Aqui, apresentamos um protocolo para isolar exossomos derivados do baço de camundongo usando uma combinação de digestão com colagenase tipo I e ultracentrifugação.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os exossomos (Exo) são estruturas de bicamada lipídica secretadas por várias células, incluindo as de animais, plantas e procariontes. Estudos anteriores revelaram que o Exo derivado de sobrenadante humoral ou celular é alvo promissor para novos biomarcadores diagnósticos ou prognósticos, ressaltando seu papel significativo na patogênese da doença. O Exo derivado de tecido (Ti-Exo) tem atraído cada vez mais atenção devido à sua capacidade de refletir com precisão a especificidade do tecido e o microambiente. Ti-Exo, presente no espaço intersticial, desempenha papéis cruciais na comunicação intercelular e na sinalização entre órgãos. Apesar de seu valor reconhecido na elucidação de mecanismos de doenças, o isolamento de Ti-Exo continua sendo um desafio devido à complexidade das matrizes teciduais e à variabilidade nos métodos de extração. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo prático para isolar exossomos do tecido do baço de camundongos, fornecendo uma técnica reprodutível para posterior análise de identificação e estudos funcionais. Usamos digestão de colagenase tipo I combinada com ultracentrifugação diferencial para isolar Exo derivado do baço. As características do Exo isolado foram determinadas por meio de microscopia eletrônica, citômetro de nanofluxo e western blot. O Exo isolado derivado do baço exibiu a morfologia típica das vesículas de bicamada lipídica, com tamanhos de partícula variando de 30 nm a 150 nm. Além disso, o perfil de expressão dos marcadores de exossomos confirmou a presença e pureza dos exossomos. Em conjunto, estabelecemos com sucesso um protocolo prático para isolar o Exo derivado do baço em camundongos.
Introdução
Os exossomos (Exo) são um subgrupo de vesículas extracelulares (EVs), variando de 30 a 150 nm de tamanho, encapsulando uma gama diversificada de biomoléculas, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios1. Essas biomoléculas são derivadas das células parentais e são liberadas no espaço extracelular. O Exo facilita a troca de informações biomoleculares entre as células e seu microambiente circundante, desempenhando papéis nos sistemas procariótico e eucariótico2. As características dos exossomos, como conteúdo, tamanho, componentes da membrana e origem celular, são altamente variáveis....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
As amostras foram obtidas de camundongos, com aprovação ética concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Guangdong. Descrições detalhadas de materiais, equipamentos e software usados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Os detalhes da preparação antes da extração são ilustrados na Figura 1, enquanto o processo de extração e enriquecimento do Spleen-Exo é descrito na Figura 2.
1. Preparação
- Pré-arrefecer centrífugas de alta e ultra-alta velocidade a 4 °C e ajustar a temperatura de um agitador de mesa a 37 ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Isolamento e purificação de exossomos derivados do baço
Para isolar os exossomos do tecido do baço de camundongos, empregamos uma combinação de digestão de colagenase e ultracentrifugação diferencial (Figura 2). As etapas iniciais envolveram o pré-tratamento do tecido do baço para remover o sangue da superfície, seguido pela digestão com colagenase tipo I. Esse tratamento enzimático facilitou a quebra dos componentes da matriz extracelular, liberando assim os exossomos e .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Pesquisas recentes relataram que os exossomos derivados do baço (Spleen-Exo) desempenham um papel crítico no tratamento do câncer gástrico12. Para elucidar ainda mais as funções do Spleen-Exo, é necessário estabelecer um método reprodutível e ideal para sua extração do tecido do baço. Embora existam protocolos para isolar exossomos de câncer cerebral e hepático13,14, os métodos para outros tecidos permanec.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82370281, 81870222), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2022A1515012103) e pelo Projeto de Alocação Competitiva do Fundo Especial de Desenvolvimento Tecnológico de Ciência da Cidade de Zhanjiang (2021A05086) e pela Fundação Startup do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangdong (23H03).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 70 µ m Cell Strainer | Biologix Group Co., Ltd.USA | 15-1070 | |
| Anti CD9 anticorpo | Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA | 983275 | |
| Anti GM130 anticorpo | Proteintech Group, Inc.China | 66662-1-lg | |
| anticorpo TSG101 | Abcam Plc, Reino Unido | 125011 | |
| placa de cultura de células | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China | Tubo de | |
| Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China | 788211 | ||
| colagenase tipo I | Sigma-Aldrich Corp., EUA | C2674 | |
| Agitador | termostático de mesaXangai bluepard instruments Co., Ltd., China | THZ-100 | |
| Eletroforese buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China | G2081-1L | |
| melhorou a | biotecnologia Co. de Shanghai Beyotime do jogo do ensaio da proteína do BCA, Ltd., China | P0010S | |
| Flow NanoAnalyzer | NanoFCM Inc., China | N30E | |
| Sistema de imagem de fluorescência / quimioluminescência | Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China | GelView 6000Plus | |
| HRP Goat anti-Mouse IgG | Proteintech Group, Inc.China | 15014 | |
| HRP Cabra anti-Coelho IgG | Proteintech Group, Inc.China | 15015 | |
| Molecular Devices, USA | CMax Plus | ||
| Microscissors | Shanghai Médico Instruments (group) Co., Ltd.,China | WA1010 | |
| Pinças microscópicas | Shanghai Médico Instrumentos (grupo) Co., Ltd.,China | WA3010 | |
| Multifuge X1R Pro centrífuga | Thermo Fisher Scientific, EUA | 75009750 | |
| Tesoura oftálmica | Xangai Médico Instruments (group) Co., Ltd.,China | Y00030 | |
| Pinças Oftálmicas | Xangai Médico Instruments (Group) Co., Ltd., China | JD1060 | |
| Optima XPN-100 Centrífuga de ultrafiltração | Beckman Coulter, EUA | A94469 | |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., China | P1003 | |
| Tampão de lise RIPA (forte, sem inibidores) | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China | P0013K | |
| Régua | Deli Fabricação Empresa, China | ||
| SDS-PAGE Buffer de Carregamento de Amostras, 5x | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China | P0015 | |
| Tubo de Transferência | Biologix Group Co., Ltd.USA | 30-0238A1 | |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | Hitachi, Japão | H-7650 | |
| Beckman Coulter, EUA | 355618 | ||
| Tampão de Transferência Ocidental | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China | G2028-1L |
Referências
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015)....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
