Artigo de método

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

DOI:

10.3791/67232

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11 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As vesículas extracelulares (EVs) liberadas pelas células estromais mesenquimais (MSCs) contêm um conjunto de microRNAs com papéis regenerativos e anti-inflamatórios. Portanto, os MSC-EVs purificados são concebidos como uma opção terapêutica de última geração para uma ampla gama de doenças. Neste protocolo, relatamos a estratégia para classificar com sucesso EVs do sobrenadante de MSCs derivadas de tecido adiposo (ASCs), frequentemente usadas em aplicações de medicina regenerativa ortopédica.

Primeiro, descrevemos a preparação da amostra, com foco nas etapas de isolamento EV e marcação com éster succinimidílico carboxifluoresceína (CFSE) para detecção de fluorescência; Posteriormente, detalhamos o processo de triagem, que constitui a parte principal do protocolo.

Além das regras definidas pelas diretrizes MISEV 2023 e MIFlowCyt EV, aplicamos condições experimentais específicas relativas ao tamanho do bico, frequência e pressão da bainha. Os parâmetros morfológicos são estabelecidos usando contas de diâmetros selecionados para cobrir a faixa teórica do tamanho do EV. Após a classificação de ASC-EVs, realizamos uma verificação de pureza da fração classificada, reanalisando-a com o classificador e verificando a distribuição do tamanho EV com a técnica de análise de rastreamento de nanopartículas.

Devido à crescente importância dos VEs, ter uma população pura para estudar e caracterizar está se tornando crucial. Aqui, demonstramos uma estratégia vencedora para configurar a classificação para atingir esse objetivo.

Introdução

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As vesículas extracelulares (EVs) são um grupo heterogêneo de vesículas estruturadas por membrana liberadas por quase todas as células, delimitadas por uma bicamada lipídica, incapazes de se replicar por conta própria1. Podem ser encontrados em vários biofluidos, como plasma sanguíneo, soro, saliva, leite materno, urina, lavado brônquico, líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano e ascite maligna2. Uma das principais funções dos EVs é transportar várias moléculas, incluindo ácidos nucléicos, proteínas, lipídios e carboidratos, entre uma célula doadora e uma receptora. Isso pode ocorrer por meio de vários mecanismos, como fusão direta da membrana, interação receptor-ligante, endocitose e fagocitose 3,4. Por esse motivo, eles demonstraram desempenhar um papel importante em muitos processos fisiológicos e patológicos e se mostram consideráveis como novos biomarcadores de doenças, como veículos de entrega de medicamentos e como agentes terapêuticos 5,6.

As células estromais mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que podem ser isoladas de muitos tecidos, incluindo tecido adiposo, polpa dentária, sangue do cordão umbilical, placenta, líquido amniótico, geléia de Wharton e até mesmo cérebro, pulmão, timo, pâncreas, baço, fígado e rim. Nos últimos anos, eles têm atraído considerável interesse pela medicina regenerativa7. As células-tronco mesenquimais (ASCs) derivadas do tecido adiposo podem ser colhidas do tecido adiposo por meio de um procedimento menos invasivo em comparação com outras fontes, como a medula óssea, resultando em menores riscos de complicações graves e evitando questões éticas8.

Além disso, o tecido adiposo contém uma concentração significativamente maior de MSCs do que a medula óssea (1% versus >0,01%) e outras fontes, como derme, polpa dentária, cordão umbilical e placenta. As MSCs são cruciais na regeneração de tecidos e células lesadas devido à sua capacidade de diferenciação e secreção de um amplo repertório de fatores de crescimento, quimiocinas e citocinas; Esses benefícios terapêuticos são atribuíveis à sua capacidade de diferenciação, mas também ao fato de secretarem um amplo repertório de fatores de crescimento, quimiocinas e citocinas. Um exemplo marcante é dado pelo potencial terapêutico das MSCs para condições ortopédicas, com o termo "Doenças Musculoesqueléticas" tendo o maior número de estudos clínicos registrados em clinicaltrials.gov (acessado em 13de maio de 2024).

Além disso, as MSCs também podem secretar EVs que participam da regeneração tecidual por meio da transferência de informações para células ou tecidos danificados e exercem atividade biológica semelhante às células-mãe 9,10. Por esse motivo, as MSC-EVs podem ser um substituto valioso para a terapia celular para alcançar uma abordagem livre de células11, com dois estudos clínicos envolvendo MSC-EVs para condições ortopédicas (NCT05261360 e NCT04998058). No entanto, ainda existem vários desafios para as aplicações clínicas dos VEs. Por exemplo, existem algumas preocupações sobre as técnicas de isolamento de EV: a maioria delas não garante a pureza ou integridade da vesícula. Além disso, algumas técnicas de isolamento são complexas, demoradas e têm baixa repetibilidade, tornando-as inadequadas para uso clínico12.

A classificação celular, por outro lado, é um método comumente usado que permite o isolamento de células únicas de suspensões celulares heterogêneas usando marcadores fluorescentes específicos13. Pode ser usado para muitas aplicações e adaptado a diferentes tipos de amostras. No entanto, embora a classificação de células seja uma tecnologia bem estabelecida e amplamente utilizada, a classificação de EV ainda é muito desafiadora porque a maioria dos EVs está abaixo do limite mínimo de detecção até mesmo para os citômetros de fluxo mais sensíveis. Existem alguns recursos que tornam um classificador mais adequado para essa finalidade. Em primeiro lugar, usando um sistema Jet-in-air no qual o fluxo que suspende as partículas é interrogado por lasers no ar, em vez de dentro de uma célula de fluxo; Este sistema preserva a amostra, diminuindo o estresse a que ela é submetida. Um segundo ponto importante é a presença de uma barra de "obscurecimento" entre o fluxo e a lente de coleta que diminui o ruído óptico de fundo do instrumento. Embora seja baixo, o ruído de fundo não é completamente eliminado e constitui uma referência que fornece uma janela parcial para os eventos que se enquadram no limiar: é muito importante para a análise de eventos que estão próximos do "limite de detecção" do instrumento14. Finalmente, o classificador apresenta um Forward Scatter (FSC) de caminho duplo com duas máscaras diferentes que permitem uma melhor discriminação entre partículas pequenas e grandes na amostra.

Com base nisso, desenvolvemos um protocolo com o objetivo de separar o éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) marcado com MSC-EVs usando um classificador de células de alta sensibilidade. Para minimizar a manipulação de EVs e preservar sua integridade e quantidade, evitamos etapas de ultracentrifugação durante o preparo da amostra. Além disso, as condições de classificação foram ajustadas para minimizar o estresse nas vesículas, incluindo uma otimização adicional de nosso instrumento, reduzindo a pressão de classificação associada ao tamanho do bico (bico de 70 μm para uma pressão de 35 psi).

Protocolo

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O protocolo aqui consiste em quatro partes: (1) Preparação da amostra, (2) caracterização de ASC-EVs, (3) classificação de ASC-EVs e (4) análise pós-classificação. Um esquema que representa o fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1.

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Figura 1: Fluxograma do protocolo. O fluxograma mostra as etapas envolvidas no protocolo. (1) preparação de amostras, (2) caracterização de vesículas antes da triagem, (3) classificação e (4) análise de vesículas pós-triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da amostra

  1. Coleção de sobrenadantes enriquecida com vesículas extracelulares (EV)
    1. Descongelar ou coletar MSCs adiposas (ASCs) que foram cultivadas na passagem antes da coleta de EVs (geralmente passagem 1 a 5) e semear por cada ASC isolar uma quantidade idêntica de células (por exemplo, 1 milhão de células por 175 cm2 de superfície do frasco resulta em aproximadamente 60% -70% de confluência).
    2. Cultive ASCs no meio de cultura apropriado (DMEM-F12 para este protocolo) suplementado com soro fetal bovino (FBS) livre de EV ou lisado de plaquetas humanas (hPL), conforme o protocolo solicitado, por 48-72 h.
      1. Para obter FBS ou hPL livre de EV, ultracentrifugar a 120.000 x g durante a noite a 4 °C e usar o sobrenadante.
        NOTA: A partir deste ponto, a força centrífuga indicada é sempre a média para o instrumento, rotor e tubos usados. Lembre-se de que diferentes rotores ou tubos podem ter força g variável por rpm e fator k. Para uma maneira fácil de comparar rotores e ajustar a força g e a velocidade, consulte uma das tabelas de conversão disponíveis https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator.
    3. A 90% de confluência celular, desconecte e conte as ASCs e suspenda em um volume adequado de meio livre de soro, idealmente 1 mL por 1 x 106 ASCs. Semeie ASCs em suspensão em placas de 24 poços com 1 mL por poço. Sem soro, as células permanecerão em suspensão e formarão um esferóide. Após 96 h, recolher o sobrenadante.
    4. Remover células flutuantes e detritos por centrifugação em série a 4 °C: 400 x g durante 10 min, 1.000 x g durante 10 min, 2.000 x g durante 10 min e duas vezes 4.000 x g durante 10 min.
    5. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para remover as partículas restantes maiores que 220 nm.
      NOTA: Use imediatamente para aplicações a jusante ou armazene por no máximo uma noite a 4 ° C ou congele a -80 ° C se outras etapas não forem executadas em 24 h.
  2. Coloração EVs para classificação
    1. Preparar uma solução a 5 mM de éster N-succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE). Use-o preparado na hora ou congele a -20 °C protegido da luz.
    2. Proceder directamente a partir dos passos 1.1.1-1.1.5 (dentro de 24 h) ou descongelar a 4 °C os sobrenadantes contendo EV armazenados a -80 °C.
    3. Antes da coloração, aqueça os sobrenadantes a 37 °C e adicione CFSE para uma concentração final de 10 μM (diluição de 500 vezes). Incubar durante 1 h a 37 °C no escuro.
    4. Durante a incubação, adicione 2 mL de PBS a um concentrador centrífugo (membrana de celulose regenerada, MWCO 100 kDa), tampa e centrifugue a 4.000 x g por 10 min em um rotor de caçamba oscilante. Remover o PBS não filtrado do fundo do dispositivo filtrante e aspirar o filtrado do tubo de recolha.
      NOTA: O protocolo de ultrafiltração centrífuga descrito é baseado no processamento de até 15 mL da amostra (volume máximo).
    5. Adicione até 15 mL de amostra ao concentrador centrífugo e tampe o dispositivo. Centrifugue a 4.000 x g por até 30 min.
      NOTA: Isso produzirá uma amostra final de 500 μL em média. No entanto, dependendo de fatores como a natureza da amostra e a vazão, o tempo de centrifugação necessário para atingir a concentração desejada pode variar.
    6. Remova o dispositivo da centrífuga e esvazie o tubo de coleta. Adicione 14 mL de PBS ao dispositivo de filtro. Centrifugue a 4.000 x g por até 30 min.
    7. Repita a etapa 1.2.6.
    8. Recuperar amostras de EVs concentradas coradas com CFSE do dispositivo filtrante, aproximadamente 500 μL, e armazenar 100 μL a 4 °C no escuro enquanto procede à classificação da amostra restante.

2. Caracterização de ASC-EVs

  1. Análise de Western blot de marcadores EV
    1. ASCs de pellets (1 x 106) a 376 x g em RT por 5 min e suspender em tampão de lise apropriado suplementado com inibidores de protease. Realize a quantificação de proteínas com o ensaio de sua escolha.
      NOTA: Como experimentado neste estudo, os melhores resultados de quantificação são obtidos com a técnica de ensaio de ácido bicinconínico.
    2. Quantificar o sobrenadante concentrado em ASCs equivalente a 1 x 106 ASCs com a técnica de Bradford ou EVs de pellets correspondentes a 1 x 106 ASCs a 100.000 x g a 4 ° C por 1 h e suspender em tampão de lise apropriado suplementado com inibidores de protease. Realize a quantificação de proteínas com o ensaio de sua escolha.
      NOTA: Conforme experimentado neste estudo, os melhores resultados de quantificação para pellets EV são obtidos com a técnica de ensaio de ácido bicinconínico.
    3. Se for usado sobrenadante concentrado no lugar de EVs purificados, lisar as amostras em 5% de 2-mercaptoetanol e 2x tampão Laemmli.
      NOTA: Conforme experimentado neste estudo, tanto o sobrenadante concentrado quanto os EVs purificados fornecem resultados comparáveis para marcadores EV positivos e negativos.
    4. Carregue e separe as amostras (1-10 μg) em um gel de poliacrilamida a 10% a 110 V por 90 min.
    5. Transferir para uma membrana de nitrocelulose a 250 mA durante 120 min.
    6. Membrana de coloração com Ponceau S para visualização de amostras e transferência em escada. Remova Ponceau S com PBS sob agitação suave.
    7. Bloqueie as membranas com 5% de leite em pó desnatado e 0,1% de Tween em PBS por 60 min.
    8. Sonda membranas com anticorpos apropriados em diluições de trabalho, incluindo marcadores EV positivos (por exemplo, neste trabalho CD9, CD81, TSG101 e Flotilina) e negativos (por exemplo, neste trabalho Calnexin), a 4 ° C durante a noite.
    9. Lave com Tween a 0.1% em PBS e incube com anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados por 45 min em RT antes que a banda se revele com o sistema ECL de escolha. Adquira imagens com um sistema de imagem disponível (Figura 2A).
  2. Análise por citometria de fluxo de marcadores EV: coloração superficial
    1. Antes de usar, centrifugue cada anticorpo monoclonal (mAb) a 15.000-17.000 x g por 30 min a 4 ° C para eliminar agregados, que podem causar sinais falsos positivos. Além disso, filtre os mAbs em tubos de filtro centrífugo separados de 0,22 μm a 1.000 x g a 4 ° C até que toda a mistura tenha passado pelo filtro e nenhum líquido de anticorpo permaneça na superfície do filtro. Armazene os mAbs a 4 °C.
    2. Prepare uma diluição de 1:10 de EVs corados com CFSE (consulte as etapas 1.2.1-1.2.8) em PBS filtrado com 0,22 μm.
    3. Incubar 100 μL de amostras, ou PBS filtrado por 0,22 μm, com ou sem mAbs específicos para EV (anti-CD9/63/81) ou mAbs específicos para MSC (anti-CD44), previamente titulados. Realize a incubação a 4 °C no escuro por 30 min.
      NOTA: Este protocolo, desenvolvido para detectar EVs típicos e marcadores de linhagem MSC, pode ser estendido a todas as outras linhagens celulares ou marcadores de superfície específicos do subtipo EVs. Não use fluorocromos que caiam no canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para evitar sobreposição com a coloração CFSE de EVs. Realize uma única coloração usando cada mAb conjugado com um fluorocromo, por exemplo, aloficocianina (APC). A coloração multicolorida é possível, mas os controles devem ser incluídos para resolver possíveis problemas de impedimento estérico de anticorpos. É necessário testar os anticorpos individuais sozinhos ou dentro de uma mistura e garantir que o sinal seja comparável. Além disso, os FMOs precisam ser incluídos entre os controles.
    4. Configure a calibração de dispersão conforme descrito na etapa 3.2.
    5. Crie um gráfico de pontos da escala logarítmica de dispersão lateral (SSC) versus a escala logarítmica FITC e execute um tubo de PBS filtrado por 0,22 μm ou EVs não corados; defina o limite no canal FITC e ajuste-o para os valores mais altos que excluem a maioria do ruído de fundo. Desenhe uma região identificando os eventos positivos do CFSE.
    6. Crie um gráfico de histograma APC fechado na região de eventos positivos CFSE e execute um tubo de PBS filtrado por 0,22 μm ou EVs não corados.
      NOTA: Para ganho de APC, use o ganho estabelecido com o CQ do instrumento, embora seja recomendado realizar uma gaintração específica para otimizar o desempenho do instrumento.
    7. Adicione 200 μL de PBS filtrado a 0,22 μm às amostras coradas e adquira. Use uma taxa de fluxo baixa (10 μL por minuto) para aquisição e gravação. Se possível, registre pelo menos 5.000 eventos na porta positiva do FITC.
    8. Use o controle PBS corado com mAb para detectar possíveis sinais aespecíficos dos mAbs. Leia todos os tubos de amostra na mesma taxa de fluxo para garantir a consistência entre as execuções.
    9. Para evitar a contaminação cruzada da amostra, passe um detergente por 10 s entre cada tubo analisado, seguido de 10 s com água deionizada (DI) (Figura 2B).
      NOTA: Para evitar qualquer instabilidade do instrumento fluídico, adquira a amostra por 10 s e comece a gravar.
  3. Análise de citometria de fluxo do marcador EV: Coloração intracelular
    NOTA: Para coloração intracelular, use um kit específico contendo reagentes de fixação e permeabilização. O mAb anti-caveolina é conjugado com Alexa 488. A coloração IC foi realizada na ausência de CFSE.
    1. Antes de usar, centrifugue o mAb conforme descrito anteriormente (etapa 2.2.1).
    2. Para coloração intracelular, siga as instruções do fabricante (Figura 2C).
  4. Caracterização da concentração e tamanho de EV por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    1. Faça diluições apropriadas das amostras para obter 20-120 eventos no quadro de visualização do visor do instrumento NTA.
    2. Injetar as amostras na câmara de recolha de amostras do instrumento NTA utilizando uma seringa de insulina de 1 ml.
    3. Defina o software NTA para gravação da seguinte forma: 5 medições padrão, 60 s cada, e uma bomba de fluxo ajustada para 30.
    4. Defina a intensidade da luz para um valor apropriado, permitindo distinguir claramente as partículas do fundo e executar o script de captura no software NTA.
      NOTA: A configuração do nível da câmera pode influenciar a detecção de partículas. Se o valor for muito alto, um fundo leitoso e um forte espalhamento de luz de partículas emergem, cobrindo a maioria dos sinais de partículas. Se o valor for muito baixo, embora um fundo mais escuro seja obtido, é possível que a maioria dos eventos menos claros seja perdida. Cada amostra deve ser monitorada para uma configuração ideal.
    5. Ajustar o factor de diluição se as partículas por imagem forem inferiores a 20 ou superiores a 80.
    6. Defina o limite como 4 para analisar o tamanho modal médio e a concentração de partículas do sobrenadante. Ter em conta os factores de diluição iniciais.
    7. Limpe a câmara do instrumento com água deionizada após cada sample para evitar contaminação cruzada.
    8. Abra o software de análise NTA e faça a análise nas amostras adquiridas, levando em consideração o fator de diluição (Figura 2D).
  5. Caracterização da morfologia do EV por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
    1. Coletar sobrenadante concentrado em ASCs ou isolar EVs por ultracentrifugação (100.000 x g a 4 °C por 1 h) seguida de suspensão de pellets no mesmo volume de PBS.
    2. Permita que 5 μL do sobrenadante concentrado ou EVs sejam absorvidos em grades revestidas de carbono por 10 min. Seque o excesso de gotas de líquido com papel de filtro.
    3. Realize a coloração negativa com acetato de uranila a 2% em suspensão aquosa por 10 min usando um volume idêntico da gota da amostra (5 μL). Remova o excesso de acetato de uranilo tocando na grade com papel de filtro.
    4. Secar a grelha à temperatura ambiente (RT) e examiná-la com um microscópio electrónico de transmissão a 120 kV (figura 2E).

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Figura 2: Caracterização de ASC-EVs. (A) Western blot representativo de marcadores positivos (CD9, CD81, TSG101 e Flotilina) e negativos (Calnexin) de Western blot representativos. Os pesos moleculares correspondentes são relatados e os lisados de ASCs têm sido usados como controle. (B) Análise de citometria de fluxo de marcadores EVs. A expressão dos seguintes marcadores foi analisada: CD9, CD63, CD81 e CD44. Apenas ASC-EVs positivos para CFSE foram analisados quanto à expressão do marcador. Os histogramas representam ASC-EVs não corados (histogramas vermelhos) e corados (histogramas azuis). (C) Análise intracelular de citometria de fluxo do marcador EVs Caveolina. Os histogramas representam ASC-EVs não corados (histograma cinza) e corados (histogramas azuis). (D) Caracterização de ASC-EVs pela NTA. Os histogramas representam a concentração (partículas/mL)/tamanho (nm) da amostra. (E) Visualização de ASC-EVs por TEM. Barras de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Classificação de ASC-EVs

  1. Configuração do classificador de células
    NOTA: Um classificador de células é um citômetro de fluxo que permite o isolamento de uma população pura de uma amostra inicial heterogênea. O classificador de células separa as partículas alvo oscilando o fluxo com um piezoelétrico em alta frequência para gerar gotas contendo um evento. As gotas que continham as partículas de interesse, como células ou vesículas, são carregadas e desviadas através de placas de deflexão de metal. A fração ordenada é usada para realizar a análise a jusante.
    1. Abra a linha de pressão e aspire.
      NOTA: Alguns classificadores têm uma inicialização automática, enquanto outros têm uma inicialização manual. Um classificador com inicialização manual é o preferido, pois permite a otimização de algumas características técnicas, como frequência, pressão e a escolha da ponta do bico. Em particular, recomenda-se trabalhar com uma frequência de 66.000 Hz, uma pressão de 35 psi e um bico de 70 μm.
    2. Ligue o instrumento, abra o gabinete de biossegurança e inicie o software do classificador.
    3. Pressurize os fluidos e, em seguida, ligue o sistema fluídico.
    4. Ative o Drop Drive, o cristal piezoelétrico no bico que vibra para ter gotículas.
    5. Execute o procedimento de desborbulhamento para eliminar a presença de bolhas no sistema e, em seguida, execute um tubo de 5 mL de solução de limpeza por 5 min em alta pressão diferencial e um tubo de 5 mL de água DI por 5 min.
    6. Execute o procedimento de inicialização manual.
      1. Na guia Controle do Laser, pressione o botão Laser Power para ligar o laser.
        NOTA: Repita este procedimento para todos os lasers: Azul 488 nm, Amarelo-Verde 561 nm, Violeta 405 nm e Vermelho 640 nm.
      2. Examine o alinhamento vertical do fluxo.
        NOTA: Em caso de necessidade, mova o conjunto do bico stage, em particular, micrômetro frontal e traseiro, micrômetro esquerdo e direito e gimbal para ajustar o alinhamento vertical e verificar o fluxo vertical com micrômetro para cima e para baixo; Para o melhor alinhamento, o fluxo deve ser vertical em cada laser. Se esta é a primeira vez que se usa um bico específico, um atraso de laser precisa ser feito. No painel da tela sensível ao toque, na guia Laser and Stream Intercept , selecione o tamanho correto do bico, pressione o botão Laser Delay e siga as instruções de atraso do laser para executar o procedimento de atraso do laser. Em geral, ao alterar a pressão da bainha e, consequentemente, a ponta do bico, a determinação do atraso do laser é executada antes de encontrar o alinhamento. Ao final do procedimento de Laser Delay , sugere-se que o Procedimento de Subtração da Imagem de Fundo seja realizado seguindo as instruções na tela para minimizar o sinal de fundo.
      3. Execute a determinação do ponto do laser pressionando a guia Interceptação do fluxo de laser , o botão Seta verde e seguindo as instruções no monitor da tela sensível ao toque.
    7. Inicialize o Intellisort. Defina a frequência do drive de queda e um valor de amplitude padrão, o que faz com que o fluxo forme uma gota.
      1. Depois que essa etapa for executada, carregue uma configuração salva. Para carregar uma configuração salva, selecione Carregar configuração de classificação na barra de ferramentas do software classificador. Depois de verificar diferentes frequências e amplitudes, escolha a melhor que garanta a melhor estabilidade de queda. Trabalhe a uma frequência de 66.000 Hz e uma amplitude de cerca de 40-45 V.
    8. Execute o procedimento de alinhamento a laser fino .
      1. Carregue no amostrador um tubo de 5 mL de grânulos de alinhamento QC e execute-o; selecione na guia Alinhamento fino o parâmetro desejado nos eixos X e Y para visualizar os cordões bem compactados e colimados. Na área de exibição de dados, selecione primeiro 488 - 513/26-H para o parâmetro do eixo Y e 488-FSC1-H para o parâmetro do eixo X. Em seguida, para ajustar todos os lasers, selecione 405-488/59-H para o parâmetro do eixo Y e 640-795/70-H para o parâmetro do eixo X.
        NOTA: Os parâmetros selecionados dependem da configuração do laser do classificador. A sugestão manual do instrumento é a escolha dos lasers que possuem maior separação espacial na faixa de orifício. Para isso, use um laser violeta (405 nm) e um laser vermelho (640 nm).
      2. Uma vez que o alinhamento manual é verificado pelo especialista em classificação, execute o QC automático. Selecione o diâmetro dos grânulos QC: 3 μm de diâmetro.
        NOTA: No final deste procedimento, o resultado pode ser QC não aprovado ou QC aprovado. Caso o CQ falhe, é necessário otimizar manualmente o alinhamento.
      3. Salve a aquisição de CQ no protocolo de alinhamento do software.
    9. Finalizar o procedimento do Intellisort
      1. Localize as placas de deflexão na posição correta no classificador e ligue o voltage (recomenda-se carga de 3,000 V nas placas de deflexão).
      2. Escolha a saída de classificação de 6 suportes de tubos, habilite os fluxos selecionando-os no indicador de fluxo e execute o fluxo de teste.
        NOTA: Se os fluxos não estiverem claramente separados e definidos, ajuste a fase de carga, defanning ou modifique outros parâmetros para obter um fluxo claramente definido e não oscilante.
      3. Habilite o botão Determinação Automática de Atraso de Queda do Intellisort . Esta etapa permite definir o atraso de queda correto. Após esta etapa, verifique os fluxos novamente.
      4. Ative o modo de manutenção do Intellisort. Verifique o atraso de queda manualmente.
      5. Carregue o protocolo manual de atraso de queda no software do classificador. Adquira esferas de controle fluorescentes.
      6. Insira o suporte de slide correto. No software classificador, selecione Assistente de Classificação > Atraso de Queda. Selecione Lógica de classificação.
      7. Verifique com um microscópio fluorescente a presença de 97% de esferas fluorescentes na quinta poça.
  2. Configuração do instrumento: Calibração de dispersão
    NOTA: A calibração de dispersão é realizada usando contas Verity Shells (doravante chamadas de contas ocas de organo sílica). Esses grânulos de organo sílica são caracterizados por uma distribuição de índice de refração e propriedades de dispersão de luz mais próximas dos EVs do que dos grânulos de poliestireno, permitindo assim a configuração da tensão SSC e FSC para discriminar melhor entre eventos semelhantes a EV e o ruído eletrônico. Os grânulos de organo sílica são constituídos por dois frascos com misturas de grânulos, VER01A (grânulos de 189 nm) e VER01B (grânulos de 374 nm). Cada frasco para injetáveis contém uma mistura de esferas ocas de organo sílica e esferas fluorescentes verdes de 380 nm, referidas como esferas de referência. A concentração dos grânulos ocos de organo sílica é de 1 x 108 grânulos / mL.
    1. Prepare uma amostra de grânulos VER01A e VER01B diluindo uma gota (50 μL) de cada um em 1 mL de PBS filtrado com 0,22 μm com uma concentração final de 5.000 grânulos / μL.
      NOTA: Agite as contas por 5 s antes de usar.
    2. Crie um gráfico de pontos da escala de log SSC versus a escala de log FITC.
    3. Adquira os cordões VER01B e ajuste a tensão para discriminar bem os cordões de referência na parte superior direita do gráfico de pontos SSC/FITC (Figura 3A).
    4. Defina uma região ao redor dessa população de contas.
    5. Crie um gráfico de pontos da escala de log do SSC versus a escala de log do FSC. Identifique as contas de referência e a população de contas VER01B. Defina uma região ao redor da população de grânulos VER01B (Figura 3B).
    6. Adquira grânulos VER01A e crie uma região ao redor dessa população de grânulos (Figura 3C).
      NOTA: Esta população de contas se sobrepõe parcialmente ao ruído de fundo do instrumento.
    7. Adquira PBS filtrado de 0,22 μm e ajuste o limite para diminuir o ruído de fundo do instrumento sem perder a visualização das menores contas.
      NOTA: A calibração de dispersão pode ser feita usando grânulos FSC Megamix (doravante chamados de grânulos de poliestireno FSC), uma mistura de grânulos fluorescentes com os seguintes diâmetros: 100 nm, 300 nm, 500 nm e 900 nm. O uso dos grânulos ocos de organo sílica deve ser preferido aos grânulos de poliestireno FSC porque eles têm distribuição de índice de refração e propriedades de dispersão de luz semelhantes aos EVs. A população de grânulos de poliestireno FSC de 300 nm se sobrepõe à referência dos grânulos ocos de organo sílica. Portanto, uma porta baseada em esferas ocas de organo sílica seleciona EVs de tamanho semelhante no citômetro de fluxo.
  3. Aquisição de amostras
    1. Crie um gráfico de pontos da escala logarítmica SSC versus a escala logarítmica FITC, adquira PBS filtrado por 0,22 μm e defina o ruído de fundo de referência (Figura 4A).
      NOTA: Defina a taxa de fluxo do citômetro para Baixa e controle a taxa de fluxo. O número de eventos/s não deve ser superior a 2.000 eventos/s. Vazão baixa significa baixa pressão diferencial.
    2. Adquirir a amostra de controlo (VE não corada) e verificar o caudal. Certifique-se de que o número de eventos/s seja de cerca de 5.000 eventos/s.
      NOTA: Se o número de eventos exceder o sugerido, dilua a amostra.
    3. Adquira PBS corado e tratado como a amostra CFSE e verifique se nenhum evento positivo é visível ( Figura 4B ).
    4. Adquira a amostra corada com CFSE. Dilua-o com base na taxa de fluxo. Desenhe uma região identificando os eventos positivos do CFSE e outra identificando os eventos negativos do CFSE. Use uma amostra não corada como controle (Figura 5A, B). Estas são as regiões de classificação.
  4. Classificação de amostras
    1. No software classificador, abra um novo protocolo (na barra de ferramentas, selecione Arquivo > Protocolo > Novo).
    2. No software classificador, clique em Configuração de aquisição de dados; na janela Parâmetro de aquisição, selecione os canais de interesse e desative os demais. Para este painel específico, os sinais habilitados são: 488-FSC1, 488-FSC2, 488-SSC e 488-513/26 (para sinal CFSE).
    3. Localize no amostrador um tubo de 5 ml de amostra. Na tela sensível ao toque, clique no botão Carregar e, na barra de ferramentas do software classificador, selecione Aquisição > Início (ou pressione o botão F2 ). Uma janela de propriedades de amostra aparecerá; Insira o nome da amostra e clique em OK.
    4. Crie o painel, com o gráfico de interesse e crie a estratégia de gating.
      1. Na barra de ferramentas do software classificador, selecione Histograma > Criar histograma.
      2. Na área de trabalho, crie três gráficos de pontos, o primeiro com o parâmetro Height-Log 488-FSC1 no eixo x e o Height-Log 488-SSC do eixo y, o segundo com o parâmetro Height-Log no eixo x 488-FSC2 e o Height-Log 488-SSC do eixo y, o terceiro com o parâmetro Height-Log do eixo x 488-513/26 CFSE e o Height-Log do eixo y 488-SSC.
    5. Na guia Classificar, identifique a(s) região(ões) a ser(em) classificada(s). No software classificador, clique em Configuração de classificação. Na janela Lógica e Estatística de Classificação , selecione a região a ser classificada no construtor de lógicas.
      NOTA: Para tomar uma decisão de classificação, há diferentes configurações a serem levadas em consideração: Lógica de classificação, Modo de classificação e Soltar envelope. A Lógica de Classificação está se referindo à estratégia de gating. Os eventos que estão fora do portão selecionado não são classificados. O Modo de Classificação está relacionado à saída final. Trabalhe em Modo Purificar, desta forma, todas as gotas classificadas contêm apenas os eventos positivos desejados. O Drop Envelope define quantas gotas serão cobradas e classificadas em relação ao local na queda do evento positivo: escolha 1-2 gotas para ter certeza de que todos os eventos positivos sejam classificados.
    6. Quando a taxa de fluxo estiver estável, pare a aquisição (na barra de ferramentas do software classificador, selecione Aquisição > Parar ou pressione o botão F2 novamente). Inicie a classificação (na barra de ferramentas do software classificador, selecione Classificar > Iniciar ou pressione o botão F4 ).
      NOTA: Antes de iniciar a classificação, verifique o fluxo de teste. Verifique se a fração classificada cai corretamente no tubo de coleta.
    7. Salve a configuração de classificação. Na barra de ferramentas do software classificador, selecione Classificar > Salvar configurações de classificação.
  5. Verificação da pureza da população selecionada
    1. Lave o instrumento adquirindo um tubo de 5 mL de solução de limpeza por 10 min em alta pressão diferencial e um tubo de 5 mL de água DI por 10 min.
    2. Adquira PBS filtrado por 0,22 μm e verifique se nenhum evento positivo para CFSE está presente.
    3. Diluir 5 μL da amostra classificada em 100 μL de PBS filtrado a 0,22 μm.
    4. Adquira e registre todos os volumes de amostra (Figura 5C, D).
      NOTA: A reanálise de EVs classificados CFSE positivos e negativos é relatada.

figure-protocol-3
Figura 3: Parametrização física com esferas ocas de organo sílica .(A) Gráfico de pontos SSC / FITC: contas fluorescentes verdes de referência foram usadas para definir o parâmetro SSC. Gráfico de pontos SSC/FSC de (B) VER01B e (C) VER01A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Ruído de fundo de referência. (A) Gráfico de pontos SSC / CFSE da amostra PBS. (B) Gráfico de pontos SSC / CFSE da amostra PBS + CFSE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Classificação de ASC-EVs corados com CFSE. (A) Gráfico de pontos SSC/CFSE de EVs não corados, (B) EVs corados com CFSE, (C) EVs negativos CFSE pós-classificação e (D) EVs CFSE positivos pós-classificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análises pós-ordenação

NOTA: Devido à quantidade limitada de material após a classificação, pode não ser possível realizar todas as análises. Com a quantidade obtida, são realizados os seguintes.

  1. Caracterização de EV por citometria de fluxo: coloração superficial (ver passo 2.2)
    NOTA: Conforme descrito anteriormente para pré-classificação de amostras, exceto para preparação de amostras. As amostras após a triagem podem ser utilizadas sem diluição.
    1. Utilizar amostras separadas não diluídas e proceder de acordo com o passo 2.2.3. (Figura 6A)
  2. Caracterização da concentração e tamanho de EV por NTA (consulte a etapa 2.4)
    NOTA: Conforme descrito anteriormente para pré-classificação de amostras, exceto para preparação de amostras. As amostras após a triagem podem ser utilizadas sem diluição.
    1. Utilizar amostras separadas não diluídas e proceder de acordo com o passo 2.4.2. (Figura 6B)
  3. Caracterização da morfologia EV por MET (ver etapa 2.5)
    NOTA: Conforme descrito anteriormente para pré-classificação de amostras, exceto para preparação de amostras.
    1. Adicione 2 mL de PBS a um concentrador centrífugo (membrana de celulose regenerada, MWCO 100 kDa), tampa e centrifugue a 4.000 x g por 10 min em um rotor de caçamba oscilante. Remova o PBS não filtrado da parte inferior do dispositivo de filtro.
    2. Aspirar o filtrado do tubo de recolha. O protocolo de ultrafiltração centrífuga descrito é baseado no processamento de amostras de até 15 mL (volume máximo).
    3. Adicione até 15 mL de amostra ao filtro AU-15 e tampe o dispositivo. Centrifugue a 4.000 x g por até 30 min. Concentre até o volume mínimo que o dispositivo permite, aproximadamente 100-150 μL.
    4. Recuperar a amostra EV concentrada do dispositivo filtrante e proceder como descrito anteriormente para a pré-selecção das amostras MET (passo 2.5.2) ( figura 6C).

figure-protocol-6
Figura 6: Caracterização de ASC-EVs classificados. Análise por citometria de fluxo de marcadores EV. A expressão dos seguintes marcadores foi analisada: CD9, CD63, CD81 e CD44. Apenas ASC-EVs positivos para CFSE foram analisados quanto à expressão do marcador. (A) Os histogramas representam ASC-EVs não corados (histogramas vermelhos) e corados (histogramas azuis). (B) Caracterização de ASC-EVs pela NTA. Os histogramas representam a concentração (partículas/mL)/tamanho (nm) das amostras de pré-classificação (esquerda) e pós-classificação (direita). (C) Visualização de ASC-EVs por TEM de amostra pré-triagem (esquerda) e pós-triagem (direita). Barras de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os grânulos de poliestireno FSC foram classificados para validar a configuração do instrumento e as condições de classificação. Os grânulos de poliestireno FSC são uma mistura de grânulos fluorescentes que variam de 100 nm, 300 nm, 500 nm e 900 nm e são visíveis no canal FITC. A Figura 7A mostra a escala logarítmica SSC versus o gráfico de pontos da escala logarítmica FITC com as quatro populações de grânulos antes da classificação. As populações fluorescentes de 100 nm, 300 nm e 500 nm foram fechadas e classificadas. As contas classificadas foram analisadas quanto à pureza e enriquecimento como uma prova inicial de conceito (Figura 7B). Todas as populações ficaram puras após a triagem. O ruído de fundo de referência é sempre visível nos gráficos de pontos antes e depois da classificação.

Para atender aos requisitos listados no MISEV2018/2023 e demonstrar a natureza das vesículas e seu grau de pureza, foram realizados experimentos para analisar marcadores presentes ou ausentes nas EVs. As EVs são positivas para alguns marcadores de superfície específicos15: CD9, CD63, CD81 e CD44. CD9, CD63 e CD81 pertencem à família das tetraspaninas de proteínas de membrana e são os marcadores mais comuns para identificar exossomos16. O CD44 é um marcador altamente expresso por CTMs e ASCs17.

Os EVs também são positivos para a proteína citosólica Caveolina, conforme demonstrado pelo experimento de citometria de fluxo intracelular. Além disso, o western blot confirma a positividade para CD9, CD81, TSG101, Flotilina e a negatividade para Calnexina (Figura 2).

Em seguida, os ASC-EVs marcados com CFSE foram classificados conforme relatado no protocolo. Esse procedimento de triagem foi repetido quatro vezes, mantendo exatamente as mesmas condições de preparo, coloração e classificação das amostras (Tabela 1). Desta forma, a repetibilidade do protocolo foi demonstrada.

Um conjunto de experimentos foi realizado para analisar a população de ASC-EVs classificada por CFSE e demonstrar que suas características não mudaram por meio da classificação. Em particular, a expressão de CD9, CD63, CD81 e CD44 não muda após a classificação (Figura 6A).

Outro ponto crítico diz respeito às dimensões dos EVs e como eles podem mudar após o procedimento de classificação devido ao estresse induzido pela pressão. A análise pós-classificação foi difícil de realizar devido à pequena quantidade de amostra, mas a análise de rastreamento de nanopartículas demonstra que a distribuição das duas amostras de ASC-EVs (pré e pós-classificação) foi a mesma (Figura 6B). Finalmente, a análise de EVs por meio de TEM demonstra que sua morfologia parece não ser significativamente alterada após a classificação (Figura 6C).

É importante observar que, conforme sugerido pelas diretrizes da estrutura MIFlowCyt-EV18, foi observada uma redução na quantidade de EVs positivos para CFSE após o tratamento com amostra Triton X-100 a 0,1%, apoiando assim sua origem vesicular (Figura 8).

figure-results-1
Figura 7: Classificação de esferas de poliestireno FSC. (A) Gráfico de pontos SSC / FITC de contas antes da classificação. Gráfico de pontos SSC/FITC de grânulos reanalisados após a classificação: (B) grânulos classificados de 100 nm, (C) grânulos classificados de 300 nm e (D) grânulos classificados de 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 8: Degradação da membrana EV na presença do Triton X-100. Triton X-100 na concentração de 0,1% foi adicionado à amostra por 15 min à temperatura ambiente. Gráficos de dispersão representativos de três experimentos independentes de amostras não tratadas (esquerda) e tratadas (direita) são relatados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ExperimentarNúmero de EVs classificadosNúmero de EVs classificados CFSE+Pressão (psi)Bico mmFrequência (Hz)
174 x 1064,8 x 106357066000
244 x 1067 x 106357066000
338 x 1063 x 106357066000
416 x 1062 x 106357066000

Quadro 1: Repetibilidade do procedimento de triagem

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analisar e classificar EVs é um desafio devido ao seu pequeno tamanho e ao fato de estarem próximos do limite de detecção da maioria dos citômetros de fluxo. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo para isolar EVs derivados de AMSCs marcados com CFSE. O CFSE foi selecionado como método de coloração devido à sua alta eficiência de marcação de EVs relatada (≥90%), sem a formação de partículas indesejadas, como agregados de proteínas fornecidos por anticorpos. No entanto, é possível que poucas EVs sem esterase possam ser perdidas e estudos futuros serão necessários para identificar métodos de coloração capazes de marcar essas partículas para protocolos de classificação19.

Nosso objetivo foi estabelecer condições de classificação que permitissem a coleta de EVs puros sem alterar suas propriedades físicas. Isso foi alcançado aproveitando as capacidades técnicas do classificador usado e implementando medidas específicas, como a redução da pressão de classificação padrão de acordo com o tamanho do bico. Estabelecemos e validamos essas condições de classificação usando esferas de poliestireno FSC. Posteriormente, aplicamos este protocolo aos EVs ASC, repetindo o experimento quatro vezes e obtendo resultados semelhantes de forma consistente, confirmando assim a repetibilidade de nosso protocolo.

No entanto, é importante observar alguns aspectos críticos e limitações, que descrevemos aqui. i) Pureza da amostra selecionada: é difícil provar conclusivamente a pureza dos EV CFSE positivos classificados, uma vez que o ruído de fundo do instrumento aparece sempre durante a reanálise. No entanto, podemos supor que enriquecemos a população positiva para CFSE. A ausência de eventos positivos para CFSE na população negativa para CFSE indica que nosso processo de classificação foi bem-sucedido, demonstrando indiretamente a pureza da amostra classificada. (ii) Contaminação potencial da amostra classificada: não podemos descartar a possibilidade de que a fração selecionada possa conter pequenas vesículas que são indetectáveis pelo instrumento e podem ser inadvertidamente incluídas nas gotas de classificação. (iii) Integridade dos EVs pós-triagem: Estamos cientes de que a pressão aplicada pelo instrumento pode danificar as vesículas. Para mitigar isso, usamos um bico de 70 μm com uma pressão mais baixa de 35 psi em vez dos 60 psi padrão. Além disso, preparamos cuidadosamente as amostras, evitando etapas de ultracentrifugação que poderiam alterar as características físicas das VEs. Apesar dessas precauções, não podemos garantir que os EVs classificados permaneçam intactos e inalterados. Portanto, recomendamos incluir análises pós-classificação e, quando possível, testes de funcionalidade para avaliar a condição dos EVs.

Aqui estão algumas possíveis modificações e solução de problemas para o protocolo. Este protocolo foi definido usando um instrumento que permite a mudança de pressões; no entanto, para instrumentos com configurações mais rígidas, recomenda-se o uso de um bico de 100 μm para ter uma pressão mais baixa, a fim de preservar ao máximo a integridade dos EVs.

Apesar dessas considerações, afirmamos que nosso protocolo oferece vantagens significativas em comparação com outros métodos de separação de EV. Em primeiro lugar, permite o isolamento de populações específicas de VEs. Embora tenhamos optado por corar as vesículas com CFSE - um corante fluorescente que identifica estruturas com membranas celulares intactas - também é possível classificar populações específicas de EV usando anticorpos monoclonais. Nesses casos, controles adicionais de coloração são essenciais. A Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), a Sociedade Internacional para o Avanço da Citometria (ISAC) e a Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia (ISTH) fornecem diretrizes abrangentes para a realização de experimentos de citometria de fluxo reprodutível. Instruções detalhadas podem ser encontradas nas diretrizes MISEV 20231 e MIFlowCyt -EV18. Em segundo lugar, este procedimento é menos demorado do que outros métodos que envolvem várias etapas de ultracentrifugação.

Em nossa opinião, este protocolo pode ser uma estratégia bem-sucedida para separar e coletar uma população específica de EVs que poderia ser potencialmente útil para fins terapêuticos.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Emanuele Canonico pelo suporte técnico. Parte deste trabalho foi realizado no ALEMBIC, um laboratório de microscopia avançada estabelecido pelo IRCCS Ospedale San Raffaele e Università Vita-Salute San Raffaele. O trabalho de Enrico Ragni e Laura de Girolamo foi apoiado pelo Ministério da Saúde italiano, "Ricerca Corrente".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína  Éster N-succinimidílicoMerck150347-59-4
Células estromais mesenquimais adiposasWepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gré goire, FrançaCélulas usadas neste estudo
Alexa 488 anti-CaveolinaR& D SystemsIC5736GAnticorpo por citometria de fluxo
APC anti-CD44 humanoBioLegend338805Anticorpo por citometria de fluxo
APC anti-CD63humano BioLegend353007Anticorpo por citometria de fluxo
APC anti-CD81 humano (TAPA-1)BioLegend349509Anticorpo por citometria de fluxo
APC anti-CD9 humanoBioLegend312107Citometria de fluxo anticorpo
BC CytoFLEX SBeckman CoulterBC CytoFLEX S equipado com 3 lasers, Azul, Vermelho e Violeta
Flow-Check Pro FluorospheresBeckman CoulterA63493Esferas de controle fluorescentes para MoFLO Astrios EQ
Software FlowJo (versão 10.8.1)BDversão 10.8.1Software de análise
Kit IntraSure BDBiosciences641776Fixação e permeabilização para coloração intracelular
Megamix-Plus FSCBioCytex7802FSC contas de poliestireno 
MoFLO Astrios EQBeckman CoulterMoFLO Astrios EQ equipado com 4 lasers, azul, amarelo - verde, violeta e vermelho
Anticorpo anti-FLOT1 do ratoBD Transduction Laboratories610820Anticorpo Western Blot
NanoSight NS300MalvernNS300
Anticorpo anti-Calnexina do coelhoAnticorpo
Origene TA336279 Western BlotAnticorpo anti-CD9 e CD81 para coelhos (kit de anticorpos ExoAb)Anticorpos Western BlotEXOAB-KIT-1System Biosciences
Anticorpo anti-TSG101 para coelhos MerckHPA006161Western Blot anticorpo
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Rainbow Partículas FluorescentesSpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Verity ShellsExometriaGrânulos de sílica Organo para calibração de dispersão
da

Referências

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