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Artigo de método

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

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DOI:

10.3791/67218

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5 de julho de 2024

 ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota, 2Graduate Program in Molecular, Cellular, Developmental Biology and Genetics, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Resumo

O desenvolvimento e a regeneração ocorrem por um processo de interações celulares espaço-temporais dinâmicas geneticamente codificadas. O uso de transplante de células entre animais para rastrear o destino celular e induzir incompatibilidades nas propriedades genéticas, espaciais ou temporais das células doadoras e hospedeiras é um meio poderoso de examinar a natureza dessas interações. Organismos como pintinhos e anfíbios fizeram contribuições cruciais para nossa compreensão do desenvolvimento e da regeneração, respectivamente, em grande parte devido à sua receptividade ao transplante. O poder desses modelos, no entanto, tem sido limitado pela baixa tratabilidade genética. Da mesma forma, os principais organismos modelo genéticos têm menor receptividade ao transplante.

O peixe-zebra é um importante modelo genético para desenvolvimento e regeneração e, embora o transplante de células seja comum no peixe-zebra, geralmente é limitado à transferência de células indiferenciadas nos estágios iniciais de desenvolvimento da blástula e da gástrula. Neste artigo, apresentamos um método simples e robusto que estende a janela de transplante de peixe-zebra para qualquer estágio embrionário ou larval entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização. A precisão dessa abordagem permite o transplante de apenas uma célula com resolução espacial e temporal quase perfeita em animais doadores e hospedeiros. Embora destaquemos aqui o transplante de neurônios embrionários e larvais para o estudo do desenvolvimento e regeneração nervosa, respectivamente, essa abordagem é aplicável a uma ampla gama de tipos de células progenitoras e diferenciadas e questões de pesquisa.

Introdução

O transplante de células tem uma longa e célebre história como uma técnica fundamental na biologia do desenvolvimento. Por volta da virada doséculo 20, abordagens que usam manipulações físicas para perturbar o processo de desenvolvimento, incluindo o transplante, transformaram a embriologia de uma ciência observacional em uma ciência experimental 1,2. Em um experimento histórico, Hans Spemann e Hilde Mangold transplantaram ectopicamente o lábio dorsal do blastóporo de um embrião de salamandra para o lado oposto de um embrião hospedeiro, induzindo o tecido próximo a formar um eixo secundáriodo corpo 3. Este experimento mostrou que as células poderiam induzir outras células a adotar certos destinos e, posteriormente, o transplante se desenvolveu como um método poderoso para interrogar questões críticas na biologia do desenvolvimento em relação à competência e determinação do destino celular, linhagem celular, capacidade indutiva, plasticidade e potência das células-tronco 1,4,5.

Avanços científicos mais recentes expandiram o poder da abordagem de transplante. Em 1969, a descoberta de Nicole Le Douarin de que a coloração nucleolar poderia distinguir espécies de origem em quimeras de codornas permitiu o rastreamento de células transplantadas e sua progênie6. Esse conceito foi posteriormente sobrecarregado pelo advento de marcadores fluorescentes transgênicos e técnicas avançadas de imagem5, e foi aproveitado para rastrear o destino celular 6,7, identificar células-tronco e sua potência 8,9 e rastrear movimentos celulares durante o desenvolvimento do cérebro10. Além disso, o surgimento da genética molecular facilitou o transplante entre hospedeiros e doadores de genótipos distintos, apoiando a dissecção precisa de funções autônomas e não autônomas de fatores de desenvolvimento11.

O transplante também fez contribuições importantes para o estudo da regeneração, particularmente em organismos com fortes habilidades regenerativas, como planárias e axolotes, elucidando as identidades e interações celulares que regulam o crescimento e a padronização dos tecidos em regeneração. Estudos de transplante revelaram princípios de potência12, padronização espacial13,14, contribuições de tecidos específicos15,16 e papéis da memória celular12,17 na regeneração.

O peixe-zebra é um dos principais modelos de vertebrados para o estudo do desenvolvimento e regeneração, inclusive no sistema nervoso, devido aos seus programas genéticos conservados, alta tratabilidade genética, fertilização externa, grande tamanho da ninhada e clareza óptica 18,19,20. O peixe-zebra também é altamente passível de transplante nos estágios iniciais de desenvolvimento. A abordagem mais proeminente é o transplante de células de um embrião de doador marcado para um embrião hospedeiro no estágio de blástula ou gástrula para gerar animais em mosaico. As células transplantadas durante o estágio de blástula se espalham e se dispersam quando a epíboa começa, produzindo um mosaico de células e tecidos marcados em todo o embrião21. Os transplantes de gástrula permitem algum direcionamento das células transplantadas de acordo com um mapa de destino aproximado, à medida que o escudo se forma e os eixos AP e DV podem ser determinados21. Os mosaicos resultantes foram valiosos para determinar se os genes agem de forma autônoma nas células, testando o comprometimento celular e mapeando o movimento do tecido e a migração celular ao longo do desenvolvimento 5,11. O peixe-zebra mosaico pode ser gerado de várias maneiras, incluindo eletroporação22, recombinação23 e transgênese F024 e mutagênese25, mas o transplante fornece a maior manipulabilidade e precisão no espaço, tempo e número e tipos de células. O estado atual do transplante de peixe-zebra é amplamente restrito a células progenitoras em estágios iniciais, com algumas exceções, incluindo transplante de neurônios motores espinhais26,27, células ganglionares da retina28,29 e células da crista neural nas primeiras 10-30 h após a fertilização (hpf) 30 e de células hematopoiéticas e tumorais em peixes-zebra adultos 5,31. Expandir os métodos de transplante para uma ampla gama de idades, estágios de diferenciação e tipos de células aumentaria muito o poder dessa abordagem para fornecer informações sobre os processos de desenvolvimento e regeneração.

Aqui, demonstramos uma técnica flexível e robusta para transplante de células de alta resolução eficaz em embriões e larvas de peixe-zebra até pelo menos 7 dias após a fertilização. Peixes hospedeiros e doadores transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em tecidos-alvo podem ser usados para extrair células únicas e transplantá-las com resolução espacial e temporal quase perfeita. A clareza óptica dos embriões e larvas de peixe-zebra permite que as células transplantadas sejam visualizadas ao vivo à medida que o animal hospedeiro se desenvolve ou se regenera. Essa abordagem foi usada anteriormente para examinar como a dinâmica da sinalização espaço-temporal influencia a identidade neuronal e a orientação do axônio no embrião32 e para examinar a lógica pela qual fatores intrínsecos e extrínsecos promovem a orientação do axônio durante a regeneração em larvasde peixes 33. Embora nos concentremos aqui no transplante de neurônios diferenciados, nosso método é amplamente aplicável a tipos de células indiferenciadas e diferenciadas em muitos estágios e tecidos para abordar questões de desenvolvimento e regeneração.

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Protocolo

Todos os aspectos deste procedimento que dizem respeito ao trabalho com peixes-zebra vivos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota (IACUC) e são realizados em conformidade com as diretrizes da IACUC.

1. Configuração inicial única do aparelho de transplante (Figura 1)

  1. Monte o microscópio de transplante de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Este protocolo usa um microscópio de fluorescência vertical com uma objetiva de imersão em água de 40x.
  2. Monte os micromanipuladores grossos e finos e monte-os no lado direito do microscópio de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Como é importante que o estágio não se mova na dimensão Z em relação à agulha, usamos um microscópio de estágio fixo com os micromanipuladores montados na base do microscópio. Se um microscópio de platina fixa não estiver disponível, o micromanipulador pode ser montado na platina.
  3. Conecte o suporte do microeletrodo à alça do eletrodo e monte no micromanipulador.
  4. Conecte um lado da torneira de três vias à bomba de microsseringa. Conecte o outro lado da torneira ao tubo de polietileno usando o adaptador de cromatografia.
  5. Conecte o lado oposto do tubo de polietileno ao suporte do microeletrodo usando o adaptador de cromatografia.
  6. Encha a seringa do reservatório de 10 mL com óleo mineral leve e monte-a na parte superior da torneira.
  7. Encha a bomba de microsseringa e a tubulação (a linha hidráulica) com óleo mineral do reservatório, certificando-se de remover todas as bolhas de ar.
    NOTA: Uma vez que o aparelho esteja configurado, ele exigirá apenas manutenção ocasional da linha hidráulica. A seringa do reservatório pode ser removida e recarregada com óleo mineral, conforme necessário.

2. Prepare empurradores de embriões.

  1. Corte um pedaço de linha de pesca de 2 cm e insira-o parcialmente na extremidade estreita de uma ponta de pipeta P1000, deixando ~ 1.5 cm exposto. Prenda a linha de pesca com uma pequena gota de supercola e deixe secar.

3. Prepare soluções.

  1. Para preparar 1% de acarose de baixo ponto de fusão dissolvida em meio embrionário (LMA), dissolva a agarose em meio embrionário fervente34. Faça alíquotas de 1-2 mL em tubos de ensaio de fundo redondo e armazene a 4 °C.
  2. Prepare a solução de Ringer com penicilina-estreptomicina e tricaína (RPT) combinando os seguintes ingredientes em concentrações finais de 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,2, 50 unidades/mL de penicilina e 50ug/mL de estreptomicina, mexendo até dissolver e passando por um filtro a vácuo. Armazene em temperatura ambiente. Adicione tricaína imediatamente antes de usar a uma concentração de 0,02%.

4. Preparar os animais doadores e hospedeiros para transplante.

  1. Crie animais hospedeiros e doadores com os genótipos apropriados e com células de interesse marcadas com fluorescência, até a idade desejada.
    NOTA: Para esses transplantes, usamos animais doadores Tg(isl1:EGFPCAAX)fh474 32 e Tg(isl1:mRFP)fh1 animais hospedeiros35 e neurônios transplantados do doador para o hospedeiro de núcleos motores vagos em 3dpf.
  2. Prepare as lâminas de transplante aplicando um contorno retangular de esmalte transparente em cada lâmina de vidro (Figura 2A). O esmalte cria uma barreira hidrofóbica para segurar no RPT adicionado na etapa 4.8. Deixe secar completamente antes de usar.
    NOTA: Os slides podem ser preparados com antecedência e armazenados indefinidamente.
  3. Derreta uma alíquota de LMA colocando um tubo de LMA em um béquer de 50mL contendo 40mL de água e leve ao micro-ondas por 1 min a 50% da potência ou até derreter. Mantenha a LMA a 40 °C em um aquecedor de banho seco.
  4. Descorione os animais hospedeiros e doadores com fórceps (se aplicável) e anestesiá-los colocando-os em pequenas placas de Petri cheias de RPT em temperatura ambiente. Aguarde 5 minutos para que os animais sejam totalmente anestesiados antes de prosseguir.
  5. Monte o doador individual e os animais hospedeiros: Usando a pipeta Pasteur e a bomba de pipeta, transfira os animais do RPT para o LMA e, em seguida, transfira os animais em pequenas gotas de LMA para lâminas dentro do contorno do esmalte. Minimize a quantidade de RPT transferida para o LMA para que o LMA não se dilua. Antes que a ML se solidifique, use um empurrador de embriões para orientar os animais, garantindo que cada animal seja montado com o local de inserção da agulha pretendido para a direita e que todos os animais estejam alinhados verticalmente (Figura 2B); Deixe a agarose endurecer completamente (~5 min) antes de prosseguir.
    NOTA: Como muitas células podem ser retiradas de cada animal doador, é mais eficiente montar de 2 a 4 animais hospedeiros com um doador em cada lâmina.
  6. Usando um bisturi, corte uma fatia vertical reta em todas as gotas de agarose à direita dos animais montados (Figura 2C). Remova a agarose solta da lâmina com lenços umedecidos.
  7. Usando um bisturi, corte cunhas da agarose para expor o local de inserção da agulha (Figura 2C). Remova a agarose solta da lâmina com lenços umedecidos.
  8. Aplique RPT na lâmina até que as gotas de agarose estejam totalmente submersas (Figura 2D).
  9. Monte a lâmina preparada no microscópio de transplante. Coloque o animal doador em foco sob o objetivo de 40x. Para fazer isso, abaixe a objetiva até que ela quebre a superfície da mídia e, em seguida, levante a objetiva para o plano focal desejado.
    NOTA: O contato com o líquido pela objetiva deve ser mantido até que o transplante seja concluído (Figura 3C).
  10. Colocar em foco a(s) célula(s) doadora(s) marcada(s) com fluorescência de interesse; Em seguida, mova o estágio para a esquerda em preparação para localizar a agulha de transplante.
    NOTA: Neste ponto, não ajuste o microscópio nos eixos Y ou Z, para garantir que você possa reencontrar facilmente o animal doador na seção 5.

5. Prepare a agulha de transplante.

  1. Insira uma micropipeta no extrator de micropipetas e puxe uma agulha de microinjeção.
    NOTA: O formato da agulha deve ser semelhante ao usado para injeções de embriões de peixe-zebra em estágio de 1 célula ou fixação de remendos. Usamos um extrator de micropipeta com o seguinte programa: PRESSÃO = 500, CALOR = rampa + 80, TRAÇÃO = 90, VELOCIDADE = 70, TEMPO = 250 (consulte a Tabela de Materiais), embora as configurações corretas para cada extrator provavelmente precisem ser determinadas empiricamente.
  2. Alinhe a ponta da agulha com as divisões do micrômetro de platina sob um escopo de dissecação. Usando o micrômetro como guia de medição, use uma pinça afiada para quebrar a agulha em um tamanho de furo ligeiramente maior que o diâmetro das células de interesse (Figura 3A). Certifique-se de que a quebra esteja o mais limpa possível, pois as bordas irregulares podem contribuir para o entupimento da agulha. NOTA: Para neurônios motores vagos (5-7 μm de diâmetro), as agulhas devem ser quebradas para um diâmetro interno de 10 μm, o que corresponde a um diâmetro externo de 20 μm. Se necessário, o tamanho, a forma e/ou o ângulo da ponta da agulha podem ser refinados com uma microforja ou micromoedor36.
  3. Usando uma seringa de 50 mL cheia de óleo mineral leve e equipada com um enchimento de pipeta, encha completamente a agulha com óleo mineral (Figura 3B). Certifique-se de que não haja bolhas de ar. Deixe a agulha cheia de lado até que esteja pronta para montagem.
    NOTA: Para garantir que não haja bolhas de ar, insira o enchimento da pipeta totalmente na agulha e libere o óleo enquanto puxa lentamente o enchimento para fora da agulha.
  4. No aparelho de transplante, gire a torneira de três vias para que seu braço longo fique voltado para a bomba de microsseringa e pressione o êmbolo da seringa do reservatório para liberar todas as bolhas de ar da linha hidráulica. Mantenha uma leve pressão no êmbolo (para evitar o refluxo de ar para a linha) e gire a torneira de três vias de modo que seu braço longo fique voltado para a seringa do reservatório.
  5. Insira a agulha no suporte, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Ajuste o ângulo da agulha de modo que ela fique voltada diretamente para a esquerda em um ângulo de 10-15° da horizontal (Figura 3C).
  6. Use os micromanipuladores grossos e finos para manobrar a ponta da agulha sob a objetiva do microscópio e colocá-la em foco (Figura 3D).
    NOTA: O posicionamento grosseiro da agulha nos planos X e Y pode ser feito observando diretamente a área abaixo da objetiva enquanto você manobra a agulha, pois a agulha refletirá o feixe de luz transmitido quando estiver posicionada sob a objetiva. As oculares do microscópio podem então ser usadas para posicionamento fino. Não ajuste a posição da platina do microscópio ou o foco durante esta etapa. Use os micromanipuladores para colocar a ponta da agulha na posição focal existente.
  7. Se o líquido estiver fluindo para dentro ou para fora da ponta da agulha, ajuste a pressão usando a bomba de seringa até que um menisco estável entre o óleo mineral e a solução de Ringer seja observado (Figura 3D).
    NOTA: Se uma bolha de óleo permanecer na ponta da agulha após a estabilização, ela pode ser removida usando o ajuste do plano X no micromanipulador grosso para mover a agulha para a direita até que sua ponta seja retirada do RPT e, em seguida, de volta para a esquerda até que seja reposicionada sob a objetiva.

6. Transplante

NOTA: Todos os movimentos da agulha devem ser feitos usando o micromanipulador fino para esta seção.

  1. Mova o palco para a direita até que o animal doador seja trazido de volta à vista, tomando cuidado para evitar a penetração acidental com a agulha.
  2. Centralize novamente e concentre-se nas células a serem transplantadas e alinhe a agulha com as células do lado de fora do animal (Figura 4A).
    NOTA: Pode ser necessário alternar entre campo claro e fluorescência com frequência para garantir o alinhamento adequado. O uso de um filtro de densidade neutra pode ajudar na visualização de ambos simultaneamente.
  3. Insira a agulha no animal doador.
    NOTA: Movimentos repetidos para dentro e para fora com a agulha podem ajudar a penetrar na pele.
  4. Reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa, conforme descrito na etapa 5.7.
  5. Posicione a ponta da agulha contra as células de interesse e aplique uma sucção suave com a bomba de microsseringa (Figura 4B).
    NOTA: Movimentos suaves de entrada e saída durante a sucção podem ajudar a soltar as células.
  6. Quando um número adequado de células tiver sido absorvido, remova a agulha do doador e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
  7. Tomando cuidado para evitar o contato com animais ou agarose com a agulha, reposicione o palco para trazer o primeiro animal hospedeiro à vista.
  8. Centralize e concentre-se na área em que as células devem ser colocadas e alinhe a agulha com essa região fora do animal (Figura 4C).
  9. Insira a agulha no animal hospedeiro e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
  10. Posicione a ponta da agulha no local de deposição e aplique uma leve pressão com a bomba de microsseringa até que o número correto de células doadoras seja liberado da agulha (Figura 4D).
    NOTA: Se as células doadoras e hospedeiras forem marcadas com fluoróforos diferentes, um filtro multibanda para permitir a visualização simultânea pode ser muito útil neste estágio.
  11. Remova a agulha do hospedeiro e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
  12. Repita as etapas 6.7 a 6.11 para todos os hosts restantes.

7. Recuperação do animal hospedeiro

  1. Levante a objetiva de 40x e use o micromanipulador grosso para manobrar a agulha de volta à posição de carregamento.
    NOTA: A agulha pode ser reutilizada para várias lâminas.
  2. Remova a lâmina do microscópio de transplante e coloque-a sob um microscópio de dissecação.
  3. Desmonte os animais hospedeiros removendo-os cuidadosamente da queda do LMA com uma pinça. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, transfira os animais hospedeiros para um prato com solução de Ringer fresca com penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que os animais se recuperem da anestesia e mantenha-os em uma incubadora de embriões até que estejam prontos para a imagem. Eutanásia dos animais doadores de acordo com os protocolos aprovados.
    NOTA: Nosso método de eutanásia é imergir os animais em um banho de gelo por pelo menos 1 hora, seguido de imersão em hipoclorito de sódio 500 mg/L.

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Resultados

Os resultados dos experimentos de transplante são observados diretamente pela visualização de células doadoras marcadas com fluorescência em animais hospedeiros em pontos apropriados após o transplante usando um microscópio de fluorescência. Aqui, transplantamos neurônios vagos anteriores individuais a 3 dpf. Os animais hospedeiros foram então incubados por 12 ou 48 h, anestesiados, montados em ML em uma lamínula de vidro e fotografados com um microscópio confocal (Figura 5). Às 12 h após o ...

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Discussão

A biologia do desenvolvimento e regenerativa há mais de um século depende de experimentos de transplante para examinar os princípios de sinalização celular e determinação do destino celular. O modelo do peixe-zebra já representa uma poderosa fusão de abordagens genéticas e de transplante. O transplante nos estágios de blástula e gástrula para gerar animais em mosaico é comum, mas limitado em quais tipos de questões pode abordar. O transplante em estágio avançado é raro, embora métodos pa...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Cecilia Moens pelo treinamento em transplante de peixe-zebra; Marc Tye pelo excelente cuidado com os peixes; e Emma Carlson pelo feedback sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NS121595 de concessão do NIH para AJI

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 mL "seringa de reservatório"Fisher Scientific14-955-459
Filtro de vácuo descartável de 150 mL, .2 µ m, PESCorning431153
bloco de aquecimento de 20 x 12 mmCorning480122
torneira de 3 viasBraun Medical Inc.
3 x 1 Corrediça de vidro foscoVWR48312-004
40x objetiva de imersão em águaNikonMRD07420
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma-AldrichC3306
Manipulador grosseiroNarishigeMN-4
Bomba de microsseringa personalizadaUniversidade de OregonN / AFabricado pela oficina mecânica da Universidade de Oregon (tsa.uoregon@gmail.com). Uma alternativa comercialmente disponível está listada abaixo.
Dumont #5 FórcepsFine Science Tools1129500
Eclipse FN1 "Microscópio de Transplante"NikonN/A
cabo de eletrodoPrecision Instruments5444
Lâmina Cirúrgica Estéril de Penas, #11VWR21899-530
Micromanipulador fino, Hidráulico de óleo de três eixos NarishigeMMO-203
HEPES pH 7.2Sigma-AldrichH3375-100G
Cabo de bisturi de alta precisão #3Fisher Scientific12-000-163
Pipeta Pasteur de Borosilicato Descartável Kimble, Ponta Larga, 5.75 inDWK Life Sciences63A53WT
Adaptador de Cromatografia KIMBLE DWK Life Sciences420408-0000
KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Óleo Mineral LeveSigma-AldrichM3516-1L
LSE, 1 bloco, 120 VBomba6875SB
World Precision InstrumentsMMPAlternativa comercial à bomba de microsseringa personalizada
Suporte de MicroeletrodoWorld Precision InstrumentsMPH310
MicroFil Pipeta FillerWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
EsmalteUnhas Eletrônica Microscopia Sciences72180
Água livre de nucleaseVWR82007-334
P-97 Tipo Flamejante/Marrom Micropipeta ExtratorSutter InstrumentsP-97
Penicilina-estreptomicinaSigma-Aldrichp4458-100ML5.000 unidades de penicilina e 5 mg de estreptomicina/mL
bomba de pipeta 10 mLBel-Art37898-0000
Cloreto de potássioSigma-AldrichP3911
Professional Super GlueLoctiteLOC1365882
Tubosde ensaio de poliestireno de fundo redondoFalcon352054
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888
Micrômetro de estágioMeiji Techno AmericaMA285
Seringas sem agulha, 50 mLBD Medical309635
Tricaine MethanosulfonateSyndel USASYNCMGAUS03
Trilene XL linha de pesca de fundição suaveBerkleyXLFS6-15
Tubos, polietileno nº 205BD Medical427445
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
Micropipetas calibradas Wiretrol IIDrummond50002010
455991 World Aquecedor de banho seco digital de microsseringa manual Corning de

Referências

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