Artigo de método

Geração de organoides 3D do mesencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

DOI:

10.3791/67228

⸱

14 de fevereiro de 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um novo método para criar organoides 3D do mesencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, orientando sua formação para imitar o tecido nativo do mesencéfalo, auxiliando assim no estudo do desenvolvimento e distúrbios.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento de organoides do mesencéfalo (MOs) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) representa um avanço significativo na compreensão do desenvolvimento do cérebro, facilitando a modelagem precisa da doença e avançando na pesquisa terapêutica. Este protocolo descreve um método para gerar organoides específicos do mesencéfalo usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), empregando uma abordagem de diferenciação estratégica. As principais técnicas incluem inibição dupla de SMAD para suprimir a sinalização SMAD, administração do fator de crescimento de fibroblastos 8b (FGF-8b) e ativação da via Sonic Hedgehog usando o agonista purmorlamina, guiando as iPSCs em direção a um destino no mesencéfalo.

Os organoides produzidos por este método atingem diâmetros de até 2 mm e incorporam uma gama diversificada de tipos de células neuroepiteliais, refletindo a diversidade celular inerente do mesencéfalo. A validação desses organoides como estruturas autênticas do mesencéfalo envolve a expressão de marcadores específicos do mesencéfalo, confirmando sua identidade. Um resultado notável dessa metodologia é a diferenciação efetiva de iPSCs em neurônios dopaminérgicos, que são característicos do mesencéfalo.

A importância deste protocolo reside em sua capacidade de produzir organoides funcionalmente maduros e específicos do mesencéfalo que replicam de perto aspectos essenciais do mesencéfalo, oferecendo um modelo valioso para uma exploração aprofundada dos processos de desenvolvimento do mesencéfalo e da fisiopatologia de distúrbios relacionados, como a doença de Parkinson. Assim, este protocolo serve como um recurso crucial para pesquisadores que buscam aprimorar nossa compreensão do cérebro humano e desenvolver novos tratamentos para doenças neurodegenerativas, tornando-se uma ferramenta indispensável no campo da pesquisa neurológica.

Introdução

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O cérebro humano, com sua arquitetura intrincada e composição celular e molecular complexa, apresenta desafios formidáveis na pesquisa em neurociência, particularmente no contexto da modelagem de doenças e do desenvolvimento de terapia celular1. Esses desafios são ainda mais complicados pela disponibilidade limitada de modelos sofisticados in vitro que realmente representam a complexidade do cérebro humano. No entanto, avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), permitindo a diferenciação controlada em subtipos neuronais específicos, abriram caminhos promissores para explorar o desenvolvimento do cérebro humano, patogênese de doenças e estratégias terapêuticas baseadas em células.

Tradicionalmente, as culturas neuronais bidimensionais (2D) derivadas de iPSCs têm sido a pedra angular dos estudos in vitro destinados a imitar a fisiologia e a patologia neuronal humana. Essas culturas de monocamada têm sido fundamentais para melhorar nossa compreensão das doenças neurológicas e na descoberta de agentes neuroprotetores 2,3,4,5,6,7. Apesar de sua utilidade, esses sistemas 2D ficam aquém de emular a verdadeira diversidade celular e a estrutura tridimensional (3D) do cérebro humano.

O advento da tecnologia de organoides cerebrais representa um salto significativo na modelagem in vitro, fornecendo uma ferramenta que imita de perto a intrincada biologia do cérebro humano dentro de uma estrutura fisiologicamente relevante8. As primeiras técnicas de desenvolvimento de organoides cerebrais capitalizaram as propriedades regulatórias inerentes das iPSCs para formar espontaneamente derivados do ectoderma, imitando assim os estágios iniciais do desenvolvimento do cérebro 5,9,10,11,12. Dadas as complexas redes formadas por neurônios com outras células neuronais e não neuronais, a modelagem 3D torna-se essencial para estudar com precisão as doenças neurodegenerativas. As culturas 3D fornecem um ambiente in vivo mais representativo, facilitando a diferenciação neuronal acelerada e a formação de redes12 , 13 , 14 , e promovem uma expressão mais ampla de genes neuronais em comparação com as culturas 2D15 . Os neurônios desenvolvidos em contextos 3D atingem morfologias e atributos fisiológicos mais reminiscentes de suas contrapartes in vivo 16.

Avanços recentes em modelos cerebrais 3D foram fundamentais para capturar a complexidade espacial e funcional do cérebro humano de forma mais eficaz. Na última década, o avanço de diversos protocolos para gerar organoides cerebrais inteiros e modelos cerebrais específicos da região 11,17,18,19,20,21,22, mostrou-se inestimável na modelagem de distúrbios neurológicos como microcefalia 11, doença de Alzheimer 14,23 e doença de Parkinson24. O objetivo deste protocolo é desenvolver e refinar um método para criar MOs humanos 3D derivados de iPSCs humanos. Este protocolo visa especificamente gerar organoides que são enriquecidos com neurônios dopaminérgicos e organizados espacialmente de uma maneira que imita de perto a estrutura natural e a funcionalidade do mesencéfalo humano. O objetivo principal desses organoides é servir como modelos in vitro avançados para estudar a doença de Parkinson, fornecendo um sistema mais preciso e fisiologicamente relevante para explorar os processos de neurodesenvolvimento e patologias associadas a essa condição. Ao alavancar iPSCs derivadas de pacientes para gerar esses organoides específicos do mesencéfalo, o protocolo busca melhorar a compreensão dos mecanismos da doença de Parkinson, facilitar a descoberta de potenciais alvos terapêuticos e melhorar o desenvolvimento de terapias baseadas em células. Por meio dessa abordagem inovadora, o protocolo visa superar as limitações das culturas neuronais 2D tradicionais e contribuir significativamente para o campo da pesquisa de doenças neurodegenerativas, oferecendo uma ferramenta potente para modelagem de doenças in vitro e a exploração de novas estratégias de tratamento.

Nos últimos 10 anos, várias equipes de pesquisa desenvolveram organoides do mesencéfalo (MOs)8,21,25,26,27,28, utilizando metodologias que exibem várias semelhanças importantes. Em nossa busca para aprofundar a compreensão da doença de Parkinson, desenvolvemos um protocolo para criar MOs humanos 3D derivados de iPSCs humanos. Esses organoides, enriquecidos com neurônios dopaminérgicos dispostos espacialmente, apresentam um modelo ideal para estudar a doença de Parkinson. Nosso desenvolvimento e refinamento de protocolos organoides específicos do mesencéfalo produziram modelos in vitro avançados que contribuíram significativamente para nossa compreensão dos processos de neurodesenvolvimento e doenças neurodegenerativas. Esses modelos, particularmente quando aplicados a MOs derivados de pacientes, demonstraram sua eficácia como ferramentas potentes para modelagem de doenças in vitro, oferecendo novas perspectivas e metodologias no campo da cultura celular 3D avançada.

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Protocolo

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As iPSCs geradas a partir de fibroblastos humanos normais Detroit 551 e células-tronco embrionárias humanas (ESCs) hESC linha 360 conforme descrito anteriormente4. As iPSCs foram obtidas com a aprovação do Comitê da Noruega Ocidental para Pesquisa em Saúde Ética REK nr. 2012/919. Todas as células foram monitoradas regularmente quanto à contaminação por Mycoplasma usando o MycoAlert Mycoplasma Detection Kit. A Tabela de Materiais contém informações sobre todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. A Tabela 1 descreve a mídia e outros materiais usados.

1. Descongelamento de iPSCs

  1. Placa revestida com matriz e preparação do meio essencial 8 (E8)
    1. Descongele o frasco da matriz da membrana basal no gelo durante a noite. Diluir 1:100 em meio de águia modificado de Dulbecco avançado frio (DMEM)/F12 DMEM/F12 de Ham (concentração final de 1%) (ver Tabela de Materiais e Tabela 1). Conservar alíquotas a -20 °C para uma utilização prolongada.
    2. Descongelar a membrana basal diluída a 4 °C; cubra uma placa de 6 poços com 1 mL de solução por poço. Incubar a 37 °C durante 1 h.
    3. Retire a placa da incubadora e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente (RT).
      NOTA: As placas podem ser refrigeradas por no máximo 2 semanas (certifique-se de aquecer a RT antes de usar). Para armazenamento prolongado, adicione 1 mL de meio E8 (consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1) à placa revestida para evitar que o gel seque.
  2. Preparação média E8
    1. Em um ambiente estéril, combine o meio basal E8 com o suplemento E8 (ver Tabela de Materiais e Tabela 1).
      NOTA: Isso pode ser armazenado a 4 ° C por 2 semanas. Descongele o suplemento E8 congelado durante a noite a 4 °C antes de preparar o meio completo. Não descongele a 37 °C, pois isso pode comprometer sua estabilidade. Antes de usar, aqueça apenas o volume necessário de E8 Médio à temperatura ambiente (RT) até que não esteja mais frio ao toque.

2. Semeando iPSCs

  1. Pré-aqueça as placas revestidas com matriz e o meio E8 em RT ou incubadora a 37 °C.
  2. Meio de cultura aspirado; enxágue os iPSCs, que estão em 60% -70% de confluência, com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio e magnésio (DPBS Ca2+/Mg2+-free, 4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
  3. Adicione ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,5 mM, 1 mL por poço, consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1); incubar a 37 °C até que as bordas da colônia se desprendam (3-5 min).
  4. Aspirar a solução de dissociação; para separar as colônias, pipete cuidadosamente o meio E8 pré-aquecido (4 mL por poço) diretamente nas colônias com uma força mais forte do que o normal da pipeta, o que gera um movimento de fluido localizado sobre a superfície da célula.
  5. Divida as células na proporção de 1:2, transferindo-as para dois novos poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz, adicionando 2 mL de meio por poço. Em seguida, incubar a 37 °C.
  6. Troque a mídia diariamente até que as colônias atinjam 80% de confluência.
  7. Usando um microscópio com ampliação de 10x, observe as colônias para garantir que sejam de tamanho apropriado, normalmente caracterizadas por uma forma redonda distinta com um diâmetro variando de 0,5 a 1 mm. Confirme se as colônias são estruturas densas e compactas com bordas delineadas e lisas.

3. Indução neural

  1. Preparação média e configuração do Dia 0
    1. Prepare 500 mL de meio quimicamente definido (CDM), meio de indução neural (NIM) e meio livre de soro de células-tronco neurais (NSC SF), consultando a Tabela de Materiais e a Tabela 1.
    2. Enxágue as células em uma placa de 6 poços com 4 mL de DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- livre) por poço, seguido pela adição de 3 mL de NIM por poço para configuração do Dia 0.
    3. Substitua o NIM (3 mL por poço) nos dias 1, 3 e 5; Observe diariamente ao microscópio.
    4. No dia 6, separe as rosetas neurais em uma cultura de suspensão usando as etapas a seguir.
      1. Lave suavemente uma vez com DPBS (1x) (livre de Ca2+/Mg2+) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços). Adicione colagenase IV (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) e incube por 1 min. Remova a colagenase IV e enxágue delicadamente uma vez com DPBS (1x) (livre de Ca2+/Mg2+) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
      2. Adicione 2 mL de NSC SF Medium a cada poço de uma placa de 6 poços. Separe as células raspando o fundo do poço, criando grades com uma ponta de pipeta de 200 μL.
      3. Transfira a suspensão celular da placa de 6 poços para um prato não aderente de 10 cm. Ajuste o volume para 12 mL com NSC SF Medium.
      4. Coloque o prato não aderente no agitador (agitador orbital compacto ssm1) a 85 rpm em um ângulo de 0° em uma incubadora ajustada para 37 °C com 5% de CO2 para evitar a agregação.

4. Padronização do mesencéfalo

  1. No dia 7, adicione 12 mL de MDL com 100 ng/mL de FGF-8b; Coloque na incubadora orbital do agitador.
  2. Nos dias 8-13, troque o meio a cada 2 dias; Observe ao microscópio diariamente.
  3. No dia 14, adicione 12 mL de CDM com 100 ng/mL de FGF-8b e 1 μM de purmorlamina (PM); Coloque no agitador orbital.
  4. Nos dias 15-20, troque o meio a cada 2 dias; Observe ao microscópio diariamente.

5. Incorporação de Matrigel e terminação e maturação MO

  1. Descongele o Matrigel no gelo a uma temperatura entre 2 °C e 8 °C por um período de 1-2 h.
    NOTA: Descongele uma quantidade adequada de Matrigel para fornecer 15 μL para cada corpo embrióide (EB). Mantenha o Matrigel resfriado no gelo para evitar a polimerização precoce. Resfrie todos os plásticos que entrarão em contato com Matrigel a -20 °C por no mínimo 30 minutos antes da utilização.
  2. Coloque uma folha de incorporação organoide estéril em um prato vazio.
  3. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL de diâmetro largo, retire suavemente o organoide do prato e transfira-o para a superfície de incorporação com um organoide por alvéo. Repita esse processo até que 12-16 EBs sejam coletados na superfície de incorporação.
  4. Remova cuidadosamente o excesso de meio de cada EB e, em seguida, adicione 15 μL de Matrigel frio gota a gota em cada EB. Com a ajuda de uma pipeta, reposicione o EB no centro da gota Matrigel.
  5. Incubar a placa numa incubadora regulada para 37 °C durante 15-20 min para permitir a polimerização do Matrigel.
  6. Usando uma pinça estéril, levante a folha de incorporação com as gotículas Matrigel. Segure a folha diretamente acima de um poço em uma placa aderente ultrabaixa de 6 poços. Pipete 3 mL de CDM com 10 ng/mL de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) e 10 ng/mL de Fator Neurotrófico Derivado da Linha de Células Gliais (GDNF) e enxágue suavemente as gotículas de Matrigel da folha em cada poço. Repita este processo até que todas as 6-8 gotículas de Matrigel sejam transferidas para um poço.
  7. Colocar as placas num agitador orbital numa incubadora a 37 °C a 85 rpm e trocar o MDL por 10 ng/ml de BDNF e 10 ng/ml de GDNF de 3 em 3 dias.
    NOTA: Manter culturas diferenciadoras por até 3 meses; A morfologia neural aparece após 2 semanas após o término. BDNF e GDNF não são necessários para cultura além de 3 meses.

6. Coloração de imunofluorescência

  1. Use uma pipeta de 1.000 μL para recuperar suavemente o organoide do meio e coloque-o suavemente em uma lâmina de microscópio com o mínimo de meio.
  2. Deixe secar completamente ao ar em RT. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) (300 μL por amostra) por 30 min.
    NOTA: O PFA é perigoso e pode ter propriedades cancerígenas. Manuseie-o com precaução, evite o contato direto com a pele e os olhos e garanta o uso dentro de uma capela de exaustão química.
  3. Adicione solução de sacarose a 30% (300 μL por amostra) às lâminas e deixe-as incubar durante a noite a 4 °C.
  4. Bloqueie e permeie os organoides adicionando tampão bloqueador (BB) (300 μL por amostra), que inclui PBS (com Ca2+/Mg2+), 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro de cabra normal, por 2 h em RT (ou durante a noite a 4 °C). Use uma caneta de barreira hidrofóbica para delinear os organoides e confinar o tampão na lâmina.
  5. Cubra as amostras com um volume apropriado de anticorpo primário em tampão de bloqueio (300 μL por amostra), proteína G1 anti-forkhead box (FOXG1, 1:200), homeobox anti-ortodôntico 2 (OTX2, 1:100), anti-Forkhead Box A2 (FOXA2, 1:100), anti-tirosina hidroxilase (TH, 1:100), anti-SRY (região determinante do sexo Y) -box 2 (SOX2, 1:100), proteína box anti-pareada (PAX6, 1:100) e proteína associada a antimicrotúbulos 2 (MAP2 1:500), e incubar durante a noite a 4 °C no escuro (ver Tabela de Materiais).
  6. Lave as amostras em 1x PBS por 3 h com duas a três trocas de tampão em uma plataforma de balanço suave.
  7. Incube com o anticorpo secundário (300 μL por amostra), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) e anti-Alexa Fluor 647 (1:800) durante a noite a 4 ° C em uma câmara escura umidificada. Adicione a coloração nuclear Hoechst 33342 (1:5.000) simultaneamente (consulte a Tabela de Materiais).
  8. Remova o anticorpo, enxágue rapidamente com PBS e, em seguida, adicione PBS contendo 0,01% de azida sódica por 1-2 dias a 4 ° C para inibir a contaminação.
  9. Aspire o PBS, remova qualquer excesso de solução e monte os organoides usando um meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais). Coloque uma lamínula, certificando-se de evitar a formação de bolhas de ar, e armazene em uma sala escura em RT por pelo menos 12 h para permitir que o meio de montagem polimerize totalmente.
    NOTA: A amostra agora está pronta para observação usando um microscópio de fluorescência.

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Resultados

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Neste estudo, apresentamos um protocolo pioneiro para a derivação de MOs de iPSCs. O ponto central de nossa metodologia é o uso inovador da inibição dupla de SMAD, combinada sinergicamente com FGF-8b e agonista da via sonic hedgehog (SHH) purmorlamina (PM). Essa abordagem é representada na Figura 1. O processo de diferenciação começa direcionando as iPSCs para a linhagem do neuroectoderma, formando colônias de rosetas neuroepiteliais ou neurais. Isso é alcançado por meio da inibição da sinal...

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Discussão

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Nesta investigação, desenvolvemos uma metodologia para a diferenciação de MO de iPSCs. Nosso protocolo emprega uma estratégia de inibição de SMAD duplo aprimorada com fatores morfogênicos, incluindo FGF-8b e o agonista SHH PM. Essa abordagem simula de perto as pistas de desenvolvimento cruciais para a ontogenia do mesencéfalo. A via de diferenciação que instituímos estimula a formação de estruturas neuroepiteliais que lembram as rosetas neurais observadas durante o desenvolvimento natura...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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A Figura 1 é criada usando BioRender.com. Agradecemos à Universidade de Bergen Meltzers Høyskolefonds (número do projeto: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson e Gerdt Meyer Nyquists legat (número do projeto: 103816102) pelo financiamento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmera de Microscópio CCD Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Alemanha
Concentrado de Lipídios Quimicamente DefinidosThermo Fisher Scientific11905031Ingrediente CDM
Colagenase  IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent para dissociação suave de iPSCs humanos
Corning  pratos de cultura não tratadosSigma-AldrichCLS430589Cultura em suspensão 
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Diferenciação de astrócitos basal Médio
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Usado para uma variedade de lavagem de cultura de células
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent para dissociação suave de iPSCs humanos
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Meio basal para cultura iPSC
Suplemento Essential 8 (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Suplemento para cultura iPSC
FCCPAbcamab120081Elimina o potencial da membrana mitocondrial e a coloração TMRE
FGF-basicPeproTech100-18BIngrediente do meio de diferenciação de astrócitos
Sistema de aspiração de fluidos Controle BVCVacuubrand, Alemanha
Formaldeído (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Fixação celular 
GDNFPeprotech450-10neurônios DA ingrediente médio
Geltrex (matriz de membrana basal)Thermo Fisher ScientificA1413302Usado para fixação e manutenção de iPSCs humanas
Suplemento GlutaMAXde 35050061Thermo Fisher Scientificpara cultura NSC
Incubadoras de CO2 Heracell 150iFisher Scientific, EUA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Meio basal para CDM
InSolution AMPK InibidorSigma-Aldrich171261Meio de indução neural ingrediente
InsulinaRoche1376497ingrediente CDM
iPSCs derivados de Detroit 551 fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STEDLeica Microsystems, Alemanha
MatrigelLife Science354230Matrigel incorporando
MonotioglicerolSigma-AldrichM6145Ingrediente CDM
Soro de cabra normalThermo Fisher ScientificPCN5000Usado para bloquear o tampão
Orbital agitadores - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel embedding
Organoid EmbeddingSheet STEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Usado para uma variedade de lavagens
Hidrobrometo de poli-D-lisinaSigma-AldrichP7405Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
Solução de poli-L-ornitinaSigma-AldrichP4957Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
ProLong Gold AntifadeMountant Thermo Fisher ScientificP36930Montando a lamínula para imagem confocal
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promove a diferenciação de neurônios DA
Proteína FGF-8b Recombinante Humana/Camundongo R& D Systems423-F8-025/CFPromove a diferenciação de neurônios DA 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPIngrediente médio de indução neural
TRITON X-100VWR International9002-93-1Usado para permeabilização de células em ensaios de imunocoloração
Agitador orbital compacto SSM1;Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230VRotator para cultivo de organoides.
Banho-maria Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
strong>Anticorpos usados para imunocoloração
strong>Primary antibody
anti-DATAbcam abcamab128848, RRID:AB_2665470Rabbit; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Coelho; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Coelho; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Coelho; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Frango; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Coelho; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Coelho; 1:100 
anticorpo secundárioDiluição (μ L)
  Alexa Fluor  594 cabra anti-coelho IgGThermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  488 cabra anti-coelho IgG ThermoFisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 cabra anti-coelho IgG ThermoFisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 cabra anti-coelho IgG ThermoFisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 cabra anti-coelho IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 cabra anti-coelho IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 cabra anti-frango IgG Thermo Fisher ScientificA-21469  1:400
Suplemento Microscópio confocal <<

Referências

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