento do tubo de diálise carregado com flocos de polietilenoglicol (PEG), (D) remoção de flocos de PEG saturados, (E) enxágue de flocos de PEG com água e (F) armazenamento de colágeno de ultra-alta densidade em tubos de microcentrífuga. (G-L) Processo de corte de lâminas de vidro: (G) aquisição de lâminas de vidro para estudo, (H,I) corte de lâmina de vidro com cortador de vidro com ponta de diamante, (J) quebra de lâmina de vidro do lado não marcado, (K) enxágue do vidro cortado com água e (L) secagem da lâmina de vidro. Feito usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Processo de fabricação de hidrogel de colágeno alinhado. Etapa 1: Extrusão de colágeno sob cisalhamento no tampão aquecido 10x PBS e indução de fibrilogênese; Passo 2: Montagem de colágeno extrudado em lâminas de vidro cortadas; Etapa 3: Montagem de colágeno extrudado adicional para aumentar o tamanho do hidrogel; e Etapa 4: Secagem de hidrogéis de colágeno. Feito usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Processo aleatório de fabricação de hidrogel de colágeno. Passo 1: Extrusão de colágeno em lâminas de vidro cortadas (tira única); Passo 2: A extrusão contínua de colágeno aumenta o tamanho (várias tiras); Etapa 3: Submersão de colágeno extrudado em um tampão PBS 10X para iniciar a fibrilogênese; e Etapa 4: Secagem de hidrogéis. Feito usando BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Possíveis etapas de erro no processo de fabricação do hidrogel de colágeno. (A-F) Exemplos de (A) tiras de colágeno otimamente espessas, (B) tiras de colágeno excessivamente grossas, (C) tiras de colágeno insuficientemente espessas, (D) tiras de colágeno onduladas e (E,F) superfícies de colágeno superlavadas mostradas usando microscopia eletrônica de varredura. Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de hidrogéis de colágeno alinhados e aleatórios. As imagens foram obtidas em microscópio eletrônico. As condições do feixe foram definidas para 2 keV, com uma faixa de corrente de 25-100 pA e uma distância de trabalho de 4-5 mm. As imagens foram salvas consistentemente em uma resolução de 6144 x 4096 pixels com um tempo de permanência de 1 μs. Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Mioblastos primários de camundongos cultivados em hidrogéis de colágeno alinhados e aleatórios. Os mioblastos foram cultivados nos hidrogéis por 3 dias antes da imagem. Imagens de campo claro foram tiradas com aumento de 10x usando um microscópio invertido. A seta denota orientação nanofibrilar alinhada. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

As etapas críticas do protocolo podem ser destiladas em três partes principais: 1) fibrilogênese do colágeno, 2) montagem do hidrogel e 3) lavagem. O processo de fibrilogênese do colágeno ocorre espontaneamente sob condições neutralizantes e depende da automontagem de moléculas individuais de colágeno em estruturas fibrilares estabilizadas maiores10,11. Isso é obtido através da aplicação de um meio tamponado neutralizante como 10x PBS que é aquecido a 37 ° C e é fundamental para orientar as interações eletrostáticas que garantem o desenvolvimento completo do colágeno em fibrilas. O alinhamento fibrilar em nanoescala é obtido pela aplicação de forças de cisalhamento simultaneamente com a ocorrência de fibrilogênese. A presença ou ausência de cisalhamento, bem como a taxa de cisalhamento, determinará o padrão das fibrilas. Em segundo lugar, a montagem de hidrogel é uma etapa fundamental para reforçar a estabilidade do material, fornecendo âncoras físicas durante o processo de secagem, durante o qual ocorre a contração e desidratação do colágeno. Esta etapa é especialmente crítica se o uso pretendido for para semeadura de células in vitro, pois prende o colágeno a um substrato rígido que evita a contração descontrolada. O processo de montagem é ligeiramente diferente entre os hidrogéis padronizados aleatórios e alinhados. A adesão adequada para hidrogéis aleatórios requer deposição adicional de colágeno ao longo das bordas da superfície de montagem (normalmente vidro) antes da fibrilogênese para prendê-la à superfície. Os hidrogéis com padrão alinhado são enrolados nas bordas da superfície de montagem para servir ao mesmo propósito de ancoragem. Uma consideração adicional importante para hidrogéis alinhados é que a colocação inicial da tira de colágeno determina a forma e a uniformidade do hidrogel. A colocação subsequente da tira é guiada pela tensão superficial do colágeno depositado, com cuidado para evitar tocar no hidrogel após a colocação. Por fim, a secagem adequada do hidrogel e a lavagem pós-montagem são vitais para manter as características topográficas do hidrogel. A secagem inadequada seguida de lavagem com 1x PBS ou água pode levar a uma camada de colágeno dissolvida ou semelhante a um bolo. Para evitar isso, a secagem completa dos hidrogéis é essencial e pode ser confirmada visualmente pela formação de cristais de PBS e aumento da opacidade do colágeno.

Os hidrogéis de colágeno têm sido usados tanto para estudos in vitro quanto para aplicações de engenharia regenerativa in vivo 23,24,25,26,27. É importante observar que os hidrogéis são fabricados em condições não estéreis e devem ser esterilizados antes de qualquer forma de cultura celular ou transplante. A forma recomendada de esterilização é o etanol a 70%, pois outras formas de esterilização, como a luz ultravioleta, interromperão o padrão de nanofibrilas por meio da reticulação e degradação das moléculas de colágeno30. No entanto, a remoção do etanol por meio das etapas de evaporação e lavagem é importante para a minimização do etanol residual, o que pode ser prejudicial à compatibilidade celular. A variabilidade lote a lote do colágeno estoque pode levar à variabilidade na concentração de trabalho do colágeno de alta densidade dialisado, o que pode afetar o processo de fibrilogênese. Dependendo da aplicação, o padrão isotrópico aleatório pode ser preferido ao padrão anisotrópico alinhado; Portanto, no protocolo atual, incluímos ambas as abordagens para modular a organização das fibrilas.

Uma limitação do método de extrusão baseado em cisalhamento descrito neste protocolo é que o processo é altamente manual e dependente do usuário. Treinamento e prática significativos são necessários para calibrar cada operador para produzir resultados reprodutíveis. Isso significa que a taxa de transferência pode ser baixa e demorada para garantir a precisão. Algumas dessas limitações podem ser resolvidas usando métodos de fabricação altamente automatizados e baseados em máquinas, como impressão 3D, eletrofiação e litografia suave e de superfície. No entanto, ao contrário desses outros métodos, este procedimento de fabricação de nanofibrilas totalmente manual não requer equipamento especializado e é acessível e acessível. À medida que os avanços nas metodologias de impressão 3D e na relação custo-benefício continuam a melhorar, há potencial para adaptar e integrar esse protocolo à tecnologia de impressão 3D. Essa integração, embora ainda não seja possível, aumentaria a consistência e a taxa de transferência desse protocolo.

A fabricação de duas topografias distintas de hidrogel oferece uma oportunidade única de aprofundar a orientação nanotopográfica das fibrilas de colágeno na morfologia celular, comportamento e regeneração tecidual. Ao observar a resposta a diferentes topografias de fibrilas, podemos obter insights sobre como o padrão em nanoescala do substrato influencia o fenótipo celular. Por exemplo, trabalhos anteriores indicam que quando as células endoteliais adotam uma morfologia alongada sobre nanofibrilas alinhadas, elas exibem um fenótipo anti-inflamatório e maior resistência a condições de fluxo perturbadas24. Esses achados não apenas aumentam nossa compreensão do desenvolvimento de lesões ateroscleróticas, mas também são promissores para o projeto de futuros enxertos de bypass aterosprotetor. Esses hidrogéis de colágeno podem ser usados para aplicações de engenharia de tecidos e enriquecidos com fatores de crescimento ou células antes da implantação para aumentar a eficácia terapêutica 25,26,27. A análise comparativa revela que os hidrogéis com topografias alinhadas exibem regeneração muscular e vascularização superiores em comparação com os hidrogéis com topografias aleatórias26 e que esses hidrogéis podem ser usados em uma forma acelular "pronta para uso" se carregados com fatores de crescimento miogênicos para aumentar a regeneração do tecido em um modelo de lesão de camundongo27. Embora o foco principal até agora tenha sido o uso desses hidrogéis como terapêutica potencial para lesões musculares, eles podem ser aplicados a um amplo espectro de aplicações regenerativas e de engenharia de tecidos.

Divulgações

Não há conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo financiamento da Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, Oregon Health & Science University Foundation e Collins Medical Trust. K.M.H. foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) e pela Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. foi apoiado por doações do NIH / NHLBI (R00HL136701) e NIH / NIAMS (R01AR080150).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colágeno I, Alta Concentração, Cauda de RatoCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U microscópioNikonTE-2000-U Microscópio invertido
Lâminas de Microscópio Extra GrossasFisher Scientific22-267-005Funciona bem para superfície de extrusão de colágeno
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AMicroscópio eletrônico de varredura
Conjunto de ferramentas de corte de vidro Ponta de carboneto de alimentação de óleo estilo lápis 2mm-20mmde B07Y1D243HAmazon/MOARMORpara um cortador de vidro
Agulhas de ponta romba Hamilton Kel-F Hub (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Agulhas para extrusão de colágeno
Corrediça H 3-DSchottNC0782819Lâminas hidrofóbicas
PBS ComprimidosThermo Fisher Scientific18912014
Polietilenoglicol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Tubo de diálise de celulose sem costura Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Clipes de DiáliseThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Cortador de VidroSynthware31-501-927Opção para um cortador de vidro
Opção

Referências

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