Artigo de método

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

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DOI:

10.3791/67186

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8 de novembro de 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

Neste artigo

Resumo

A respiração mitocondrial em células inteiras de levedura é um indicador valioso da bioenergética celular. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar esse fenótipo aplicável a diferentes espécies de leveduras.

Resumo

O metabolismo é coordenado principalmente pela disponibilidade de energia celular e pelas condições ambientais. Ensaios para saber como as células adaptam o metabolismo energético a diferentes condições nutricionais e ambientais fornecem informações valiosas para elucidar mecanismos moleculares. A fosforilação oxidativa é a principal fonte de ATP na maioria das células, e a atividade da respiração mitocondrial é um componente chave da fosforilação oxidativa, mantendo o potencial da membrana mitocondrial para a síntese de ATP. A respiração mitocondrial é frequentemente estudada em mitocôndrias isoladas que não possuem o contexto celular. Aqui, apresentamos um método para quantificar a respiração mitocondrial em células intactas de leveduras. Este método se aplica a qualquer espécie de levedura, embora tenha sido geralmente usado para células de Saccharomyces cerevisiae. Primeiro, o crescimento da levedura em condições específicas é testado. Em seguida, as células são lavadas e ressuspensas em água deionizada na proporção de 1:1 (p/v). As células são então colocadas em uma câmara de oxímetro com agitação constante, e um eletrodo de Clark é usado para quantificar o consumo de oxigênio. Algumas moléculas são colocadas sequencialmente na câmara e selecionadas de acordo com esse efeito na cadeia de transporte de elétrons ou síntese de ATP. A oligomicina inibidora da ATPase é adicionada pela primeira vez para medir a respiração acoplada à síntese de ATP. Posteriormente, um desacoplador é usado para medir a capacidade respiratória máxima. Finalmente, uma mistura de inibidores da cadeia de transporte de elétrons é adicionada para descartar o consumo de oxigênio não relacionado à respiração mitocondrial. Os dados são analisados por meio de uma regressão linear para obter a inclinação, representando a taxa de consumo de oxigênio. A vantagem deste método é que ele é específico para a respiração mitocondrial de leveduras, mantendo o contexto celular. É essencial destacar que os inibidores usados na quantificação da respiração mitocondrial podem variar entre as espécies de leveduras.

Introdução

A mitocôndria desempenha um papel fundamental na bioenergética celular, uma vez que é a principal fonte de ATP para a maioria das células, e várias vias convergem e dependem da atividade das vias mitocondriais1. A fosforilação oxidativa é necessária para a síntese de ATP que combina o transporte de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons para reduzir o oxigênio e a atividade da ATPase F1F0, sintetizando ATP usando o potencial de membrana mitocondrial produzido devido ao fluxo de elétrons2. Assim, a respiração mitocondrial faz parte da fosforilação oxidativa3.

A cadeia respiratória mitocondrial compreende quatro complexos ou, em alguns casos, complexo de levedura deficiente em I (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), três complexos e três proteínas desidrogenase4. Os complexos respiratórios estão localizados na membrana mitocondrial interna; algumas leveduras apresentam a cadeia canônica de transporte de elétrons com complexo I (NADH desidrogenase) ou três NADH desidrogenase, ubiquinona (Co Q), complexo II (succinato ubiquinona oxidorredutase), complexo III (ubiquinona citocromo oxidorredutase), citocromo c (Cyt c) e complexo IV (citocromo c oxidase)5,6. O transporte de elétrons através dos complexos permite o bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar, formando um potencial de membrana mitocondrial7. Os prótons localizados no espaço intermembranar são bombeados ao contrário, em direção à matriz mitocondrial por F1F0 -ATPase para sintetizar uma molécula de ATP por quatro prótons bombeados8.

As medições da respiração mitocondrial fornecem informações valiosas sobre a integridade mitocondrial, a bioenergética celular e a capacidade respiratória mitocondrial9. A função da respiração mitocondrial pode ser analisada in vitro ou in situ usando diversas técnicas. No entanto, a análise da respiração mitocondrial em células intactas pode apresentar uma série de vantagens, uma vez que compreende todo o metabolismo celular, uma vez que as interações das células com seu ambiente e o metabolismo intracelular são considerados quando se emprega células inteiras10. Além disso, o uso de células intactas permite a fácil avaliação de várias condições experimentais e detecta alterações mínimas que não puderam ser observadas em mitocôndrias isoladas10,11. Outra vantagem da quantificação da respiração mitocondrial em células intactas é que os efeitos da proliferação e localização mitocondrial são retidos12.

A respiração mitocondrial de mamíferos em células intactas tem sido descrita em grande detalhe12, deixando de lado o estudo de outros organismos eucarióticos, como leveduras. Aqui, propomos uma técnica para quantificar a respiração mitocondrial adaptada à levedura a partir de protocolos de mamíferos. Assim, conceitos da quantificação da respiração mitocondrial em mamíferos têm sido utilizados nesta técnica. Por exemplo, esta técnica é dividida em vários estágios como o protocolo de mamíferos: 1) respiração basal (dependente do substrato), 2) respiração ligada ao ATP (através da inibição da ATP sintase), 3) capacidade respiratória máxima (empregando um desacoplador que permite a permeabilidade dos prótons através da membrana mitocondrial interna), 4) inibição da respiração mitocondrial (utilizando uma mistura de inibidores da cadeia respiratória para descartar o consumo de oxigênio para outras fontes diferentes de respiração mitocondrial)11,13. Portanto, este trabalho tem como objetivo apresentar um protocolo para quantificar a respiração mitocondrial em leveduras.

Protocolo

1. Meios de cultura e preparação do inóculo

  1. Prepare 100 mL de extrato de levedura-peptona-dextrose (YPD) adicionando 1 g de extrato de levedura, 2 g de peptona de caseína e 2 g de glicose em 95 mL de água destilada. Distribua 3 mL em tubos de ensaio de vidro de 10 mL, esterilize a 121 °C e 1,5 psi por 15 min.
    NOTA: O meio pode ser armazenado a 4 - 8 °C por até 1 mês.
  2. Inocule um tubo de ensaio de vidro de 10 mL contendo 3 mL de meio YPD com 250 μL de células de levedura preservadas em glicerol a -20 ° C. Incubar durante a noite com agitação constante a 200 rpm e 30 °C.
    NOTA: A temperatura de incubação pode variar em algumas espécies de leveduras (por exemplo, Kluyveromyces marxianus tem uma temperatura de crescimento ideal de 37 °C).
  3. Encha uma placa de Petri (60 x 15 mm2) com ágar YPD estéril a 2% (adicione 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glicose e 20 g de ágar bacteriológico para 950 mL de água destilada) e risque a placa de Petri com as células de levedura cultivadas no tubo de ensaio de vidro de 10 mL usando uma alça estéril. Incubar a placa de Petri a 30 °C até aparecerem colónias isoladas.
  4. Prepare um pré-inóculo inoculando um tubo de ensaio de vidro estéril de 10 mL contendo 3 mL de meio YPD a 2% de glicose com duas ou três colônias isoladas de levedura da placa de Petri. Incubar durante a noite com agitação constante a 30 °C.

2. Condições de crescimento e desenho de experimentos

  1. Inocular um balão Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio sintético completo estéril (meio SC; 0,18 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 0,5 g de sulfato de amônio, 0,2 g de fosfato dipotássico, 1 g de suplementos de drop-out sintético de levedura e glicose de acordo com o desenho experimental, em 98,02 mL de água destilada) com cultura de levedura em ODinicial 600 ~ 0,1, isto é, aproximadamente 3 ml do pré-inóculo durante a noite (OD600 ~ 3). Defina a condição ambiental ou suplemento com o desafio químico a ser testado na respiração mitocondrial (por exemplo, adicionando 100 μM de resveratrol). Preparar um comando do veículo num balão separado para o teste de provocação química. Testar pelo menos três réplicas biológicas.
    NOTA: Recomenda-se o uso de um meio mínimo para descartar o ruído nutrimental no ensaio, e o meio mínimo proposto neste ponto é usado para S. cerevisiae e pode diferir para outras espécies de leveduras. Finalmente, a concentração de glicose suplementada nos meios de cultura é fundamental para evitar a repressão da glicose ou o efeito Crabtree que inibe a respiração mitocondrial; concentrações abaixo de 0,5% (p/v) deram boas respostas na respiração mitocondrial acompanhadas de altas taxas de crescimento em S. cerevisiae. Em leveduras negativas para Crabtree, altas concentrações de glicose não afetaram a respiração mitocondrial (por exemplo, K. marxianus).
  2. Pese um tubo cônico vazio de 50 mL e use-o para colher células na fase intermediária (OD600 ~ 0,5) por centrifugação a 4000 x g por 5 min.
    NOTA: A fase mid-log é recomendada para testar a respiração mitocondrial, pois é a fase de crescimento em que o metabolismo energético é mais ativo.
  3. Descarte o sobrenadante e lave o pellet 3x com 25 mL de água deionizada. Pesar o tubo cónico com as células do sedimento (peso húmido) e subtrair o peso do tubo cónico para obter o peso húmido celular.
  4. Ressuspenda o pellet em 2 mL de água deionizada.
  5. Registre a concentração celular dividindo o peso úmido por 2 para obter mg de células / mL. Este valor é essencial para determinar quanto volume precisa ser adicionado para ter 50 mg de células para o ensaio.

3. Ensaio de consumo de oxigênio (polarografia)

  1. Empregue um eletrodo de oxigênio do tipo Clark conectado a um monitor de YSI5300A e um computador para aquisição de dados.
    1. Colocar 5 ml de ácido sulfónico morfo-etanol ajustado a pH 6 com trietanolamina (tampão MES-TEA; 10 mM) e 50 mg de células (peso húmido) na câmara polarográfica. Coloque o eletrodo com cuidado, tomando cuidado para que não haja bolhas.
    2. Ligue o monitor YSI5300A, o computador para aquisição de dados e a câmara para agitação. Defina o monitor YSI5300A selecionando o Dial de configuração do canal 1 no AIR. Ajuste o canal 1 para 100% com o botão de calibração do canal 1 e estabilize o sinal por 5 min a 100%.
    3. Comece a gravar dados no computador e medir o tempo usando um cronômetro.
      NOTA: O monitor YSI5300A não possui um computador ou programa de aquisição de dados; Isso pode ser implementado externamente pelo usuário.
    4. Use a canalização lateral do eletrodo na câmara do oxímetro para adicionar o substrato oxidável, a oligomicina, o desacoplador e a mistura de inibidores da cadeia respiratória sequencialmente.
  2. Adicionar o substrato oxidável (glicose, glicerol, L-lactato ou outra fonte de carbono, de acordo com a concepção experimental) a uma concentração final de 10 mM com uma seringa de cromatografia. Mantenha a câmara fechada o tempo todo e com agitação constante. Registre o consumo percentual de ar por 2-3 min para determinar a respiração basal.
    NOTA: Glicose, glicerol e L-lactato são usados para analisar a cadeia de transporte de elétrons em diferentes locais da cadeia respiratória: o metabolismo da glicose reduz o NAD + para formar NADH e é utilizado para analisar toda a cadeia respiratória; o glicerol transfere elétrons para a ubiquinona e é usado para avaliar a cadeia respiratória da ubiquinona; finalmente, o L-lactato cede seus elétrons ao citocromo c e é empregado para determinar o efeito do citocromo c14. Esses substratos podem variar dependendo da capacidade enzimática das espécies de leveduras.
  3. Adicione oligomicina para obter uma concentração final de 0,01 mM na câmara do oxímetro usando uma seringa de cromatografia para avaliar a respiração ligada ao ATP e registrar o consumo percentual de ar por 2-3 min.
  4. Suplementar o desacoplador, 3-clorofenilhidrazona carbonilo cianeto (CCCP) para obter uma concentração final de 0,015 mM na câmara do oxímetro com uma seringa de cromatografia para determinar a capacidade respiratória máxima e registrar o consumo percentual de ar por 2-3 min.
  5. Use uma seringa de cromatografia para adicionar os inibidores da cadeia de transporte de elétrons: primeiro, 2-tenoiltrifluoroacetona (TTFA) e, em seguida, antimicina A (AA) nas concentrações finais de 1 mM e 1 mg / mL, respectivamente. Meça cada inibidor por 2-3 min.
    NOTA: Os inibidores da cadeia de transporte de elétrons podem diferir entre as espécies de leveduras; Isso deve ser considerado nesta etapa.
  6. Filtre cada fonte de carbono independentemente (ou seja, glicose, glicerol ou L-lactato). Repita as etapas 3.3 a 3.5 para cada fonte de carbono. Lave a câmara 3x com etanol 70% e 3x com água deionizada após cada uso.

4. Processamento de dados

  1. Use curvas de consumo de oxigênio (plotando a porcentagem de ar versus tempo) para calcular as inclinações do substrato oxidável (respiração basal), oligomicina (respiração ligada a ATP), CCCP (respiração máxima), AA e TTFA (não respiração mitocondrial; Figura 1). Calcule inclinações individuais para cada composto suplementado usando regressão linear, conforme descrito abaixo.
    1. Crie um novo arquivo de projeto no software estatístico. Escolha XY na seção Criar. Selecione a opção Inserir ou importar dados para uma nova tabela na seção Tabela de dados.
    2. Selecione Números na subseção X na seção Opções. Clique em Inserir 3 valores de replicação em subcolunas lado a lado na subseção Y na seção Opções.
      NOTA: O formato da tabela tem uma coluna X e várias colunas Y, cada uma com 3 subcolunas chamadas A: Y1 e A: Y2.
    3. Insira dados de tempo em colunas X (por exemplo, 0, 2, 4, 6, 8 s ou 0, 1, 2, 3 min). Escreva a porcentagem de ar nas colunas Y.
    4. Faça uma adequação de regressão linear. Clique em Analisar na barra de menus. Na opção Análise, selecione Regressão linear simples em análises XY e clique em OK.
    5. Obtenha o valor da inclinação nas tabelas Resultados em dados na parte esquerda da tela.
  2. Escreva os valores de inclinação em uma folha de dados e subtraia o valor de inclinação obtido da mistura de inibidores respiratórios (AA e TTFA) das inclinações obtidas do substrato oxidável, oligomicina e CCCP para descartar o consumo de oxigênio de fontes diferentes da respiração mitocondrial.
  3. Multiplique os valores obtidos por 237 μM de O2. Este valor é considerado a solubilidade de O2 em meio mitocondrial tamponado equilibrado com ar (20,9% O2) a 25 °C; Este valor varia de acordo com a temperatura, altitude e buffer empregado.
  4. Converter em minuto; os valores obtidos são μM de O2 por vez, dependendo de como o tempo é plotado, para obter μM de O2/min.
  5. Divida por 50, ou seja, o mg de células utilizadas; O Mg da célula pode variar de acordo com o desenho experimental. Finalmente, o consumo de oxigênio é expresso como μM de O2/mg de células x min

Resultados

Esta técnica de respiração mitocondrial pode ser usada para outras espécies de leveduras além de S. cerevisiae, como Scheffersomyces stipitis15 e K. marxianus16. No entanto, para fins representativos, apresentamos apenas resultados de S. cerevisiae. Sabe-se que S. cerevisiae apresenta um metabolismo respiratório predominante em baixas concentrações de glicose (abaixo de 0,8 mM)17,18. Assim, para corroborar o fenótipo respiratório de S. cerevisiae, ele foi cultivado em duas concentrações de glicose para estimular (0,5% de glicose) e limitar (5% de glicose) a respiração mitocondrial18,19. Como esperado, os resultados obtidos na respiração basal (substrato oxidável), respiração ligada ao ATP (oligomicina) e capacidade respiratória máxima (CCCP) validam o metabolismo energético característico de S. cerevisiae (Figura 2). Observamos valores mais elevados de consumo de oxigênio (respiração basal, respiração ligada ao ATP e capacidade respiratória máxima) nas células cultivadas com glicose a 0,5% em comparação com os valores obtidos nas células cultivadas com glicose a 5% (Figura 2).

Além disso, os ensaios utilizaram três substratos: glicose, glicerol e L-lactato. O objetivo do emprego de diversos substratos é avaliar diferentes partes da cadeia respiratória mitocondrial. Nessas condições, a respiração mitocondrial não apresentou alterações significativas dependentes do substrato, uma vez que nenhum tratamento para perturbar a cadeia respiratória foi adicionado (Figura 2).

Utilizamos a quercetina para avaliar a capacidade da técnica, um composto que influencia negativamente a respiração mitocondrial20. Os dados obtidos mostraram que a quercetina diminuiu significativamente a respiração mitocondrial em células cultivadas em meio suplementado com glicose a 0,5% (Figura 3). Por outro lado, as células cultivadas em meio suplementado com glicose a 5% não apresentaram influência negativa significativa da quercetina (Figura 4).

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Figura 1: Curva representativa de consumo de oxigênio. Curva de consumo de oxigênio obtida em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (0,5% de glicose). As cores representam diferentes inclinações obtidas no substrato, desacopladores e suplementação de inibidores. Verde: O substrato utilizou glicose e respiração basal correspondente à inclinação. Azul: oligomicina, inibidor da ATP sintase, inclinação empregada para determinação da respiração ligada ao ATP. Amarelo: CCCP, desacoplador, inclinação usada para avaliar a respiração máxima. Cinza e vermelho: complexo inibidor II e III, respectivamente; inclinação empregada para determinar o consumo de oxigênio não dependente das mitocôndrias. Abreviaturas: CCCP = 3-clorofenilhidrazona carbonila-cianeto; TTFA = 2- tenoiltrifluoroacetona; AA = antimicina A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Ensaios de consumo de oxigênio em células de S. cerevisiae cultivadas a 0,5% e 5% de glicose. A respiração mitocondrial é avaliada através do consumo de oxigênio medido na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em SC suplementadas com 0,5% e 5% de glicose. Três substratos foram utilizados para avaliar sua influência específica na cadeia de transporte de elétrons: glicose (NADH desidrogenase), glicerol (pool de ubiquinona) e L-lactato (citocromo c). (A) Respiração basal a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substratos; (B) respiração máxima a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substratos; (C) Respiração ligada ao ATP a 5% e 0,5% de glicose com glicose, glicerol e L-lactato como substrato. Os resultados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes, com cada experimento tendo duas repetições técnicas. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey (p ≤ 0,05; letras diferentes: diferença significativa, mesmas letras: sem diferença significativa) para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: A quercetina limitou a respiração mitocondrial em baixa concentração de glicose em células de S. cerevisiae cultivadas. A medição do consumo de oxigênio foi realizada na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (glicose a 0,5%) suplementada com quercetina (100 μM). O etanol foi usado para dissolver a solução de quercetina. Os resultados são apresentados como média ± DP de três experimentos independentes, com cada experimento tendo duas repetições técnicas. As análises estatísticas foram feitas por meio de um teste t de Student pareado (*, ** p ≤ 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: A quercetina não afeta a respiração mitocondrial em alta concentração de glicose em S. cerevisiae. O consumo de oxigênio foi medido na respiração basal, capacidade respiratória máxima e respiração ligada ao ATP em células de S. cerevisiae cultivadas em meio SC (glicose a 5%) suplementada com quercetina (100 μM). O etanol é usado para dissolver a solução de quercetina. Os resultados mostram ± médio DP de três experimentos independentes, cada um com duas repetições técnicas. As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste t de Student pareado (p ≤ 0,05; ns: não significativo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A fosforilação da respiração mitocondrial desempenha um papel fundamental em várias vias que dependem do potencial da membrana mitocondrial e mantêm os níveis de ATP através da fosforilação oxidativa. Compreender como as condições ambientais e nutricionais afetam a respiração mitocondrial das leveduras serve como uma ferramenta para elucidar os mecanismos moleculares.

É essencial considerar as seguintes etapas críticas para obter resultados confiáveis desse método. A agitação >200 rpm é fundamental para obter biomassa suficiente em condições de crescimento respiratório para testar a respiração mitocondrial; Condições de agitação inferiores a 200 rpm causam baixo crescimento e formação de biomassa, levando mais tempo para atingir a fase de crescimento mid-log e podem afetar as taxas de consumo de oxigênio, uma vez que as células sobrevivem em um ambiente menos oxigenado. A concentração de glicose no meio é definida de acordo com o fenótipo da levedura (Crabtree-positivo ou negativo); isso é crítico no caso de leveduras positivas para Crabtree, uma vez que altas concentrações de glicose inibem a respiração mitocondrial e podem exercer um viés na interpretação dos dados. Por exemplo, em S. cerevisiae, a glicose causa repressão catabólica, inibindo a respiração mitocondrial em altas concentrações de glicose21,22. Com base nessas evidências, valores mais baixos na respiração basal, respiração ligada ao ATP e respiração máxima de células cultivadas em alta concentração de glicose (5%) são obtidos em comparação com células de levedura cultivadas em baixa concentração de glicose (0,5%). Os inibidores da cadeia respiratória devem ser cuidadosamente selecionados de acordo com a suscetibilidade da levedura; Isso é fundamental para descartar outras fontes de consumo de oxigênio celular além da respiração mitocondrial.

Substratos, desacopladores mitocondriais e inibidores são usados para determinar diferentes parâmetros da respiração mitocondrial em células intactas. No entanto, seu uso tem algumas limitações. Por exemplo, os alvos inespecíficos fora das mitocôndrias de inibidores e desacopladores mitocondriais em células intactas devem ser considerados para evitar vieses na interpretação do consumo de oxigênio. Além disso, o uso de fontes alternativas de carbono para triagem do local de ação na cadeia respiratória deve ser testado com mais detalhes, uma vez que subprodutos do metabolismo do glicerol ou L-lactato podem ser oxidados para reduzir NAD+ ou FAD+, que cedem elétrons e ativam a cadeia respiratória desde NADH desidrogenases e Complexo II, respectivamente. Finalmente, S. cerevisiae e outras leveduras abrigam transportadores de PDR, como Yor1p (proteína de resistência à oligomicina de levedura), o que sugere o efluxo de oligomicina das células23. Além disso, ensaios usando células deficientes em PDR, por exemplo, a cepa AD1-8, que possui os principais transportadores de PDR e fatores de transcrição PDR1 / PDR3 excluídos, são necessários para validar o uso de oligomicina em S. cerevisiae para quantificação da respiração mitocondrial.

O uso de células intactas para quantificação da respiração mitocondrial mantém o contexto celular, proporcionando uma técnica mais robusta para conhecer os efeitos nutrimentais ou ambientais na bioenergética de leveduras. Além disso, o uso de células intactas de levedura para quantificação da respiração mitocondrial é mais econômico e, no nível técnico, mais fácil do que mitocôndrias isoladas. Além disso, como em ensaios de mitocôndrias isoladas, diversas fontes de carbono indicam o local de ação na cadeia respiratória de algumas moléculas. Como prova de conceito, essa técnica corrobora que a suplementação de resveratrol afeta a cadeia respiratória no nível da NADH desidrogenase, uma vez que a inibição do resveratrol na respiração basal é observada apenas com glicose e não com glicerol ou L-lactato24. Estudos in vitro com complexo I solubilizado demonstraram que o resveratrol compete com o NAD+, afetando a atividade do complexoI 25. Isso corrobora o fenótipo observado em células intactas com a técnica aqui apresentada. Além disso, esta técnica também é confiável para explorar os efeitos negativos dos produtos químicos na respiração mitocondrial da levedura. Por exemplo, a quercetina é um polifenol amplamente estudado nas últimas décadas. Entre as principais evidências encontradas, foi demonstrado limitar a respiração mitocondrial em células intactas, o que foi validado pela atividade complexa da cadeia respiratória 26,27. É importante ressaltar que diversas pesquisas relataram efeitos inibitórios da quercetina na respiração mitocondrial em diferentes estudos de modelo28.

É importante ter uma descrição detalhada do metabolismo das leveduras, incluindo a bioenergética, uma vez que esses microrganismos podem ser patógenos animais, incluindo humanos, e também são utilizados como fábricas de células ou em aplicações biotecnológicas.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) concedido ao LAMP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2- tenoiltrifluoroacetona (TTFA)MerckT27006Complexo inibidor II
3-clorofenilhidrazona carbonil cianeto (CCCP)MerckC2759Desacoplador de respiração mitocondrial   
Absolut etanolMerck107017Para dissolver a quercetina 
ÁgarMerckA1296YPD preparação de ágar
Sulfato de amônio granular (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC preparação de caldo
Antimicina A (AA)MerckA8674Complexo inibidor III
aYSI5300A--------Monitor 
CentrífugaHermleZ 206 APara centrifugação de células
tipo Clark oxigênio--------Eletrodo 
Computador--------Para aquisição de dados 
Fosfato dipotássico K2HPO4J.T. Baker3252-05SC preparação de caldo
GlicoseMerckG7021YPD preparação de caldo
GlicerolMerckG5516Suplementação de substrato médio 
Suplementação de substrato LactateMerckL1250em meio 
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Inibição da ATP sintase mitocondrial
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000Inóculo incubação tubos de vidro e frasco 
Peptona de caseína, digestão enzimáticaMerck82303YPD preparação de caldo
Quercetina Merck337951Para diminuir a respiração mitocondrial
UracilaPreparação do caldoMerckU0750
Extrato de leveduraMerckY1625YPD preparação do caldo
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônioMerckY1251SC preparação do caldo
Levedura sintética Suplementos médios sem uracilaMerckY1501SC preparação do caldo
SC

Referências

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