Artigo de método

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

DOI:

10.3791/67204

⸱

23 de agosto de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University, 2PhD Program in Systems, Synthetic, and Physical Biology, Rice University, 3Department of Bioengineering, Rice University, 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University, 5Rice Synthetic Biology Institute, Rice University

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um protocolo para caracterizar a transferência de elétrons extracelular mediada (EET) em bactérias do ácido lático usando um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras. Ilustramos este método com Lactiplantibacillus plantarum e o mediador redox ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico e fornecemos uma descrição completa das técnicas eletroquímicas usadas para avaliar o EET mediado.

Resumo

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Muitas bactérias realizam transferência de elétrons extracelular (EET), por meio da qual os elétrons são transferidos da célula para um aceptor de elétrons terminal extracelular. Este aceptor de elétrons pode ser um eletrodo e os elétrons podem ser entregues indiretamente por meio de uma molécula mediadora redox ativa. Aqui, apresentamos um protocolo para estudar EET mediado em Lactiplantibacillus plantarum, uma bactéria probiótica do ácido lático amplamente utilizada na indústria alimentícia, utilizando um sistema bioeletroquímico. Detalhamos como montar um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras e fornecemos orientação sobre a caracterização do EET na presença de um mediador solúvel usando técnicas de cronoamperometria e voltametria cíclica. Usamos dados representativos de experimentos de EET mediados por ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico (DHNA) com L. plantarum para demonstrar a análise e interpretação dos dados. As técnicas descritas neste protocolo podem abrir novas oportunidades para eletrofermentação e bioeletrocatálise. Aplicações recentes desta técnica eletroquímica com L. plantarum demonstraram uma aceleração do fluxo metabólico para a produção de produtos finais de fermentação, que são componentes críticos de sabor na fermentação de alimentos. Como tal, este sistema tem o potencial de ser desenvolvido para alterar os sabores na produção de alimentos ou produzir produtos químicos valiosos.

Introdução

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Os sistemas bioeletroquímicos fazem interface de micróbios com eletrodos, permitindo a investigação de mecanismos de transferência de elétrons extracelulares (EET) e fornecendo abordagens renováveis para bioeletrocatálise 1,2,3. Os micróbios que realizam EET naturalmente são conhecidos como exoeletrogênios, que transferem elétrons derivados do metabolismo para aceptores de elétrons terminais extracelulares, por exemplo, óxidos de ferro (hidr) e eletrodos1. Caracterizadas pela primeira vez nas espécies Geobacter e Shewanella 4,5, as vias EET foram identificadas em muitas bactérias. Esses exoeletrógenos desempenham um papel central em várias tecnologias eletroquímicas microbianas, como a geração de energia elétrica a partir de fluxos de resíduos, a fixação de CO2 e a produção de produtos químicos valiosos por meio da eletrossíntese 1,6,7,8,9,10,11,12.

Um desses exoeletrogênios é o Lactiplantibacillus plantarum, uma bactéria do ácido lático gram-positivo13. L. plantarum é uma bactéria probiótica nômade que reside em uma ampla variedade de ambientes, incluindo o intestino de humanos e outros vertebrados, bem como muitos tipos de alimentos, como carne, cereais, vegetais e alimentos e bebidas fermentados 14,15,16,17. Seu genoma codifica um metabolismo heterofermentativo flexível, permitindo uma adaptação bem-sucedida nesses diversos ambientes. É bem estudado, amplamente utilizado nas indústrias de alimentos e saúde e geralmente reconhecido como seguro pela Food and Drug Administration18,19. Como tal, L. plantarum tem o potencial de servir como uma plataforma útil para tecnologias baseadas em EET.

Pesquisas recentes em L. plantarum identificaram um operon multigênico que codifica uma via complexa de EET originalmente caracterizada em Listeria monocytogenes13,20. Em L. plantarum, as proteínas sintetizadas a partir deste operon facilitam o EET em um sistema bioeletroquímico (BES) quando fornecido o ácido quinona 1,4-dihidroxi-2-naftóico (DHNA) como mediador eletrônico13. A primeira proteína essencial nesta via é uma NADH-quinona oxidorredutase ligada à membrana (Ndh2), que oxida o NADH e reduz o DHNA. O DHNA fornece elétrons diretamente a um eletrodo ou indiretamente por meio da proteína acessória PplA (Figura 1) 13 , 21 , 22 . Pesquisas recentes indicam que L. plantarum também pode usar outras quinonas que são estruturalmente semelhantes ao DHNA como mediadores eletrônicos; no entanto, L. plantarum é incapaz de produzir DHNA ou essas quinonas alternativas, portanto, os mediadores devem estar exogenamente presentes no ambiente para que o EET ocorra 13,22,23.

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Figura 1: Fluxo de elétrons em Lactiplantibacillus plantarum EET. Ndh2 passa elétrons do NADH para a quinona DHNA. Os elétrons são transportados para o eletrodo para produzir corrente, diretamente pela quinona reduzida ou indiretamente através da proteína acessória PplA. Abreviaturas: FAD = Dinucleotídeo flavina adenina; FMN = mononucleotídeo de flavina; EET = transferência de elétrons extracelulares; NADH = dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido; Ndh2 = NADH-quinona oxidorredutase; DHNA = ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico; PplA = fosfolipase A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste artigo, fornecemos um protocolo abrangente para o uso de um método baseado em BES para caracterizar EET mediado por DHNA em L. plantarum. Um sistema de três eletrodos e duas câmaras confina as bactérias ao eletrodo de trabalho, permitindo o controle preciso do potencial aplicado às bactérias, evitando a diafonia entre o eletrodo de trabalho e o contra-eletrodo. Apresentamos um protocolo abrangente de 5 dias, que abrange a preparação pré-experimento, montagem do BES, análise EET utilizando cronoamperometria (CA) e voltametria cíclica (CV) e análise de amostra pós-experimento. Este protocolo pode ser aplicado para desvendar os mecanismos das vias de EET e construir sistemas para eletrofermentação e eletrocatálise.

Protocolo

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NOTA: Os conjuntos BES de duas câmaras serão referidos como "reatores" no protocolo a seguir.

1. Preparação de mídia

  1. Prepare o meio de cultura de L. plantarum .
    1. Prepare os meios MRS (de Man Rogosa Sharpe) comerciais conforme as instruções e os meios mMRS24 conforme descrito na Tabela 1. Ajuste o pH da mMRS para 6,5. Filtre e esterilize ambos os meios passando-os por um filtro de 0,22 μm e armazene ambos a 4 °C até o uso.
    2. Prepare um meio quimicamente definido com manitol (mCDM) 13,25 conforme descrito na Tabela 2 e ajuste o pH para 6,5. Prepare meio suficiente para encher a câmara anódica de cada reator com 110 mL de meio. Filtre e esterilize o mCDM através de um filtro de 0,22 μm.
      NOTA: O mCDM deve ser preparado fresco no dia do uso pretendido. As soluções componentes podem ser preparadas com antecedência. Filtre e esterilize todas as soluções de componentes através de um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 °C. Ao preparar as vitaminas de Wolfe, ajuste o pH para 11 antes de esterilizar e armazene no escuro ou embrulhado em papel alumínio. Ao preparar os minerais de Wolfe, ajuste o pH para 8 após adicionar ácido nitrilotriacético (NTA). Em seguida, adicione os componentes restantes, esterilize e armazene no escuro ou embrulhado em papel alumínio.
  2. Prepare 1x PBS e autoclave para esterilizar. Conservar a 4 °C para utilização neste protocolo.
  3. Prepare o meio M9 comercial conforme as instruções (Tabela 3) e a autoclave para esterilizar. Prepare meios suficientes para encher a câmara catódica de cada reator com 110 mL. Armazene em temperatura ambiente.

2. Dia 1: Montagem do reator BES e cultura inicial de L. plantarum  

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter um esquema de um reator BES e um diagrama detalhando as peças de montagem indicadas no protocolo.

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Figura 2: Componentes BES e diagrama para montagem. (A) Um esquema de um reator BES de duas câmaras. As bactérias (verde) na câmara anódica transferem elétrons para um eletrodo de trabalho (círculo preto) na presença de um mediador de quinona. Os elétrons fluem através do circuito para a câmara catódica, permitindo que as medições de corrente sejam feitas entre o ânodo e o cátodo por um potenciostato. (B) Uma imagem representando um reator BES totalmente montado, incluindo agulhas de entrada e saída de N2 na câmara anódica. (C) Uma imagem representando todas as partes de um reator desmontado. Abreviatura: BES = sistema bioeletroquímico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Monte e esterilize reatores.
    1. Prepare os eletrodos de trabalho e contra-eletrodos. Lixe fios de titânio pré-cortados de 1,0 mm de diâmetro para os eletrodos de trabalho e contra-eletrodos com lixa de óxido de alumínio até ficar uniformemente brilhante. Usando um alicate, dobre uma extremidade de cada fio do eletrodo de trabalho em um pequeno gancho. Deslize um cartucho de feltro de carbono2 de 16 cm em cada fio de eletrodo de trabalho, tecendo o fio para dentro e para fora do feltro de carbono uma vez e puxando o cartucho para baixo do fio até ficar preso no gancho. Prenda os eletrodos de trabalho e os contra-eletrodos nas tampas GL45 perfurando o septo de borracha com o fio e puxando-o por alguns centímetros.
    2. Para montar reatores emparelhados, primeiro monte o O-ring e coloque uma membrana de troca catiônica pré-cortada que foi pré-embebida em água no O-ring montado. Coloque o O-ring com a membrana entre as grandes aberturas inferiores de duas garrafas de reator emparelhadas. Prenda as garrafas do par do reator e o O-ring com a membrana com uma junta clamp para apertar com os dedos. Coloque uma barra de agitação magnética em cada câmara anódica e, em seguida, feche todas as pequenas aberturas na parte superior de cada frasco com tampas GL14 equipadas com septos de borracha.
      NOTA: Não aperte demais a junta clamps ou quaisquer tampas, pois isso pode causar rachaduras ou quebras nas garrafas.
    3. Encha cada frasco do reator com 110 mL de água deionizada (DI) e, em seguida, feche cada frasco com a tampa GL45 apropriada encaixada no eletrodo. Insira as tampas equipadas com um eletrodo de trabalho redondo de feltro de carbono pressionando suavemente a parte superior do redondo de feltro para que ele permaneça no gancho.
      NOTA: O feltro de carbono fresco é hidrofóbico e repele a água no reator na montagem inicial. A autoclavagem fará com que o feltro de carbono se torne apropriadamente hidrofílico para experimentação.
    4. Reúna as tampas dos eletrodos GL14 equipadas com anéis de vedação de silicone.
    5. Afrouxe suavemente todas as tampas GL45 antes da autoclavagem. Autoclave reatores cheios de água e tampas de eletrodos para esterilizar. Após a autoclavagem, deixe os reatores esfriarem até a temperatura ambiente.
  2. Cultura L. plantarum NCIMB8826. Em condições estéreis, raspe algumas bactérias do topo de um estoque de glicerol e inocule em 3 mL de meio MRS comercial. Cultive a cultura durante a noite a 37 °C sem agitar.
    NOTA: L. plantarum não usa oxigênio como aceptor terminal de elétrons; portanto, não é necessário oxigenar o meio por agitação26. No entanto, as condições de cultura variam se outros micróbios forem usados.

3. Dia 2: Preparação dos eletrodos de referência, preparação dos reatores para o início do experimento e subcultura de L. plantarum

  1. Prepare os eletrodos de referência Ag/AgCl.
    NOTA: Estas etapas descrevem a preparação dos eletrodos de referência Ag/AgCl indicados na Tabela de Materiais. Os usuários devem seguir as instruções do fabricante se estiverem usando um eletrodo de referência diferente.
    1. Desmonte os eletrodos de referência Ag/AgCl e lixe os fios. Puxe suavemente o eletrodo de seu invólucro de vidro e sacuda o invólucro de vidro para esvaziar a solução de KCl antiga. Lixe suavemente os fios do eletrodo com lixa de óxido de alumínio até que fiquem uniformemente brilhantes para remover o material oxidado.
    2. Recolher todos os fios lixados do eléctrodo de referência num copo pequeno com uma pequena barra de agitação e encher o copo com 100% de água sanitária até que os fios estejam totalmente submersos. Clore os fios permitindo que os fios branqueiem em uma plataforma de agitação por 30 min até que os eletrodos fiquem cinza mais escuro. Após o branqueamento, enxágue bem os fios do eletrodo com água DI.
    3. Para remontar um eletrodo de referência, use uma seringa para encher totalmente o invólucro de vidro com solução de KCl 3 M saturada com cloreto de prata, batendo suavemente na lateral para desalojar quaisquer bolhas de ar. Usando a mesma seringa, encha a tampa do fio do eletrodo com solução KCl e, em seguida, insira o fio no invólucro. Coloque a parte inferior do invólucro de vidro contra uma toalha de papel na bancada, insira o eletrodo no invólucro de vidro e pressione firmemente a tampa para fechar o eletrodo. Armazenar os eléctrodos de referência num copo cheio superficialmente com solução de KCl até serem necessários e repetir com todos os eléctrodos de referência restantes.
    4. Use um multímetro digital para medir a tensão de eletrodos de referência Ag/AgCl caseiros.
      1. Mergulhe as extremidades dos eletrodos de referência Ag/AgCl (estimados em 197 mV versus o eletrodo de hidrogênio padrão, SHE) superficialmente em um béquer cheio de 3 M KCl. Conecte firmemente o multímetro a um eletrodo de calomelano saturado comprado comercialmente (SCE, 241 mV versus SHE) também submerso nos mesmos eletrólitos KCl.
      2. Medir a diferença de potencial entre cada eléctrodo de referência e o SCE. Confirmar que os eléctrodos de referência diferem do SCE em 44 ± 10 mV. Desmonte e remonte qualquer eletrodo de referência que esteja fora dessa faixa.
    5. Sele a costura onde a tampa encontra a caixa de vidro com parafilme.
  2. Prepare os reatores para experimentação.
    1. Em um gabinete de biossegurança estéril, troque a água autoclavada nos reatores pelo meio apropriado. Despeje a água autoclavada. Encha as câmaras catódicas com 110 mL de meio M9 autoclavado. Encha as câmaras anódicas com 110 mL de mCDM recém-preparado.
    2. Instale os eletrodos de referência. Remova uma tampa GL14 de cada câmara anódica e substitua-a por uma tampa de eletrodo autoclavada (tampa GL14 com um anel de vedação de silicone). Pulverize os eletrodos de referência com etanol a 70% para esterilizar e, em seguida, coloque um eletrodo de referência através da tampa do eletrodo em cada câmara anódica.
      NOTA: Certifique-se de que o eletrodo de referência não faça contato direto com o cartucho de feltro de carbono.
    3. Antes de remover os reatores do gabinete de biossegurança, aperte todas as tampas e clamps para ficarem apertados com os dedos para evitar vazamentos.
    4. Conecte os reatores ao sistema de bomba de água. Coloque cada reator na plataforma apropriada da barra de agitação. Conecte as torneiras da camisa de água de cada reator ao próximo com tubos de borracha, conectando os reatores finais aos tubos de entrada e saída da bomba d'água.
      NOTA: Certifique-se de que todas as conexões estejam firmes sem vazamentos, usando braçadeiras para prender a tubulação, se necessário.
    5. Encha a bomba com água e adicione 4-6 gotas de condicionador de água. Ligue o sistema de bomba e ajuste a temperatura para 30 °C. Ligue a bomba e observe o fluxo de água através de todas as camisas de água do reator, garantindo que não haja vazamentos em nenhuma conexão.
    6. Ligue as plataformas de agitação e ajuste-as para agitação contínua a 220 RPM.
    7. Conecte os reatores às linhas de gás de aspersão de nitrogênio. Conecte um filtro de ar a uma agulha de 4 polegadas e 22 G e insira a agulha através do septo superior de uma câmara anódica do reator no meio para servir como entrada de nitrogênio. Insira outra agulha de 1 polegada e 18 G no septo superior da câmara anódica para servir como saída de nitrogênio. Conecte as linhas de gás de uma fonte de nitrogênio ao filtro de ar e abra a válvula para permitir que o gás borbulhe suavemente através do reator. Certifique-se de que o nitrogênio borbulhe continuamente por todas as câmaras anódicas durante o experimento para manter as condições anaeróbicas.
      NOTA: Certifique-se de que a agulha de entrada esteja afastada do feltro de carbono redondo. O fluxo de bolhas não deve entrar em contato com o feltro de carbono ou eletrodos de referência.
    8. Conecte os biorreatores aos cabos do potenciostato. Conecte os cabos de clipe jacaré do eletrodo de trabalho, contador e referência do potenciostato aos eletrodos correspondentes.
      NOTA: Use um multímetro para verificar a resistência entre o coletor de fio/corrente e os eletrodos para garantir conexões elétricas adequadas e minimizar possíveis erros de medição.
  3. Parâmetros de potenciostato de entrada para pré-execução.
    NOTA: As configurações críticas da técnica são fornecidas abaixo. Consulte a Tabela 4 para obter uma lista estendida de configurações de software para cada técnica.
    1. Ligue o potenciostato e inicialize o software EC-lab no computador. Conecte o potenciostato ao computador clicando no botão do símbolo do potenciostato no painel superior esquerdo em Dispositivos. Uma vez conectado, o nome do dispositivo aparecerá com um círculo verde na caixa de texto abaixo.
    2. Sincronize todos os canais conectados aos biorreatores em um grupo clicando na guia Editar e selecionando sincronizar. Clique nas caixas de número de canal apropriadas | ok.
    3. Adicione a técnica tensão de circuito aberto (OCV) ao potenciostato clicando no botão + no painel Configurações de parâmetros à esquerda. Na caixa azul de configurações; configure-o para medir o potencial do eletrodo de trabalho (EWE) em relação ao eletrodo de referência (RE), registrando o tempo no intervalo dt a cada 36 s por um total de 3 h.
    4. Em seguida, adicione a técnica voltametria cíclica (CV) ao potenciostato. Defina o potencial inicial do EWE para Ei de 0 V versus RE com uma taxa de varredura de 2 mV / s. Varrer para um potencial de vértice (E1) de 0,4 V versus RE, revertendo para potencial de vértice (E2) de -0,7 V versus RE. Repita a varredura para um total de duas varreduras.
      NOTA: Em sistemas eletroquímicos microbianos, a inoculação microbiana e a formação de biofilme induzem altas capacidades em comparação com materiais metálicos ou moléculas inorgânicas. Durante a varredura de voltametria cíclica, o potencial varia e uma corrente de carga atua como plano de fundo. Para obter uma alta relação sinal-ruído, são necessárias taxas de varredura mais baixas, embora isso aumente a duração da varredura. Como fazemos a varredura de dois ciclos cobrindo uma ampla janela eletroquímica de 1,1 V, uma taxa de varredura de 2 mV/s resulta em um meio ciclo que leva até 9,1 min. Consequentemente, dois ciclos levam um total de 36,4 min. Reduzir ainda mais a taxa de varredura seria excessivamente demorado.
    5. Adicione a técnica cronoamperometria (CA). Aplique um potencial constante EWE de 0.2 V versus RE por um tempo de t = 200 h, registrando o tempo em intervalos dt a cada 25-40 s. Ajuste o intervalo de tempo com base no software potenciostato para obter o nível de detalhe desejado.
      NOTA: O potencial do ponto médio do DHNA é de aproximadamente -0,093 V vs. Ag/AgCl; assim, um potencial aplicado de 0,2 V versus RE ao eletrodo de trabalho é suficiente para permitir a transferência de elétrons do DHNA para o eletrodo.
    6. Depois de inserir todos os parâmetros, inicie a corrida pressionando o triângulo inicial verde. Salve o arquivo conforme desejado, conforme indicado pelo software, e clique em Salvar. O software iniciará a técnica 1, "OCV". Observe os traços OCV por alguns minutos para garantir que todos os reatores leiam positivamente e se juntem com um sinal constante. Deixe o experimento ser executado durante a noite para concluir o OCV e o CV inicial (consulte a Figura Suplementar S1 para o CV de controle de mídia) e permitir que o CA seja executado até estabilizar.
  4. Em condições estéreis, subcultive a cultura MRS de L. plantarum 1:200 em 50 mL de mMRS. Cultive as células durante a noite a 37 °C sem agitar.
    NOTA: Uma cultura noturna de 50 mL normalmente produz células mais do que suficientes para seis reatores, assumindo um OD600 final de 0,2 no reator. Ajuste os volumes de cultura de acordo com experimentos maiores ou menores.

4. Dia 3: Injeção de células e DHNA/DMSO

  1. Lave as células e injete-as em reatores.
    1. Remova a cultura mMRS L. plantarum da incubadora pela manhã. Em condições estéreis, transfira a cultura para um tubo cônico de 50 mL e coloque a cultura no gelo.
    2. Lave as células 2x em PBS estéril e frio 1x. Para isso, centrifugue a cultura a 4.000 × g por 5 min em uma centrífuga a 4 °C para peletizar as células. Em condições estéreis, ressuspenda suavemente, mas completamente, as células em 50 mL de PBS e, em seguida, centrifugue novamente como antes; Repita para uma segunda lavagem. Após a centrifugação final, ressuspender as células em PBS frio a OD600 = 11.
    3. Em condições estéreis, carregue 2 mL de células ressuspensas em uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha para cada reator.
    4. Na estação do reator, decape uma seringa de células e insira a agulha no topo de uma câmara anódica do reator. Não pressione o êmbolo da seringa neste momento; Repita para todos os reatores. Quando todas as seringas estiverem no lugar, pressione os êmbolos para injetar as células nos reatores e registre o tempo de injeção a partir do traço CA. Este volume de células produz um OD600 final de 0,2 nos reatores. Descarte todas as seringas em caixas de risco biológico e agulhas no recipiente de risco biológico designado para perfurocortantes. Deixe a corrente estabilizar no traço CA por 2-4 h.
      NOTA: Após a injeção, flutuações de corrente podem ser observadas no traço CA. Após 2-4 h, essas flutuações se estabilizarão em uma corrente plana (mudança de <2 μA na corrente ao longo de uma hora), ponto em que o DHNA pode ser injetado.
  2. Meça o pH inicial e injete DHNA.
    1. Prepare uma solução de DHNA. Em um tubo de 1,5 mL, prepare 500 μL de uma solução de DHNA de 20 mg / mL dissolvendo o DHNA em pó em 100% de DMSO. Encha 3 seringas de insulina com 110 μL de solução de DHNA e 3 seringas de insulina apenas com 110 μL de DMSO.
      NOTA: Embora o DHNA seja levemente solúvel em água, o DMSO é um solvente melhor para estoques de DHNA nessa concentração. O solvente do mediador pode variar se outros mediadores forem usados.
    2. Na estação do reator BES, rotule os reatores experimentais como + DHNA e os reatores de controle de solvente como - DHNA. Decape uma seringa de DHNA e insira a seringa na parte superior de cada câmara anódica designada como + DHNA. Insira uma seringa somente DMSO em cada câmara anódica designada como - DHNA. Não pressione os êmbolos da seringa neste momento.
    3. Pegue amostras de ponto de tempo de 0 h para análise de amostra. Usando uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de 2 polegadas e 21 G, retire uma amostra de mídia de 2 mL de cada câmara anódica através do septo de tampa pequena não utilizada e transfira as amostras para uma placa de 24 poços profundos para fazer medições de pH para o ponto de tempo de 0 h (ponto de injeção de DHNA). Se desejar, pegue 1 mL de meio gasto de cada câmara anódica e filtre através de um filtro de 0,2 μm em tubos limpos e marcados para quantificar metabólitos usando HPLC ou outros ensaios. Armazene amostras de mídia usadas a -80 °C.
    4. Pressione os êmbolos de todas as seringas de DHNA e DMSO para injetar nos reatores. Registre a hora da injeção do rastreamento da CA. Descarte todas as seringas e agulhas adequadamente.
    5. Meça e registre as amostras de pH de 0 h para cada reator.

5. Dia 4: Conclusão do experimento e coleta de amostras

  1. Realize análises eletroquímicas 24 h após a injeção de DHNA e colete amostras finais.
    1. Encerre a execução do CA 24 h após a injeção de DHNA.
    2. Colher amostras pontuais de 24 horas para análise de amostras de acordo com a etapa 4.2.3.
    3. Execute CV novamente para o ponto de tempo de 24 h de acordo com os parâmetros descritos na etapa 3.3.4.
    4. Meça e registre o pH das amostras de 24 horas de cada reator.
  2. Desmonte e limpe os reatores.
    1. Desligue o potenciostato. Em seguida, desconecte os cabos de trabalho, contador e referência de cada reator. Limpe qualquer umidade dos clipes jacaré de chumbo do potenciostato.
    2. Desligue o fluxo de gás nitrogênio. Desconecte os cabos de gás e, em seguida, remova as agulhas de entrada e saída. Descarte todas as agulhas adequadamente em um recipiente para objetos cortantes.
    3. Desligue a bomba d'água. Desconecte a tubulação de entrada e saída da bomba e deixe a água escorrer para um balde. Ao desconectar, mantenha as extremidades da tubulação elevadas acima da linha de água na bomba para evitar que a água caia no chão. Um por um, desconecte cada reator da tubulação da camisa de água, trabalhando do reator de saída final para o reator de entrada inicial.
    4. Esvazie todos os meios dos reatores em um grande recipiente de risco biológico. Siga os métodos normais de branqueamento da cultura para descarte.
    5. Depois de esvaziado, desmonte e limpe todas as peças do reator. Descarte as membranas de troca catiônica e as rodadas de feltro de carbono em resíduos de risco biológico adequados. Limpe os eletrodos de referência e os fios de titânio com etanol a 70% e armazene os eletrodos de referência limpos em um béquer cheio de água. Limpe suavemente as garrafas, tampas, anéis de vedação e braçadeiras do reator em água morna com detergente de laboratório, enxágue bem com água DI e seque ao ar todas as peças antes de guardá-las.

6. Dia 5: Análise eletroquímica

NOTA: Abaixo está uma descrição geral da plotagem de dados para este protocolo. Descrições mais detalhadas sobre análise e interpretação de dados serão fornecidas na seção Resultados Representativos.

  1. Para análise CA: Defina o tempo de injeção de DHNA como o ponto de tempo de 0 h. Traçar a média e o desvio-padrão da densidade de corrente medida (j em μA/cm2) de 36 em 36 s para todos os replicados a partir do ponto de tempo de 0 h em função do tempo (h). Calcule a densidade de corrente em função da área do eletrodo de trabalho (16 cm2).
  2. Para análise CV: Plote um traço CV representativo para cada condição experimental (somente meio, DMSO ou DHNA) representando a densidade de corrente (j em μA/cm2) em função do potencial do eletrodo de trabalho (EWE em V). Plote o ciclo dois da execução de VC selecionada.

Resultados

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Análise de cronoamperometria
O EET de L. plantarum pode ser observado através dos dados de cronoamperometria (CA) representados na Figura 3, na qual o traço de densidade de corrente visualiza a transferência de elétrons de L. plantarum para o eletrodo de trabalho. Monitoramos a densidade de corrente (j) versus tempo, mantendo um potencial constante de +200 mV versus Ag/AgCl por 24 h. Ao injetar 20 μg / mL de DHNA na solução eletrolítica agitadora, foi observado um pico de oxidação abiótico de DHNA, seguido por um rápido aumento na densidade de corrente biótica com pico de 132,0 ± 2,47 μA / cm2 aproximadamente no ponto de tempo de 8 h. Por outro lado, a injeção de DMSO resultou em densidade de corrente insignificante. Esses resultados enfatizam a importância do DHNA como um mediador necessário e eficiente para facilitar a transferência de elétrons entre L. plantarum e o eletrodo. Os usuários podem ajustar a saída de corrente ajustando a concentração de DHNA no BES. Pesquisas anteriores também indicam que L. plantarum responde ao DHNA de maneira dose-dependente em uma ampla gama de concentrações de DHNA, produzindo corrente significativa na presença de concentrações de DHNA tão baixas quanto 0,01 μg / mL13,22.

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Figura 3: Análise cronoamperométrica de Lactiplantibacillus plantarum EET mediada por DHNA. DHNA (20 μg/mL) ou DMSO foi injetado em eletrólitos mCDM (pH~ 6,5) com tempo de injeção identificado como t = 0. j representa a densidade de corrente em função da área do eletrodo de trabalho. Os experimentos foram conduzidos a 200 mV versus Ag/AgCl com eletrodo de feltro de carbono (16cm2) e agitação. Os valores são representados graficamente como ± média sd obtidos em reatores BES triplicados. Abreviaturas: EET = transferência de elétrons extracelulares; DHNA = ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico; DMSO = dimetilsulfóxido; mCDM = Meio quimicamente definido com manitol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de voltametria cíclica
Para avaliar melhor o EET mediado por DHNA em L. plantarum, realizamos voltametria cíclica 24 h após a injeção de DHNA. Aqui mostramos traços CV para três condições: L. plantarum com 20 μg/mL DHNA, L. plantarum com DMSO e meio com 20 μg/mL DHNA. Conforme mostrado na Figura 4A, a presença de 20 μg / mL de DHNA em reatores contendo L. plantarum resultou em um aumento distinto na corrente oxidativa a 50 mV que não ocorreu apenas na presença de DMSO. Esses dados confirmam que a adição do mediador redox DHNA é necessária para facilitar a transferência de elétrons entre L. plantarum e o ânodo. Embora tenhamos observado vários picos redox menores no traço L. plantarum + DMSO, esses picos foram semelhantes ao traço de controle de mídia e provavelmente são atribuídos a componentes redox-ativos no mCDM (Figura Suplementar S1). Na Figura 4B, comparamos traços de DHNA em condições bióticas (L. plantarum + DHNA) versus DHNA em condições abióticas (Meio + DHNA). Embora ambos os traços exibissem um pico oxidativo distinto de DHNA em torno de 50 mV, observamos um aumento sustentado na corrente além de 50 mV apenas em condições bióticas. O pico catalítico atingiu uma densidade de corrente de 129 μA/cm2 a 300 mV, representando um aumento de 256% em relação ao traço abiótico. Este perfil CV de turnover é característico do EET27 microbiano, indicando re-redução de DHNA por células de L. plantarum na presença de uma fonte de elétrons (manitol) após a oxidação de DHNA no ânodo. Além disso, o traço abiótico exibiu novos picos oxidativos em torno de -240 mV e -180 mV. Pesquisas anteriores indicam que o aparecimento desses picos pode ser devido à degradação do DHNA em ACNQ (2-amino-3-carboxi-1,4-naftoquinona)21,28. Não observamos esses picos no traço biótico, indicando que a interação das células de L. plantarum com o DHNA pode estabilizar o DHNA e prevenir a degradação. Um ponto a ser observado é que o traço de 24 h para meios com 20 μg/mL de DHNA foi realizado separadamente de acordo com este protocolo, sem adição de células.

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Figura 4: Traços representativos de voltametria cíclica. Todos os experimentos CV foram realizados em mCDM usando feltro de carbono (16 cm2) como eletrodo de trabalho a uma taxa de varredura de 2 mV / s enquanto agitava a solução. (A) Traços CV para Lactiplantibacillus plantarum com DHNA (20 μg/mL) ou DMSO em t = 24 h. (B) Traços CV de 20 μg/mL de DHNA em L. plantarum (condições bióticas) ou mCDM apenas (condições abióticas) em t = 24 h. Abreviaturas: CV = voltametria cíclica; mCDM = Meio Quimicamente Definido com manitol; DHNA = ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico; DMSO = dimetilsulfóxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de pH
A atividade de EET em L. plantarum resultou em uma queda notável no pH ao longo de 24 h. Conforme mostrado na Figura 5, o pH médio da amostra de L. plantarum exposta ao DHNA caiu para 3,33 ± 0,01 (p = 6,85 × 10-6, n = 3), enquanto o pH médio da amostra de L. plantarum exposta ao DMSO caiu para 6,50 ± 0,06 (p = 0,0409, n = 3). Conforme exibido em pesquisas anteriores, essa queda é atribuída a um aumento no metabolismo fermentativo que ocorre quando L. plantarum realiza EET13. L. plantarum normalmente metaboliza manitol por meio de glicólise e vias fermentativas, que produzem acetato, lactato e etanol como produtos de fermentação final e geram ATP por meio da fosforilação em nível de substrato29. Sob condições de EET, o fluxo metabólico através da fermentação aumenta, aumentando assim a produção de produtos de fermentação final no meio BES13. Essa mudança metabólica faz com que o pH do meio caia mais rapidamente nos reatores com DHNA em comparação com os reatores de controle DMSO.

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Figura 5: Análise de pH do sistema bioeletroquímico de Lactiplantibacillus plantarum . As amostras foram coletadas em t = 0 e t = 24 h durante a cronoamperometria. Os valores são representados graficamente como ± média sd obtidos em reatores BES triplicados. A significância foi determinada por um teste t unicaudal. DHNA: Valor de p = 6,85 × 10-6. DMSO: Valor de p = 0,0409. Abreviaturas: DHNA = ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico; DMSO = dimetilsulfóxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Ingredientes para preparação de mídia mMRS24. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Ingredientes para preparação de mídia mCDM. Essa tabela foi extraída de Tejedor-Sanz et al.13 e Aumiller et al.25. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Ingredientes para preparação de meios M9. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Configurações de parâmetros EC-Lab para técnicas OCV, CA e CV. Abreviaturas: OCV = tensão de circuito aberto; AC = cronoamperometria; CV = voltametria cíclica. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar S1: Traços representativos de voltametria cíclica de Lactiplantibacillus plantarum com DMSO e mCDM sozinhos. Traços CV para L. plantarum com DMSO em t = 24 h e mCDM sozinho em t = 0 h. Todos os experimentos CV foram realizados usando feltro de carbono (16 cm2) como eletrodo de trabalho a uma taxa de varredura de 2 mV / s durante a agitação da solução. Abreviaturas: CV = voltametria cíclica; mCDM = Meio Quimicamente Definido com manitol; DHNA = ácido 1,4-dihidroxi-2-naftóico; DMSO = dimetilsulfóxido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Usando o sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras descrito aqui, mostramos a medição da geração de corrente a partir de EET mediado por DHNA em L. plantarum. Esses experimentos BES geram dados de alta qualidade; no entanto, os BESs são sensíveis. Assim, o sucesso do protocolo depende da precisão do usuário, particularmente na montagem do reator e do eletrodo de referência, posicionamento de agulhas e eletrodos dentro da câmara anódica e substituição da membrana de troca catiônica. É fundamental montar os reatores com cuidado, garantindo que não haja vazamento de água/mídia durante a autoclavagem ou experimentação. O vazamento de água pode ser resolvido garantindo que as membranas de troca catiônica sejam cortadas para se encaixar com precisão no O-ring e apertando a braçadeira da junta com os dedos. Também é essencial submergir totalmente o feltro de carbono redondo em água durante a autoclavagem para permitir que ele se torne hidrofílico para experimentação. Recomendamos que novos usuários permitam que os reatores recém-montados cheios de água fiquem parados por 2 h antes da autoclavagem, verificando se há sinais de vazamentos lentos abaixo das junções principais da garrafa. Além disso, garantir um conjunto adequado de eletrodos de referência garante uma replicação consistente dos dados entre os reatores. Se a frita de Teflon dentro do invólucro de vidro ficar descolorida, rachada ou seca, isso pode causar uma alta resistência do eletrodo de referência. Os usuários podem substituir o invólucro de vidro para restaurar o desempenho do eletrodo de referência.

A orientação adequada de todas as agulhas e eletrodos dentro da câmara anódica durante a experimentação é fundamental para o sucesso do experimento. O eletrodo de referência não deve entrar em contato direto com nenhuma parte do eletrodo de trabalho de feltro de carbono. Os usuários podem ajustar a posição do feltro de carbono girando suavemente o fio de titânio do eletrodo de trabalho acima do reator. Além disso, a colocação da agulha para aspersão de nitrogênio não deve fazer contato direto com eletrodos dentro da câmara ou quaisquer conexões eletrodo/potenciostato acima da câmara. O fluxo de nitrogênio deve ser ajustado para não fluir para nenhum dos eletrodos. Finalmente, os usuários devem certificar-se de que a barra de agitação não entre em contato com o eletrodo de trabalho, posicionando o eletrodo de trabalho 1-2 cm acima da barra de agitação. Se um sinal errático for observado no OCV, isso geralmente pode ser resolvido garantindo a colocação adequada dos eletrodos e do fluxo de nitrogênio dentro do reator e verificando se as conexões entre os cabos do potenciostato e os eletrodos do reator estão corretas e seguras. Por fim, nossa experiência mostra que mediadores de elétrons como o DHNA podem ser retidos dentro da membrana de troca catiônica e causar uma alta corrente de fundo se reutilizados muitas vezes. Recomendamos a substituição da membrana de troca catiônica após dois a três usos, especialmente ao investigar EET mediado, para garantir resultados experimentais confiáveis.

Ao contrário do EET direto, onde a ligação microbiana direta ao eletrodo facilita a transferência de elétrons, o EET mediado requer difusão consistente de vaivéns de elétrons através da membrana celular e do eletrodo, resultando nas configurações exclusivas de BES descritas aqui. Primeiro, escolhemos um BES de câmara dupla em vez da contraparte de câmara única em nosso protocolo para separar as reações anódicas e catódicas com uma membrana de troca catiônica. Essa separação evita que os mediadores de elétrons de difusão livre (DHNA) e os micróbios interajam de forma cruzada com o cátodo, garantindo que o EET microbiano seja a principal fonte de elétrons para reduzir os mediadores de elétrons e o ânodo. A separação também permite um controle preciso sobre parâmetros como concentração/distribuição do mediador e o potencial posicionado no ânodo. Além disso, escolhemos feltro de carbono como material anódico entre outras opções, como hastes de grafite, eletrodos de metal, carbono vítreo ou óxido de índio e estanho (ITO). Isso ocorre porque a estrutura porosa 3D do feltro de carbono fornece uma área de superfície muito maior do que os eletrodos30, permitindo a utilização eficiente de mediadores mesmo em altas concentrações. Nossas configurações BES de três eletrodos e duas câmaras fornecem uma leitura confiável e reprodutível do EET mediado, mesmo em monitoramento de longo prazo; no entanto, esse processo é relativamente baixo. Este protocolo é adequado para compreensão em escala de bancada dos mecanismos EET ou para testar protótipos de aplicações EET. Arquiteturas BES alternativas, como BESs portáteis ou impressos 31,32, matrizes de semicondutores de óxido metálico complementar (CMOS)33 ou BESs34 ampliados, podem ser consideradas pelos pesquisadores para diferentes propósitos fundamentais ou de aplicação.

Neste protocolo, fornecemos instruções detalhadas para as técnicas eletroquímicas mais comumente utilizadas: cronoamperometria (CA) e voltametria cíclica (CV). Vale ressaltar que outras técnicas eletroquímicas, como Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e Voltametria de Pulso Diferencial (DPV), podem fornecer insights mais profundos sobre o BES, analisando a resistência de transferência de carga e a capacitância de camada dupla 35,36,37. Embora este protocolo BES permita medições de EET, complementar os dados eletroquímicos com medições de atividade metabólica e biomassa celular também pode ser essencial para uma análise abrangente. Micróbios como L. plantarum envolvem EET como um dos sumidouros de elétrons ao lado de outros subprodutos da fermentação, como lactato e etanol. Além disso, vale ressaltar que o crescimento da biomassa celular também serve como um sumidouro de elétrons13. Portanto, quantificar os doadores de elétrons consumidos (por exemplo, manitol), avaliar o crescimento da biomassa celular e monitorar os subprodutos da fermentação oferecem insights mais profundos sobre a eficiência e as ramificações fisiológicas do EET. Os metabólitos celulares são comumente quantificados usando cromatografia e ensaios enzimáticos, enquanto a viabilidade e o crescimento celular são avaliados pela contagem de unidades formadoras de colônias e pela medição da densidade óptica do meio gasto a 600 nm, respectivamente13 . Também é importante notar que as medições de EET são sensíveis a pequenas perturbações em condições experimentais. Isso inclui, mas não se limita a pH, temperatura, velocidade de agitação e taxa de aspersão de gás nitrogênio38. Portanto, a normalização dos níveis medidos de EET com medições bioanalíticas atua como um controle interno, facilitando a avaliação consistente em experimentos realizados em dias diferentes.

Combinando técnicas eletroquímicas com outras medições bioanalíticas, o EET mediado cria novas oportunidades para eletrofermentação e bioeletrocatálise. O uso convencional de eletrocatalisadores orgânicos, inorgânicos ou enzimáticos apresenta desafios devido ao seu alto custo e são propensos à degradação. Alternativamente, o uso de micróbios como eletrocatalisadores vivos oferece uma solução mais barata e escalável devido às habilidades de auto-reparo e auto-replicação dos micróbios39. L. plantarum, geralmente reconhecida como uma bactéria segura do ácido lático, é um chassi particularmente intrigante. Usando configurações eletroquímicas idênticas descritas neste protocolo, mostramos anteriormente que L. plantarum pode fermentar suco de couve sob condições de EET e acelerar o fluxo metabólico para produzir mais produtos finais de fermentação, como lactato, acetato e succinato13; Esses ácidos orgânicos são compostos de sabor essenciais na fermentação de alimentos. Isso implica que, usando técnicas eletroquímicas, o EET mediado em L. plantarum pode ser potencialmente sequestrado para manipular o fluxo metabólico, alterar os sabores dos alimentos ou produzir produtos químicos valiosos. Vale ressaltar que as técnicas eletroquímicas apresentadas neste protocolo podem não apenas ser aplicadas a L. plantarum, mas também podem ser aplicadas genericamente a outros micróbios nativos ou modificados que realizam EET mediado40,41. Diferentes mediadores eletrônicos, como flavina, ferroceno, vermelho neutro, ferricianeto, lawsona e menadiona, podem ser selecionados com base no mecanismo de transferência de elétrons do micróbio específico que está sendo usado22,42. Além disso, o protocolo BES estabelecido neste trabalho pode ser estendido a exoeletrogênios que realizam EET sem mediador, como demonstrado anteriormente com as espécies de Shewanella e Geobacter 43,44. Um meio de crescimento otimizado deve ser usado para apoiar a atividade celular do micróbio específico para facilitar seu desempenho no EET. Este protocolo ajusta os parâmetros para EET mediado por DHNA em L. plantarum, mas modificações são esperadas quando um micróbio diferente e mediadores eletrônicos são aplicados.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos aos membros do laboratório Ajo-Franklin por discussões perspicazes sobre montagem, manutenção, etapas críticas e solução de problemas do BES. A pesquisa foi patrocinada pelo Escritório de Pesquisa do Exército e foi realizada sob o número de concessão W911NF-22-1-0239 (para CMAF, apoiando RA) e pelo Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas, concessão # RR190063 (para CMAF, apoiando RC, SL e BBK). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,4-Ácido Dihidroxi-2-naftóico (DHNA)Sigma-Aldrich281255-25G
Fio de titânio de 1,0 mmde diâmetro Thermo Fisher Scientific045485.BYCorte sob medida para eletrodos de trabalho e contra-eletrodos
Folhas de Óxido de Alumínio 120-C 9" x 11"Johnson Abrasives10108-15
Seringas de plástico de 3 mLThermo Fisher Scientific14955457
Solução 3M KCl saturada com cloreto de prataMillipore Sigma60137-250ML
feltro de carbono de 6,35 mm de espessuraThermo Fisher Scientific043200.RFCorte em rodadas de 16 cm2
eletrodo de referência Ag/AgClCH InstrumentsCH111
Air-Tite Premium Agulhas HipodérmicasThermo Fisher Scientific14-817-102
AlK(SO)4 * 12H2OSigma-Aldrich237086-100G
Citrato de amônio tribásicoCentrífuga Millipore SigmaA1332
Avanti J-15RBeckman CoulterB99517
BD, 18 G x 1 polegadaThermo Fisher Scientific14-826-5G
BD Agulha de Precisão de Deslizamento, 21 G x 2 polegadasThermo Fisher Scientific14-821-13N
Bel-Art SP Scienceware Cleanware Aqua-Clear Water CondtionerThermo Fisher Scientific23-278339
BiotinaMillipore SigmaB4639
CaCl2Millipore SigmaC4901
Cálcio D-(+)-pantotenatoMilliporeSigma 1087009
Millipore Sigma2240-OPCasamino
InternationalCMI-7000Corte em círculos adequados ao O-ring BES
CoCl2 * 6H2OMillipore SigmaC8661
CuSO4 * 5H2OMillipore SigmaC8027
Cisteína-HCl * H2OMillipore Sigma30129
DMSOMillipore Sigma5439001000
DS-11+ EspectrofotômetroDenovixN/A
EC-Lab SoftwareBioLogicN/A
ECO E 4 S termostato de aquecimentoLauda-BrinkmannCat. Nº 115 V; 60 Hz : L001191
FeSO4 * 7H2OMillipore Sigma215422
Ácido fólicoMilliporeSigma F8758
H3BO3Millipore Seringas de insulina SigmaB6768
com agulha BD Micro-Fine IVThermo Fisher Scientific14-829-1A
Lactiplantibacillus plantarum NCIMB8826N/AN/AReferência: Tejedor-Sanz et al., 2022
Caldo Lactobacillus MRSHiMediaM369
M9 CaldoMilliport Sigma63011
Sulfato de magnésio anidroMillipore Sigma208094
Sulfato de manganês monohidratadoMillipore Sigma221287
manitolMillipore SigmaM1902-1KG
Mettler Toledo FiveEasy Medidor de pH de BancadaHogentoglerF20-KIT
MgCl2 * 6H2OMillipore SigmaM9272
MgSO4 * 7H2OMillipore SigmaM2773
Millex - GV 0.22 & Micro; m Unidade de filtro de membrana PVDFMillipore SigmaSLGV004SL
MnCl2 * 4H2OMillipore Sigma203734
MnSO4 * H2OMillipore Sigma221287
MOPSMillipore SigmaM1442
N2 gásAirgasNI UHP300antes de usar
Na2MoO4 * 2H2OMillipore Sigma331058
Na2SO4Millipore Sigma238597
NaClMillipore SigmaS9888
NH4ClMillipore SigmaA9434
Ácido nicotínicoMillipore SigmaN-0761
Ácido nitrilotriacético (NTA)Millipore Sigma72560
Ácido p-aminobenzóicoMillipore SigmaP9879
Solução salina tamponada com fosfato, solução 10xThermo Fisher ScientificBP399-1
Fosfato de potássio dibásicoMillipore SigmaP8281
potenciostatoBioLogicVMP-300
Protease peptona #3Bacto211693
Piridoxina HClMillipore SigmaP6280
RiboflavinaMillipore Sigma555682
Plataforma de barra de agitação magnética RO10IKA3691000
Acetato de sódio trihidratadoMillipore Sigma935700
Barra de agitação, em forma de ovoThermo Fisher Scientific14-512-121Coloque na câmara anódica de BES
Tiamina HClMillipore SigmaV-014
Ácido tióctico (&alfa;-ácido lipóico)Millipore SigmaT-1395
TriptofanoMillipore Sigma9136
Tween80Millipore SigmaP4780
Vitamina B12Millipore SigmaV6629
Conjunto MCF revestido, 100 ml, NW25, 2 x porta GL14Adams & Chittenden Scientific GlassNA
Extrato de leveduraMillipore SigmaY1625
ZnSO4 * 7H2OMillipore SigmaZ0251
Agulha de Precisão Membranas de membrana de troca catiônica de ácidos Filtro personalizado

Referências

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