Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

Resumo

O sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta útil para estudar vários processos biológicos, particularmente doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, a quantificação manual de fenótipos de olhos ásperos pode ser tendenciosa e não confiável. Aqui descrevemos um método pelo qual ilastik e Flynotyper são usados para quantificar o fenótipo ocular de forma imparcial.

Resumo

O olho composto de Drosophila melanogaster é uma matriz bem estruturada e abrangente de cerca de 800 omatídeos, exibindo um padrão simétrico e hexagonal. Essa regularidade e facilidade de observação tornam o sistema ocular da Drosophila uma ferramenta poderosa para modelar várias doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, as formas de quantificar fenótipos anormais, como a classificação manual dos escores de gravidade ocular, têm limitações, especialmente ao classificar alterações fracas na morfologia ocular. Para superar essas limitações, abordagens computacionais foram desenvolvidas, como o Flynotyper. O uso de um anel de luz permite melhores imagens qualitativas acessando a integridade dos omatídeos individuais. No entanto, essas imagens não podem ser analisadas diretamente pelo Flynotyper devido às sombras nos omatídeos introduzidas pelo anel de luz. Aqui, descrevemos uma maneira imparcial de quantificar os fenótipos oculares ásperos observados em modelos de doença de Drosophila , combinando dois softwares, ilastik e Flynotyper. Ao pré-processar as imagens com ilastik, a quantificação bem-sucedida do fenótipo do olho rugoso pode ser alcançada com o Flynotyper.

Introdução

O genoma de Drosophila melanogaster contém ~ 75% dos ortólogos de genes relacionados a doenças humanas. Além disso, durante o desenvolvimento do olho da Drosophila, aproximadamente dois terços dos genes do genoma são expressos, tornando o olho da Drosophila um excelente sistema genético para investigar várias funções moleculares e celulares, desenvolvimento e modelos de doenças ^1,2. Assim, o sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta experimental útil para estudar vários processos biológicos.

O olho composto de Drosophila é uma matriz bem estruturada e abrangente de ~ 800 omatídeos que exibem um padrão simétrico e hexagonal³. A regularidade desse padrão hexagonal pode ser usada para estimar o efeito da introdução de mutações e alterações na expressão gênica na morfologia do olho⁴. Estudos anteriores que requerem avaliação da morfologia ocular basearam-se fortemente na classificação manual da gravidade dos fenótipos oculares detectados a olho nu. Para classificar os fenótipos oculares, as imagens da morfologia externa do olho são obtidas por um estereomicroscópio ^5,6. O fenótipo ocular de cada grupo é avaliado dividindo o olho externo em quatro áreas e calculando a proporção de degeneração em cada área ^5,6. Em seguida, os valores são usados para calcular médias que são comparadas com os valores obtidos das moscas controle⁷. A pontuação é baseada na extensão da fusão, perda de omatídeos e organização das cerdas ^7,8. Fotos de olhos de moscas tiradas com um estereomicroscópio são adquiridas por um pesquisador, e a análise do fenótipo do olho é realizada por outro pesquisador com conjuntos de validação triplos ^7,8.

Quando se trata de classificar alterações fracas na morfologia do olho a olho nu, existem limitações⁴. Para superar essas limitações, abordagens computacionais como FLEYE e Flynotyper foram desenvolvidas ^1,9. Flynotyper é um novo método computacional para estimar quantitativamente mudanças morfológicas no sistema ocular de Drosophila¹. Ele detecta automaticamente o olho da Drosophila e o omatídio individual, calculando as pontuações fenotípicas (P-Scores) com base na irregularidade doolho¹. Um P-Score mais alto indica que o olho da mosca está mais degenerado. Este software foi usado com sucesso na quantificação da anormalidade dos olhos de Drosophila ¹⁰. Embora o Flynotyper garanta um processo automatizado, ele ainda não pode ser aplicado com sucesso a algumas imagens oculares tiradas por vários métodos de microscopia de luz.

Qualitativamente, preferimos uma fonte de luz de anel em comparação com uma fonte de luz de ponto único, pois oferece uma representação mais precisa de cada omatídio. No entanto, quando o anel de luz é usado, ele gera uma sombra em forma de anel no topo de cada omatídio devido à forma hemisférica do omatídio. Essa sombra em forma de anel inibe a detecção omatídica precisa pelo Flynotyper, levando ao cálculo incorreto dos P-Scores.

Para superar esses problemas, implementamos o ilastik, uma ferramenta baseada em aprendizado de máquina para várias análises, para classificar omatídeos em imagens de olhos de mosca¹¹. Em seguida, alimentamos as imagens geradas pelo ilastik no Flynotyper para calcular os P-Scores. Isso nos permite quantificar os defeitos morfológicos do olho da Drosophila de forma imparcial¹.

Protocolo

1. Preparação para quantificação

1. Baixe e instale o ilastik¹¹, ImageJ e o plug-in ImageJ Flynotyper¹. Consulte a Tabela de Materiais para obter links de sites para instalação. Baixe os pacotes apropriados de acordo com o sistema operacional do computador (Mac, Windows, Linux, etc). Siga as instruções de instalação exatamente como indicado.
   NOTA: Seguir as instruções exatamente como indicado nos links fornecidos é imperativo. O computador usado precisa de um sistema operacional de 64 bits; caso contrário, não há outras especificações necessárias. Consulte a Tabela de Materiais para obter as especificações do computador do sistema usado para este protocolo.
2. Use uma imagem padrão para treinar o modelo de aprendizado de máquina. Tire uma imagem de um olho de mosca saudável usando um microscópio de luz com um anel de luz (como w1118 x GMR-GAL4), usando o centro do olho como ponto focal. Analise machos e fêmeas separadamente; portanto, adquira uma imagem padrão para homens e mulheres.
   NOTA: As configurações variam muito dependendo do microscópio e da câmera. Consulte o segundo parágrafo da discussão para obter informações mais gerais sobre a preparação da mosca e aquisição de imagens.
3. Tire imagens dos olhos experimentais da mosca usando as mesmas configurações usadas para a aquisição de imagem padrão.
   NOTA: Uma boa orientação é fundamental para uma quantificação precisa. Veja a Figura 4 como um exemplo de orientação adequada.

2. Usando ilastik para detectar omatídeos de imagens de olhos de mosca

1. Antes de iniciar a análise, certifique-se de que todos os grupos experimentais, independentemente da condição experimental, estejam na mesma pasta de arquivos para facilitar os processos a seguir. Certifique-se de que os arquivos sejam nomeados adequadamente para identificar grupos experimentais e distinguir entre homens e mulheres.
   NOTA: Recomendamos imprimir o protocolo e usar o computador para ampliar as figuras, pois esse protocolo é mais facilmente seguido visualmente.
2. Abra o software.
   NOTA: É aconselhável não ter outros aplicativos abertos durante a execução do software; caso contrário, o computador pode funcionar muito lentamente, principalmente em sistemas mais antigos ou menos robustos.
3. Clique em Criar Novo Projeto | Outros fluxos de trabalho, escolha Contagem de densidade de células e selecione um local para salvar o arquivo de projeto (Figura 1A).
4. Clique em 1. Dados de entrada | Adicionar Novo | Adicione imagens separadas. Escolha a imagem padrão (Figura 1B).
5. Clique em 2. Seleção de recursos e selecione os recursos a serem usados. Selecione os recursos mostrados na Figura 1C; Escolha mais valores sigma para aumentar a sensibilidade (ou seja, 10, 15, 20, etc.).
   NOTA: Se muitas caixas estiverem marcadas, o programa poderá ser executado por um longo tempo.
6. Clique em 3. Contando e defina o valor sigma do primeiro plano como 5,00. Marque 50 ou mais omatídios individuais usando a ferramenta Primeiro plano na imagem padrão.
   NOTA: Cinquenta marcações são normalmente adequadas para análise; no entanto, quanto mais omatídeos marcados, mais precisos serão os resultados (Figura 1D).
7. Clique em 3. Contagem e use a ferramenta Plano de fundo para marcar a parte externa dos omatídeos (Figura 1E). Desenhe linhas verdes em forma de treliça ao redor do omatídio.
   NOTA: Semelhante a mais marcações nos omatídeos, quanto mais linhas verdes desenhadas, mais precisos serão os resultados.
8. Clique em 4. Densidade de exportação | Escolha Export Image Settings (Exportar configurações de imagem ) para definir as configurações de imagem (Figura 1F). Clique em Informações do arquivo de saída | selecione Formatar e tif para análise posterior no Flynotyper.
9. Clique em 5. Processamento em lote | Selecione Arquivos de dados brutos e selecione todas as fotos experimentais de moscas a serem analisadas (Figura 1G). A lista de imagens importadas a serem analisadas é vista em Selecionar arquivos de dados brutos (Figura 1H). Clique em Processar todos os arquivos na parte inferior do 5. Seção de processamento em lote .
   NOTA: Como lembrete, as análises masculinas e femininas devem ser feitas separadamente. Dependendo do computador usado, essa etapa pode levar 10 minutos ou mais, especialmente se houver muitas imagens importadas.
10. Após a conclusão do software, verifique a mesma pasta de arquivos contendo as imagens experimentais do olho da mosca; haverá imagens pretas denominadas "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Usando o ImageJ para preparar fotos para o Flynotyper

1. Abra o arquivo .tif gerado pelo ilastik (as caixas pretas) no ImageJ.
   NOTA: Cada arquivo .tif gerado pelo ilastik precisa ser tratado separadamente.
2. Use a ferramenta Seleção de retângulo para criar um retângulo apenas ao redor do olho. Depois que o retângulo for desenhado, corte a área escolhendo Ctrl + X ou Ctrl + C (Figura 2A). Aguarde até que uma caixa preta na forma do contorno do retângulo apareça.
   NOTA: O sistema operacional do computador determinará se deve usar 'Ctrl + X' ou 'Ctrl + C'. Normalmente, 'Ctrl + X' é para Windows e 'Ctrl + C' é usado para Mac.
3. Abra o olho de mosca agora cortado usando ImageJ; clique em Arquivo | Novo | Área de transferência interna (Figura 2B).
4. Salve o olho de mosca cortado como JPEG clicando em Arquivo | Salvar como | Jpeg. As imagens cortadas estão agora na mesma pasta de arquivos que as imagens experimentais originais.
   NOTA: Para facilitar a próxima etapa, é recomendável criar uma nova pasta de arquivos chamada 'cortar' e colocar todas as imagens cortadas nessa pasta.

4. Usando o Flynotyper para calcular pontuações fenotípicas

1. Abra o Flynotyper como um plugin ImageJ clicando em Plugins | Flynotyper.
2. Selecione Adicionar genótipos e abra a pasta que contém as imagens do olho da mosca cortada (pasta do arquivo de corte). O nome da pasta aparecerá em Genótipos (Figura 2C).
3. Verifique as caixas Microscópio de luz e Verticalmente, mas ajuste de acordo, se necessário. Marque as caixas Estabilidade e Distância até o Centro em Classificar Ommatídios por: (Figura 2C).
4. Para Número de omatídeos classificados considerados, insira 200.
   NOTA: Em geral, 200 é um bom número, mas ajuste de acordo com as preferências.
5. Clique em Executar e aguarde até que os resultados da análise apareçam (Figura 2D).
   NOTA: Esta etapa pode levar 5 minutos ou mais (ou menos), dependendo do poder de processamento do computador usado.
6. Copie e cole o arquivo de amostra e o P-Score no software estatístico para análise posterior.

Resultados

Em um estudo anterior, usamos esse protocolo para determinar modificadores genéticos da proteína VCP mutante ligada à esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal (ALS-FTD)¹². Além disso, esse método também foi usado em outro artigo para avaliar a toxicidade de CHCHD10 ALS-FTD mediada por^S59L, mesmo usando um estereomicroscópio mais antigo¹³. Para validar ainda mais esses resultados, usamos ilastik e Flynotyper na mesma mutação da doença ALS-FTD que Baek et ^al.13; no entanto, um pessoal de laboratório não treinado realizou o experimento e obteve resultados semelhantes. Assim, a combinação de ilastik e Flynotyper é um método robusto para pontuar de forma imparcial a degeneração da omatídia de Drosophila .

Preferimos o uso de um anel de luz porque permite melhores avaliações qualitativas (Figura 3). No entanto, o uso de um anel de luz causa uma sombra que o Flynotyper não pode analisar diretamente. Para superar isso, pré-processamos as imagens no ilastik antes de quantificar os P-Scores com o Flynotyper. No geral, os P-Scores do olho de mosca não degenerado (GMR-GAL4) foram significativamente menores em comparação com um olho moderadamente degenerado (2x_S81L) e um olho gravemente degenerado (3x_S81L) (Figura 4A, B e Tabela 1). Este é o resultado esperado, pois P-Scores mais altos gerados pelo Flynotyper indicam um olho mais degenerado¹. Quando o ilastik não foi usado, houve diferenças insignificantes nos escores P entre um olho não degenerado e um olho moderadamente degenerado (Figura 4C e Tabela 1). Isso sugere que o Flynotyper se esforça para identificar com precisão os padrões de omatídeos sob condições de luz do anel sem usar ilastik. Isso ocorre porque o Flynotyper foi projetado para usar imagens tiradas com uma luz de ponto duplo que é convertida em tons de cinza com ajustes adicionais para identificar o centro omatidial¹. O Ilastik replica esse processo incorporando um ponto no centro de cada omatídio, permitindo a quantificação no Flynotyper.

Figura 1: Exemplo de fluxo de trabalho ilastik. (A) Criação de um novo projeto em ilastik. (B) Escolhendo a imagem padrão. (C) Seleção de valores sigma em Seleção de recursos. (D) Marcando o primeiro plano dos omatídeos para sensibilidade. (E) Marcar o fundo dos omatídeos para sensibilidade. (F) Selecionar como o software exportará os arquivos processados. (G) Escolher quais imagens experimentais do olho da mosca serão analisadas. (H) Mostrando quais imagens experimentais do olho da mosca serão analisadas. (I) Produto acabado após a execução do software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de fluxo de trabalho do Flynotyper. (A) Selecionar apenas o olho da mosca para análise posterior. (B) Abrindo a imagem do olho cortado em uma nova janela. (C) Selecionar quais imagens cortadas serão analisadas e os parâmetros a serem verificados para análise. (D) Exemplos de resultados. Os escores fenotípicos são apresentados na extrema direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens qualitativas dos olhos de Drosophila . O mesmo olho de mosca tirado com um anel de luz (esquerda) e tirado com uma luz de ponto duplo (direita) em condições não degeneradas (superior) e degeneradas (inferiores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Usando ilastik antes de Flynotyper para quantificação precisa do fenótipo do olho rugoso em Drosophila. (A) Imagens oculares representativas de Drosophila de um olho não degenerado (GMR-GAL4), um olho moderadamente degenerado (2x_S81L) e um olho gravemente degenerado (3x_S81L). (B) Resultados da quantificação do Flynotyper após a utilização de ilastik. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Resultados de quantificação de Flynotyper sem usar ilastik. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 para cada grupo. Os pontos de dados são tremidos ou empilhados no eixo x para maior clareza visual. A linha horizontal sólida representa a média. As barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Com ilastik	Sem ilastik	Com ilastik	Sem ilastik	Com ilastik	Sem ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tabela 1: P-Scores ao usar Flynotyper com ilastik e ao usar Flynotyper sozinho.

Figura S1 suplementar: Montagem da cabeça de mosca configurada para aquisição de imagem. Este é um exemplo de como configurar a aquisição de imagens usando várias folhas de papel. No entanto, qualquer método que garanta a orientação adequada da cabeça e do olho da mosca pode ser usado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Resultados quantitativos de ilastik e Flynotyper ao usar um valor sigma de 2,5 na seleção de recursos. Usar um valor sigma diferente de 5.0 na seleção de recursos no ilastik pode resultar em quantificação imprecisa. Especificamente, um valor sigma de 2,5 resulta em uma perda de sensibilidade. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 para cada grupo. Os pontos de dados são tremidos ou empilhados no eixo x para maior clareza visual. A linha horizontal sólida representa a média. As barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3: Perda de sensibilidade e P-Scores imprecisos devido a manchas necróticas. Setas brancas estão apontando para segmentos de manchas necróticas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: P-Scores ao usar um valor sigma de 2,5 na seleção de recursos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Os omatídeos de Drosophila compreendem um sistema útil para estudar várias funções biológicas e doenças genéticas. A regularidade dos omatídeos é uma boa medida para examinar o efeito de mutações genéticas⁴. Embora existam vários métodos para calcular a regularidade omaticidial, como a classificação manual, esses métodos podem ser fortemente tendenciosos. Para superar essa abordagem tendenciosa, ferramentas semiautomáticas foram desenvolvidas ^1,11.

Para uma quantificação precisa dos olhos, a preparação e a configuração da mosca devem ser otimizadas. Embora entendamos que cada laboratório terá sua configuração, estamos fornecendo a seguinte configuração em nosso laboratório para dar aos leitores uma ideia de como preparar moscas para aquisição de imagens. As moscas são congeladas e armazenadas a -80 °C. Usamos um tamanho de amostra de 3 porque, em nossa experiência, quando GMR-GAL4 é combinado com a mutação S81L, há muito pouca variação entre a população. No entanto, lembre-se de que o tamanho da amostra deve ser ajustado para realizar testes de significância de hipótese nula. Para montar as moscas para aquisição de imagens, a cabeça da mosca repousa sobre uma folha de papel muito pequena que funciona como um travesseiro de modo que o centro do olho seja aproximadamente o plano focal (Figura Suplementar S1). Nosso laboratório usa um microscópio e uma câmera Z-stack (consulte a Tabela de Materiais), pois isso produz imagens gerais mais claras, permitindo a melhor visualização de todo o olho, pois o olho da mosca é em forma de cúpula. No entanto, a função Z-stack não é um requisito para este protocolo, pois usamos com sucesso esse método com um estereomicroscópio mais antigo sem a função Z-stack¹³. O mostrador de luz do anel para brilho é girado não mais do que 1/4 do caminho para cima para evitar superexposição. A espessura total de nossas amostras varia entre 300 e 450 mícrons.

Neste estudo, mostramos que a análise de olhos de mosca com ilastik e Flynotyper gera resultados de quantificação de omatídeos imparciais e confiáveis. Analisamos os padrões de omatídeos de Drosophila usando o ilastik, uma ferramenta de análise de bioimagem baseada em aprendizado de máquina, para marcar os omatídeos e, em seguida, o Flynotyper, um método computacional usado para medir a regularidade dos omatídeos ^1,11. Preferimos usar um anel de luz para obter imagens para melhor avaliação qualitativa. No entanto, essa abordagem não permite que o Flynotyper produza resultados quantitativos usando essas imagens. Portanto, o ilastik é implementado para pré-processar essas imagens, e essas imagens processadas foram usadas com sucesso com o Flynotyper para produzir resultados quantitativos. Quando as imagens não foram pré-processadas com ilastik antes do Flynotyper, os P-Scores gerais foram semelhantes entre os olhos não degenerativos e degenerativos. Isso destaca a importância de usar o ilastik primeiro ao implementar um anel de luz para resultados quantitativos.

Existem algumas limitações em nossos métodos. As configurações no ilastik podem variar muito e podem resultar em dados não significativos. Por exemplo, realizamos outro conjunto de análises usando as mesmas imagens, mas ajustamos o valor sigma de primeiro plano em ilastik para 2,5 em vez de 5. Isso resultou em uma perda de sensibilidade em fenótipos moderadamente degenerativos (Figura Suplementar S2 e Tabela Suplementar S1). Outra limitação é a perda de sensibilidade nos olhos com muita degeneração. Comparado a um olho 3x_S81L, um olho com manchas necróticas é qualitativamente muito mais degenerado. No entanto, o P-Score médio para 3x_S81L olhos foi de 60,2, enquanto o P-score médio para os olhos com manchas necróticas foi de 60,9. Assim, olhos com muita degeneração, como manchas necróticas, também podem resultar em perda de sensibilidade (Figura Suplementar S3).

Uma etapa crítica deste protocolo é a seleção de uma imagem padrão apropriada, que é usada para treinar o ilastik. Uma imagem padrão não degenerada com um contraste distinto entre os omatídeos e as células de pigmento circundantes, como olhos vermelhos ou laranja, resultará em uma quantificação mais precisa no Flynotyper. Outra etapa crítica é a seleção de recursos no ilastik, onde a sensibilidade, representada como valores sigma, é selecionada para ajustar o software de aprendizado de máquina (Figura 1D). A seleção de poucas características pode reduzir a sensibilidade do ilastik, levando à marcação imprecisa dos omatídeos. A seleção de muitos recursos aumentará o tempo e o poder de processamento necessários para gerar resultados, diminuindo a eficiência do procedimento. Alternativamente, se houver degeneração qualitativa perceptível do olho, mas os resultados da análise não forem estatisticamente significativos, aumentar o valor sigma dos recursos selecionados seria uma correção potencial. No entanto, as seleções de recursos fornecidas neste protocolo produzem regularmente resultados precisos. Seguir as etapas críticas escritas ajudará a mitigar os problemas mais comuns e a solução de problemas no futuro.

Em resumo, este método fornece melhores imagens qualitativas, ao mesmo tempo em que produz uma quantificação imparcial e confiável do sistema ocular de Drosophila . Consequentemente, esse método pode aumentar a utilidade da degeneração ocular como uma ferramenta poderosa para modelar doenças degenerativas no futuro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Especificações			Ryzen 5, 16 GB de RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Baixe o software aqui: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Software de código aberto. Não use o Flynotyper 2.0. No momento da publicação, o 2.0 era relativamente novo e esse protocolo é otimizado para a versão original do Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Baixe o software aqui: https://www.ilastik.org/download.html	Software de código aberto. Baixe a versão 1.4.0.post1 em Compilações regulares correspondentes ao sistema operacional do seu computador.
ImageJ		Baixe o software aqui: https://imagej.net/ij/download.html	Software de código aberto. Foram utilizadas as versões 1.53 e 1.54. 1.54 é a versão atualizada e é o download padrão.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	Sistema e software usados para aquisição de pilha z.
Microscópio Leica Z16 APO com uma câmera DMC2900	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referido como microscópio Z-stack e câmera no texto. Este produto está arquivado.