Triagem de fragmentos covalentes usando o ensaio quantitativo de amarração irreversível

Summary

O ensaio quantitativo de amarração irreversível (qIT) é um método baseado em fluorescência para identificar fragmentos covalentes que se envolvem seletivamente com uma proteína-alvo. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para descrever o ensaio qIT, com exemplos de resultados incluídos.

Abstract

Compostos que formam ligações covalentes com proteínas-alvo específicas oferecem uma variedade de vantagens como sondas químicas e agentes terapêuticos. Mais comumente, pequenas moléculas eletrofílicas levemente reativas são empregadas para formar ligações covalentes com cadeias laterais de cisteína selecionadas em proteínas específicas. As abordagens eletrófilas de descoberta de ligantes, em que uma biblioteca de pequenas moléculas eletrofílicas são rastreadas contra um alvo de proteína, tornaram-se populares, pois evitam a necessidade de instalação demorada a jusante de uma ogiva eletrofílica. Essa triagem é complicada, no entanto, pois os ligantes eletrofílicos podem exibir uma ampla gama de diferentes taxas de reação espontânea com cisteínas. O tethering quantitativo-irreversível (qIT) oferece um método baseado em fluorescência para identificação e desenvolvimento de acertos que normaliza os dados para essas diferenças na reatividade intrínseca do composto. As taxas de reação de compostos individuais com uma proteína alvo são determinadas e comparadas com a reatividade do composto com o tripeptídeo glutationa não estruturado (sendo este um proxy para a reação espontânea do composto), permitindo a identificação de compostos que reagem preferencialmente com a proteína de interesse. Essa metodologia foi aplicada com sucesso para identificar fragmentos covalentes seletivos contra vários alvos de drogas, incluindo a protease principal do SARS-CoV-2, a quinase dependente de ciclina 2 e a RAP27A. Aqui, demonstramos a aplicação de qIT a uma proteína alvo para gerar um conjunto de dados quantitativo e robusto, permitindo a priorização de ligantes de hit para desenvolvimento futuro.

Introduction

Os ligantes covalentes direcionados reativos à cisteína (moléculas que exercem um efeito biológico ao reagir com um resíduo de cisteína selecionado em uma proteína específica) tornaram-se cada vez mais populares como ferramentas químicas e terapêuticas nas últimas décadas¹. Estes geralmente consistem em um eletrófilo levemente reativo (como acrilamida, cloroacetamida ou vinil sulfona) anexado a uma porção ligante com alta afinidade por uma proteína alvo². Idealmente, a interação ligante-proteína ocorre por meio de um mecanismo de duas etapas envolvendo a ligação inicial do ligante não covalente, seguida pela formação de ligações covalentes irreversíveis entre a cisteína alvo e o eletrófilo³.

Vários ligantes covalentes direcionados iniciais, incluindo o inibidor de tirosina quinase de Bruton, ibrutinibe, foram desenvolvidos fornecendo um ligante reversível previamente identificado com uma alça eletrofílica⁴. No entanto, essa abordagem nem sempre é bem-sucedida, e outras tentativas descobriram que a instalação de eletrófilos requer otimização significativa⁵. Em vez disso, as abordagens eletrófilas, particularmente usando fragmentos eletrofílicos, tornaram-se mais populares nos últimos anos. Isso normalmente envolve a incubação de uma biblioteca de eletrófilos com uma proteína e, em seguida, a seleção de compostos com uma taxa aumentada de reação em direção a uma cisteína, que se supõe ser induzida por interações produtivas não covalentes entre o ligante e a bolsa de ligação⁶. Notavelmente, esses métodos foram aplicados com sucesso durante o desenvolvimento do inibidor de KRAS (G12C) Sotorasib¹.

A triagem do primeiro eletrófilo apresenta vários desafios únicos quando comparada à triagem tradicional de ligantes não covalentes, principalmente devido à alta variabilidade na reatividade dentro e entre as classes de ogivas⁷. A maioria dos eletrófilos reativos à cisteína irá, com o tempo, reagir com todos os resíduos de cisteína expostos ao solvente, independentemente de qualquer interação seletiva para a proteína alvo. A ocupação do ligante, portanto, aumentará ao longo do tempo para quase todos os eletrófilos e, sem controlar a reatividade, a seleção de acertos geralmente será tendenciosa para fragmentos mais reativos que atingem um alvo mais rapidamente⁸.

Além disso, os métodos de triagem eletrófilos geralmente usam espectrometria de massa para detectar a formação de adutos proteína-ligante, que é limitada no rendimento⁹. A amostragem regular de reação é necessária por um longo período de tempo (horas a dias) para caracterizar adequadamente a cinética da reação para uma biblioteca de compostos com eletrofilicidade variada¹⁰. Uma triagem de 300 fragmentos amostrados em 10 pontos de tempo exigirá, portanto, a realização de 3000 espectros de massa, excedendo o rendimento da maioria dos sistemas de espectrometria de massa de proteínas. Métodos de maior rendimento de monitoramento da formação de adutos proteína-ligante são, portanto, desejáveis.

A abordagem descrita aqui, o ensaio de tethering quantificado irreversível (qIT), é um método de triagem eletrófilo que controla a reatividade intrínseca e utiliza uma leitura de fluorescência simples⁷. Proteínas, ou glutationa (um tripeptídeo não estruturado contendo tiol usado como controle da reatividade intrínseca) são incubadas com uma biblioteca de fragmentos eletrofílicos e amostras regulares coletadas para têmpera em uma solução de CPM (7-dietilamino-3- (4'-maleimidilfenil) -4-metilcumarina, um agente fluorogênico de quantificação de tiol). A formação de adutos entre a cisteína e o fragmento eletrofílico reduz a quantidade de tiol disponível para reação com CPM, reduzindo a fluorescência resultante na têmpera. A fluorescência CPM, portanto, atua como um proxy para o tiol não reagido, permitindo que a cinética da reação do tiol com cada fragmento eletrofílico seja determinada. Fragmentos eletrofílicos com reatividade proteica significativamente aumentada sobre a glutationa são selecionados como hits e priorizados para desenvolvimento posterior (Figura 1).

Figura 1: Esquema do qIT. Uma visão geral esquemática do ensaio qIT. (criado usando BioRender). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A seleção de acertos usando valores REF controla a reatividade intrínseca e garante que os fragmentos sejam selecionados como acertos apenas se formarem interações produtivas não covalentes com um alvo de proteína. A leitura simples de fluorescência também significa que o ensaio qIT é altamente escalável e não requer métodos de monitoramento de reação baseados em espectrometria de massa.

Aqui, um procedimento abrangente para o ensaio qIT é descrito, com exemplos de resultados incluídos para ilustrar o desempenho do ensaio e a seleção de acertos.

Protocol

1. Construção da biblioteca de fragmentos

1. Projete uma biblioteca de fragmentos eletrofílicos e sintetize-os ou compre-os. As bibliotecas de fragmentos eletrofílicos geralmente consistem em eletrófilos levemente reativos (como acrilamidas, cloroacetamidas e vinil sulfonamidas) anexados a uma gama diversificada de andaimes químicos. Bibliotecas de fragmentos eletrofílicos estão amplamente disponíveis em fornecedores comerciais, e mais detalhes sobre seu projeto e construção são revisados em outro lugar ^5,11.
2. Dissolva cada composto em DMSO até uma concentração de 50 mM e, em seguida, dispense um composto diferente em cada poço das colunas 3 a 22 de uma placa reservatório de 384 poços, denominada Placa de Biblioteca de Fragmentos.
   1. Dispensar DMSO em cada alvéolo das colunas 1, 2, 23 e 24 para os controlos positivo e negativo. O layout da placa pode variar dependendo do número de compostos que estão sendo peneirados (Figura 2). O volume adicionado à placa biblioteca dependerá do número de peneiras a serem realizadas, considerando que é necessário aproximadamente 1,8 μL de cada poço por peneira qIT. Preparar esta placa de biblioteca de fragmentos com antecedência e guardá-la a 4 °C.

Figura 2: Layout da placa. Uma visão geral do layout da placa de 384 poços do ensaio qIT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Configuração do ensaio (Figura 3)

1. Prepare as seguintes soluções: solução de proteína recombinante (proteína-alvo em qualquer tampão), tampão de ensaio qIT (NaCl 150 mM, Hepes 25 mM (pH 8)), tampão de resfriamento de ensaio qIT (NaCl 150 mM, Hepes 25 mM (pH 7,5)) e soluções estoque compostas (fragmento eletrofílico (50 mM) em DMSO).
   NOTA: Um pH de 8 é usado no tampão de reação para acelerar a reação entre o resíduo de cisteína alvo e os fragmentos, permitindo que a taxa de reação seja medida mesmo para fragmentos extremamente levemente reativos. Um pH ligeiramente mais baixo de 7,5 é usado no tampão de têmpera, pois a ligação tioéter formada entre a maleimida do CPM e o tiol cisteína é propensa à hidrólise em pHs mais básicos (por exemplo, trabalhos anteriores descobriram que os conjugados cisteína-maleimida são muito mais estáveis em pH 7,3 do que pH 8¹²).
2. Remova as soluções de estoque de fragmentos de DMSO do armazenamento e deixe-as em temperatura ambiente por no mínimo 2 h para permitir que os estoques compostos descongelem.
3. Degas qIT tampão de ensaio borbulhando com gás argônio por aproximadamente 30 min.
4. Troque completamente a solução de proteína-alvo em tampão de ensaio qIT desgaseificado. Crucialmente, agentes redutores como DTT e TCEP devem ser completamente removidos para concentrações < 100 nM, pois eles interferirão na quantificação do tiol. Esta etapa pode ser executada por meio de uma série repetitiva de trocas de buffer, conforme descrito abaixo.
   1. Diluir a solução proteica em excesso do tampão qIT desgaseificado numa unidade de filtro de centrifugação, concentrar por centrifugação (4000 x g, 4 °C, 15 min) e repetir. Normalmente, são necessárias 4 rodadas de diluições de 1 em 15 para remover suficientemente a TDT (1 mM) de 1 mL de solução estoque de proteína recombinante, embora essa etapa possa ser ajustada dependendo da concentração do agente redutor na solução de proteína recombinante original.
      NOTA: Alternativamente, dialisar a solução de proteína alvo contra um grande excesso de tampão de ensaio qIT desgaseificado pode alcançar o mesmo resultado.
5. Diluir a solução de proteína-alvo (produzida na etapa 2.1) até uma concentração de proteína de 15 μM em tampão qIT desgaseificado. Aproximadamente 9 mL de solução de proteína-alvo são necessários para preencher uma placa de 384 poços com volume morto suficiente.
6. Preparar uma suspensão a 1,5% (v/v) de TCEP-agarose em tampão de ensaio qIT desgaseificado. São necessários aproximadamente 9 mL de suspensão de TCEP-agarose por placa de triagem.
7. Dispense 20 μL de solução de TCEP-agarose em cada poço de duas placas de 384 poços.
8. Preparar uma reserva de glutationa a 15 μM em tampão de ensaio qIT desgaseificado. Isso deve ser preparado imediatamente antes do plaqueamento, pois a glutationa oxida rapidamente em solução sem agente redutor.
9. Dispense 20 μL de tampão de ensaio qIT nas colunas 1 e 2 de ambas as placas de 384 poços.
10. Dispense 20 μL de proteína 15 μM ou solução de glutationa (de acordo com a placa pretendida) nas colunas 3-24 da placa de 384 poços. Estes são denominados Placa de Reação de Proteína e Placa de Reação de Glutationa. Deixar reduzir à temperatura dos ovos durante 1 h.
11. Dispense 58,2 μL de tampão de ensaio qIT desgaseificado em cada poço de uma placa de 384 poços e, em seguida, transfira 1,8 μL de cada poço correspondente da Placa de Biblioteca de Fragmentos para criar uma Placa de Diluição de Composto, onde cada composto é diluído a uma concentração de 1,5 mM em tampão de ensaio qIT mais 3% de DMSO.
    NOTA: Esta etapa é facilitada com uma estação de pipetagem 384, que permite que os estoques compostos sejam transferidos para cada poço em uma operação.
12. Após 1 h de incubação de proteína e glutationa com TCEP-agarose, transfira 20 μL de solução composta de cada poço da placa de diluição composta para as placas de reação de proteína e glutationa para iniciar o ensaio. Esta etapa também é facilitada com uma estação de pipetagem 384. As etapas do ensaio estão resumidas na Figura 3.
    NOTA: A concentração do fragmento pode ser variada conforme necessário, e os ensaios qIT podem ser repetidos para os acertos em concentrações mais baixas, se desejado, para confirmar que a afinidade da proteína não é um artefato da alta concentração do fragmento. A concentração relativamente alta do fragmento é usada para elevar o k_pro e k_GSH para garantir que as taxas precisas sejam determináveis para compostos levemente reativos (que podem exibir t_1/2 (GSH) > 24 h sob as condições do ensaio). Além disso, embora uma concentração de fragmentos de 500 μM seja alta, altas concentrações de μM a baixas mM têm sido usadas na triagem de fragmentos, por exemplo¹³.
13. Inicie um cronômetro - o ensaio começou e as têmperas devem ser realizadas em pontos de tempo regulares, de acordo com a seção abaixo.

Figura 3: resumo do ensaio qIT. Um resumo ilustrando as principais etapas da configuração do poço de reação do ensaio qIT. (criado usando BioRender). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. O CPM extingue

NOTA: As têmperas de CPM são realizadas para quantificar a quantidade de tiol não reagido restante nas placas de reação de proteína e glutationa. Estes devem ser realizados em pontos de tempo discretos (por exemplo, os seguintes pontos de tempo são normalmente usados: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 e 1440 min) para permitir que a cinética da reação seja monitorada.

1. Prepare soluções de estoque CPM (500 μM) em DMSO, distribua-as em alíquotas de 111,2 μL em tubos de microcentrífuga e armazene-as a -20 °C. Esses estoques de CPM podem ser preparados com antecedência e 1 alíquota será necessária por ponto de tempo de extinção.
2. Prepare a solução de resfriamento de CPM (1,4 μM) descongelando uma solução de estoque de CPM congelada (500 μM) e adicionando-a a 40 mL de tampão de resfriamento de ensaio qIT.
3. Dispense 27 μL de solução de têmpera de CPM em cada poço de duas placas de 384 poços - duas são necessárias para extinguir as placas de reação de proteína e glutationa. Estas são denominadas placas de têmpera CPM, prepare-as no máximo 30 minutos antes do uso.
4. Centrifugue a placa de reação de proteína a 200 x g por 3 min para garantir que a TCEP-agarose seja peletizada.
5. Em pontos de tempo pré-determinados, transfira 3 μL de amostra de cada poço da placa de reação de proteína para uma placa de têmpera CPM pré-preenchida. Esta etapa também é simplificada usando uma estação de pipetagem 384.
6. Misture a placa de têmpera CPM aspirando e dispensando 3 x 25 μL. É importante remover a amostra do topo do poço para evitar a aspiração da TCEP-agarose na parte inferior, o que interferirá na têmpera do CPM.
7. Repita as etapas 3.4-3.6 com a placa de reação de glutationa.
8. Incube as placas de têmpera CPM (preparadas em 3.4-3.6) à temperatura ambiente por 1 h.
9. Medir a intensidade de fluorescência da placa de atenuação CPM (excitação a 384 nm e emissão a 470 nm).

4. Análise de dados e seleção de acertos

1. Para cada têmpera, calcule Z' como uma medida da qualidade do ensaio. Quaisquer apagamentos de CPM com Z' < 0,5 devem ser desconsiderados.
   Z' = 1 - ((3σ_{controle positivo} + 3σ_{controle negativo}) / (μ_{controle positivo} - μ_{controle negativo}))
   Onde σ = desvio padrão da intensidade de fluorescência e μ = média da intensidade de fluorescência
2. Calcular os valores médios de fluorescência para os alvéolos de controlo negativo e positivo (colunas 1 e 2 e 23 e 24, respectivamente).
3. Normalizar bem cada reacção para os valores médios de fluorescência dos controlos positivo e negativo:
   % modificado = 100 x (fluorescência de poço composto - fluorescência de controlo negativo) / (fluorescência de controlo positivo - fluorescência de controlo negativo)
4. Represente separadamente o gráfico % modificado em relação ao tempo para cada composto que reage com a glutationa e com a proteína-alvo.
5. Ajuste os dados normalizados de % modificados em relação ao tempo a um modelo de decaimento exponencial de uma fase para a reação com proteína e com glutationa usando a equação:
   % Modificado = ae ^{- kt + c}
   Onde a = o intervalo de % de valores modificados, k = taxa de reação, t = tempo, c = o valor % modificado em tempo infinito. O ajuste da curva e a determinação dos parâmetros podem ser realizados usando software comercial (como o Graphpad).
6. Use a taxa na qual os fragmentos reagem com proteína (k_pro) e glutationa (k_GSH) para calcular o valor do Fator de Aumento de Taxa (REF) para cada fragmento:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Use os valores REF para selecionar fragmentos de ocorrência. Isso pode ser feito definindo um limite REF (por exemplo, REF > 3), uma taxa de acerto arbitrária (por exemplo, top 2%) ou selecionando fragmentos com desvios padrão REF 3 maiores que a média geométrica.

Results

O ensaio qIT é usado aqui para identificar fragmentos covalentes para uma proteína de cisteína única sem nome. MgCl₂ (10 mM) foi adicionado aos tampões de reação, pois a proteína-alvo é conhecida por se ligar a íons Mg²⁺ . A triagem foi realizada em triplicata, e a taxa na qual cada fragmento reagiu com a proteína alvo (k_pro) e a glutationa (k_GSH) foi determinada. Os valores de Z' foram maiores que 0,5 para todas as placas de têmpera e a média foi de 0,75 para têmperas de proteína e 0,79 para têmperas de glutationa, indicando excelente desempenho do ensaio. Os valores de REF foram então calculados para cada fragmento e os acertos selecionados onde REF > 3.

Os resultados representativos (Figura 4) fornecem um exemplo de seleção de acertos usando o ensaio qIT. O composto 1 reagiu a uma taxa 6,0 vezes maior com o resíduo de cisteína na proteína-alvo do que com a glutationa e, usando um critério de REF > 3, foi selecionado como acerto (Figura 4B). Essa aceleração da taxa indica a presença de um efeito de modelagem, pelo qual as interações não covalentes posicionam 1 na orientação correta para a cisteína na proteína alvo reagir com a ogiva de cloroacetamida. Em contraste, 2 é um exemplo de fragmento não atingido, pois a reação entre 2 e o resíduo de cisteína alvo não é acelerada em relação à reação entre 2 e glutationa. A falta de aceleração da taxa indica que não há interações não covalentes produtivas posicionando 2 na orientação correta para reagir com o resíduo de cisteína alvo.

Figura 4: Resultados representativos. Os resultados mostram o monitoramento da reação de proteína e glutationa por qIT para (A) uma alta reatividade intrínseca, um possível fragmento de hit falso-positivo e (B) um fragmento de hit. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O ensaio qIT fornece uma plataforma eficaz e conveniente para a triagem de fragmentos eletrofílicos reativos à cisteína em relação a uma proteína-alvo. No entanto, existem considerações críticas que podem prejudicar o desempenho do ensaio se não forem adequadamente contabilizadas. Mais notavelmente, as proteínas-alvo devem incluir apenas uma única cisteína exposta à superfície para serem adequadas para a triagem de qIT, pois outros resíduos de cisteína reagirão com o CPM e interferirão nas medições de fluorescência. Em casos anteriores em que as proteínas-alvo contêm várias cisteínas expostas à superfície (como a protease principal do SARS-CoV-2, a pequena GTPase RAP27A e a quinase dependente de ciclina 2), construções de triagem com resíduos interferentes removidos foram usadas anteriormente com sucesso. No entanto, a eficácia dessa estratégia varia de acordo com a proteína 10,14,15.

Além disso, como o ensaio qIT mede a diminuição do tiol disponível para reagir com o CPM ao longo do tempo, qualquer fator que reduza a proporção de tióis disponíveis, como oxidação de tióis ou agregação de proteínas, pode prejudicar o desempenho do ensaio. A desgaseificação do tampão e o uso de um agente redutor imobilizado (TCEP-agarose) garantem que a oxidação do tiol seja lenta e qualquer oxidação remanescente deve ser mitigada normalizando as medições de fluorescência para os poços de controle positivo. No entanto, podem surgir problemas quando uma distribuição desigual de TCEP-agarose entre os poços causa oxidação não uniforme do tiol. O plaqueamento consistente de TCEP-agarose é, portanto, essencial para o desempenho do ensaio, o que pode ser um desafio, pois as partículas de TCEP-agarose afundam nos reservatórios de pipetagem.

A agregação de proteínas também pode ser um problema, pois as condições do ensaio (24 h de incubação à temperatura ambiente) são relativamente severas. Estratégias de solução de problemas, como fundir proteínas-alvo com etiquetas solubilizantes, alterar tampões de reação ou realizar o ensaio em temperaturas mais baixas, podem reduzir a agregação e resolver problemas de estabilidade de proteínas. Certos fragmentos também podem induzir a agregação de proteínas, o que novamente reduz a proporção de tiol disponível para reagir com o CPM e cria resultados falsos positivos. A validação ortogonal de acertos usando espectrometria de massa de proteínas intactas é um método eficaz de detectar esses casos, pois os acertos falsos positivos criarão uma população pequena ou inexistente de espécies marcadas quando incubadas com uma proteína-alvo.

Quando essas considerações são controladas, o ensaio qIT tem algumas vantagens claras sobre outros métodos de triagem de fragmentos covalentes. A seleção de acertos usando REF garante que os acertos sejam selecionados apenas se formarem interações produtivas não covalentes com a proteína-alvo. A eletrofilicidade do fragmento varia em grandes intervalos, tanto entre diferentes ogivas quanto dentro das classes de ogivas; Por exemplo, trabalhos anteriores encontraram várias centenas de vezes variações na taxa de reatividade da glutationa entre as acrilamidas¹⁰. Essa ampla gama de eletrofilicidade pode dificultar a distinção de fragmentos com altos valores de k_pro devido a um efeito de modelagem daqueles que são simplesmente altamente reativos, o que pode levar à seleção de fragmentos altamente reativos como acertos falsos positivos. Por exemplo, 2 reagiu com o resíduo de cisteína alvo mais rapidamente do que 1 e, sem considerar a reatividade intrínseca, pode ser selecionado como um acerto. No entanto, 2 não reage com o resíduo de cisteína alvo em uma taxa maior do que com a glutationa, indicando que o maior k_pro de 2 em relação a 1 é devido à maior reatividade intrínseca do fragmento, e não a um efeito de modelagem.

A leitura simples de fluorescência usada pelo ensaio qIT para quantificar o tiol restante também é altamente vantajosa. Outros métodos de triagem de fragmentos covalentes usam espectrometria de massa de proteína intacta para determinar a taxa na qual os fragmentos reagem com uma proteína-alvo e LC-MS para determinar a taxa na qual a glutationa reage com fragmentos - ambos requerem equipamento especializado e carecem de rendimento ^8,16. A leitura de fluorescência conveniente torna o ensaio qIT altamente escalável e requer apenas equipamentos de laboratório comumente disponíveis.

Combinadas, essas inovações criam um método robusto e escalável de triagem de fragmentos covalentes, o que elimina a necessidade de equipamentos de espectrometria de massa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gás argônio	BOC	I1149
Corning 384 poços, flange baixo, placas de ensaio de fundo plano	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
TCEP-agarose imobilizado	Pierce	77712
Leitor de microplacas	CLARIOstar
Selos de placa de PCR	BioRad	MSA5001
L-glutationa reduzida	Sigma-Aldrich	G4251
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S9888
Hepes de sódio	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7