O sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta útil para estudar vários processos biológicos, particularmente doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, a quantificação manual de fenótipos de olhos ásperos pode ser tendenciosa e não confiável. Aqui descrevemos um método pelo qual ilastik e Flynotyper são usados para quantificar o fenótipo ocular de forma imparcial.
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Artigo de método
Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O olho composto de Drosophila melanogaster é uma matriz bem estruturada e abrangente de cerca de 800 omatídeos, exibindo um padrão simétrico e hexagonal. Essa regularidade e facilidade de observação tornam o sistema ocular da Drosophila uma ferramenta poderosa para modelar várias doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, as formas de quantificar fenótipos anormais, como a classificação manual dos escores de gravidade ocular, têm limitações, especialmente ao classificar alterações fracas na morfologia ocular. Para superar essas limitações, abordagens computacionais foram desenvolvidas, como o Flynotyper. O uso de um anel de luz permite melhores imagens qualitativas acessando a integridade dos omatídeos individuais. No entanto, essas imagens não podem ser analisadas diretamente pelo Flynotyper devido às sombras nos omatídeos introduzidas pelo anel de luz. Aqui, descrevemos uma maneira imparcial de quantificar os fenótipos oculares ásperos observados em modelos de doença de Drosophila , combinando dois softwares, ilastik e Flynotyper. Ao pré-processar as imagens com ilastik, a quantificação bem-sucedida do fenótipo do olho rugoso pode ser alcançada com o Flynotyper.
Introdução
O genoma de Drosophila melanogaster contém ~ 75% dos ortólogos de genes relacionados a doenças humanas. Além disso, durante o desenvolvimento do olho da Drosophila, aproximadamente dois terços dos genes do genoma são expressos, tornando o olho da Drosophila um excelente sistema genético para investigar várias funções moleculares e celulares, desenvolvimento e modelos de doenças 1,2. Assim, o sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta experimental útil para estudar vários processos biológicos.
O olho composto de Drosophila é uma matriz bem estruturada e abrangente de ~ 800 omatídeos que exibem um padrão simétrico e hexagonal3. A regularidade desse padrão hexagonal pode ser usada para estimar o efeito da introdução de mutações e alterações na expressão gênica na morfologia do olho4. Estudos anteriores que requerem avaliação da morfologia ocular basearam-se fortemente na classificação manual da gravidade dos fenótipos oculares detectados a olho nu. Para classificar os fenótipos oculares, as imagens da morfologia externa do olho são obtidas por um estereomicroscópio 5,6. O fenótipo ocular de cada grupo é avaliado dividindo o olho externo em quatro áreas e calculando a proporção de degeneração em cada área 5,6. Em seguida, os valores são usados para calcular médias que são comparadas com os valores obtidos das moscas controle7. A pontuação é baseada na extensão da fusão, perda de omatídeos e organização das cerdas 7,8. Fotos de olhos de moscas tiradas com um estereomicroscópio são adquiridas por um pesquisador, e a análise do fenótipo do olho é realizada por outro pesquisador com conjuntos de validação triplos 7,8.
Quando se trata de classificar alterações fracas na morfologia do olho a olho nu, existem limitações4. Para superar essas limitações, abordagens computacionais como FLEYE e Flynotyper foram desenvolvidas 1,9. Flynotyper é um novo método computacional para estimar quantitativamente mudanças morfológicas no sistema ocular de Drosophila1. Ele detecta automaticamente o olho da Drosophila e o omatídio individual, calculando as pontuações fenotípicas (P-Scores) com base na irregularidade doolho1. Um P-Score mais alto indica que o olho da mosca está mais degenerado. Este software foi usado com sucesso na quantificação da anormalidade dos olhos de Drosophila 10. Embora o Flynotyper garanta um processo automatizado, ele ainda não pode ser aplicado com sucesso a algumas imagens oculares tiradas por vários métodos de microscopia de luz.
Qualitativamente, preferimos uma fonte de luz de anel em comparação com uma fonte de luz de ponto único, pois oferece uma representação mais precisa de cada omatídio. No entanto, quando o anel de luz é usado, ele gera uma sombra em forma de anel no topo de cada omatídio devido à forma hemisférica do omatídio. Essa sombra em forma de anel inibe a detecção omatídica precisa pelo Flynotyper, levando ao cálculo incorreto dos P-Scores.
Para superar esses problemas, implementamos o ilastik, uma ferramenta baseada em aprendizado de máquina para várias análises, para classificar omatídeos em imagens de olhos de mosca11. Em seguida, alimentamos as imagens geradas pelo ilastik no Flynotyper para calcular os P-Scores. Isso nos permite quantificar os defeitos morfológicos do olho da Drosophila de forma imparcial1.
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Protocolo
1. Preparação para quantificação
- Baixe e instale o ilastik11, ImageJ e o plug-in ImageJ Flynotyper1. Consulte a Tabela de Materiais para obter links de sites para instalação. Baixe os pacotes apropriados de acordo com o sistema operacional do computador (Mac, Windows, Linux, etc). Siga as instruções de instalação exatamente como indicado.
NOTA: Seguir as instruções exatamente como indicado nos links fornecidos é imperativo. O computador usado precisa de um sistema operacional de 64 bits; caso contrário, não há outras especificações necessárias. Consulte a Tabela de Materiais para obter as especificações do computador do sistema usado para este protocolo. - Use uma imagem padrão para treinar o modelo de aprendizado de máquina. Tire uma imagem de um olho de mosca saudável usando um microscópio de luz com um anel de luz (como w1118 x GMR-GAL4), usando o centro do olho como ponto focal. Analise machos e fêmeas separadamente; portanto, adquira uma imagem padrão para homens e mulheres.
NOTA: As configurações variam muito dependendo do microscópio e da câmera. Consulte o segundo parágrafo da discussão para obter informações mais gerais sobre a preparação da mosca e aquisição de imagens. - Tire imagens dos olhos experimentais da mosca usando as mesmas configurações usadas para a aquisição de imagem padrão.
NOTA: Uma boa orientação é fundamental para uma quantificação precisa. Veja a Figura 4 como um exemplo de orientação adequada.
2. Usando ilastik para detectar omatídeos de imagens de olhos de mosca
- Antes de iniciar a análise, certifique-se de que todos os grupos experimentais, independentemente da condição experimental, estejam na mesma pasta de arquivos para facilitar os processos a seguir. Certifique-se de que os arquivos sejam nomeados adequadamente para identificar grupos experimentais e distinguir entre homens e mulheres.
NOTA: Recomendamos imprimir o protocolo e usar o computador para ampliar as figuras, pois esse protocolo é mais facilmente seguido visualmente. - Abra o software.
NOTA: É aconselhável não ter outros aplicativos abertos durante a execução do software; caso contrário, o computador pode funcionar muito lentamente, principalmente em sistemas mais antigos ou menos robustos. - Clique em Criar Novo Projeto | Outros fluxos de trabalho, escolha Contagem de densidade de células e selecione um local para salvar o arquivo de projeto (Figura 1A).
- Clique em 1. Dados de entrada | Adicionar Novo | Adicione imagens separadas. Escolha a imagem padrão (Figura 1B).
- Clique em 2. Seleção de recursos e selecione os recursos a serem usados. Selecione os recursos mostrados na Figura 1C; Escolha mais valores sigma para aumentar a sensibilidade (ou seja, 10, 15, 20, etc.).
NOTA: Se muitas caixas estiverem marcadas, o programa poderá ser executado por um longo tempo. - Clique em 3. Contando e defina o valor sigma do primeiro plano como 5,00. Marque 50 ou mais omatídios individuais usando a ferramenta Primeiro plano na imagem padrão.
NOTA: Cinquenta marcações são normalmente adequadas para análise; no entanto, quanto mais omatídeos marcados, mais precisos serão os resultados (Figura 1D). - Clique em 3. Contagem e use a ferramenta Plano de fundo para marcar a parte externa dos omatídeos (Figura 1E). Desenhe linhas verdes em forma de treliça ao redor do omatídio.
NOTA: Semelhante a mais marcações nos omatídeos, quanto mais linhas verdes desenhadas, mais precisos serão os resultados. - Clique em 4. Densidade de exportação | Escolha Export Image Settings (Exportar configurações de imagem ) para definir as configurações de imagem (Figura 1F). Clique em Informações do arquivo de saída | selecione Formatar e tif para análise posterior no Flynotyper.
- Clique em 5. Processamento em lote | Selecione Arquivos de dados brutos e selecione todas as fotos experimentais de moscas a serem analisadas (Figura 1G). A lista de imagens importadas a serem analisadas é vista em Selecionar arquivos de dados brutos (Figura 1H). Clique em Processar todos os arquivos na parte inferior do 5. Seção de processamento em lote .
NOTA: Como lembrete, as análises masculinas e femininas devem ser feitas separadamente. Dependendo do computador usado, essa etapa pode levar 10 minutos ou mais, especialmente se houver muitas imagens importadas. - Após a conclusão do software, verifique a mesma pasta de arquivos contendo as imagens experimentais do olho da mosca; haverá imagens pretas denominadas "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).
3. Usando o ImageJ para preparar fotos para o Flynotyper
- Abra o arquivo .tif gerado pelo ilastik (as caixas pretas) no ImageJ.
NOTA: Cada arquivo .tif gerado pelo ilastik precisa ser tratado separadamente. - Use a ferramenta Seleção de retângulo para criar um retângulo apenas ao redor do olho. Depois que o retângulo for desenhado, corte a área escolhendo Ctrl + X ou Ctrl + C (Figura 2A). Aguarde até que uma caixa preta na forma do contorno do retângulo apareça.
NOTA: O sistema operacional do computador determinará se deve usar 'Ctrl + X' ou 'Ctrl + C'. Normalmente, 'Ctrl + X' é para Windows e 'Ctrl + C' é usado para Mac. - Abra o olho de mosca agora cortado usando ImageJ; clique em Arquivo | Novo | Área de transferência interna (Figura 2B).
- Salve o olho de mosca cortado como JPEG clicando em Arquivo | Salvar como | Jpeg. As imagens cortadas estão agora na mesma pasta de arquivos que as imagens experimentais originais.
NOTA: Para facilitar a próxima etapa, é recomendável criar uma nova pasta de arquivos chamada 'cortar' e colocar todas as imagens cortadas nessa pasta.
4. Usando o Flynotyper para calcular pontuações fenotípicas
- Abra o Flynotyper como um plugin ImageJ clicando em Plugins | Flynotyper.
- Selecione Adicionar genótipos e abra a pasta que contém as imagens do olho da mosca cortada (pasta do arquivo de corte). O nome da pasta aparecerá em Genótipos (Figura 2C).
- Verifique as caixas Microscópio de luz e Verticalmente, mas ajuste de acordo, se necessário. Marque as caixas Estabilidade e Distância até o Centro em Classificar Ommatídios por: (Figura 2C).
- Para Número de omatídeos classificados considerados, insira 200.
NOTA: Em geral, 200 é um bom número, mas ajuste de acordo com as preferências. - Clique em Executar e aguarde até que os resultados da análise apareçam (Figura 2D).
NOTA: Esta etapa pode levar 5 minutos ou mais (ou menos), dependendo do poder de processamento do computador usado. - Copie e cole o arquivo de amostra e o P-Score no software estatístico para análise posterior.
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Resultados
Em um estudo anterior, usamos esse protocolo para determinar modificadores genéticos da proteína VCP mutante ligada à esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal (ALS-FTD)12. Além disso, esse método também foi usado em outro artigo para avaliar a toxicidade de CHCHD10 ALS-FTD mediada porS59L, mesmo usando um estereomicroscópio mais antigo13. Para validar ainda mais esses resultados, usamos ilastik e Flynotyper na mesma mutação da doença ALS-FTD que ...
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Discussão
Os omatídeos de Drosophila compreendem um sistema útil para estudar várias funções biológicas e doenças genéticas. A regularidade dos omatídeos é uma boa medida para examinar o efeito de mutações genéticas4. Embora existam vários métodos para calcular a regularidade omaticidial, como a classificação manual, esses métodos podem ser fortemente tendenciosos. Para superar essa abordagem tendenciosa, ferramentas semiautomáticas foram desenvolvidas
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Pedro Fernandez-Funez pelo uso do microscópio e da câmera utilizados neste protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Ava Schapman por fornecer feedback sobre a clareza do protocolo. O apoio financeiro foi fornecido pelo The Wallin Neuroscience Discovery Fund a Nam Chul Kim.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Especificações | Ryzen 5, 16 GB de RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Baixe o software aqui: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Software de código aberto. Não use o Flynotyper 2.0. No momento da publicação, o 2.0 era relativamente novo e esse protocolo é otimizado para a versão original do Flynotyper. |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Baixe o software aqui: https://www.ilastik.org/download.html | Software de código aberto. Baixe a versão 1.4.0.post1 em Compilações regulares correspondentes ao sistema operacional do seu computador. |
| ImageJ | Baixe o software aqui: https://imagej.net/ij/download.html | Software de código aberto. Foram utilizadas as versões 1.53 e 1.54. 1.54 é a versão atualizada e é o download padrão. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | Sistema e software usados para aquisição de pilha z. |
| Microscópio Leica Z16 APO com uma câmera DMC2900 | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Referido como microscópio Z-stack e câmera no texto. Este produto está arquivado. |
Referências
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
- Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
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Reimpressões e permissões
