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Artigo de método

Avaliando o mecanismo de um xarope de ervas tradicional para tratamento de anemia usando metabolômica hepática

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DOI:

10.3791/67225

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30 de agosto de 2024

 ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Chinese Medicine, 2School of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, 3Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta principalmente a aplicação da metabolômica hepática na investigação da eficácia do xarope Shi-Liu-Bu-Xue no tratamento da anemia.

Resumo

Como um conhecido medicamento uigur, o xarope Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) tem sido amplamente utilizado para tratar a anemia na China há mais de 20 anos. No entanto, os mecanismos subjacentes à sua eficácia no tratamento da anemia permanecem obscuros. Neste estudo, a metabolômica hepática foi empregada principalmente para determinar os potenciais mecanismos regulatórios da SLBXS no tratamento da anemia. O perfil metabolômico hepático foi conduzido para caracterizar o mecanismo de ação do SLBXS em um modelo de anemia de camundongo induzido por acetilfenilhidrazina. O SLBXS demonstrou diminuir o índice hepático, a contagem de glóbulos brancos e a contagem de plaquetas, enquanto aumenta a contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e níveis de hematócrito. Os alvos principais foram selecionados para verificação usando Western blotting. O SLBXS demonstrou um efeito terapêutico significativo na anemia, principalmente pela regulação do metabolismo da galactose e da via de sinalização do HIF-1, conforme indicado pela regulação negativa das proteínas HIF-1α, NOS3, VEGFA e GLA nos tecidos hepáticos de camundongos anêmicos. Este estudo esclarece os potenciais mecanismos regulatórios do metabolismo hepático pela administração de SLBXS no tratamento da anemia.

Introdução

A anemia é um problema de saúde global premente e prevalente, afetando 25% da população mundial e pessoas de todas as idades, particularmente adolescentes e mulheres grávidas 1,2,3. Está associada a um risco aumentado de trabalho de parto prematuro e mortalidade materna e pode levar a distúrbios do desenvolvimento físico e desempenho cardiovascular prejudicado4. Essa condição também pode impactar negativamente o estado de saúde dos adolescentes, resultando em infecções e insuficiência cardíaca5. Os tratamentos atuais incluem principalmente transfusão de sangue, suplementação de ferro e terapia com eritropoietina. No entanto, esses tratamentos apresentam desvantagens e efeitos colaterais adversos, como anafilaxia, distúrbios gastrointestinais, sobrecarga de ferro e urticária1. Portanto, identificar medicamentos eficazes com menos efeitos colaterais para o tratamento da anemia é crucial.

A medicina tradicional chinesa, incluindo a medicina uigur, oferece várias vantagens, como formulações de vários ingredientes, efeitos de múltiplos alvos, interações de vários links e menos efeitos colaterais na prevenção e tratamento de doenças multifatoriais. O xarope Shi-Liu-Bu-Xue (SLBXS) é um agente tradicional notável na medicina uigur usado para tônicos sanguíneos e produção de sangue. É reconhecido como um medicamento regulador do sangue que pode reduzir o calor do fígado e foi incluído nas diretrizes para o uso clínico de medicamentos minoritários para o tratamento da anemia. Também é licenciado pela Food and Drug Administration (Z20026094) do Estado Chinês6,7,8. Nas últimas duas décadas, o SLBXS tem sido amplamente utilizado na China para tratar condições relacionadas à anemia. No entanto, seus mecanismos potenciais para o tratamento da anemia permanecem desconhecidos e requerem mais investigações. A metabolômica, que examina as respostas metabólicas dinâmicas dos sistemas biológicos a doenças, intervenções medicamentosas ou condições ambientais9, é cada vez mais usada para elucidar os mecanismos de ação da medicina tradicional chinesa, avaliando mudanças nos biomarcadores metabólicos em amostras biológicas após estímulos externos 9,10.

Assim, uma abordagem metabolômica hepática foi adotada neste estudo para determinar os mecanismos terapêuticos subjacentes da SLBXS no tratamento da anemia. Primeiro, um modelo de anemia de camundongo induzido por acetilfenilhidrazina (APH) foi estabelecido. Em seguida, as vias metabólicas dos metabólitos endógenos foram investigadas usando metabolômica hepática com cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) e métodos de dados multivariados após a administração de SLBXS. Finalmente, os principais alvos foram analisados experimentalmente para elucidar os efeitos antianêmicos e os mecanismos moleculares dos SLBXS.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Hubei (HBUCMS201912015). Camundongos C57BL/6 machos (peso 20-22 g) foram alojados em uma sala específica livre de patógenos com umidade relativa de 50%-60% e temperatura de 22 °C ± 2 °C, submetidos a um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridão e com livre acesso a comida e água. Antes do início do experimento, todos os camundongos tiveram uma semana para se aclimatar ao ambiente. Os camundongos foram aleatoriamente designados para um dos quatro grupos a seguir (n = 12): controle, modelo, xarope de Fu-Fang-E-Jiao (FFEJS, um medicamento positivo, administrado por via intragástrica a 7,8 mL / kg) e SLBXS (administrado por via intragástrica a 11,7 mL / kg). Os camundongos dos grupos controle e modelo receberam volumes iguais de solução salina. Os camundongos em todos os grupos receberam administração intragástrica dos medicamentos correspondentes uma vez ao dia por 2 semanas. Detalhes dos medicamentos, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de modelo de anemia em camundongos

  1. Pesar 2 g de acetilfenilhidrazina (APH) com uma balança electrónica e transferi-los para um copo de 150 ml. Adicione 100 mL de soro fisiológico e mexa com uma vareta de vidro até que o APH esteja totalmente dissolvido.
  2. Estabeleça o modelo de anemia em camundongos injetando subcutaneamente 2% de APH, conforme preparado na etapa 1.1 no1º, 4º e7º dias em dosagens de 200 mg/kg, 100 mg/kg e 100 mg/kg, respectivamente11.
    NOTA: A partir do primeiro dia, os camundongos dos grupos FFEJS (7,8 mL / kg) e SLBXS (11,7 mL / kg) receberam administração intragástrica uma vez ao dia por 2 semanas. Os camundongos dos grupos controle e modelo receberam volumes iguais de solução salina uma vez ao dia durante 2 semanas.

2. Determinação do índice hepático

  1. No final do experimento, pesar cada camundongo usando uma balança eletrônica.
  2. Anestesiar os camundongos inalando isoflurano a 2%. Aperte o globo ocular dos camundongos para torná-lo hiperêmico e saliente. Remova rapidamente o globo ocular com uma pinça e colete o sangue em tubos de amostra heparinizados.
  3. Prenda os camundongos anestesiados da etapa 2.2 a uma placa de manipulação cirúrgica.
  4. Faça uma incisão completa ao longo da linha média do abdômen com um bisturi. Dissecar e isolar cuidadosamente o tecido hepático intacto12 e, em seguida, medir o seu peso com uma balança electrónica.
    NOTA: O índice hepático de cada camundongo é calculado usando a seguinte fórmula: Índice hepático = peso hepático / peso corporal.

3. Análise hematológica

  1. Agite suavemente o tubo que contém a amostra de sangue heparinizada da etapa 2.2 para evitar a coagulação do sangue.
  2. Coloque a amostra de sangue abaixo da agulha de injeção para garantir que ela esteja totalmente imersa na agulha.
  3. Clique no botão Detecção automática para medir a contagem de glóbulos vermelhos (RBC), hematócrito (HCT), contagem de glóbulos brancos (WBC), níveis de hemoglobina (HGB) e contagem de plaquetas (PLT) usando um analisador de hemócitos totalmente automático.

4. Estudo metabolômico hepático

  1. Preparação de amostras de fígado
    1. Homogeneizar amostras de tecido hepático (50 mg) da etapa 2.4 com 1 mL de metanol pré-resfriado. Centrifugar a 18.759 x g durante 10 min a 4 °C para remover o precipitado.
    2. Transferir 200 μL do sobrenadante para um frasco para injetáveis de amostra utilizando uma pipeta e secar a vácuo num liofilizador a 35 °C durante 2 h.
    3. Reagir as amostras secas com 40 μL de uma solução de cloridrato de metoxiamina a 40 mg/ml em piridina durante 90 min a 30 °C. Em seguida, adicione 80 μL de N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA) com 1% de trimetilclorossilano (TMCS) e incube por 60 min a 37 °C.
    4. Adicione 10 μL de n-hexano ao frasco para encerrar a reação de derivatização.
  2. Análise metabólica do fígado
    1. Analisar as amostras derivatizadas (1 μL) utilizando um sistema GC-MS. Separar as derivadas utilizando uma coluna capilar DB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).
      NOTA: As condições do programa de temperatura do forno foram definidas da seguinte forma: 60 °C por 1 min; aumentar para 325 °C a uma taxa de 10 °C/min e manter por 10 min. As temperaturas do injetor, da fonte de íons e do MS foram ajustadas para 250 °C, 230 °C e 150 °C, respectivamente. O hélio (99,999%) foi usado como gás de arraste a uma taxa de fluxo de 1,1 mL / min, e a razão de divisão foi definida para 10:1. Utilizou-se uma energia de feixe de elétrons de 70 eV e um tempo de atraso do solvente de 5,9 min.
  3. Processamento e análise dos dados
    1. Adquira e converta dados brutos de GC-MS usando o software MassHunter compatível.
    2. Realize análises espectrais usando a ferramenta Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS)12.
    3. Identifique todos os metabólitos usando os bancos de dados NIST e HMDB (consulte Tabela de Materiais).
    4. Importe os dados para a ferramenta MetaboAnalyst para análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA), testes t, análise de caminho e análise de rede12.

5. Análise de Western blot

  1. Extraia as proteínas totais do tecido hepático do camundongo
    1. Adicione 50 mg de tecido hepático da etapa 2.4 e 250 μL de lisado celular a um homogeneizador de vidro de 1 mL e triture no gelo por 5 min.
    2. Transfira o homogeneizado do tecido hepático da etapa 5.1.1 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pipetador e centrifugue a 18.759 x g por 10 min a 4 ° C. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml usando um pipetador.
  2. Determinar as concentrações de proteína e pré-processar amostras de proteína
    1. Adicione 2 μL de sobrenadante da etapa 5.1.2, 18 μL de PBS e 180 μL de solução de trabalho BCA a uma placa de microtitulação de 96 poços8.
    2. Oscilar a placa num oscilador durante 30 s, deixá-la repousar 30 min a 37 °C e determinar a absorvância a 562 nm utilizando um leitor de microplacas.
  3. Separe as proteínas totais usando SDS-PAGE, transfira para membranas de fluoreto de polivinilideno e bloqueie com 5% de leite desnatado8.
  4. Incube as membranas da etapa 5.3 com anticorpos primários contra HIF-1α (1:1000), VEGFA (1:1000), GLA (1:1000), NOS3 (1:1000) e β-actina (1:5000) durante a noite a 4 ° C.
  5. Coloque as membranas da etapa 5.4 em uma caixa de incubação de anticorpos, adicione 10 mL de TBST e agite horizontalmente a 111 x g em temperatura ambiente para lavar os anticorpos primários não ligados três vezes por 5 min cada.
  6. Adicione 200 μL de IgG (H + L)-HRP (1:1000) anti-coelho de cabra a cada membrana da etapa 5.5 e incube por 2 h em temperatura ambiente. Em seguida, repita a etapa 5.5 para lavar o anticorpo secundário não ligado (IgG anti-coelho de cabra (H + L)-HRP).
  7. Adicione 200 μL de solução quimioluminescente ECL de sensibilidade ultra-alta à superfície de cada membrana a partir da etapa 5.6 e visualize imediatamente as bandas de proteínas usando um sistema automático de análise de imagem de quimioluminescência.

6. Análise estatística

  1. Analise os dados usando software estatístico e gráfico com ANOVA unidirecional seguida do teste de Tukey.
  2. Apresente os resultados como média ± desvio padrão (DP) e considere um valor de P < 0,05 como estatisticamente significativo.

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Resultados

Para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do modelo de anemia em camundongos e analisar o efeito do SLBXS na anemia, o índice hepático e os parâmetros hematológicos foram investigados pela primeira vez. A Figura 1 ilustra que o grupo modelo exibiu uma diminuição significativa (P < 0,01) na contagem de glóbulos vermelhos (RBC), hemoglobina (HGB) e hematócrito (HCT) em comparação com o grupo controle. Por outro lado, o índice hepático, a contagem de glóbulos brancos (WBC) e a c...

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Discussão

A anemia é uma condição comum que afeta muitas pessoas em todo o mundo, particularmente nos países em desenvolvimento1. Na China, os pacientes frequentemente usam a medicina tradicional chinesa, incluindo a medicina uigur, para aliviar os sinais e sintomas da anemia. SLBXS é um medicamento uigur que tem sido usado na prática clínica por muitos anos; no entanto, seu mecanismo exato de ação contra a anemia permanece pouco compreendido13. Nest...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Plano Especial de Treinamento para Talentos Minoritários de Ciência e Tecnologia, Fundação de Ciências Naturais da Região Autônoma Uigur de Xinjiang (2020D03021), Fundos para o Programa Chave de Medicina Tradicional Chinesa da Universidade de Medicina Chinesa de Hubei (2022ZZXZ004) e Programa da Equipe de Inovação de Tianshan (2020D14030).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetilfenilhidrazinaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Sistema automático de análise de imagem por quimioluminescênciaShanghai Tanon Life Science Co., Ltd.Tanon-5200
Kit de ensaio de ácido bicinconínicoThermoFisher ScientificQPBCA-1KT
Coluna capilarAgilent J& W Scientific, Agilent Technologies, Inc.de DB-5MS
para a biotecnologia ocidental e IPBeyotimeP0013
ChlorotrimethylsilaneShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Balança eletrônicaMettler-Toledo International Inc.ME203E
Balança eletrônicaMettler-Toledo International Inc.LE104E
Fu-Fang-E-Jiao XaropeDong E E Jiao Co., Ltd.
Analisador de hemócitos totalmente automáticoShenzhen Mindray Animal Care Technology Co., Ltd.Sistema IDEXX ProCyte Dx
GC-MSAgilent Technologies, Inc.7890B-5977B 
de tecnologia de Bioworldde BS77041
de GLA Shanghai Lei Gu Instruments Co., Ltd.B-013001
Haste de vidro Fornecedor verificado - Shanghai Lei Gu Instruments Co., Ltd.B-003904
Software GraphPad Prism  GraphPad, La JollaVersão 9.0
Tubos de amostra heparinizadosChangde BKMAM Biotechnology Co., Ltd.B-ACT1P5
HIF-1&alfa; anticorpo primárioBioworld TechnologyBS3514
Banco de dados HMDBhttp://www.hmdb.ca/—
IsofluranoHebei Jindafu Pharmaceutical Co., Ltd.
Camundongos C57BL/6 machosLiaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.Não. SCXK [Liao] 2015-0001
MassHunterAgilent Technologies, Inc.B.08.00
MetaboAnalyst 5.0https://www.metaboanalyst.ca/—
Cloridrato de metoxiaminaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
n-hexanoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
banco de dados do NISThttp://webbook.nist.gov/chemistry/—
NOS3 anticorpo primárioBioworld TechnologyBS3625
PyridineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
salinaBIOSHARP LIFE SCIENCES
Shi-Liu-Bu-Xue XaropeXinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.
Placa de manipulação cirúrgicaDIXSGZK-JPB-A
VEGFA anticorpo primárioBioworld TechnologyAP0742
β-actinABclonal (Shanghai) Trading Co., Ltd.AC026
C13979660Tampão da lise da pilha C104814214020031 Homogeneizador de vidro primário Fornecedor verificado - 20231202E1818113C14878803C13026996solução 2308262009 211277

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