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Artigo de método

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

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DOI:

10.3791/67186

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8 de novembro de 2024

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1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

Neste artigo

Resumo

A respiração mitocondrial em células inteiras de levedura é um indicador valioso da bioenergética celular. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar esse fenótipo aplicável a diferentes espécies de leveduras.

Resumo

O metabolismo é coordenado principalmente pela disponibilidade de energia celular e pelas condições ambientais. Ensaios para saber como as células adaptam o metabolismo energético a diferentes condições nutricionais e ambientais fornecem informações valiosas para elucidar mecanismos moleculares. A fosforilação oxidativa é a principal fonte de ATP na maioria das células, e a atividade da respiração mitocondrial é um componente chave da fosforilação oxidativa, mantendo o potencial da membrana mitocondrial para a síntese de ATP. A respiração mitocondrial é frequentemente estudada em mitocôndrias isoladas que não possuem o contexto celular. Aqui, apresentamos um método para quantificar a respiração mitocondrial em células intactas de leveduras. Este método se aplica a qualquer espécie de levedura, embora tenha sido geralmente usado para células de Saccharomyces cerevisiae. Primeiro, o crescimento da levedura em condições específicas é testado. Em seguida, as células são lavadas e ressuspensas em água deionizada na proporção de 1:1 (p/v). As células são então colocadas em uma câmara de oxímetro com agitação constante, e um eletrodo de Clark é usado para quantificar o consumo de oxigênio. Algumas moléculas são colocadas sequencialmente na câmara e selecionadas de acordo com esse efeito na cadeia de transporte de elétrons ou síntese de ATP. A oligomicina inibidora da ATPase é adicionada pela primeira vez para medir a respiração acoplada à síntese de ATP. Posteriormente, um desacoplador é usado para medir a capacidade respiratória máxima. Finalmente, uma mistura de inibidores da cadeia de transporte de elétrons é adicionada para descartar o consumo de oxigênio não relacionado à respiração mitocondrial. Os dados são analisados por meio de uma regressão linear para obter a inclinação, representando a taxa de consumo de oxigênio. A vantagem deste método é que ele é específico para a respiração mitocondrial de leveduras, mantendo o contexto celular. É essencial destacar que os inibidores usados na quantificação da respiração mitocondrial podem variar entre as espécies de leveduras.

Introdução

A mitocôndria desempenha um papel fundamental na bioenergética celular, uma vez que é a principal fonte de ATP para a maioria das células, e várias vias convergem e dependem da atividade das vias mitocondriais1. A fosforilação oxidativa é necessária para a síntese de ATP que combina o transporte de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons para reduzir o oxigênio e a atividade da ATPase F1F0, sintetizando ATP usando o potencial de membrana mitocondrial produzido devido ao fluxo de elétrons2. Assim, a respiração mitocondrial faz parte da fosforilação oxidativa3.

A cadeia respiratória mitocondrial compreende quatro complexos ou, em alguns casos, complexo de levedura deficiente em I (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), três complexos e três proteínas desidrogenase4. Os complexos respiratórios estão localizados na membrana mitocondrial interna; algumas leveduras apresentam a cadeia canônica de transporte de elétrons com complexo I (NADH desidrogenase) ou três NADH desidrogenase, ubiquinona (Co Q), complexo II (succinato ubiquinona oxidorredutase), complexo III (ubiquinona citocromo oxidorredutase), citocromo c (Cyt c) e complexo IV (citocromo c oxidase)5,6. O transporte de elétrons através dos complexos permite o bombeamento de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar, formando um potencial de membrana mitocondrial7. Os prótons localizados no espaço intermembranar são bombeados ao contrário, em direção à matriz mitocondrial por F1F0 -ATPase para sintetizar uma molécula de ATP por quatro prótons bombeados8.

As medições da respiração mitocondrial fornecem informações valiosas sobre a integridade mitocondrial, a bioenergética celular e a capacidade respiratória mitocondrial9. A função da respiração mitocondrial pode ser analisada in vitro ou in situ usando diversas técnicas. No entanto, a análise da respiração mitocondrial em células intactas pode apresentar uma série de vantagens, uma vez que compreende todo o metabolismo celular, uma vez que as interações das células com seu ambiente e o metabolismo intracelular são considerados quando se emprega células inteiras10. Além disso, o uso de células intactas permite a fácil avaliação de várias condições experimentais e detecta alterações mínimas que não puderam ser observadas em mitocôndrias isoladas10,11. Outra vantagem da quantificação da respiração mitocondrial em células intactas é que os efeitos da proliferação e localização mitocondrial são retidos12.

A respiração mitocondrial de mamíferos em células intactas tem sido descrita em grande detalhe12, deixando de lado o estudo de outros organismos eucarióticos, como leveduras. Aqui, propomos uma técnica para quantificar a respiração mitocondrial adaptada à levedura a partir de protocolos de mamíferos. Assim, conceitos da quantificação da respiração mitocondrial em mamíferos têm sido utilizados nesta técnica. Por exemplo, esta técnica é dividida em vários estágios como o protocolo de mamíferos: 1) respiração basal (dependente do substrato), 2) respiração ligada ao ATP (através da inibição da ATP sintase), 3) capacidade respiratória máxima (empregando um desacoplador que permite a permeabilidade dos prótons através da membrana mitocondrial interna), 4) inibição da respiração mitocondrial (utilizando uma mistura de inibidores da cadeia respiratória para descartar o consumo de oxigênio para outras fontes diferentes de respiração mitocondrial)11,13. Portanto, este trabalho tem como objetivo apresentar um protocolo para quantificar a respiração mitocondrial em leveduras.

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Protocolo

1. Meios de cultura e preparação do inóculo

  1. Prepare 100 mL de extrato de levedura-peptona-dextrose (YPD) adicionando 1 g de extrato de levedura, 2 g de peptona de caseína e 2 g de glicose em 95 mL de água destilada. Distribua 3 mL em tubos de ensaio de vidro de 10 mL, esterilize a 121 °C e 1,5 psi por 15 min.
    NOTA: O meio pode ser armazenado a 4 - 8 °C por até 1 mês.
  2. Inocule um tubo de ensaio de vidro de 10 mL contendo 3 mL de meio YPD com 250 μL de células de levedura preservadas em glicerol a -20 ° C. Incubar durante a noite com agitação constante a 200 rpm e 30 °C.
    NOTA: A temperatura de incubação pode variar em algumas espécies de leveduras (por exemplo, Kluyveromyces marxianus tem uma temperatura de crescimento ideal de 37 °C).
  3. Encha uma placa de Petri (60 x 15 mm2) com ágar YPD estéril a 2% (adicione 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glicose e 20 g de ágar bacteriológico para 950 mL de água destilada) e risque a placa de Petri com as células de levedura cultivadas no tubo de ensaio de vidro de 10 mL usando uma alça estéril. Incubar a placa de Petri a 30 °C até aparecerem colónias isoladas.
  4. Prepare um pré-inóculo inoculando um tubo de ensaio de vidro estéril de 10 mL contendo 3 mL de meio YPD a 2% de glicose com duas ou três colônias isoladas de levedura da placa de Petri. Incubar durante a noite com agitação constante a 30 °C.

2. Condições de crescimento e desenho de experimentos

  1. Inocular um balão Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio sintético completo estéril (meio SC; 0,18 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 0,5 g de sulfato de amônio, 0,2 g de fosfato dipotássico, 1 g de suplementos de drop-out sintético de levedura e glicose de acordo com o desenho experimental, em 98,02 mL de água destilada) com cultura de levedura em ODinicial 600 ~ 0,1, isto é, aproximadamente 3 ml do pré-inóculo durante a noite (OD600 ~ 3). Defina a condição ambiental ou suplemento com o desafio químico a ser testado na respiração mitocondrial (por exemplo, adicionando 100 μM de resveratrol). Preparar um comando do veículo num balão separado para o teste de provocação química. Testar pelo menos três réplicas biológicas.
    NOTA: Recomenda-se o uso de um meio mínimo para descartar o ruído nutrimental no ensaio, e o meio mínimo proposto neste ponto é usado para S. cerevisiae e pode diferir para outras espécies de leveduras. Finalmente, a concentração de glicose suplementada nos meios de cultura é fundamental para evitar a repressão da glicose ou o efeito Crabtree que inibe a respiração mitocondrial; concentrações abaixo de 0,5% (p/v) deram boas respostas na respiração mitocondrial acompanhadas de altas taxas de crescimento em S. cerevisiae. Em leveduras negativas para Crabtree, altas concentrações de glicose não afetaram a respiração mitocondrial (por exemplo, K. marxianus).
  2. Pese um tubo cônico vazio de 50 mL e use-o para colher células na fase intermediária (OD600 ~ 0,5) por centrifugação a 4000 x g por 5 min.
    NOTA: A fase mid-log é recomendada para testar a respiração mitocondrial, pois é a fase de crescimento em que o metabolismo energético é mais ativo.
  3. Descarte o sobrenadante e lave o pellet 3x com 25 mL de água deionizada. Pesar o tubo cónico com as células do sedimento (peso húmido) e subtrair o peso do tubo cónico para obter o peso húmido celular.
  4. Ressuspenda o pellet em 2 mL de água deionizada.
  5. Registre a concentração celular dividindo o peso úmido por 2 para obter mg de células / mL. Este valor é essencial para determinar quanto volume precisa ser adicionado para ter 50 mg de células para o ensaio.

3. Ensaio de consumo de oxigênio (polarografia)

  1. Empregue um eletrodo de oxigênio do tipo Clark conectado a um monitor de YSI5300A e um computador para aquisição de dados.
    1. Colocar 5 ml de ácido sulfónico morfo-etanol ajustado a pH 6 com trietanolamina (tampão MES-TEA; 10 mM) e 50 mg de células (peso húmido) na câmara polarográfica. Coloque o eletrodo com cuidado, tomando cuidado para que não haja bolhas.
    2. Ligue o monitor YSI5300A, o computador para aquisição de dados e a câmara para agitação. Defina o monitor YSI5300A selecionando o Dial de configuração do canal 1 no AIR. Ajuste o canal 1 para 100% com o botão de calibração do canal 1 e estabilize o sinal por 5 min a 100%.
    3. Comece a gravar dados no computador e medir o tempo usando um cronômetro.
      NOTA: O monitor YSI5300A não possui um computador ou programa de aquisição de dados; Isso pode ser implementado externamente pelo usuário.
    4. Use a canalização lateral do eletrodo na câmara do oxímetro para adicionar o substrato oxidável, a oligomicina, o desacoplador e a mistura de inibidores da cadeia respiratória sequencialmente.
  2. Adicionar o substrato oxidável (glicose, glicerol, L-lactato ou outra fonte de carbono, de acordo com a concepção experimental) a uma concentração final de 10 mM com uma seringa de cromatografia. Mantenha a câmara fechada o tempo todo e com agitação constante. Registre o consumo percentual de ar por 2-3 min para determinar a respiração basal.
    NOTA: Glicose, glicerol e L-lactato são usados para analisar a cadeia de transporte de elétrons em diferentes locais da cadeia respiratória: o metabolismo da glicose reduz o NAD + para formar NADH e é utilizado para analisar toda a cadeia respiratória; o glicerol transfere elétrons para a ubiquinona e é usado para avaliar a cadeia respiratória da ubiquinona; finalmente, o L-lactato cede seus elétrons ao citocromo c e é empregado para determinar o efeito do citocromo c14. Esses substratos podem variar dependendo da capacidade enzimática das espécies de leveduras.
  3. Adicione oligomicina para obter uma concentração final de 0,01 mM na câmara do oxímetro usando uma seringa de cromatografia para avaliar a respiração ligada ao ATP e registrar o consumo percentual de ar por 2-3 min.
  4. Suplementar o desacoplador, 3-clorofenilhidrazona carbonilo cianeto (CCCP) para obter uma concentração final de 0,015 mM na câmara do oxímetro com uma seringa de cromatografia para determinar a capacidade respiratória máxima e registrar o consumo percentual de ar por 2-3 min.
  5. Use uma seringa de cromatografia para adicionar os inibidores da cadeia de transporte de elétrons: primeiro, 2-tenoiltrifluoroacetona (TTFA) e, em seguida, antimicina A (AA) nas concentrações finais de 1 mM e 1 mg / mL, respectivamente. Meça cada inibidor por 2-3 min.
    NOTA: Os inibidores da cadeia de transporte de elétrons podem diferir entre as espécies de leveduras; Isso deve ser considerado nesta etapa.
  6. Filtre cada fonte de carbono independentemente (ou seja, glicose, glicerol ou L-lactato). Repita as etapas 3.3 a 3.5 para cada fonte de carbono. Lave a câmara 3x com etanol 70% e 3x com água deionizada após cada uso.

4. Processamento de dados

  1. Use curvas de consumo de oxigênio (plotando a porcentagem de ar versus tempo) para calcular as inclinações do substrato oxidável (respiração basal), oligomicina (respiração ligada a ATP), CCCP (respiração máxima), AA e TTFA (não respiração mitocondrial; Figura 1). Calcule inclinações individuais para cada composto suplementado usando regressão linear, conforme descrito abaixo.
    1. Crie um novo arquivo de projeto no software estatístico. Escolha XY na seção Criar. Selecione a opção Inserir ou importar dados para uma nova tabela na seção Tabela de dados.
    2. Selecione Números na subseção X na seção Opções. Clique em Inserir 3 valores de replicação em subcolunas lado a lado na subseção Y na seção Opções.
      NOTA: O formato da tabela tem uma coluna X e várias colunas Y, cada uma com 3 subcolunas chamadas A: Y1 e A: Y2.
    3. Insira dados de tempo em colunas X (por exemplo, 0, 2, 4, 6, 8 s ou 0, 1, 2, 3 min). Escreva a porcentagem de ar nas colunas Y.
    4. Faça uma adequação de regressão linear. Clique em Analisar na barra de menus. Na opção Análise, selecione Regressão linear simples em análises XY e clique em OK.
    5. Obtenha o valor da inclinação nas tabelas Resultados em dados na parte esquerda da tela.
  2. Escreva os valores de inclinação em uma folha de dados e subtraia o valor de inclinação obtido da mistura de inibidores respiratórios (AA e TTFA) das inclinações obtidas do substrato oxidável, oligomicina e CCCP para descartar o consumo de oxigênio de fontes diferentes da respiração mitocondrial.
  3. Multiplique os valores obtidos por 237 μM de O2. Este valor é considerado a solubilidade de O2 em meio mitocondrial tamponado equilibrado com ar (20,9% O2) a 25 °C; Este valor varia de acordo com a temperatura, altitude e buffer empregado.
  4. Converter em minuto; os valores obtidos são μM de O2 por vez, dependendo de como o tempo é plotado, para obter μM de O2/min.
  5. Divida por 50, ou seja, o mg de células utilizadas; O Mg da célula pode variar de acordo com o desenho experimental. Finalmente, o consumo de oxigênio é expresso como μM de O2/mg de células x min

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Resultados

Esta técnica de respiração mitocondrial pode ser usada para outras espécies de leveduras além de S. cerevisiae, como Scheffersomyces stipitis15 e K. marxianus16. No entanto, para fins representativos, apresentamos apenas resultados de S. cerevisiae. Sabe-se que S. cerevisiae apresenta um metabolismo respiratório predominante em baixas concentrações de glicose (abaixo de 0,8 mM)17,18

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Discussão

A fosforilação da respiração mitocondrial desempenha um papel fundamental em várias vias que dependem do potencial da membrana mitocondrial e mantêm os níveis de ATP através da fosforilação oxidativa. Compreender como as condições ambientais e nutricionais afetam a respiração mitocondrial das leveduras serve como uma ferramenta para elucidar os mecanismos moleculares.

É essencial considerar as seguintes etapas críticas para obter resultados confiáveis desse mé...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) concedido ao LAMP.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2- tenoiltrifluoroacetona (TTFA)MerckT27006Complexo inibidor II
3-clorofenilhidrazona carbonil cianeto (CCCP)MerckC2759Desacoplador de respiração mitocondrial   
Absolut etanolMerck107017Para dissolver a quercetina 
ÁgarMerckA1296YPD preparação de ágar
Sulfato de amônio granular (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC preparação de caldo
Antimicina A (AA)MerckA8674Complexo inibidor III
aYSI5300A--------Monitor 
CentrífugaHermleZ 206 APara centrifugação de células
tipo Clark oxigênio--------Eletrodo 
Computador--------Para aquisição de dados 
Fosfato dipotássico K2HPO4J.T. Baker3252-05SC preparação de caldo
GlicoseMerckG7021YPD preparação de caldo
GlicerolMerckG5516Suplementação de substrato médio 
Suplementação de substrato LactateMerckL1250em meio 
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Inibição da ATP sintase mitocondrial
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000Inóculo incubação tubos de vidro e frasco 
Peptona de caseína, digestão enzimáticaMerck82303YPD preparação de caldo
Quercetina Merck337951Para diminuir a respiração mitocondrial
UracilaPreparação do caldoMerckU0750
Extrato de leveduraMerckY1625YPD preparação do caldo
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônioMerckY1251SC preparação do caldo
Levedura sintética Suplementos médios sem uracilaMerckY1501SC preparação do caldo
SC

Referências

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