Artigo de método

Incorporando a Estrutura da Proteína-Alvo, Flexibilidade e Dinâmica na Descoberta Computacional de Medicamentos Usando Análise de Docking Baseada em Conjunto

DOI:

10.3791/67174

⸱

20 de junho de 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os métodos computacionais prometem acelerar a descoberta de medicamentos, mas frequentemente ignoram a natureza dinâmica das estruturas das proteínas. Aqui, discutimos a análise de encaixe baseada em conjunto para incorporar indiretamente a flexibilidade da proteína, melhorando potencialmente a precisão e a confiabilidade dos esforços de descoberta de medicamentos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O processo de descoberta de medicamentos é uma operação rigorosa, demorada e cara. A abordagem computacional na descoberta de medicamentos permite que os pesquisadores priorizem os compostos mais promissores para testes adicionais, o que reduziria muito os recursos necessários, levando a um incremento da eficiência geral nos pipelines de descoberta de medicamentos. A descoberta de medicamentos baseada em estrutura é uma abordagem comum que requer a informação estrutural da proteína-alvo em um formato tridimensional. No entanto, a limitação atual da maioria das estratégias de descoberta de medicamentos auxiliadas por computador é sua incapacidade de introduzir a flexibilidade e a dinâmica da estrutura da proteína-alvo durante a simulação de acoplamento ligante-proteína. Embora o encaixe de ajuste induzido e o encaixe baseado em conjunto tenham como objetivo abordar a flexibilidade da proteína no procedimento de encaixe, o último pode fornecer uma visão mais abrangente do comportamento dinâmico da proteína, incorporando várias conformações ao longo da simulação. Neste relatório, demonstramos e discutimos a aplicação de uma técnica chamada análise de docking baseada em conjunto que introduz indiretamente a flexibilidade e a dinâmica da estrutura da proteína-alvo no processo de docking molecular. A proteína e o ligante selecionados para estudos de docking baseados em conjunto foram lisozima e Flovokawain B (FB), respectivamente. Foi relatado anteriormente que o FB tem atividade de ligação com a lisozima. Uma simulação de dinâmica molecular (MD) foi realizada em lisozima na presença de água, e a energia total, o desvio quadrático médio (RMSD) e a flutuação quadrática média (RMSF) foram examinados. O agrupamento de conformação foi gerado com base em vários valores de corte de agrupamento e foi escolhido para análise de encaixe adicional com FB. O cluster nº 2 fornece a energia de ligação mais baixa a -29,37 kJ/mol. Imagens de docking molecular foram geradas para antecipar a presença de forças de ligação. Ao incorporar a dinâmica estrutural da proteína, a abordagem de encaixe baseada em conjunto pode capturar melhor a gama de possíveis cenários de ligação, levando a previsões mais confiáveis dos resultados da ligação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na descoberta computacional de medicamentos (CDD), técnicas de ciência da computação, química, biologia e física são integradas para explorar um vasto espaço químico, prever interações medicamento-alvo e otimizar candidatos a medicamentos com maior eficiência e custos mais baixos em comparação com os métodos experimentais tradicionais sozinhos. É uma abordagem poderosa que aproveita métodos e algoritmos computacionais para acelerar a descoberta e otimização de novos compostos terapêuticos 1,2,3. O CDD revolucionou a descoberta de medicamentos. No entanto, existem limitações associadas à dinâmica da estrutura tridimensional (3D) da proteína que podem afetar a precisão e a confiabilidade das previsões computacionais4. As estruturas 3D de proteínas servem como modelos no CDD para projetar ou otimizar candidatos a medicamentos com base nas interações proteína-medicamento alvo. Embora os modelos de cristalografia de raios-X das estruturas das proteínas forneçam informações estruturais valiosas sobre as proteínas, é essencial reconhecer a natureza dinâmica das estruturas das proteínas e as limitações dos modelos estáticos 5,6,7. Além disso, avanços recentes em microscopia crioeletrônica (crio-EM) e previsões computacionais como o AlphaFold também expandiram muito a disponibilidade de dados estruturais na captura de todo o espectro de flexibilidade e dinâmica de proteínas 8,9,10,11,12.

As simulações de dinâmica molecular (MD) simulam o movimento e as interações de átomos e moléculas ao longo do tempo, fornecendo informações sobre o comportamento dinâmico e a flexibilidade da estrutura 3D da proteína13,14. As simulações de MD são usadas para gerar estruturas 3D de proteínas representando vários estados conformacionais, que servem como entrada para análise de encaixe baseada em conjunto. Por meio da amostragem de diversas conformações de proteínas, a análise de docking baseada em conjunto leva em conta a flexibilidade e a dinâmica inerentes aos alvos biológicos, permitindo uma exploração mais abrangente dos modos e interações de ligação do ligante3.

Compreender a flexibilidade proteica é essencial, pois influencia como os medicamentos exercem seus efeitos biológicos, determina a localização e a orientação dos locais de ligação e afeta a cinética de ligação, o metabolismo e o transporte15,16. Capturar essa natureza dinâmica pode aumentar significativamente a precisão e a confiabilidade das previsões de encaixe. Em 1994, Kearsley et al. introduziram uma técnica de acoplamento flexível, uma estrutura que modela a flexibilidade de ligantes e proteínas. Essa abordagem permite que a conformação da proteína se ajuste durante o acoplamento, melhorando as previsões das interações ligante-receptor, levando em conta a flexibilidade estrutural17. Da mesma forma, em 1999, Carlson et al. relataram o acoplamento de conjunto, que aplica modelagem de farmacoforo flexível a modelos estáticos e dinâmicos de integrase do HIV-1, destacando ainda mais a importância de levar em conta a dinâmica de proteínas em estudos de encaixe18. Além disso, Cavasotto et al. também relataram a melhoria da precisão do acoplamento do ligante ao incorporar a flexibilidade do receptor no processo de encaixe usando a análise de modo normal19. Mais recentemente, as técnicas baseadas em conjunto 20,21,22,23,24,25,26,27 expandiram a descoberta de medicamentos, identificando potenciais novos locais de ligação ao ligante e fornecendo estimativas mais precisas da energia de ligação livre do ligante-receptor. Esses avanços foram aplicados a alvos como DNA quadruplex-duplex20, fator de crescimento endotelial vascular 165 (VEGF-165)21, a enzima alvo SARS-CoV-222, enzimas do citocromo P450 do fígado humano23 e proteínas anticancerígenas24.

A flavokawaína B (FB), classificada como flavonóide, foi documentada como exibindo várias propriedades farmacológicas 28,29,30. Com base em análises experimentais e computacionais, foi relatado que o FB forma um complexo estável com lisozima (LYZ) 31 , uma proteína amplamente reconhecida por sua atividade antimicrobiana e também foi identificada como um transportador de ligantes32 , 33 , 34 . Neste relatório, analisamos ainda mais a natureza da interação de FB com LYZ usando análise de docking baseada em conjunto para incorporar o impacto da flexibilidade da proteína na formação do complexo FB-LYZ. O objetivo deste método é fornecer aos pesquisadores um processo passo a passo e repetível para análise de encaixe baseada em conjunto. Além disso, é aconselhável que os pesquisadores selecionem as estruturas proteicas do organismo alvo para pesquisa.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação da estrutura do ligante Flavokawain B

  1. Abra o site do PubChem. Procure por Flavokawain B. Selecione Baixar e selecione Salvar para estrutura 2D SDF como SDF Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL.
  2. Abra o software Avogadro. Mova o arquivo SDF para o espaço vazio do software. Clique em Sim.
    NOTA: O software Avogadro construirá automaticamente uma geometria tridimensional (3D).
  3. Na guia, clique no ícone, conforme mostrado na Figura 1. Na guia do menu à esquerda, altere o campo de força para MMFF9435,36. Ajuste as etapas por atualização para 15. Defina o algoritmo como Steepest Descent e clique em Start.
    NOTA: Não mova nenhum átomo enquanto a rotação estiver em andamento. Quando terminar, clique em Parar. O MMFF94 é adequado para uma ampla gama de ligantes de moléculas pequenas (incluindo neutros e carregados) e é amplamente utilizado para minimização de energia e modelagem molecular37. O método de descida mais íngreme é escolhido para minimização inicial de energia porque é direto, computacionalmente eficiente e eficaz para remover grandes tensões estruturais e alcançar um estado básico de minimização 38,39,40.
  4. Na guia do menu, vá para Arquivo e clique em Salvar como. Quando uma pasta Save Molecule As for exibida, escreva o nome do arquivo como ligand.pdb e clique em Save.

2. Preparação da estrutura da proteína lisozima

  1. Abra o site do banco de dados de proteínas RCSB. Pesquise por lisozima, código: 1LYZ. Clique em Baixar arquivos e selecione Formato PDB. Salve como 1lyz.pdb.
  2. Abra o software Chimera. Na guia, clique em Arquivo e em Abrir. Na pasta, selecione o arquivo 1lyz.pdb .
    NOTA: Uma estrutura 3D de lisozima será construída usando software.
  3. Na guia, clique em Selecionar > resíduo > HOH. Em seguida, clique em Ações > Atom/Vínculos > Excluir. Clique em Selecionar e Limpar Seleção.
    NOTA: Isso removerá qualquer água da proteína.
  4. Na guia, clique em Selecionar > Cadeia > A. Em seguida, clique em Ferramentas > Edição de estrutura > AddH. Uma caixa de parâmetro será exibida e a deixará como padrão. Clique em OK. Clique em Selecionar e desmarque a seleção (Figura 2).
    NOTA: Isso adicionará hidrogênio à proteína. O resíduo de histidina também é protonado para criar um sistema neutro. O software pode realizar cálculos de pKa integrando o PROPKA 41,42.
  5. Na guia, clique em Ferramentas, Edição de Estrutura e Adicionar Encargo. Uma caixa de parâmetro será exibida; selecione Gasteiger. Clique em OK. NOTA: Isso adicionará cargas parciais à proteína.
  6. Para salvar o arquivo, na guia, clique em Arquivo > Salvar PDB. Salvar como proteína.pdb.
    NOTA: Neste estudo, a estrutura da lisozima foi escolhida para comparar com o resultado relatado anteriormente31. Os leitores são aconselhados a selecionar cuidadosamente as estruturas proteicas do organismo alvo de seu interesse.

3. Simulação de MD de lisozima em água

NOTA: Os computadores personalizados para simulação de dinâmica molecular (MD) usados neste estudo são Intel CORE i711ª geração para CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 para GPU e memória DDR4 de 128 GB. O sistema operacional é o Ubuntu 22.04.4 LTS. A simulação MD está usando o software GROMACS. O suporte à GPU é CUDA.

  1. Baixe todos os documentos necessários neste link: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (Tutorial GROMACS, Lisozima em Água)43.
    NOTA: Os documentos necessários são em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff e protein.pdb (da etapa 2.5). Para configuração do sistema, em.mdp é para minimização de energia e ions.mdp é para adicionar íons e neutralizar o sistema. Para equilíbrio, nvt.mdp é para equilíbrio de temperatura, enquanto npt.mdp é para equilíbrio de pressão. Para produção, md.mdp é para simulação. Charmm36 ff é para topologia.
  2. Clique com o botão direito do mouse no espaço vazio na pasta (o diretório de trabalho) e clique em Abrir Terminal. Digite gmx para abrir o software GROMACS. NOTA: O GROMACS não possui uma interface gráfica de usuário; é tudo a partir do comando escrito no terminal.
  3. Para a geração de topologia de proteínas, digite gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. Uma lista de campos de força é fornecida, e o tipo 1 para o campo de força de todos os átomos CHARMM44, seguido pelo tipo 1 para TIP3P para o modelo de água.
    NOTA: A versão atualizada, CHARMM36, também está disponível e pode ser baixada do http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. Defina uma caixa cúbica para cobrir toda a estrutura da proteína. Digite gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic. NOTA: A proteína é colocada a pelo menos 1 nm da borda da caixa. Certifique-se de que o tamanho da caixa de água seja grande o suficiente para proteínas, solventes e íons. Além disso, a caixa d'água deve ser adequada para evitar interações entre imagens periódicas da proteína. A distância mínima recomendada entre a proteína e a borda da caixa é de pelo menos 1,0–1,5 nm.
  5. Para a configuração de solvente46, digite gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. Adicione íons como sódio e/ou cloreto digitando gmx solvato -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
    NOTA: Os íons de sódio e/ou cloreto são/são usados para neutralizar o sistema.
  7. Neutralize o sistema digitando gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral. Selecione 13 para o grupo SOL.
    NOTA: Para a lisozima, 8 moléculas de soluto foram substituídas por íons cloreto (Figura 3).
  8. No arquivo CHARMM 36, procure a pasta ions.itp . A abreviatura de íon cloreto é CLA.
  9. Abra topol.top arquivo, adicione CLA e o número 8 conforme mostrado na Figura 4.
  10. Abra o arquivo solv_ions.gro e troque todos os CL por CLA.
    NOTA: Certifique-se de que os arquivos solv_ions.gro e topol.top tenham a mesma abreviatura dos respectivos íons, caso contrário, um aviso será emitido. Renomear o nome do ion está de acordo com a versão do arquivo CHARMM 36 ff. Como a abreviatura de cloreto já é CL, não há necessidade de renomear os íons na versão mais antiga. No entanto, verifique sempre a abreviatura dos íons.
  11. Relaxe a estrutura da proteína pela minimização da energia de descida mais íngreme com o número máximo de 50.000 passos. Para isso, digite gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr seguido por gmx mdrun -v -deffnm em.
    NOTA: O solvente e os íons são equilibrados em torno da proteína em duas fases: (i) o número de partículas (N), o volume do sistema (V) e a temperatura (T) são constantes (NVT) e (ii) o número de partículas (N), a pressão do sistema (P) e a temperatura (T) são constantes (NPT). O acoplamento de temperatura (fase NVT) é definido em 300 K com base em um termostato Berendsen modificado, enquanto o acoplamento de pressão (fase NPT) é definido em 1 bar com base em Parrinello-Rahman. As interações eletrostáticas de longo alcance e a busca do vizinho mais próximo são calculadas automaticamente usando o método de Ewald de malha de partículas (PME) e o algoritmo Verlet, respectivamente.
  12. Para o equilíbrio do NVT, digite gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr seguido por gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    NOTA: O tempo necessário para o equilíbrio de temperatura é de cerca de 5 min, dependendo da CPU e GPU. Para o equilíbrio do sistema, o tempo de simulação é de 100 ps.
  13. Para o equilíbrio do NPT, digite gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr seguido por gmx mdrun -v -deffnm npt.
    NOTA: O tempo necessário para o equilíbrio de pressão é de cerca de 5 min, dependendo da CPU e GPU. Para o equilíbrio do sistema, o tempo de simulação é de 100 ps.
  14. Faça com que o sistema passe por execuções de balanceamento por 1 ns, seguidas pela execução de produção usando a função mdrun com uma duração de 100 ns. Abra o arquivo md.mdp . Em n etapas, mude para 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Para a produção de dinâmica molecular, digite gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr seguido por gmx mdrun -v -deffnm md.
    NOTA: O tempo para isso é de cerca de ~ 2 dias. Os quadros de trajetória gerados a partir da simulação MD são capturados em intervalos de 10 ps e utilizados para análise de agrupamento baseada em desvio quadrático médio (RMSD).

4. Análise de agrupamento baseada em RMSD

  1. Após a simulação de MD, continue com a análise de comandos. A proteína se difundirá através da célula unitária e pode parecer "quebrada" ou "pular" para o outro lado da caixa. Tipo gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -ur compacto. Tipo 1 para centralizar a proteína e 0 para a saída do sistema. Digite vmd em.gro para visualizar a proteína.
  2. Para análise de energia total, digite gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg e continue para digitar 14 para energia total.
    NOTA: O monitoramento da energia total é fundamental para garantir a confiabilidade e correção das simulações de MD47,48.
  3. Para análise RMSD, digite gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. Continue para digitar 3 para o C-alfa do ajuste de mínimos quadrados e 3 para o C-alfa do cálculo RMSD (Figura 5).
  4. Para análise RMSF, digite gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. Continue para o tipo 1 para proteína.
  5. Para usar grace, digite este comando xmgrace totalenergy.xvg. Ajuste os eixos clicando duas vezes na linha da caixa do gráfico. Uma caixa Grace: Axes aparecerá. Clique em Aceitar.
  6. No menu de guias, clique em Arquivo e Print_setup. Uma graça: A configuração do dispositivo aparecerá. Altere o dispositivo de PostScript para JPEG. Clique em Aceitar. Agora clique em Imprimir no menu de arquivo. Salvar como totalenergy.jpg.
  7. Repita as etapas 4.5 e 4.6 para xmgrace rmsd.xvg e xmgrace rmsfxvg.
  8. Para análise de agrupamento, digite gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. Continue para o tipo 1 (grupo de proteínas) para calcular o ajuste de mínimos quadrados e RMSD e tipo 1 (grupo de proteínas) para saída do sistema.
    NOTA: Ajuste o valor de corte de acordo com o resultado do agrupamento. O comando -cl representa as saídas da média para cada cluster.
  9. Abra cluster-size.xvg.
    1. Com base nas informações fornecidas, aumente o valor de corte RMSD se o número de clusters for baixo ou diminua o valor de corte RMSD se o número de clusters for alto.
  10. Repita a etapa 4.8 com diferentes valores de corte.
    NOTA: Agrupamento com diferentes valores de corte até que um valor de corte RMSD ideal tenha sido determinado com base nos seguintes critérios: (1) O número total de clusters deve ser limitado a menos de 30. (2) É preferível minimizar a presença de clusters com apenas um membro. (3) É desejável que mais de 90% da trajetória seja representada em menos de 10 clusters.
  11. Abra o software Chimera e procure por cluster.pdb.
    NOTA: cluster.pdb contém uma média para cada grupo de clusters.
  12. Clique em Apresentações e Publicação 1 (silhueta, faixa arredondada).
  13. Em seguida, vá para Arquivo > Salvar imagem > Salvar.
  14. Clique em Selecionar > de Cadeia de > (sem ID) > cluster.pdb . Clique em Selecionar > Inverter (todos os modelos). Clique em Ações > Átomos/Vínculos > excluir.
    NOTA: Isso removerá todos os clusters de grupo, exceto o cluster 1.
  15. Em seguida, vá para Arquivo > salve o PDB > salve. Salve como cluster1.pdb.
  16. Repita as etapas 4.11 a 4.15 para clusters diferentes. Salve como cluster2.pdb, cluster3.pdb e cluster4.pdb.
    NOTA: Como o número total dos 4 principais clusters é superior a 90% das trajetórias totais, cada representante dos 4 principais clusters é extraído e submetido à análise de docking molecular usando o Chimera (consulte a Figura 6).

5. Encaixe baseado em conjunto

  1. Clique duas vezes em Autodock Tools software.
    NOTA: Para o docking, este estudo utilizou o software AutoDock e as ferramentas AutoDock 13,49,50,51.
  2. Coloque os arquivos cluster1.pdb e ligand.pdb em uma nova pasta.
  3. No menu, clique em Arquivo > Preferências > Definir. Uma caixa Definir preferências do usuário será exibida. Copie o endereço da "nova pasta" como um texto. Cole o endereço no Diretório de inicialização na caixa Definir preferências do usuário . Clique em Definir.
    NOTA: Esta é uma etapa importante se estiver usando o sistema operacional Windows.
  4. Clique na imagem da pasta azul. Uma pasta de molécula de leitura aparecerá. Selecione cluster1.pdb.
    NOTA: As ferramentas de autodock lerão a estrutura molecular da proteína.
  5. Clique em Editar > encargos > Adicionar encargos Kollman. Em seguida, clique em OK. Clique em Editar > hidrogênios > mesclar apolar.
    NOTA: Cargas de Kollman são adicionadas à proteína.
  6. Clique em Grade > macromoléculas > escolher. Uma caixa Escolher macromoléculas aparecerá. Selecione cluster1 e clique em Selecionar moléculas. Clique em OK. Um arquivo de macromolécula AutoDock4 modificado aparecerá. Salve como cluster1.pdbqt.
  7. Esvazie a área de trabalho clicando em Editar > Excluir > Excluir Todas as Moléculas. Clique em Continuar.
  8. Clique em Ligante > entrada > Abrir.   Um arquivo Ligante para a pasta Autodock4 aparecerá. Escolha Todos os arquivos, selecione ligand.pdb e clique em Abrir. Clique em OK.
    NOTA: O ligante de configuração incluirá a incorporação de cargas de Gasteiger e a fusão de hidrogênio não polar.
  9. Clique em Árvore de torção de ligante > > Detectar raiz.
  10. Clique em Ligante > Saída > Salvar como PDBQT. Uma pasta Formatted Autotors Molecules aparecerá. Salve como ligand.pdbqt.
  11. Esvazie a área de trabalho clicando em Editar > Excluir > Excluir Todas as Moléculas. Clique em Continuar.
    NOTA: Siga o mesmo procedimento descrito na etapa 5.6.
  12. Clique em Grade > Macromoléculas > Abrir. Selecione cluster1.pdbqt e clique em Abrir. Clique em Sim. Clique em Ok.
  13. Clique em Grade > Definir Tipos de Mapa > Ligante Aberto. Selecione ligand.pdbqt e clique em Abrir.
    NOTA: No espaço de trabalho, existem proteínas e ligantes.
  14. Clique em Grade e Caixa de grade. Uma caixa Opções de grade aparecerá. Em Número de pontos na dimensão x, ajuste o parâmetro para 120 e defina Número de pontos na dimensão y para 120, defina Número de pontos na dimensão z para 120. Defina o espaçamento (angstrom) como 0,375. Deixe os parâmetros da caixa de grade central como padrão. Clique em Arquivo e feche Salvando atual.
    NOTA: A caixa da grade está cobrindo toda a proteína, o que significa que é um encaixe cego.
  15. Clique em Saída de > de grade > Salvar GPF. Um arquivo de saída de parâmetro de grade aparecerá. No nome do arquivo, digite grid.gpf e clique em Salvar.
  16. Clique em Executar e Executar AutoGrid. Uma caixa Executar AutoGrid será exibida. Na guia Nome do arquivo de parâmetro , clique em Procurar. Um arquivo de parâmetro de grade automática será exibido. Selecione grid.gpf. Clique em Abrir. Em Nome do caminho do programa > Procurar. Um arquivo autogrid4 aparecerá. Pesquise autogrid4.exe e clique em Abrir > Iniciar.
    NOTA: Certifique-se de que o nome da pasta não contenha espaços, pois isso pode resultar em um erro durante a execução. A pasta autogrid4.exe pode ser instalada a partir do https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  17. Clique em Encaixar > macromoléculas > definir nomes de arquivos rígidos. Um arquivo PDBQT Macromolecules aparecerá. Selecione cluster1.pdbqt e clique em Abrir.
  18. Clique em Encaixar > ligante > escolher. Uma caixa Escolher ligantes é exibida. Selecione o ligante e clique em Selecionar ligante. Uma caixa AutoDpf4 Ligand Parameter aparecerá. Clique em Aceitar.
  19. Clique em Encaixe > Parâmetro de Pesquisa > Algoritmo Genético. Uma caixa Parâmetros de algoritmo genético aparecerá. Altere o número de execuções de GA para 100. Deixe os parâmetros restantes como padrão. Clique em Aceitar.
  20. Clique em Encaixar > Saída > Lamarckian GA(4.2). Um arquivo de saída do parâmetro de encaixe GALS do Autodock4.2 será exibido. Para o nome do arquivo, digite docking.dpf e clique em Salvar.
  21. Clique em Executar > Executar AutoDock. Uma caixa Executar Autodock aparecerá. Em Nome do arquivo de parâmetro, clique em Procurar. Um arquivo de parâmetro autodock4 é exibido. Selecione docking.dpf. Clique em Abrir. Em Nome do Caminho do Programa, clique em Procurar. Um arquivo autodock4 aparecerá. Pesquise autodock4.exe e clique em Abrir. Clique em Iniciar.
    NOTA: Certifique-se de que o nome da pasta não contenha espaços, pois isso pode resultar em um erro durante a execução. O tempo gasto é de ~ 30 min. A pasta autodock4.exe pode ser instalada usando o link: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Exclua todas as moléculas conforme descrito na etapa 5.7.
  23. Repita as etapas de 5.1 a 5.22 para cluster2.pdb, cluster3.pdb e cluster4.pdb.
    NOTA: Todos os 4 grupos de encaixe serão usados para análise.

6. Análise de encaixe baseada em conjunto

  1. Use o software AutoDock Tools para continuar a análise. Clique em Analisar > encaixe > Abrir. Um arquivo de log de encaixe será exibido. Selecione docking.dlg e clique em Abrir. Em seguida, clique em OK.
  2. Clique em Analisar > macromoléculas > abrir.
  3. Clique em Analisar > Conformações > Jogo, classificado por energia. Uma caixa de ligante aparecerá.
  4. Na nova pasta, abra a pasta docking.dlg usando um bloco de notas. Busca por análise de agrupamento de conformação. A partir das informações fornecidas, pesquise o trecho de conformação (indicado como Run), que tem a energia de ligação mais baixa.
    NOTA: Como existem 100 conformações executadas, apenas uma tem a afinidade de ligação mais forte entre ligante e proteína. O termo para menor energia de ligação é definido como tendo uma afinidade de ligação mais forte 52,53,54.
  5. Na etapa 6.3 (caixa de ligante ), insira o trecho de conformação (da etapa 6.4) e pressione Enter.
    NOTA: O ligante se posicionará adequadamente dentro da proteína.
  6. Na caixa de ligante , clique no botão abrir painel para alterar a opção de reprodução. Uma caixa Definir opção de reproduçãoaparecerá. Clique em Gravar complexo. Um complexo de gravação da pasta receptora aparecerá. Salve como complex.pdb.
    NOTA: Como há 4 grupos de clusters, o arquivo complex.pdb pode ser nomeado de acordo, como complex1.pdb para o grupo de clusters 1.
  7. Abra o software Chimera e procure por complex.pdb (como na etapa 6.6).
  8. Clique em Predefinições > Interativa 1 (faixas de opções) > Publicação 1 (silhueta, faixa de opções arredondada).
  9. Em seguida, vá para Arquivo e clique em Salvar imagem.
    NOTA: A imagem salva é a estrutura da faixa de opções do complexo FB-LYZ.
  10. Clique em Predefinições > Interativa 3 (superfície de hidrofobicidade) > Publicação 1 (silhueta, faixa arredondada).
    NOTA: A imagem salva é a estrutura de balão do complexo FB-LYZ.
  11. Abra o software Discovery Studio.
  12. Arraste o complex.pdb para o espaço vazio do software.
  13. Clique na guia Ferramentas e selecione Mostrar diagrama 2D.
    NOTA: O software irá gerar automaticamente a estrutura 2D do complexo (Figura 7).
  14. Clique em Arquivo e Salvar como. Escreva o nome do arquivo e clique em Salvar.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A estrutura química e a representação estrutural 3D do FB após a otimização são mostradas na Figura 8A. A Figura 8B mostra a estrutura 3D da lisozima com o código pdb 1LYZ no estado inicial antes da simulação MD. A fim de estudar a dinâmica e flexibilidade da estrutura 3D da lisozima, foi realizada uma simulação de MD para 100 ns. A energia total da estrutura da proteína foi estável durante a simulação, conforme mostrado na

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aplicação baseada em conjunto na descoberta computacional de medicamentos envolve a utilização de vários conjuntos conformacionais derivados de estruturas cristalinas, estudos de ressonância magnética nuclear (RMN) ou simulações de dinâmica molecular26. A exploração de múltiplas conformações computacionais permitiria que a análise incorporasse a dinâmica e a flexibilidade de uma estrutura proteica, levando ao aumento da precisão e confiabilidade na identificação...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Universiti Malaya RMF Grant, Projeto Número RMF1392-2021 da Universiti Malaya.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AutoDockThe Scripps Research Institute, EUAVersão 4.2.6
Ferramentas AutoDockThe Scripps Research Institute, EUAVersão 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Departamento de Química, Universidade de Pittsburgh, Pittsburgh, EUAVersão 1.95
Discovery StudioDassault Systè mes, Massachusetts,EUA Versão 2021
GROMACsUniversity of Groningen
Royal Institute of Technology
Uppsala University, Suécia		Versão 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics
University of California		Version 1.16

Referências

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Ensemble Based DockingProtein Structure FlexibilityMolecular Dynamics SimulationStructure Based Drug DiscoveryProtein Conformation ClusteringLigand DockingRoot Mean Square DeviationFlavokawain B BindingElectrostatic Surface MappingComputational Drug Discovery

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