Artigo de método

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

DOI:

10.3791/67213

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20 de setembro de 2024

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1School of Life Sciences, Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 2MiDx Ltd, Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 3School of Life Sciences, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 4National Biofilms Innovation Centre, School of Life Sciences, Biodiscovery Institute, University of Nottingham

Neste artigo

Resumo

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Essa metodologia permite o estabelecimento de um modelo de biofilme polimicrobiano na fibrose cística para testes de sensibilidade antimicrobiana em pesquisa e laboratórios clínicos. Este modelo fornece resultados precisos e confiáveis em uma variedade de saídas.

Resumo

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Existe uma variedade de modelos de biofilme de bactérias para o teste de antibióticos. No entanto, muitos deles são limitados a uma única saída experimental, como unidades formadoras de colônias ou atividade metabólica. Além disso, muitos modelos de biofilme não refletem as propriedades biológicas e físico-químicas do ambiente hospedeiro humano. Esta é uma questão importante em muitas condições, mas mais notavelmente na fibrose cística (FC). Uma grande proporção de pessoas com FC sofre de infecções crônicas e intermitentes e, in vitro, o teste de suscetibilidade a antibióticos se correlaciona mal com os resultados do tratamento do paciente. Alguns modelos de biofilme incorporam meios relevantes para o pulmão da FC, incluindo imitadores sintéticos de escarro, mas não consideram a natureza polimicrobiana do ambiente, que altera a arquitetura do biofilme, a fisiologia e a maneira como os micróbios respondem ao tratamento. O modelo de biofilme de colônia de interface de ar sólido descrito aqui é altamente adaptável e incorpora meios relevantes para CF e um contexto polimicrobiano. Este modelo também pode ser usado para triagem de antimicrobianos de médio rendimento e para estudar seu efeito na dinâmica polimicrobiana. As medições de saída do modelo podem ser unidades formadoras de colônias, atividade metabólica e análise de microscopia confocal. O modelo pode ser facilmente adaptado a diferentes microrganismos, meios, temperaturas e condições variáveis de oxigênio e pode ser usado para testar uma ampla gama de tratamentos químicos, biológicos e físicos.

Introdução

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A fibrose cística (FC) é uma condição genética que afeta mais de 11.000 pessoas no Reino Unido e 162.000 pessoas em todo o mundo 1,2. Embora a FC seja uma doença de múltiplos órgãos, um sintoma importante experimentado por pessoas com fibrose cística (pwFC) é a formação de muco anormalmente espesso e desidratado no trato respiratório3. Isso, juntamente com a redução do batimento dos cílios, pode aumentar a colonização dos pulmões por uma ampla gama de bactérias, fungos, vírus e arqueias 4,5. Apesar do pulmão com FC fornecer condições e pressões seletivas para limitar o crescimento e a sobrevivência de microrganismos, bactérias como a Pseudomonas aeruginosa são altamente adaptadas a esses ambientes hostis6. Isso permite tanto a colonização quanto a sobrevida, resultando na formação de infecções crônicas persistentes7.

Muitos dos micróbios que causam essas infecções crônicas o fazem usando uma mudança fenotípica de um estilo de crescimento planctônico inicial para um estilo de biofilme, seja ligado à superfície ou em agregados7. Esses biofilmes são caracterizados por comunidades bacterianas compactas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeo (EPS) que consiste em uma variedade de componentes, incluindo polissacarídeos, proteínas, lipídios e DNA ambiental (eDNA)8. Essa matriz é uma característica comum entre microrganismos; no entanto, sua composição pode ser diferente. Por exemplo, os principais componentes polissacarídeos da matriz bacteriana de P. aeruginosa são Psl, Pel e alginato, ao contrário dos fungos Candida albicans, cujos principais componentes da matriz polissacarídica são mananos e glucanos9. Em biofilmes monoespécies, essa matriz pode afetar muito a tolerância a antibióticos em comparação com o planctônico, reduzindo a penetração de antibióticos no biofilme, diminuindo sua eficácia10. O estilo de crescimento do biofilme também induz a formação de células persistentes com atividade metabólica reduzida em comparação com suas contrapartes planctônicas e, portanto, diminui ainda mais a suscetibilidade aos antibióticos11. Esse estilo de crescimento também é caracterizado pela regulação positiva de alguns mecanismos de resistência a antibióticos, como bombas de efluxo e aqueles necessários para a transferência horizontal de genes, permitindo a troca de genes de resistência 11,12,13. Além disso, o ambiente relacionado à doença do hospedeiro influencia muito a fisiologia microbiana e a maneira como eles respondem aos antibióticos. Isso inclui o aumento da microaerobiose dentro do muco espesso, bem como a disponibilidade de fontes de carbono não padronizadas, como aminoácidos e eDNA, derivadas do hospedeiro ou da degradação microbiana de produtos pulmonares 14,15,16.

Essas interações específicas são ainda mais complicadas pela natureza polimicrobiana dos biofilmes, que introduz uma camada adicional de complexidade com interações complexas não apenas entre bactérias, mas também entre bactérias e fungos. Em comparação com os biofilmes bacterianos, sabe-se menos sobre algumas das interações entre biofilmes bacterianos e fúngicos, apesar de C. albicans ser isolado de mais de 75% das pessoas com FC15. Geralmente, as interações entre C. albicans e bactérias como P. aeruginosa são antagônicas, mas podem resultar em infecções mais crônicas e graves18. A combinação de interações microbianas, tanto patogênicas quanto comensais, juntamente com uma série de fatores ambientais relacionados à FC pode resultar em aumento da tolerância a antibióticos19,20. Muitos desses fatores não são frequentemente considerados em testes pré-clínicos de antibióticos, apesar de serem atribuídos ao aumento da tolerância a antibióticos em modelos existentes21.

Essas condições também são difíceis de recapitular in vitro e, como resultado, muitos modelos carecem da presença de fatores indutores de tolerância específicos presentes na pwCF, como aqueles que aumentam a produção de beta-lactamase em P. aeruginosa22, a indução de variantes de pequenas colônias em Staphylococcus aureus e a inibição da hifenização em C. albicans; todos os quais foram demonstrados como ocorrendo no escarro da FC23,24.

Há, portanto, uma grande disparidade entre as condições utilizadas nos métodos atuais de teste de sensibilidade a antibióticos, baseados em culturas planctônicas ou cultivadas em placas de ágar em meios padronizados, como Mueller-Hinton com ensaios de microdiluição em caldo de difusão em disco, Etest e CLSI, e as condições encontradas no ambiente hospedeiro25. Isso freqüentemente falha em determinar com precisão a sensibilidade aos antibióticos26. Esse problema é ainda mais complicado pela falta de padronização nos testes de biofilme antimicrobiano, dificultando a tradução precisa da eficácia antimicrobiana do laboratório para a clínica27,28.

O modelo polimicrobiano que desenvolvemos aqui demonstra maior tolerância de Pseudomonas aeruginosa a uma variedade de antimicrobianos, incluindo meropeném e tobramicina. Isso ilustra a grande variação entre os testes antimicrobianos atuais usando biofilmes monoespécies e o modelo de biofilme polimicrobiano desenvolvido neste estudo para determinar concentrações inibitórias mínimas. Este modelo também mantém um rendimento relativamente alto e baixo custo desejável para testes antimicrobianos. O modelo também pode ser usado para estudar o impacto da terapia antimicrobiana na dinâmica polimicrobiana e estabelecer se um determinado tratamento pode levar a um determinado patógeno a se tornar dominante, permitindo a previsão de complicações adicionais. Embora este modelo permita a construção de biofilmes complexos, sua configuração não requer equipamentos de laboratório sofisticados e fornece uma plataforma para uma ampla gama de resultados clínicos e de pesquisa.

Protocolo

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1. Preparação de meio sintético de fibrose cística-2 (SCFM2) e placas

  1. Fazer SCFM2 de acordo com a receita descrita em Palmer et al.16 em um frasco de vidro borossilicato de 500 mL na concentração 2x com algumas modificações.
    1. Pesar e preparar as matérias-primas conforme indicado no quadro 1. Preparar as reservas de aminoácidos de acordo com o quadro 2.
    2. Pesar 5 g de mucina (do estômago suíno (Tipo II)) e 600 mg de eDNA (de esperma de salmão) em 100 ml de dH2O num frasco de vidro borossilicato de 200 ml. Agitar a 4 °C durante a noite antes da esterilização em autoclave.
    3. Em um frasco esterilizado de 500 mL, adicione 0,54 g de glicose, 6,06 g de NaCl e 2,228 g de KCl. Adicione 10 mL a cada um dos estoques preparados na etapa 1.1.1. Ajuste o pH para 6,9 usando 1 M NaOH ou HCl.
    4. Adicionar 10 mL de dH2O seguido de 10 mL de CaCl 0,175 M2 e 0,0606 M de MgCl2. Prepare e adicione 10 mL de ácido L-láctico 0,93 M. Imediatamente antes do uso, adicione 10 mL de 0,36 mM Fe(III)SO47H2O
    5. Esterilize o filtro SCFM2 usando uma unidade de filtro e uma bomba de vácuo e, em seguida, adicione a mucina autoclavada e o eDNA.
      NOTA: O SCFM2 preparado pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.
  2. Prepare placas de ágar SCFM2 conforme descrito abaixo.
    1. Pré-aqueça 25 mL de 2x SCFM2 em um tubo de 50 mL em banho-maria a 55 °C antes de misturar com 25 mL de ágar técnico a 3% (p/v) pré-derretido, resultando em uma mistura de 1x SCFM2 e 1,5% (p/v) de ágar técnico.
    2. Usando uma pipeta sorológica, transfira 5 mL da mistura para cada poço de uma placa de 6 poços.
    3. Preparar o mesmo número de discos de policarbonato de 13 mm com poros de 0,2 μm, colocando-os no fundo de uma placa de Petri e aplicando UV-C durante 600 s a um comprimento de onda de 254 nm e uma frequência de 60 Hz. Vire os discos e repita o procedimento UV-C.
    4. Uma vez que o ágar técnico 1x SCFM2-1,5% (p/v) tenha endurecido, use uma pinça estéril para adicionar um único disco de policarbonato à superfície de cada poço da placa de 6 poços.

2. Preparação de bactérias para infecção

  1. Antes de configurar o modelo, prepare a(s) placa(s) de ágar para as cepas de bactérias e fungos necessárias de acordo com o ágar padrão usado no laboratório para P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 e C. albicans SC5314 (por exemplo, caldo de lisogenia com ágar 1,2% (p / v) para bactérias e ágar Sabouraud dextrose para C. albicans).
    NOTA: Para estabelecer o modelo, foram utilizadas cepas de referência laboratoriais específicas. No entanto, este modelo também tem sido utilizado com outras cepas, incluindo isolados clínicos, com algumas modificações, como aumentar o tempo para o estabelecimento do biofilme antes do tratamento para cepas de crescimento mais lento.
  2. Use uma alça de inoculação de 1 μL para escolher uma única colônia de cada microrganismo para inocular 5 mL de meio líquido de laboratório padrão (por exemplo, caldo de lisogenia para P. aeruginosa, S. aureus e dextrose de peptona de levedura (YPD) para C. albicans). Incubar essas culturas até atingirem a fase de crescimento exponencial a 200 rpm, 37 ° C para a bactéria e 200 rpm, 30 ° C para C. albicans.
    NOTA: A aeração será diferente dependendo da incubadora agitada e do raio de rotação

3. Configurando o modelo de interface de ar sólido

NOTA: Uma representação esquemática geral do modelo pode ser vista na Figura Suplementar 1.

  1. Transfira 1 mL de cada cultura líquida para um tubo estéril separado de 1,5 mL e centrifugue por 2 min a 8.000 x g para peletar as bactérias/fungos. Execute esta e todas as etapas de centrifugação a seguir em temperatura ambiente.
  2. Aspire o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda os grânulos em 1 mL de PBS antes da centrifugação, mais uma vez, por 2 min a 8.000 x g.
  3. Remova o sobrenadante como antes e ressuspenda os pellets em 1 mL de PBS. Diluir as células ressuspensas de P. aeruginosa e S. aureus 1:10 em PBS e medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 600 nm.
  4. Ajuste as amostras lavadas para 1 x 108 unidade formadora de colônias (UFC)/mL com base na validação prévia de que um OD600 de 0,05 para P. aeruginosa e 0,1 para S. aureus é equivalente a 1 x 108 UFC/mL.
  5. Para C. albicans, diluir amostras lavadas 1:100 em PBS, adicionar 10 μL de cada uma a duas câmaras individuais de um hemocitômetro e usar as dimensões fixas da câmara e a diluição usada para calcular UFC/mL. Usando o hemocitômetro Neubauer aprimorado, o cálculo será o seguinte:
    Número de células = contagem média de células × 10.000 / (fator de diluição)
  6. As UFC calculadas representam UFC/ml de C. albicans na amostra pré-diluída. Ajuste a amostra de C. albicans para 1 x 108 UFC / mL em PBS como nas culturas bacterianas.
  7. Para preparar o inóculo para adição ao biofilme, ajuste o inóculo de P. aeruginosa para 1 x 104 UFC / mL (diluições de 2 vezes 100 vezes), C. albicans para 1 x 105 UFC / mL (diluição de 100 vezes seguida de uma diluição de 10 vezes) e, finalmente, S. aureus para 1 x 106 UFC / mL (diluição de 100 vezes) usando PBS.
  8. Para biofilmes monoespécies, adicionar 10 μL do micróbio desejado diluído ao centro do disco de policarbonato previamente colocado nas placas de seis poços de ágar técnico 1x SCFM2-1,5% e incubar estaticamente a 37 °C por 24 h antes do tratamento ou interrupção.
  9. Para biofilmes polimicrobianos, adicione 10 μL de cada S. aureus e C. albicans um sobre o outro no mesmo disco. Incubar o disco inoculado estaticamente durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: A ordem em que os inóculos de S. aureus e C. albicans são adicionados não afeta o desenvolvimento do modelo e gera os mesmos resultados.
  10. Em seguida, transferir os discos de policarbonato para placas de ágar técnicas frescas 1x SCFM2-1,5% com pinça estéril e adicionar 10 μL da diluição 1 x 104 UFC/mL de P. aeruginosa sobre o biofilme pré-estabelecido de S. aureus - C. albicans . Incubar por mais 24 h a 37 °C.
    NOTA: P. aeruginosa é adicionado 24 h após S. aureus e C. albicans para refletir a ordem em que esses organismos freqüentemente colonizam o pulmão da FC em pessoas com FC. Isso também evita que P . aeruginosa supere os outros dois microrganismos. Uma vez que P. aeruginosa tenha sido adicionado, o biofilme pode ser cultivado por mais de 24 h; No entanto, o disco de policarbonato com o biofilme precisa ser transferido para um meio fresco a cada 24 h. Antes da interrupção, os biofilmes podem ser usados para microscopia usando cepas que expressam proteínas fluorescentes, corantes fluorescentes ou anticorpos específicos de cepa/micróbio. No entanto, vale ressaltar que alguns corantes mancham o disco de policarbonato.

4. Interrupção do biofilme

  1. Adicione esferas de cerâmica com um diâmetro de 2.8 mm às placas e reticule as placas por UV conforme descrito na etapa 1.3. Adicione 5 esferas de cerâmica a um tubo homogeneizador estéril de 2 mL usando uma pinça esterilizada por chama. Em seguida, pipete 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no tubo de homogeneização de 2 mL.
  2. Tubos de vórtice durante, pelo menos, 10 s ou até que o biofilme tenha sido removido do disco de policarbonato, determinado por inspecção visual, altura em que retirar o disco de policarbonato.
  3. Coloque os tubos com as esferas no homogeneizador e bata 2x por 10 s a 6 m/s com um intervalo de 10 s entre as batidas.
    NOTA: Esta combinação de grânulos, tempo de batimento e uso de homogeneizador resulta em ruptura suficiente do biofilme com lise mínima, conforme determinado por microscopia e unidades formadoras de colônias. Isso pode variar dependendo do batedor de contas específico usado.
  4. Despeje o biofilme interrompido do tubo homogeneizador em uma bijuteria de 7 mL contendo 4 mL de PBS, resultando em um volume final de 5 mL.
  5. Certifique-se de que todo o líquido dos tubos homogeneizadores foi transferido para a bijuteria centrifugando os tubos a 8.000 x g por 2 min e transferindo o líquido restante para a bijuteria de 7 mL.
    NOTA: A partir desses 5 mL de biofilme interrompido, uma série de ensaios pode ser realizada, mas é fundamental lembrar para qualquer cálculo a diluição de 1 mL de biofilme PBS em um volume final de 5 mL.

5. Teste de atividade metabólica

  1. Adicione 200 μL do biofilme interrompido da etapa 4 acima a uma placa preta de 96 poços de fundo transparente. Em seguida, adicione 10 μL de solução de resazurina a 0,02% (p / v).
  2. Incube o biofilme tratado com resazurina com um leitor de placas e leia a atividade metabólica. Incubar a placa a 37 °C, aplicando agitação orbital de 30 em 30 minutos durante 10 s a 200 rpm antes de efectuar qualquer leitura fluorescente.
  3. Medir a fluorescência utilizando uma excitação de 540 nm e uma emissão de 590 nm. Repita este ciclo de 30 minutos por 4 h usando um leitor de placas.
    NOTA: O ponto de tempo de 4 h é usado, pois fornece variações mais distintas entre amostras tratadas versus não tratadas e entre amostras com concentrações variadas de antibióticos.

6. Teste de sensibilidade antimicrobiana

  1. Para testar a tolerância antimicrobiana dos antibióticos padrão, solubilize os antibióticos de escolha em seu solvente relevante e adicione-o ao meio de ágar técnico 1x SCFM2-1,5% (p / v) enquanto ainda líquido antes de transferir 5 mL para cada poço de uma placa de seis poços. Uma vez endurecido, transferir o biofilme cultivado no disco de policarbonato para o topo do meio contendo antibióticos usando uma pinça estéril e adicionar uma gota de 10 μL da concentração de antibiótico correspondente no topo do biofilme.
    NOTA: Para este estudo, uma diluição serial de 2 log entre 64 μg / mL e 0,125 μg / mL de meropenem e tobramicina foi usada para refletir concentrações clinicamente relevantes. A administração de antibióticos ou outros tratamentos antimicrobianos/antivirulência apenas em cima do biofilme é suficiente, pois foram observadas respostas semelhantes quando adicionadas ao meio e ao biofilme.
  2. Após 24 h de incubação a 37 °C com o tratamento, biofilmes de imagem e interrupção conforme descrito na etapa 4.
  3. A partir dos 5 mL de cultura interrompida, pegue uma alíquota e faça uma diluição seriada de 10 vezes usando PBS. Plaquear pontos de 10 μL em triplicado em ágar para determinar as unidades formadoras de colónias utilizando o método de Miles e Misra30.
    NOTA: O volume adicionado às placas de ágar afetará o limite de detecção, volumes maiores reduzirão o limite de detecção, mas exigirão mais amostras e placas de ágar.
  4. Para biofilmes monoespécies, listre P. aeruginosa e S. aureus em placas de ágar LB e C. albicans em ágar SDA.
  5. Para biofilmes polimicrobianos, colocar alíquotas em três meios seletivos diferentes contendo antibióticos para isolar cada uma das três espécies e permitir a determinação de UFC. Isso inclui ágar de isolamento de Pseudomonas e ágar sal de manitol contendo nistatina a 10 μg/mL para isolar P. aeruginosa e S. aureus, respectivamente, e ágar Sabouraud dextrose com tetraciclina a 125 μg/mL para isolar C. albicans. Incubar placas de S. aureus a 37 °C durante a noite e placas de P. aeruginosa e C. albicans a 30 °C.
    NOTA: Incube placas de P. aeruginosa a 30 ° C para minimizar o crescimento excessivo da colônia e reduzir a enxameação.

Resultados

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A simplicidade do modelo de biofilme de interface sólido-ar permite a triagem de um grande número de antimicrobianos sob diferentes condições clinicamente relevantes ao mesmo tempo. Este modelo permite a avaliação da eficácia dos antibióticos usando contagens de UFC e ensaios metabólicos em biofilmes mono e polimicrobianos a serem realizados em uma semana. Devido à natureza do modelo, ele também permite fácil manipulação das condições ambientais, como alterar a composição do meio e colocar os biofilmes sob condições anaeróbicas e de oxigênio reduzidas. Usando este modelo, mostramos mudanças na tolerância a dois antibióticos comumente usados em pwCF entre P. aeruginosa cultivada em biofilmes monoespécies e polimicrobianos (Figura 1). Paralelamente, conseguimos determinar como o tratamento antimicrobiano pode impactar a dinâmica populacional dentro dos biofilmes polimicrobianos (Figura 2).

Para realizar esses experimentos, o inóculo inicial foi preparado conforme especificado no protocolo acima, levando à formação de monoespécies estáveis e biofilmes polimicrobianos com UFC/mL reprodutíveis e pequenos desvios padrão determinados por ANOVA de uma ou duas vias. Este modelo também destacou o crescimento consistente e a recuperação de UFC, além de permitir a possibilidade de combinar essas técnicas clássicas de microbiologia com outras técnicas não realizadas neste estudo sem a necessidade de processamento sofisticado. Isso inclui imagens como vivos/mortos, visualização de matriz e análise molecular, que outros modelos tridimensionais não conseguem oferecer de maneira tão acessível (Figura 1)31. Deve-se notar que o desvio padrão esperado para UFC/mL aumenta quando os dados são exibidos como a porcentagem de sobrevida em relação à UFC/mL (Figura 1). Ao comparar a eficácia do tratamento com antibióticos entre monoespécies e biofilmes polimicrobianos, houve um aumento significativo em todas as concentrações de antibióticos necessárias para atingir 50% de morte. Um aumento de 2 log na concentração de antibióticos foi necessário para atingir esse nível de morte para meropenem e tobramicina (Figura 1). Houve também um aumento global na sobrevida de P. aeruginosa na presença de S. aureus e C. albicans no biofilme polimicrobiano quando tratado com 64 μg/mL de tobramicina, enquanto o oposto foi verdadeiro para o meropenem.

O método utilizado para determinar a actividade metabólica mede a actividade global de todo o biofilme polimicrobiano sem ser capaz de distinguir a contribuição individual de cada espécie. Por esse motivo, apenas alterações metabólicas monoespécies são mostradas para demonstrar o uso de ensaios de atividade metabólica para este modelo. Para biofilmes monoespécies houve uma forte relação entre a sobrevivência de P. aeruginosa e a atividade metabólica tanto para meropenem quanto para tobramicina (Figura 2). A utilização da atividade metabólica e da contagem de UFC das mesmas amostras permite a fácil identificação dos efeitos bacteriostáticos e bactericidas. Para biofilmes polimicrobianos, a determinação da atividade metabólica pode indicar como o direcionamento de uma espécie pode induzir um aumento geral na atividade metabólica do biofilme e, portanto, potencialmente aumentar o crescimento microbiano de outras espécies.

Embora as UFC sejam o padrão ouro para testes de sensibilidade antimicrobiana, em biofilmes polimicrobianos elas também permitem a avaliação da composição de espécies dentro do biofilme. Ao tratar P. aeruginosa em biofilmes polimicrobianos, não só podemos mostrar o aumento do MBEC50 para este organismo, mas também estabelecer o efeito que isso tem sobre as outras espécies co-isoladas (Figura 3). Isso é, por exemplo, visto com o meropenem (antipseudomonal), onde a redução de P. aeruginosa é acompanhada por um aumento nas UFC de S. aureus e C. albicans , resultando em S. aureus se tornando o organismo mais prevalente após a exposição a certas concentrações de antibióticos (Figura 3A). Isso destaca a importância de considerar a natureza polimicrobiana do biofilme devido ao aumento potencial no tamanho da população de outras espécies causadoras de doenças ao tratar um patógeno específico.

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Figura 1: Variação na tolerância antimicrobiana de P. aeruginosa ao meropeném e tobramicina entre biofilmes mono e polimicrobianos cultivados no modelo de interface sólido-ar. P. aeruginosa PAO1 cultivada em biofilmes mono ou polimicrobianos com S. aureus e C. albicans foi estabelecida usando os modelos de interface sólido-ar por 24 h em SCFM2. Os biofilmes foram tratados com uma faixa de concentrações de (A) meropenem ou (B) tobramicina de 0,125 μg / mL a 64 μg / mL, juntamente com um controle sem antibióticos. A UFC/mL de cada biofilme foi determinada. P. aeruginosa As UFC foram determinadas em PIA e convertidas em porcentagem de sobrevida usando o controle negativo como 100% de sobrevida. As barras de erro denotam desvio padrão e cada ponto de dados é derivado de 3 repetições biológicas, cada uma com três repetições técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Variação na atividade metabólica de biofilmes de P. aeruginosa na presença de meropenem ou tobramicina cultivados no modelo de interface sólido-ar. P. aeruginosa Os biofilmes PAO1 foram cultivados em SCFM2 no modelo de interface sólido-ar, e uma faixa de concentrações de (A) meropenem ou (B) tobramicina de 0,125 μg/mL a 64 μg/mL foram adicionadas junto com um controle sem antibióticos. A placa foi lida fluorescentemente com excitação de 540 nm e emissão de 590 nm a cada 30 min. A porcentagem de atividade metabólica foi calculada determinando a porcentagem dessa atividade em cada amostra tratada com antibióticos em comparação com o controle sem antibióticos. As barras de erro denotam desvio padrão e cada ponto de dados é derivado de 3 repetições biológicas, cada uma com três repetições técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Impacto nas contagens totais de UFC de P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans recuperados do modelo de interface sólido-ar polimicrobiano após tratamento antimicrobiano. S. aureus e C. albicans foram cultivados em SCFM2 no modelo de interface sólido-ar. P. aeruginosa foi adicionado e uma faixa de concentrações de 0,125 μg / mL a 64 μg / mL de (A) meropenem ou (B) tobramicina foram adicionadas aos biofilmes juntamente com um controle sem antibióticos. A UFC/mL de cada biofilme foi determinada. As barras de erro denotam desvio padrão, e cada ponto de dados foi derivado de 3 repetições biológicas, cada uma com três repetições técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Estabelecimento e fluxo de trabalho do modelo de interface sólido-ar. Representação gráfica do estabelecimento do modelo de interface de ar sólido, interrupção de biofilme e saídas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo de biofilme descrito aqui nos permite imitar alguns aspectos do ambiente de infecção pulmonar da FC, incorporando uma variedade de interações polimicrobianas comuns de uma maneira mais acessível do que os métodos de teste antimicrobiano in vitro usados atualmente, como o reator CDC e o modelo de biofilme de Lubbock31. Isso é importante quando uma série de fatores, incluindo as propriedades físicas do biofilme, disponibilidade de nutrientes e interações moleculares entre as espécies dentro do biofilme, podem afetar tanto a atividade do agente antimicrobiano quanto a resposta dos micróbios ao antimicrobiano21. Ao incorporar esses fatores, conseguimos desenvolver um modelo altamente versátil que pode permitir com mais precisão a previsão dos resultados do tratamento antimicrobiano do que os modelos atuais que não consideram os fatores acima mencionados.

P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans foram escolhidos como Gram-positivos, Gram-negativos e fungos representativos comumente isolados na FC32. No entanto, também conseguimos mostrar que este modelo pode ser usado para uma variedade de outros micróbios relevantes para a FC, incluindo Burkholderia cenocepacia, Burkholderia multivorans, Aspergillus fumigatus, e atualmente está sendo adaptado para uso com bactérias anaeróbicas como Prevotella melaninogenica. Isso demonstra a versatilidade do modelo, pois uma ampla gama de micróbios pode ser incorporada, destacando a adaptabilidade desse modelo para testes antimicrobianos contra uma ampla gama de patógenos microbianos. O modelo também pode ser facilmente adaptado a uma variedade de condições ambientais para testes de sensibilidade antimicrobiana mais personalizados, incluindo a substituição de SCFM2 pelo escarro do paciente.

A consideração de modelos de biofilme polimicrobiano para o teste de novos antimicrobianos também é fundamental, pois eles podem cobrir uma lacuna existente no pipeline de desenvolvimento de antimicrobianos antes de seu uso em estudos com animais ou humanos33,34. Além disso, o modelo mantém um rendimento relativamente alto e permite uma variedade de resultados relevantes para a indústria e a pesquisa.

Embora tenhamos exemplificado apenas UFC e atividade metabólica neste artigo de métodos, também demonstramos a utilidade do modelo na análise do exometaboloma de biofilme usando espectrometria de massa de análise de superfície de extração líquida (LESA). Isso permite sondar alguns dos mecanismos moleculares subjacentes à tolerância antimicrobiana35. Além desses outros resultados, também demonstramos o uso desse modelo para testar novos sistemas de administração de antimicrobianos. Estes incluem conjugados de polímero-ciprofloxacina para aumentar a penetração desse antibiótico no biofilme, aumentando sua atividade e reduzindo o desenvolvimento de resistência36.

Etapas e considerações críticas
É importante manter a esterilidade, especialmente na produção de SCFM2 e meios, pois a contaminação pode resultar na introdução de espécies não naturais, o que pode interferir nos resultados. Diferentes cepas do mesmo micróbio e diferentes micróbios podem exigir diferentes condições ambientais para o crescimento ou podem ter características de crescimento variadas. Portanto, o modelo deve ser otimizado antes de realizar qualquer teste de sensibilidade a antibióticos. Recomendamos a realização de um pequeno estudo piloto de 24 h e 48 h para monoespécies e biofilme polimicrobiano para avaliar o crescimento em condições de modelo padrão. Descobrimos que diferentes cepas de P. aeruginosa e certas concentrações de antibióticos podem induzir o enxame do disco de policarbonato. Isso pode ser facilmente superado usando discos de tamanho maior que estão disponíveis comercialmente. A interrupção do biofilme também pode exigir otimização, dependendo do batedor de esferas e dos micróbios usados. Otimizamos o método de interrupção determinando a UFC/mL de uma amostra conhecida antes e depois do batimento do cordão. Também usamos microscopia para visualizar as amostras de batimento de esferas para visualizar o quão bem o biofilme foi interrompido.

Uma das limitações desse modelo de biofilme que imita a FC é a fixação a uma superfície sólida contendo policarbonato, que não é encontrado no pulmão da FC, em vez de serem agregados flutuantes dentro do escarro da FC37 . No entanto, o modelo de ágar sólido apresentado aqui exclui a necessidade de lavar os biofilmes para remover micróbios planctônicos e garante que os resultados incluam apenas micróbios derivados do biofilme, em oposição a uma cultura mista de biofilme planctônico. Também descobrimos que a penetração de alguns antibióticos nas áreas mais profundas desse modelo de biofilme pode ser reduzida, e o uso de DNase pode ser necessário para alterar a reologia da matriz extracelular e diminuir as interações eletrostáticas com o eDNA.

Acreditamos que o modelo é altamente adequado para testes antimicrobianos devido à sua versatilidade, adaptabilidade e inclusão de fatores ambientais que muitos modelos existentes não levam em consideração. Seu uso em pesquisa fundamental e testes pré-clínicos de sensibilidade antimicrobiana pode fornecer uma abordagem clinicamente mais relevante para AST de amostras clínicas e o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Divulgações

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Nenhum conflito de interesse ou interesse financeiro concorrente é declarado para este trabalho.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo National Biofilms Innovation Centre (NBIC), que é um Centro de Inovação e Conhecimento financiado pelo Biotechnology and Biological Sciences Research Council, Innovate UK e Hartree Centre [Awards BB/R012415/1 e BB/X002950/1] e pelo UK CF Trust e USA CF Foundation Strategic Research Centre: 'Uma estrutura pré-clínica baseada em evidências para o desenvolvimento de terapêuticas antimicrobianas na fibrose cística' (PIPE-CF) [Prêmio SRC022].

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 µ L  loops de inoculação 
13 mm 0,2 µ Discos de Policarbonato de Tamanho M pore Isoporo GTTP01300Discos maiores também estão disponíveis 
Tubos reforçados de 2 mL Thermofisher 
contas de cerâmica de 2,5 mL Qiagen13114-325
500 mL de vidro borossilicato Garrafa DuranSigma Aldrich Z305197garrafas maiores disponíveis em volumes maiores são desejadas
Placas de cultura de 6 poçosGreiner657165
7 mL BijouThermofisher 129B
Thermofisher 167008para diluições seriadas em ensaio de UFC
Placas de ágar para preparação de placas de P. aerugnisa, S. aureus, e C. albicansLB miller para P. aeruginosa e S. aureus e ágar Sabouraud dextrose para C. albicans 
Batedor de contas - adequado para tubos de 2 mLFisherbrand 15515799Centrífuga de bancada Thermofisher 24 para moinho de contas
 deve ser capaz de pelo menos 8000 x g
Placas pretas de fundo transparente de 96 poçosCostar 3603
Queimador de Bunsen 
Recipientes para descarte de equipamentos e materiais contaminados de acordo com os regulamentos de saúde e segurança do instituto. 
água desionizada 
eDNA Sigma Aldrich 31149
Unidade de filtro Marca Fisher FB12566504Intercambiável dependendo da bomba de vácuo usada, mas deve ter um tamanho de poro de 0,2 µ m
Hemocitômetro e lamínulaHawksley HC001podem diferir em tamanho e volume. Verifique e ajuste os cálculos de UFC de acordo 
LB caldo oxóide 1.46813
Ágar sal de manitolOxóide 
meropenemabcrAb243429
Mucina de estômago suíno Tipo IISigma Aldrich M2378
NistatinaMillipore 
placas de Petri SLSSLS2000
solução salina tamponada com fosfato 
Pseudomonas isolamento agarMillipore 17208
Sal de sódio de resazurinaSigma Aldrich 
ágar Sabouraud dextrose Oxóide CM0041
seleção de pinças pinça de ponta fina e tecido com dentes para transferência de esferas de cerâmica
pipeta
e incubadoras estáticas deve ser controlado por temperatura
Leitor de placas de microtitulação SparksTecan Para o ensaio de Resazurina, o leitor de placas de microtitulação deve ter os filtros apropriados ou ser um monocromador para detectar a fluorescência.
espectrofotômetro
Ágar Técnico (Ágar Técnico No.2 )Oxoid LP0012B 
tetraciclinaSigma Aldrich Reticulador UV T7660
 Espectrolina 11-992-89
bomba de vácuo/ balãoFisherbrand 
banho-maria deve ser capaz de manter 55 &graus; C
YPD caldo Millipore Y1375 Pode ser comprado pré-fabricado ou feito com os ingredientes básicos
15545809Placas de 96 poços Os hemocitômetros CM0085B1003352658199303 agitação de sorológicaFB12566504

Referências

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