Artigo de método

Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

DOI:

10.3791/67234

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20 de setembro de 2024

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1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar exossomos derivados do baço de camundongo usando uma combinação de digestão com colagenase tipo I e ultracentrifugação.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os exossomos (Exo) são estruturas de bicamada lipídica secretadas por várias células, incluindo as de animais, plantas e procariontes. Estudos anteriores revelaram que o Exo derivado de sobrenadante humoral ou celular é alvo promissor para novos biomarcadores diagnósticos ou prognósticos, ressaltando seu papel significativo na patogênese da doença. O Exo derivado de tecido (Ti-Exo) tem atraído cada vez mais atenção devido à sua capacidade de refletir com precisão a especificidade do tecido e o microambiente. Ti-Exo, presente no espaço intersticial, desempenha papéis cruciais na comunicação intercelular e na sinalização entre órgãos. Apesar de seu valor reconhecido na elucidação de mecanismos de doenças, o isolamento de Ti-Exo continua sendo um desafio devido à complexidade das matrizes teciduais e à variabilidade nos métodos de extração. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo prático para isolar exossomos do tecido do baço de camundongos, fornecendo uma técnica reprodutível para posterior análise de identificação e estudos funcionais. Usamos digestão de colagenase tipo I combinada com ultracentrifugação diferencial para isolar Exo derivado do baço. As características do Exo isolado foram determinadas por meio de microscopia eletrônica, citômetro de nanofluxo e western blot. O Exo isolado derivado do baço exibiu a morfologia típica das vesículas de bicamada lipídica, com tamanhos de partícula variando de 30 nm a 150 nm. Além disso, o perfil de expressão dos marcadores de exossomos confirmou a presença e pureza dos exossomos. Em conjunto, estabelecemos com sucesso um protocolo prático para isolar o Exo derivado do baço em camundongos.

Introdução

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Os exossomos (Exo) são um subgrupo de vesículas extracelulares (EVs), variando de 30 a 150 nm de tamanho, encapsulando uma gama diversificada de biomoléculas, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios1. Essas biomoléculas são derivadas das células parentais e são liberadas no espaço extracelular. O Exo facilita a troca de informações biomoleculares entre as células e seu microambiente circundante, desempenhando papéis nos sistemas procariótico e eucariótico2. As características dos exossomos, como conteúdo, tamanho, componentes da membrana e origem celular, são altamente variáveis e influenciadas pelo tipo de célula de origem, estado celular e condições ambientais.

Os exossomos são comumente classificados em três categorias com base em sua fonte: derivados de cultura de células, derivados de fluidos corporais e derivados de tecidos (Ti-Exo). Embora os exossomos derivados de cultura de células tenham sido extensivamente estudados devido à sua acessibilidade e rendimento consistente, seu uso é limitado por possíveis alterações nas características celulares após cultura prolongada, o que pode deturpar suas funções biológicas 3,4,5. Além disso, a maioria das culturas de células é mantida em ambientes bidimensionais que não imitam as complexas interações intercelulares in vivo, potencialmente impactando a interpretação dos dados6. Por outro lado, exossomos isolados de fluidos biológicos oferecem uma opção minimamente invasiva para monitorar a progressão da doença em tempo real7. No entanto, essas amostras geralmente contêm uma mistura de exossomos de várias origens, complicando a identificação precisa de sua fonte primária8. Dados esses desafios, há um interesse crescente no Ti-Exo, que reside no interstício extracelular e é um dos principais mediadores da sinalização intercelular.

O baço desempenha um papel crucial na função imunológica e na manutenção da homeostase interna. Apesar dos protocolos existentes para isolar Ti-Exo de órgãos como cérebro, fígado e tumores, métodos práticos para exossomos derivados do baço são relatados de forma limitada 9,10. Este estudo teve como objetivo estabelecer um protocolo prático para isolamento de exossomos do tecido esplênico em camundongos modificado a partir de um relato anterior11. Detalhamos um método que envolve a digestão da colagenase seguida de ultracentrifugação, que minimiza a ruptura da membrana celular e garante alta pureza e rendimento do Exo derivado do baço. As características do Exo isolado usando este protocolo estabelecido foram validadas por meio de microscopia eletrônica (TEM), citômetro de nanofluxo (Nano-FCM) e western blot, confirmando a eficácia do protocolo para pesquisas experimentais futuras.

Protocolo

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As amostras foram obtidas de camundongos, com aprovação ética concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Guangdong. Descrições detalhadas de materiais, equipamentos e software usados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Os detalhes da preparação antes da extração são ilustrados na Figura 1, enquanto o processo de extração e enriquecimento do Spleen-Exo é descrito na Figura 2.

1. Preparação

  1. Pré-arrefecer centrífugas de alta e ultra-alta velocidade a 4 °C e ajustar a temperatura de um agitador de mesa a 37 °C.
  2. Prepare placas de cultura de células (figure-protocol-1100 mm), tubos de centrífuga estéreis de 50 mL, gelo e filtro de células estéreis (figure-protocol-270 μm) conforme mostrado na Figura 1A, B.
  3. Esterilize tesouras e pinças com spray de álcool 75%, seguido de esterilização em alta temperatura. Essas ferramentas são mostradas na Figura 1C.
  4. Coloque o tecido do baço em uma placa de Petri estéril figure-protocol-3de 100 mm no gelo e lave o sangue da superfície com 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) gelada. Seque os tecidos do baço com gaze estéril e pese-os após a secagem.
    NOTA: Se o tecido estiver congelado, descongele-o em um prato por 15 min no gelo antes de prosseguir.
  5. Hidrate o filtro de células (figure-protocol-470 μm) colocando 1 mL de PBS estéril no filtro usando uma pipeta de transferência estéril.
  6. Prepare o tampão digestivo (0,1% colagenase tipo I) usando 1x PBS com um misturador de vórtice.
    NOTA: Use 10 mL de tampão digestivo para cada 100 mg de tecido do baço. A concentração de colagenase foi escolhida neste estudo com base nas instruções do produto. Para outros tipos de tecido, os pesquisadores podem precisar ajustar esses parâmetros com base na densidade e composição do tecido. Experimentos preliminares com concentrações e tempos de digestão variados são recomendados para determinar as condições ideais para cada tipo de tecido.

2. Digestão de tecidos

  1. Pique o tecido em pequenos pedaços uniformes com uma tesoura em uma placa de cultura sobre gelo (Figura 3A) e transfira para um tubo de centrífuga de 50 mL com uma pipeta de transferência estéril.
  2. Adicione o tampão de digestão ao tubo de acordo com o peso do tecido do baço, conforme indicado acima (Figura 3B), agite o tubo com um ângulo de 45° em um agitador horizontal a 37 °C. Monitore o progresso da digestão e pare a digestão quando os pedaços de tecido se dispersarem e a maioria perder a forma. O tempo de digestão deve variar entre os tecidos. Nas condições experimentais deste estudo, o tempo de digestão é de aproximadamente 30 min.
  3. Transferir a mistura digerida para um filtro celular (Ф70 μm) à temperatura ambiente (RT) para remover os detritos fibrosos e de tecido maior.
    NOTA: Filtração completa imediatamente após a digestão.
  4. Recolher o filtrado num novo tubo de centrifugação de 50 ml.

3. Isolamento de exossomos por centrifugação diferencial

  1. Centrifugar os filtrados a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Um pellet contendo células residuais, detritos celulares e núcleos pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3C.
  2. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Um pellet contendo corpos apoptóticos e microssomas pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3D.
  3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Pellet contendo microvesículas e membrana plasmática pode ser visto após centrifugação, conforme mostrado na Figura 3E.
  4. Ultracentrifugar o sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3F.
  5. Rejeitar o sobrenadante, lavar o sedimento com PBS e voltar a fazer a ultracentrifugação a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obter exossomas. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3G.
  6. Dissolver os exossomas isolados com PBS estéril (200 μL por baço) e armazenar os exossomas isolados num novo tubo de centrifugação de 2 ml a -80 °C.

4. Caracterização de exossomas por microscopia eletrónica de transmissão (MET)

NOTA: O TEM foi usado para determinar se o Exo extraído exibia características de vesícula. As amostras Exo identificadas por microscopia electrónica devem ser amostras frescas ou armazenadas brevemente a 4 °C durante um curto período de tempo.

  1. Fixe os exossomos (2-6 μg / μL) com paraformaldeído de grau de microscopia eletrônica (EM) a 2% em RT por 2 h.
  2. Coloque 10 μL de solução de exossomo em uma malha de cobre, incube em RT por 10 min, enxágue com água destilada estéril e seque o excesso de líquido com papel absorvente.
  3. Manchar a malha de cobre com acetato de uranilo a 2% por 1 min, secar o excesso de líquido com papel de filtro e secar sob uma lâmpada incandescente por 2 min.
  4. Observar a amostra preparada ao microscópio electrónico de transmissão a 80 kV.

5. Distribuição de tamanho e medição da concentração de partículas de exossomos

  1. Carregar as nanopartículas de poliestireno padrão (250 nm) no citómetro de nanofluxo.
  2. Meça a concentração de proteína de amostras Exo usando um kit de ensaio de proteína BCA. Dilua a amostra Exo com PBS de acordo com os resultados do ensaio de proteína BCA (dilua os exossomos para 1-10 ng/μL) e, em seguida, carregue as amostras Exo no nanofluxo para medir a intensidade de dispersão lateral (SSI).
  3. Calcule a concentração de Exo de acordo com a proporção de SSI para concentração de partículas nas nanopartículas de poliestireno padrão.
    NOTA: Para medição de tamanho, uma curva padrão é gerada carregando nanopartículas de sílica padrão com tamanhos de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) para o citômetro de nanofluxo. O carregamento da amostra Exo segue isso. A distribuição de tamanho do Exo foi calculada de acordo com a cura padrão.

6. Confirmação de lise e immunoblot de proteínas exossômicas

  1. Adicione 100 μL de tampão de lise de ensaio de imunoprecipitação de rádio (RIPA) ao pellet de exossomo para análise de proteínas.
  2. Vórtice vigorosamente, cubra com parafilme, balance por 20 min em RT e depois vórtice novamente.
  3. Centrifugue brevemente a 1000 x g por 30-60 s para coletar a amostra, transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a -20 ° C a -80 ° C até a análise.
  4. Para immunoblot, misture amostras com tampão de carga 5x para atingir uma concentração de 1x e prepare-se para eletroforese em gel.
  5. Se forem desejados controles de homogeneizado de tecido inteiro, use um tampão de lise forte com um inibidor de protease para lisar o tecido, conforme detalhado acima. Em seguida, centrifugue as amostras a 10.000 x g por 10 min e descarte a matriz extracelular restante, células inteiras ou detritos celulares intactos.
  6. Ferva o tampão de amostra contendo exossomos ou homogeneizado de tecido a 95 °C por 5-10 min. Carregue a mesma proteína por pista em um gel SDS-PAGE a 10%. Carregue a proteína igual do homogeneizado do tecido como controle.
  7. Prossiga com a eletroforese em gel sob uma tensão de 80 V por aproximadamente 2 h usando o tampão de eletroforese convencional. Realize a análise de western blot para confirmar a expressão da proteína Exo nos lisados purificados e comparar a abundância relativa de Exo em frações.

Resultados

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Isolamento e purificação de exossomos derivados do baço
Para isolar os exossomos do tecido do baço de camundongos, empregamos uma combinação de digestão de colagenase e ultracentrifugação diferencial (Figura 2). As etapas iniciais envolveram o pré-tratamento do tecido do baço para remover o sangue da superfície, seguido pela digestão com colagenase tipo I. Esse tratamento enzimático facilitou a quebra dos componentes da matriz extracelular, liberando assim os exossomos e preservando sua integridade. Após a digestão, uma série de etapas de centrifugação foi empregada para remover sequencialmente detritos celulares, corpos apoptóticos e vesículas maiores, culminando na ultracentrifugação do sobrenadante a 120.000 x g para pellet os exossomos. Os procedimentos de isolamento subsequentes produziram pellets solúveis em PBS enriquecidos com Exo derivado do baço, conforme mostrado na Figura 3G.

Resultados do GDT
A morfologia dos exossomos isolados foi examinada usando microscopia eletrônica de transmissão, um método padrão-ouro para estudar a caracterização dos exossomos. O MET é comumente usado para validar a presença de exossomos, avaliar a qualidade dos exossomos e observar a morfologia dos exossomos. As imagens MET (Figura 4A) revelaram a presença de vesículas em forma de taça, que são características dos exossomos. Essas vesículas exibiam uma estrutura clara de bicamada lipídica, confirmando o isolamento bem-sucedido dos exossomos do tecido do baço.

Distribuição de tamanho do Spleen-Exo
A distribuição de tamanho e a concentração dos exossomos foram determinadas usando um citômetro de nanofluxo. Os resultados (Figura 4B) indicaram que o diâmetro dos exossomos isolados variou de 30 a 150 nm, com um pico de concentração em aproximadamente 60 nm. O diâmetro das partículas isoladas foi predominantemente de 50-80 nm, com uma concentração média de partículas de 4,6 x 109 partículas/mL. Essa faixa de tamanho é consistente com as características dos exossomos relatadas anteriormente, validando ainda mais o protocolo de isolamento.

Análise de Western blot
Para confirmar a presença de marcadores exossômicos, realizamos uma análise de western blot. Os marcadores exossômicos TSG101 e CD9 foram detectados nas amostras de Spleen-Exo, enquanto GM130, uma proteína da matriz de Golgi usada como controle negativo, não foi detectada (Figura 4C). Em comparação, a proteína desses marcadores foi expressa em tecidos do baço de camundongos (Spleen-T). Isso indica a alta pureza dos exossomos isolados, pois eram desprovidos de contaminantes celulares.

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Figura 1: Preparação do insuprimento. (A) Tubos de centrífuga de 50 mL, placas de cultura, gelo e ferramentas cirúrgicas foram colocados em uma cabine de biossegurança. (B) Um filtro de células estéreis (figure-results-270 μm). (C) Ferramentas de cirurgia esterilizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Procedimento de isolamento Spleen-Exo. Prepare o tecido do baço e corte-o em pequenos pedaços em PBS gelado, seguido de digestão com colagenase tipo I e centrifugação conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagens representativas do isolamento Spleen-Exo. (A) Pequenos blocos de baço prontos para digestão subsequente. (B) Blocos de tecido do baço com tampão de digestão. (C) Pellets após centrifugação de 500 x g . (D) Pellets após centrifugação de 3.000 x g . (E) Pellets após centrifugação de 10.000 x g . (F) Pellets após centrifugação de 120.000 x g . (G) Pellets de exossomos após centrifugação de 120.000 x g . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 4: Identificação de Spleen-Exo. (A) Resultados do MET mostrando partículas isoladas como vesículas membranosas redondas ou ovais com morfologia em forma de taça. Barra de escala = 200 nm e 50 nm, respectivamente. (B) A análise da distribuição de tamanho pelo Flow Nano Analyzer mostrou que o diâmetro do Spleen-Exo variou predominantemente de 50 nm a 80 nm, com uma concentração média de partículas de 4,6 × 109 partículas/mL. (C) Análise de Western blot mostrando expressão de proteínas marcadoras específicas do exossomo (TSG101 e CD9) em Spleen-Exo, com expressão negativa de GM130. Esses marcadores foram detectáveis em amostras de proteínas extraídas de baços de camundongos (grupo Baço-T). As imagens representativas de western blot foram mostradas (n = 6 tecidos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Pesquisas recentes relataram que os exossomos derivados do baço (Spleen-Exo) desempenham um papel crítico no tratamento do câncer gástrico12. Para elucidar ainda mais as funções do Spleen-Exo, é necessário estabelecer um método reprodutível e ideal para sua extração do tecido do baço. Embora existam protocolos para isolar exossomos de câncer cerebral e hepático13,14, os métodos para outros tecidos permanecem subdesenvolvidos e requerem validação adicional. Neste estudo, delineamos um método prático para isolar Exo do tecido do baço.

Nos últimos anos, vários métodos foram usados para extrair Exo em pesquisas e aplicações científicas, incluindo ultracentrifugação, centrifugação por gradiente de densidade, imunoadsorção de esferas magnéticas, ultrafiltração e precipitação de polímeros15. A ultracentrifugação continua sendo o método padrão-ouro para extrair Exo de várias fontes. Estudos anteriores se concentraram em interromper as estruturas teciduais para obter concentrações mais altas de Exo, que consiste em fontes intracelulares e extracelulares de Exo16. A colagenase minimiza o impacto na integridade da membrana celular, garantindo a pureza do Ti-Exo3. A colagenase tem sido usada para extrair vesículas extracelulares de melanoma metastático humano, tecido adiposo, câncer de cólon e tecido de câncer de fígado 5,10,13,17. No entanto, a concentração e o tempo de digestão da colagenase variam entre os diferentes tecidos.

Estabelecemos um protocolo específico para isolar o Spleen-Exo usando colagenase Tipo I para digestão, seguida de filtração por ultracentrifugação diferencial, para produzir Spleen-Exo de alta qualidade. A ultracentrifugação pode efetivamente remover células residuais, vesículas grandes, detritos celulares e corpos apoptóticos das amostras16. Crescitelli e col. empregaram colagenase D e ultracentrifugação gradiente para isolar pequenas vesículas extracelulares com tamanho médio de 75 nm de diâmetro5. Comparado com o protocolo, nosso protocolo usou colagenase tipo I e uma etapa adicional de ultracentrifugação a 120.000 x g para atingir a pureza ideal dos exossomos. Em contraste com relatos anteriores usando homogeneização tecidual para obter suspensão tecidual14,18, nossa abordagem preserva a integridade da membrana das células nos tecidos. Além disso, Vella et al. aplicaram centrifugação com gradiente de densidade (um gradiente triplo de sacarose) para gerar três grupos de partículas, o que exigiu tempo extra para a operação10. Essa abordagem produziu grandes vesículas com tamanho superior a 200 nm, uma população heterogênea de vesículas com tamanhos variando de 50 nm a 200 nm e pequenas vesículas com cerca de 20 nm de tamanho. O protocolo descrito neste protocolo de estudo envolve uma série de etapas de ultracentrifugação para eliminar metodicamente células residuais, detritos celulares, corpos apoptóticos e vesículas maiores, aumentando assim a pureza do Exo obtido. Enfatizamos o manuseio cuidadoso durante a coleta do sobrenadante para evitar perturbar os pellets sedimentados.

Avaliamos a morfologia e pureza do Spleen-Exo isolado por meio de TEM e análise de rastreamento de nanopartículas. Ambos os ensaios revelaram que as partículas derivadas do baço isoladas por esse protocolo exibiam uma bicamada lipídica e vesículas em forma de taça com tamanhos variando de 30 nm a 150 nm, características típicas dos exossomos19. CD9 e TSG101 são marcadores de exossomos19, e GM130, uma proteína de Golgi, é usada como marcador negativo para identificação de exossomos20. Os resultados mostraram que o Spleen-Exo foi positivo para CD9 e TSG101, enquanto o GM130 não foi detectado, confirmando o isolamento bem-sucedido de Exo derivado de tecido de alta qualidade do baço.

Para obter Ti-Exo de alta qualidade, é essencial selecionar o tipo de enzima, concentração e duração da digestão apropriados, bem como o armazenamento adequado do tecido. Não observamos diferença significativa nas concentrações de proteínas entre Exo derivado de tecidos do baço frescos versus congelados (dados não mostrados), indicando a viabilidade do processamento de grandes quantidades de tecidos congelados para reduzir o fluxo de trabalho. O isolamento do Ti-Exo requer um longo tempo de operação para a ultracentrífuga, tornando impraticável a conclusão de todo o protocolo dentro de um período apropriado ao usar tecidos frescos em aplicações clínicas. Assim, usar tecidos congelados para isolamento de exossomos seria uma opção melhor. O descongelamento a 37 °C não é adequado para tecidos congelados devido à penetração incompleta de agentes crioprotetores nos tecidos. Foi relatado que, ao realizar o isolamento de exossomos usando tecidos congelados descongelados em gelo, o rendimento dos exossomos não mostrou significância no conteúdo em comparação com os tecidos frescos21. Assim, descongelamos os tecidos do baço congelados no gelo para realizar o isolamento do exossomo ao usar as amostras de armazenamento a -80 °C.

No entanto, o protocolo descrito neste estudo apresenta várias limitações. As extensas etapas envolvidas na extração e identificação são demoradas. Dado o objetivo final de aplicar a pesquisa Exo ao tratamento clínico de doenças, métodos mais rápidos e econômicos estão se tornando cada vez mais críticos. Além disso, embora os resultados sejam baseados em amostras de tecido de camundongo, a aplicabilidade aos tecidos humanos ainda precisa ser determinada.

Em conclusão, o protocolo fornece um método para extrair Exo altamente puro do tecido do baço, adequado para análise detalhada a jusante. O Exo derivado de tecido reflete o microambiente de sua origem com mais precisão e possui um potencial significativo para elucidar processos fisiológicos e patológicos em organismos vivos. Estudos futuros poderão adaptar este protocolo a tecidos humanos, permitindo a extração de exossomos clinicamente relevantes para fins diagnósticos e terapêuticos. Essa técnica pode ser particularmente útil no estudo do papel dos exossomos nas respostas imunes, dada a função crítica do baço no sistema imunológico. Além disso, o protocolo pode ser modificado para isolar exossomos de outros tecidos, potencialmente auxiliando no desenvolvimento de biomarcadores específicos de tecido e terapias direcionadas. Ao melhorar nossa compreensão da biologia dos exossomos, este protocolo pode contribuir para avanços na medicina de precisão e no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82370281, 81870222), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2022A1515012103) e pelo Projeto de Alocação Competitiva do Fundo Especial de Desenvolvimento Tecnológico de Ciência da Cidade de Zhanjiang (2021A05086) e pela Fundação Startup do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangdong (23H03).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
70 µ m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 anticorpoCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 anticorpoProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
anticorpo TSG101Abcam Plc, Reino Unido125011
placa de cultura de célulasWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, ChinaTubo de
Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China788211
colagenase tipo ISigma-Aldrich Corp., EUAC2674
Agitadortermostático de mesaXangai bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
Eletroforese bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2081-1L
melhorou abiotecnologia Co. de Shanghai Beyotime do jogo do ensaio da proteína do BCA, Ltd., China P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChinaN30E
Sistema de imagem de fluorescência / quimioluminescência Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinaGelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP Cabra anti-Coelho IgGProteintech Group, Inc.China 15015
Molecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai  Médico  Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaWA1010
Pinças microscópicasShanghai  Médico  Instrumentos (grupo) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrífugaThermo Fisher Scientific, EUA75009750
Tesoura oftálmicaXangai  Médico  Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaY00030
Pinças OftálmicasXangai  Médico  Instruments (Group) Co., Ltd., China JD1060
Optima XPN-100 Centrífuga de ultrafiltraçãoBeckman Coulter, EUAA94469
solução salina tamponada com fosfato (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., ChinaP1003
Tampão de lise RIPA (forte, sem inibidores)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0013K
RéguaDeli  Fabricação  Empresa, China
SDS-PAGE Buffer de Carregamento de Amostras, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0015
Tubo de TransferênciaBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscópio Eletrônico de TransmissãoHitachi, JapãoH-7650
Beckman Coulter, EUA355618
Tampão de Transferência Ocidental Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2028-1L
centrífuga 704001 Leitor de microplacas Tubo de Ultracentrifugação

Referências

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