Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

Resumo

O protocolo proposto envolve uma abordagem global para avaliar a formação óssea no contexto da regeneração óssea usando análises multimodais. Tem como objetivo fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a nova formação óssea, aumentando o rigor e a validade das investigações básicas e pré-clínicas.

Resumo

A extensa caracterização da mineralização tecidual no contexto da regeneração óssea representa um desafio significativo, dadas as inúmeras modalidades atualmente disponíveis para análise. Aqui, propomos um fluxo de trabalho para uma avaliação abrangente da nova formação óssea usando um explante ex vivo ósseo de grande porte animal relevante. Um defeito ósseo (diâmetro = 3,75 mm; profundidade = 5,0 mm) é criado em uma cabeça femoral de ovelha explantada e injetado com um substituto ósseo macroporoso carregado com um fator de crescimento pró-osteogênico (proteína morfogenética óssea 2 - BMP2). Posteriormente, o explante é mantido em cultura por um período de 28 dias, permitindo a colonização celular e posterior formação óssea. Para avaliar a qualidade e a estrutura do tecido recém-mineralizado, os seguintes métodos sucessivos são estabelecidos: (i) Caracterização e imagens 3D de alta resolução de todo o explante usando micro-CT, seguidas de análises de imagem de aprendizado profundo para melhorar a discriminação de tecidos mineralizados; (ii) Nano-indentação para determinar as propriedades mecânicas do tecido recém-formado; (iii) Exames histológicos, como Hematoxilina/Eosina/Açafrão (HES), tricrômico de Goldner e pentacromo de Movat para avaliação qualitativa do tecido mineralizado, particularmente no que diz respeito à visualização da barreira osteóide e à presença de células ósseas; (iv) Mapeamento de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de retroespalhamento com referência interna para quantificar o grau de mineralização e fornecer informações detalhadas sobre a morfologia da superfície, composição mineral e interface osso-biomaterial; (v) Espectroscopia Raman para caracterizar a composição molecular da matriz mineralizada e fornecer informações sobre a persistência de BMP2 dentro do cimento através da detecção de ligações peptídicas. Esta análise multimodal fornecerá uma avaliação eficaz do osso recém-formado e insights qualitativos e quantitativos abrangentes sobre tecidos mineralizados. Por meio da padronização desses protocolos, pretendemos facilitar as comparações entre estudos e melhorar a validade e a confiabilidade dos resultados da pesquisa.

Introdução

Os defeitos ósseos, sejam eles causados por trauma, ressecção tumoral, anomalias congênitas ou infecção, representam um grande desafio para a medicina regenerativa. Essas alterações comprometem a integridade estrutural do sistema esquelético, levando a desconforto, comprometimento funcional e redução da qualidade de vida dos pacientes.

Para superar esses desafios, surgiram estratégias inovadoras de reparo ósseo, com foco no aprimoramento da osteogênese e da regeneração do tecido ósseo. Essas abordagens incluem o uso de substitutos ósseos implantáveis, injetáveis ou imprimíveis em 3D, que podem ser de origem natural (por exemplo, macromoléculas de origem biológica, hidroxiapatita de origem animal) ou sintéticos (por exemplo, biovidros, fosfatos de cálcio)¹. Para aumentar sua baixa capacidade inerente de guiar e estimular a regeneração óssea, os substitutos ósseos podem ser carregados com fatores osteoindutores, como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), para promover a diferenciação osteogênica das células progenitoras e aumentar a formação óssea².

A formação óssea baseia-se na formação inicial de uma matriz de colágeno, que é então mineralizada por cristais de hidroxiapatita, reforçando a estrutura óssea³. Este processo confere rigidez e resistência específicas ao osso. A qualidade do tecido mineralizado é intrinsecamente governada por seus atributos microestruturais e grau de mineralização⁴. Essa qualidade desempenha um papel fundamental na cicatrização óssea e na funcionalidade do osso regenerado⁵. No entanto, caracterizar a mineralização óssea continua sendo uma tarefa desafiadora devido à variabilidade inerente entre estudos multivariados ^6,7,8.

Além disso, as avaliações iniciais da biocompatibilidade, citocompatibilidade e potencial de diferenciação de substitutos de enxerto ósseo são normalmente conduzidas in vitro. No entanto, as disparidades metodológicas impedem a comparação perfeita dos resultados. Além disso, esses estudos in vitro não capturam totalmente as interações multicelulares e o diálogo complexo entre as populações celulares, incluindo as células da medula óssea, que são essenciais para regular o processo de regeneração óssea⁹. Essa falta de representação precisa do microambiente ósseo pode comprometer a acurácia dos estudos pré-clínicos subsequentes¹⁰.

Embora as avaliações in vivo forneçam uma representação mais precisa dos contextos fisiológicos, elas são limitadas por considerações éticas, logísticas e financeiras. Consequentemente, as avaliações ex vivo desempenham um papel fundamental como interface entre estudos in vitro e in vivo, servindo como uma etapa intermediária necessária antes de passar para experimentos em sujeitos vivos^{11 , 12 , 13} .

Nesse contexto, a implementação de metodologias abrangentes de caracterização é necessária para avaliar a qualidade do tecido ósseo regenerado e garantir a relevância da estratégia antes de passar para um modelo pré-clínico. Consequentemente, propomos um protocolo baseado na análise de um modelo de explante usando tecido articular do joelho de ovelha. Essa metodologia inovadora envolve a implantação de cimento carregado com BMP2 nos explantes e a realização de uma análise detalhada da mineralização tecidual após 28 dias de cultivo.

As abordagens técnicas empregadas neste estudo são diversas e complementares, fornecendo coletivamente uma abordagem abrangente para avaliar a qualidade do tecido ósseo regenerado (Figura 1). A micro-TC de alta resolução permite a visualização 3D detalhada da estrutura óssea, fornecendo informações valiosas sobre a densidade mineral, morfologia e integridade do tecido recém-formado. Esta técnica é crucial para avaliar a eficácia da regeneração óssea e monitorar a progressão da mineralização ao longo do tempo. A nanoindentação é uma abordagem precisa para determinar as propriedades mecânicas do tecido, como sua dureza e resistência. Ao medir a resposta do material a uma força aplicada em escala nanométrica, esse método permite avaliar a robustez e a qualidade do tecido mineralizado. Exames histológicos usando colorações comuns, como hematoxilina/eosina/açafrão (HES), tricrômico de Goldner e pentacromo de Movat, fornecem informações valiosas sobre a estrutura e composição do tecido. Essas colorações permitem a diferenciação dos vários componentes do tecido, incluindo células, matriz extracelular e depósitos minerais, permitindo assim uma avaliação qualitativa abrangente do processo de regeneração óssea. O mapeamento por microscopia eletrônica de varredura por retroespalhamento (MEV) oferece uma visualização de alta resolução da superfície das amostras, permitindo uma análise detalhada do grau de mineralização da matriz óssea, bem como das interfaces entre o material implantado e o tecido hospedeiro. Finalmente, a espectroscopia Raman fornece informações sobre a composição molecular do tecido, particularmente através da identificação de componentes específicos, como proteínas, lipídios e minerais. Essa abordagem permite a caracterização da matriz mineralizada e a detecção de fatores de crescimento como o BMP2, fornecendo informações cruciais sobre a persistência de estímulos pró-osteogênicos no meio de regeneração.

Utilizando uma abordagem multidisciplinar, integrando várias técnicas analíticas, nosso estudo visa fornecer uma avaliação completa e abrangente da qualidade do tecido ósseo regenerado, fornecendo assim uma base sólida para a avaliação de substitutos de enxerto ósseo e sua potencial aplicação clínica.

Protocolo

Este estudo foi aprovado por um comitê de ética e bem-estar animal e pela Administração Nacional Veterinária e Alimentar da França sob o número G44171.

1. Preparação e cultura de explantes osteocondrais

1. Colha espécimes de ovelhas de animais recém-sacrificados em um ambiente asséptico. Posicione a ovelha em decúbito dorsal e raspe o membro posterior esquerdo. Prepare-se desinfetando com álcool ao redor da articulação do joelho. Use a artrotomia parapatelar lateral para expor os ligamentos cruzados anterior e posterior, seguida de luxação patelar para revelar a tróclea femoral.
   1. Após a coleta de tecido, crie um defeito de 4,75 mm de diâmetro no côndilo lateral usando um sistema de transferência de autoenxerto osteocondral.
2. Usando um martelo ortopédico, crie um defeito de 10 mm de profundidade e recupere o explante do côndilo. Em seguida, realizar um segundo defeito de 8 mm de diâmetro, centrado em torno do primeiro, utilizando um sistema de transferência de autoenxerto osteocondral. Isso produz explantes osteocondrais medindo 8 mm x 10 mm, contendo um defeito central de 4,75 mm x 10,0 mm.
3. Se necessário por razões logísticas, transportar os explantes em solução salina balanceada de Hank (hBSS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 1% e armazenar a 4 °C.
4. Enxágue os explantes 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, injete o defeito de 4,75 mm x 10,0 mm com um cimento de fosfato de cálcio suplementado com 40 μg/mL de BMP2. Prepare o cimento conforme descrito abaixo.
   1. Produzir fosfato α-tricálcico (α-TCP) por tratamento térmico de barras de fosfato tricálcico apático (prensa isostática a 120 MPa) a 1364 °C durante um mínimo de 12 h, seguido de têmpera ao ar¹⁴.
   2. Moer as hastes α-TCP em etanol absoluto com uma esfera de moinho planetária 2x por 5 min a 500 rpm para produzir um pó fino de 13,1 ± 1,7 μm (medido usando difração a laser, conforme descrito anteriormente¹⁴).
   3. Esterilize o pó de α-TCP aquecendo-o a seco a 180 °C por 45 min. Prepare o cimento de fosfato de cálcio misturando pó de α-TCP com uma solução filtrada de 2,5% (p / v) Na₂HPO₄ 0,22 μm (proporção líquido/pó de 0,35) por 1 min.
   4. Coloque a pasta de cimento em uma seringa de 3 mL antes da injeção usando uma agulha de 18 G.
5. Após 10 min em temperatura ambiente (TR), transfira os explantes para um frasco de 25 cm² e adicione suavemente 10 mL de meio de cultura completo consistindo de meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com alta glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
6. Manter os explantes por até 28 dias em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e trocar o meio de cultura completo a cada 2 dias sob uma capela de fluxo laminar.
7. Enxágue os explantes 3x com PBS. Transfira-os para tubos de 50 mL, adicione 20 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) e mantenha-os a 4 ° C por 3 dias. Em seguida, enxágue os explantes com PBS e armazene-os em etanol a 70% antes das análises subsequentes.

2. Análise de micro-CT

1. Realize análises de microtomografia utilizando um raio-X de microtomografia computadorizada. Adquira projeções de raios X com resolução de 10,7 μm, com tempo de exposição de 1200 ms e filtro de alumínio de 1 mm (80 kV e 125 μA). Calcule a média de três imagens para cada incremento de rotação de 0,45° para melhorar a relação sinal-ruído.
2. Reconstrua imagens tridimensionais (3D) usando o software de reconstrução do fabricante após um alinhamento X/Y com uma varredura de referência, com os seguintes parâmetros - Suavização: 0, Artefato de anel: 3, Endurecimento do feixe: 35%. Limpe as pilhas de imagens com software de processamento de imagem e observe com ferramentas de visualização bidimensional (2D) e 3D.

3. Análises de imagem de aprendizado profundo

1. Realize a segmentação de imagens usando software especializado dedicado. Use o Assistente de segmentação integrada para treinar um modelo de aprendizado profundo para discriminação de ossos e cimentos.
2. Selecione uma zona representativa (ou seja, quadro) contendo osso, cimento e fundo das imagens de micro-TC reconstruídas. Segmente esse primeiro quadro manualmente usando ferramentas simples (por exemplo, limite) ou poderosas (por exemplo, propagação) fornecidas pelo software.
3. Gere um modelo de aprendizado profundo na guia Modelo e selecione Rotina 3D-Unet no menu suspenso. Defina seus parâmetros experimentais em adequação com as imagens a serem analisadas clicando com o botão direito do mouse no modelo gerado; aqui: profundidade de 5, tamanho do patch 32 x 32, algoritmo Adadetla, taxa de passada de 0,25, aumento de dados x10.
4. Use o quadro segmentado para treinar a rotina de aprendizado profundo (clique no botão Treinar), que é reconhecida como relevante por seus recursos de segmentação de imagem rápida e precisa ^3,15. Uma vez concluído o treinamento, defina uma segunda zona de trabalho (quadro) e segmente automaticamente usando a função de previsão.
   1. Aplique a correção manual, se necessário, para gerar dados de treinamento mais precisos. Treine a rotina mais uma vez. Repita o processo até obter um resultado satisfatório; O número de aumentos de dados diminui progressivamente à medida que o número de quadros de treinamento aumenta.
      NOTA: O índice DICE fornecido durante o treinamento do modelo fornece uma indicação da precisão do modelo (em comparação com as informações de entrada), mas não é suficiente. A confirmação da relevância do modelo deve ser realizada pela validação dos dados segmentados automaticamente por 3 pesquisadores experientes independentes.
5. Publique o modelo clicando no botão Exportar e aplique-o a todo o conjunto de dados micro -CT clicando em Segmentar > Modelo exportado > Segmentar conjunto de dados completo.

4. Incorporação

1. Desidrate os explantes ósseos colocando-os em um frasco de vidro de 40 mL contendo 25 mL de solução de desidratação composta por 70% de acetona e 30% de xileno. Coloque o frasco de vidro em uma roda giratória por 1 h em RT. Repita esta etapa 3x.
2. Substitua a solução de desidratação por 25 ml de xileno e coloque o frasco de vidro na roda rotativa durante 1 h à RT.
3. Substitua a solução de xileno por 25 mL de metilmetacrilato enriquecido (MMA) com 10% de peróxido de benzoíla (BPO) e 10% de ftalato de dibutila (DBP). Coloque-o na roda giratória por 1 h em RT. Repita esta etapa 2x.
4. Substitua a solução de MMA por 25 mL de MMA enriquecido com 10% de BPO, 10% de DBP e 450 μL de N, N dimetilanilina diluída 1:20 em propan-2-ol. Colocar o frasco para injetáveis de vidro a -20 °C durante a noite. A solução torna-se amarelada.
5. Coloque o explante em um molde de incorporação de tamanho médio e despeje o MMA-BPO-DBP-N, N anilina no molde. Coloque o molde em uma caixa plástica e ventile com fluxo de nitrogênio por 5 min. Feche a caixa hermeticamente e coloque-a a 4 °C por 48 h para polimerização e endurecimento do MMA.
6. Retirar a resina que contém o explante da forma e mantê-la a 4 °C até ser processada para análise posterior.

5. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) - imagem eletrônica retroespalhada quantitativa (qBEI)

1. Corte o bloco de pMMA contendo o explante com uma serra diamantada ao longo de seu eixo longo. Guarde a primeira metade do bloco para análise histológica. Corte a outra metade para gerar uma seção de 1,5 mm de espessura. Execute o corte a 3000 rpm com uma velocidade de 3 mm/min.
2. Lixe a seção com papel de carboneto de silício com números crescentes correspondentes ao tamanho de grão inferior: SiC 320 por 10 s, SiC 1000 por 15 s, SiC 2000 por 30 s e SiC 4000 por 30 s.
3. Polir a seção com pasta de diamante e roupas específicas: pano de polimento com solução de diamante Mol B3 de 3 μm por 1 min e pano de lã com solução de diamante Nap B1 de 1 μm por 1 min.
4. Enxágue a seção em água bidestilada e limpe as partículas de diamante com um cotonete. Seque a seção sob gás nitrogênio.
5. Cubra a seção grossa (espessura do filme de carbono de 10 nm) e monte-a em um topo de alumínio com tinta prateada. Faça uma ponte de tinta prateada entre o topo da seção e o toco para permitir a evacuação do carregamento de elétrons para o solo.
6. Coloque o stub no estágio SEM. Ao lado da amostra, insira um stub de controle composto por um copo de Faraday com padrões de carbono, alumínio e silício na câmara SEM. Isso será usado para calibrar o feixe de elétrons e converter os níveis de cinza em porcentagens de Ca. Feche a câmara SEM e aspire.
7. Ligue o feixe de elétrons e ajuste os parâmetros SEM para serem executados no modo de elétrons retroespalhados. Em imagens retroespalhadas, o nível de cinza do padrão de carbono é 25, o padrão de alumínio é 225 e o padrão de silício é 253. Como indicação, no sistema utilizado, os parâmetros SEM são tensão de aceleração 20 keV, corrente da sonda medida com o copo de Faraday: 250 pA, distância de trabalho: 15 mm, abertura: 30 μm, resolução da imagem: 1024 x 768 pixels, vácuo: < 4,10-4 Pa, tempo de permanência de 100 μs/pixel, brilho ~38 e contraste ~72.
8. Quando o SEM é calibrado com os padrões, adquira imagens da amostra no modo de elétrons retroespalhados.
9. Use a imagem de elétrons retroespalhados do espécime para converter os níveis de cinza em conteúdo de cálcio, conforme descrito em Roschger et ^al.16. Faça isso usando qualquer software de análise de imagem.
10. Traçar a distribuição do teor de cálcio. A distribuição do conteúdo de cálcio mostra uma distribuição gaussiana. Três parâmetros principais de interesse são calculados: Ca_médio, como o teor médio de cálcio na imagem, pico de_{Ca como} a concentração de cálcio mais frequente encontrada na imagem e_largura de Ca como a largura total na metade máxima da distribuição do teor de cálcio.
    NOTA: A reprodutibilidade do qBEi foi investigada por meio de imagens da mesma região de interesse por 5 dias consecutivos (uma aquisição por dia). Isso significa que o feixe de elétrons foi ligado e desligado entre as sessões. A porcentagem de erro em_média de Ca,_{pico de} Ca e Cawidth foi estimada em 0,5%, 0,7% e 1,2%, respectivamente. O teor de cálcio também foi investigado por análise de raios-X por dispersão de energia (EDS). Foi estabelecida uma relação linear muito boa entre a_média de Ca e o teor de cálcio estimado pela EDS com um valor de R² de 0,99, semelhante aos dados obtidos por Roschger et al. anteriormente¹⁷.

6. Histologia

1. Para cada amostra, corte cortes de 7 μm usando um micrótomo de tecido duro com uma lâmina de tungstênio ^18,19. Seções de coloração com coloração tricrômica Goldner, HES e MOVAT usando um sistema de coloração automática.
2. Para a deplastificação, mergulhe as amostras sucessivamente em acetona por 5 min e repita 2x. Enxágue as amostras em água destilada por 5 min e repita 2x.
3. Execute a coloração Goldner Trichrome conforme descrito abaixo.
   1. Coloque as amostras em hematoxilina férrica Weigert por 20 min. Lave com água da torneira. Mergulhe as amostras em álcool ácido a 0,5% por 30 s-1 min. Lave com água da torneira por 20 min.
   2. Coloque as amostras em solução de Ponceau/ácido fucsina / azopfloxina por 5 min. Mergulhe em ácido acético a 1% por 1 min.
   3. Manchar com solução de ácido fosfomolíbdico/Laranja G por 20 min. Mergulhe em ácido acético a 1% por 1 min.
   4. Manchar com solução verde rápida por 15 min em temperatura ambiente ou 8 min a 60 °C. Enxágue abundantemente com água da torneira; repita 3x.
4. Execute a coloração Movat Pentachrome conforme descrito abaixo.
   1. Coloração Alcian Blue: mergulhe as amostras na solução de Alcian Blue por 30 min. Enxágue as amostras em água da torneira por 5 min. Coloque as amostras em etanol alcalino por 60 min. Enxágue as amostras em água da torneira por 10 min. Faça um enxágue final com água destilada.
   2. Coloração de hematoxilina de Weigert: coloque amostras na hematoxilina férrica de Weigert por 20-30 min. Enxágue as amostras em água da torneira por 15 min. Enxágüe novamente com água destilada.
   3. Coloração com Croceína Brilhante/ácido fucsina: mergulhar as amostras em uma solução de Croceína Brilhante/Ácido Fucsina por 10 min. Enxágüe com ácido acético a 0,5%. Mergulhe as amostras em uma solução de ácido fosfotúngstico a 5% por 20 min. Enxágüe com ácido acético a 0,5% por 2 min. Realize três lavagens sucessivas com etanol 100%, cada uma com duração de 5 min.
   4. Coloração com Safran du Gatinais: coloque amostras em Safran du Gatinais por 15 min. Faça um enxágue final com água da torneira.
5. Execute a coloração HES conforme descrito abaixo.
   1. Coloração com Hematoxilina de Weigert: mergulhe as amostras na Hematoxilina de Weigert por 30 min. Enxágüe com água da torneira por 2 min.
   2. Descoloração: mergulhar as amostras em álcool ácido clorídrico durante 10 s. Enxágüe com água da torneira por 2 min.
   3. Neutralização: mergulhe as amostras em uma solução de carbonato de lítio por 1 min. Enxágüe com água da torneira por 2 min. Realize um enxágue final com água destilada por 1 min.
   4. Coloração com Eosina-Eritrosina: coloque as amostras em uma solução de Eosina-Eritrosina por 3 min. Enxágüe com água da torneira por 10 s.
   5. Desidratação: Mergulhe as amostras em álcool 95% por 15 s. Transfira para álcool 100% por 15 s. Repita a imersão em álcool 100% por 30 s.
   6. Coloração final com Safranina Alcoólica: mergulhar as amostras em safranina alcoólica por 10 min. Faça um enxágue final com água da torneira.
6. Execute a montagem deslizante conforme descrito abaixo.
   1. Enxágue as amostras em etanol a 95%, depois em etanol a 100%, depois em metilciclohexano e repita 3x para cada etapa.
   2. Monte as amostras usando um kit de montagem e adicione uma lamínula. Digitalize as imagens usando um scanner de lâminas digital.

7. Microespectroscopia Raman

1. Use a mesma seção usada para análise Raman que o SEM. Lixe e polir brevemente a seção conforme descrito nas etapas 5.2 a 5.3 para remover a fina camada de carbono adicionada para SEM que prejudica a dissipação de calor da amostra.
2. Coloque a seção no palco do microespectrômetro Raman. Calibre o número de onda para garantir a precisão e alinhe o laser antes da medição. Como tais procedimentos são específicos para cada instrumento, eles não serão descritos neste artigo.
3. Localize regiões de interesse no tecido que precisam ser analisadas. Posicione a zona a ser analisada no centro da ferramenta de vídeo e colete espectros Raman com os seguintes parâmetros: laser de 785 nm usado a 30 mW, tempo de integração: 20 s repetido 3 vezes, faixa espectral: 350-1800 ^cm-1, grade de 1200 linhas/mm.
4. Colete 10 espectros da resina de incorporação com as mesmas configurações Raman e calcule-os em média. Use isso para subtrair a contribuição de resina na etapa 7.6.
5. Pré-processe os espectros da seguinte forma para remover a contribuição de fluorescência, ruído e resina: correção de linha de base com um ajuste polinomial de cinco ordens, filtro Savitzky-Golay com um grau de 4 e um tamanho de janela compreendido entre 17 e 21, subtração de resina digital usando o pico de ~ 812 ^cm-1 da resina. Esse pré-processamento pode ser realizado com diferentes softwares projetados para análise e visualização de dados.
6. Analise ainda mais os espectros pré-processados para extrair parâmetros valiosos, racionando a intensidade de pico da vibração de interesse com a intensidade de pico da vibração de referência. Para análise óssea, por exemplo, use os seguintes parâmetros para calculá-la.
   1. Proporções mineral-matriz: divida a intensidade de pico das vibrações v1PO4 em ~ 960 ^cm-1 pela intensidade de pico dos modos vibracionais Amida I (~ 1668 ^cm-1), amida III (~ 1250 ^cm-1), CH2-wag (~ 1450 ^cm-1) ou a soma dos modos vibracionais de prolina (~ 854 ^cm-1) e hidroxiprolina (Hyp, ~ 872 ^cm-1). O v2PO4, localizado a ~430 ^cm-1, ou o v4PO4, localizado a ~600 ^cm-1, também pode ser usado e racionado com a vibração Amide III²⁰. Esses parâmetros representam o grau de mineralização da fase orgânica da matriz óssea.
   2. Carbonato/Fosfato: divida a intensidade de pico do v1CO₃, localizado a ~1070 ^cm-1, pelo v1PO4. Isso representa a quantidade de substituição de carbonato do tipo B na rede de apatita. Hyp/Pro, representa o conteúdo de hidroxiprolina, ~1375 ^cm-1/Amida III, representa o conteúdo de proteoglicanos, ~1150 ^cm-1/CH2-wag e ~1495 ^cm-1/CH2-wag, representa a quantidade dos produtos finais de glicação avançada carboximetilisina e pentosidina, 1670 ^cm-1/1690 ^cm-1 e 1670 ^cm-1/1640 ^cm-1 representam a estrutura secundária desordenada do colágeno, também conhecida como maturidade do colágeno, e estruturas ordenadas na forma de α-hélice no colágeno tipo I, respectivamente.
7. Avalie a reprodutibilidade das medições Raman examinando a mesma região de interesse em 5 aquisições consecutivas (uma aquisição por dia). Para cada parâmetro analisado, a variância foi inferior a 0,2% do valor do parâmetro, apoiando boa reprodutibilidade. A especificidade de cada pico investigado tem sido amplamente discutida em campo, e uma visão geral é apresentada na recente revisão do Unal²¹.

8. Nanoindentação

NOTA: Devido à natureza destrutiva da nanoindentação, geralmente é realizada no final da rotina de análise da amostra. O sistema de nanoindentação que possuímos está equipado com um penetrador de diamante de Berkovitch piramidal. No entanto, existem várias formas de penetradores e nenhum consenso na literatura foi determinado para espécimes ósseos ou biomateriais.

1. Hidratar a amostra de osso embebida em solução salina durante 16 h a RT antes do ensaio de nanoindentação.
2. Calibre o sistema de nanoindentação usando sílica fundida e registre o módulo de indentação resultante. Para sílica fundida, o módulo de indentação é de aproximadamente 72 GPa usando um coeficiente de Poisson de 0,17.
3. Uma vez calibrado o sistema de nanoindentação, coloque a amostra usada para análises Raman no sistema óptico do dispositivo de nanoindentação para apontar os locais onde a nanoindentação será realizada.
   NOTA: Esta modalidade varia de um equipamento para outro; Não detalhamos como o sistema de nanoindentação e o software funcionam, mas damos conselhos gerais sobre as diferentes etapas que devem ser executadas.
4. Uma vez escolhido o local da nanoindentação, mova a amostra sob o dispositivo de indentação e execute a indentação. Realize nanoindentação a uma profundidade constante de 900 nm, com uma velocidade de carga/descarga de 40 mm/min e uma pausa de 15 s entre carga e descarga. Defina o coeficiente de Poisson para o tecido ósseo em 0,3.
5. Recupere os diferentes parâmetros das curvas de nanoindentação e calcule-os de acordo com a teoria de Oliver e Pharr²².
   1. O módulo de indentação (E_IT) é derivado das propriedades conhecidas da ponta de indentação e do módulo reduzido e combina o módulo de elasticidade local do corpo de prova. Calcule o recuo como:
      
      Com v_s, v_i, E_i e E_r representando o coeficiente de Poisson da amostra, assumido como 0,3 para osso, o coeficiente de Poisson do penetrador de diamante, assumido como 0,07, o módulo de elasticidade do penetrador de diamante, fixado em 1140 GPa e o módulo reduzido, calculado como:
      
      Com S representando a inclinação do segmento de descarga e Ap sendo a área projetada e calculada como:
      
   2. Dureza (H_IT): corresponde à resistência óssea à iniciação e propagação de trincas. Em outras palavras, é um indicador de resistência óssea. Compute H_IT como:
      
   3. Taxa de fluência de indentação (C_IT): Isso reflete a deformação óssea ao longo do tempo em carga constante, indicativa das propriedades viscoelásticas do corpo de prova, calculadas como:
      
   4. Carga máxima (L_m): Corresponde à carga oposta necessária para penetrar na profundidade indicada na matriz óssea mineralizada.
   5. Trabalho de indentação (W_plast): corresponde à área sob a curva de deformação de carga/descarga. É um reflexo direto da energia dissipada para induzir a deformação plástica.
      NOTA: A reprodutibilidade da nanoindentação é mais difícil de avaliar em amostras de osso devido à natureza destrutiva desta metodologia. No entanto, estimamos a reprodutibilidade da amostra de sílica fundida padrão e uniforme. Para todos os parâmetros acima, a variância foi estimada abaixo de 0,26% (5 medidas consecutivas em 5 dias separados), apoiando uma reprodutibilidade muito boa. Por outro lado, devido à natureza anisotrópica das amostras ósseas, é mais difícil avaliar sua reprodutibilidade.

Resultados

Uma imagem de micro-TC do explante é mostrada na Figura 2. O uso da segmentação manual não pode separar de forma ideal o osso do cimento, presente no canal central, usando o limiar global. Para melhorar o reconhecimento do osso trabecular e do cimento, propomos o uso de aprendizado profundo. O deep learning é poderoso para reconhecer as características do biomaterial e ajuda a melhorar a separação entre osso e cimento, permitindo uma melhor avaliação das interações cimento-osso. Isso é de extrema importância para quantificar com precisão a quantidade de osso formado na interface com o cimento e não incorporar pixels falsos nesse cálculo.

No entanto, simplesmente quantificar o osso na interface não é suficiente para caracterizar o osso recém-formado. Um estudo mais aprofundado da qualidade da matriz óssea e da composição celular é necessário para entender melhor a resistência do novo osso e os mecanismos celulares que levaram à formação dessa nova matriz. A matriz óssea pode ser caracterizada por meio de duas abordagens complementares: qBEI e microespectroscopia Raman. Um exemplo de uma imagem qBEI é apresentado na Figura 3. Com o qBEI, cada pixel codificado em tons de cinza é transformado em uma concentração de cálcio. Este é um pré-requisito para avaliar a distribuição do teor de cálcio no osso trabecular e para entender (i) o grau de mineralização do osso neoformado na interface com o cimento e (ii) se a presença de cimento interrompe a mineralização do osso trabecular. A vantagem do qBEI é sua capacidade de adquirir uma imagem de alta resolução em um tempo muito curto, ao contrário da microespectroscopia Raman, que requer um tempo de aquisição mais longo. Os parâmetros qBEI, como_média de Ca,_pico de Ca e_largura de Ca, podem ser derivados da distribuição de cálcio e usados para comparar a resposta entre dois cimentos ou biomateriais.

Por outro lado, o qBEI não fornece nenhuma informação sobre a qualidade da fase orgânica da matriz óssea na interface com o biomaterial. Informações adicionais sobre as propriedades do material da fase orgânica são derivadas da microespectroscopia Raman. A microespectroscopia Raman é realizada no mesmo espécime usado para qBEI após uma rápida retificação e polimento da superfície para remover a camada condutora de carbono. Na microespectroscopia Raman, os espectros são adquiridos em cada local de pixel. Exemplos de espectros Raman brutos não processados e processados são fornecidos na Figura 4. Cada espectro contém informações sobre a composição do pixel analisado e inclui picos relacionados à resina de incorporação, neste caso, pMMA, a fase mineral, picos v1PO4 e v1CO3, e a fase orgânica, picos Pro, Hyp, CML, Amida III, PG, CH2, Pen. e Amida I. No exemplo da Figura 4, o espectro não tratado mostra a contribuição da resina de revestimento em ~ 812 ^cm-1 e uma linha de base curva diferente de zero devido à fluorescência, embora um laser vermelho infravermelho próximo seja usado. O processamento do espectro é um pré-requisito para garantir o cálculo preciso dos vários parâmetros Raman, em particular a eliminação da fluorescência de fundo. Ao adquirir dados, o usuário deve garantir o posicionamento preciso e evitar a saturação do detector para confirmar a presença do pico v1PO4 localizado ~960 ^cm-1. Após o pós-processamento, as taxas de intensidade de pico são calculadas de acordo com a localização do modo vibracional característico.

No entanto, é questionável se as mudanças na composição do material levaram a mudanças na resposta biomecânica. Para coletar informações sobre a biomecânica do osso recém-formado, realizamos sistematicamente investigações de nanoindentação na mesma amostra usada para microespectroscopia Raman. As informações mecânicas dos tecidos são obtidas a partir de curvas de nanoindentação representadas por curvas de carga versus profundidade (Figura 5). Vale ressaltar que a profundidade não volta a zero no final do ensaio, representando a deformação plástica e os danos permanentes criados ao material. A taxa de fluência de recuo é derivada da curva de profundidade versus tempo.

Finalmente, a coloração histológica é usada para avaliar a resposta do tecido ao biomaterial no nível celular (Figura 6). As colorações histológicas propostas permitem determinar a presença de tecido osteóide, mas também a identificação de células (macrófagos, células gigantes multinucleadas, osteoclastos, osteoblastos) e a possível presença de uma cápsula fibrosa na interface com o biomaterial. Isso é muito importante para entender a biocompatibilidade de um biomaterial, mas também a persistência de novo osso quando o biomaterial é degradado.

No geral, a abordagem multimétodo permite um estudo aprofundado da formação óssea, da qualidade do osso recém-formado e da composição celular. Quando realizadas na ordem sequencial proposta, todas as investigações podem ser realizadas na mesma amostra, reduzindo o custo e o tempo de processamento.

Figura 1: Resumo gráfico. Um resumo das etapas do protocolo é fornecido aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análises de micro-CT e deep learning. (A) Reconstrução 3D de imagens de micro-CT. (B) Segmentação óssea e de cimento: comparação entre segmentação manual e deep learning. Barra de escala = 5 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem eletrônica retroespalhada quantitativa para determinar o teor de cálcio. (A) A imagem retroespalhada composta de níveis de cinza obtidos na microscopia eletrônica de varredura (SEM) é convertida pelo software de análise de imagem em (B) um mapa de cálcio mostrando os pontos quentes da amostra óssea. (C) A distribuição do conteúdo de cálcio versus área óssea é plotada e os três principais parâmetros qBEI, Camean, Capeak e_largura de Ca, são calculados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de espectros Raman. (A) Espectro Raman bruto não processado obtido na faixa espectral de 800 a 1800 ^cm-1. O fundo de fluorescência é claramente visível, pois os espectros não começam em 0. A contribuição da resina (pMMA) é claramente visível em ~ 812 ^cm-1. (B) Espectro processado. A posição dos diferentes modos vibracionais de interesse é indicada no espectro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Investigação das propriedades mecânicas do tecido por nanoindentação. (A) O dispositivo de nanoindentação é composto por uma parte óptica usada para definir a localização da região de interesse na superfície do bloco de amostra e, em seguida, o bloco é traduzido sob a parte de indentação. (B) Carga versus tempo e profundidade versus tempo são plotados durante o teste de indentação e são usados para gerar o (C) curva carga versus profundidade. Neste exemplo, a profundidade escolhida foi fixada em 400 nm. A carga máxima (L_m), a profundidade no final do carregamento (h_l), a profundidade após o período de pausa (h_m), a inclinação do segmento de descarga (S) e a área sob a fase de carga-descarga do teste (W_plast) são derivadas da curva de carga versus profundidade e são usadas para calcular os diferentes parâmetros de nanoindentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise histológica dos explantes osteocondrais tratados com cimento após 28 dias de cultivo. (A) A coloração Movat demonstra a estrutura do tecido, incluindo o osso e o cimento preenchendo o defeito. (B) A coloração HES ilustra a integração do tecido e a resposta celular ao redor do cimento. Barra de escala: 2,5 mm. (C) Ampliação da área destacada em (B), que detalha a interface entre o cimento e o tecido circundante, onde as células podem ser observadas invadindo o cimento. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O reparo de defeitos ósseos é um grande desafio na medicina regenerativa para restaurar a mobilidade, reduzir a dor e melhorar a qualidade de vida dos indivíduos afetados. O uso de modelos de explante oferece uma série de vantagens em relação aos estudos in vivo para a investigação do reparo de defeitos ósseos. Além das considerações éticas, esse modelo permite o controle rigoroso das condições experimentais e a redução da variabilidade biológica, facilitando a geração de resultados mais precisos e reprodutíveis. Além disso, as propriedades mecânicas e biológicas do osso de ovelha estão intimamente alinhadas com as do osso humano em comparação com outros animais^23,24. Isso torna o modelo de explante de ovelhas uma escolha particularmente relevante para estudos pré-clínicos e um modelo representativo das condições clínicas humanas.

Juntamente com o desenvolvimento da metodologia de imagem e ciências dos materiais, o modelo de explante descrito aqui representa um bom modelo para investigar os efeitos da medicina regenerativa nos tecidos esqueléticos em um ambiente controlado, reduzindo o viés experimental. As dimensões e morfologia do explante são ideais para uma análise detalhada da neoosteogênese e das propriedades do material, permitindo uma avaliação e caracterização abrangentes²⁵. Essas descobertas enfatizam o potencial do modelo para tradução clínica, oferecendo uma estrutura robusta para avaliar substitutos de enxerto ósseo e aumentando a probabilidade de resultados clínicos bem-sucedidos em terapias de regeneração óssea. Além disso, o modelo facilita a avaliação precisa da osteointegração e do desempenho do biomaterial, que são fatores críticos no desenvolvimento de estratégias eficazes de reparo ósseo.

Para garantir o sucesso do estudo, é fundamental seguir meticulosamente as principais etapas do protocolo. Um dos aspectos mais importantes é garantir que a amostra esteja totalmente desidratada durante o processo de incorporação. Qualquer umidade remanescente pode dificultar a incorporação adequada da resina, levando a uma resina borrada e não transparente, o que pode comprometer a clareza e a precisão dos resultados e também pode resultar em furos durante a secção histológica. Essa atenção cuidadosa aos detalhes é essencial para produzir descobertas confiáveis e reprodutíveis. Para garantir a conversão precisa dos níveis de cinza em um mapa de teor de cálcio, é essencial empregar a calibração usando um copo de Faraday e os padrões C, Al e Si para análise de SEM. É crucial garantir a consistência no uso do mesmo MEV para todas as amostras, pois as diferenças nos detectores de elétrons retroespalhados podem levar à variabilidade nos resultados. Na espectroscopia Raman, a calibração do número de onda e a correção completa da linha de base são essenciais para excluir o fundo de fluorescência e diferenciar entre os picos da resina de incorporação e da amostra. Para nanoindentação, obter uma superfície perfeitamente lisa é fundamental, dados os limites de deslocamento dos indentadores, e a calibração com um padrão conhecido, como sílica fundida, é necessária para garantir medições confiáveis.

As modificações e a solução de problemas dessas técnicas frequentemente abordam a natureza anisotrópica do material ósseo, que tem o potencial de influenciar a consistência da medição. Para ilustrar, na espectroscopia Raman, a polarização do laser incidente pode ter um impacto considerável na intensidade registrada. O uso de uma objetiva de 20x com uma abertura numérica baixa pode ajudar na mitigação desse problema. Também é de suma importância garantir condições consistentes de calibração e medição em todas as amostras, a fim de manter a integridade dos dados. A anisotropia inerente ao osso representa uma limitação dessas metodologias, pois pode afetar a uniformidade das medidas, principalmente em técnicas como a espectroscopia Raman. Além disso, a necessidade de calibração precisa e controle ambiental pode limitar a aplicabilidade geral se esses aspectos não forem meticulosamente gerenciados.

A aplicabilidade potencial dessas abordagens se estende significativamente à avaliação de novos biomateriais e estratégias terapêuticas para reparo ósseo. A capacidade do modelo de imitar de perto a fisiologia óssea humana fornece uma plataforma robusta para testes pré-clínicos, permitindo uma avaliação completa da segurança e eficácia de novos tratamentos em um ambiente controlado. A utilidade deste modelo é particularmente relevante para acelerar a via translacional da pesquisa laboratorial para a prática clínica, facilitando a identificação precoce de candidatos promissores para terapias de regeneração óssea. Ao fornecer um método confiável e reprodutível para avaliar materiais de reparo ósseo, essa técnica apóia o avanço da medicina regenerativa e o desenvolvimento de soluções clinicamente viáveis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,20 filtros	VWR	28145-501
Agulha de 18 G (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
seringa de 3	mL HENKE-JECT	8300005762
37% de ácido clorídrico	VWR	1.00317.1000
Ácido acético (glacial)	Sigma	A6283
Acetona	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR
Hidróxido de amónio	VWR
Fosfato tricálcico apático	Centro de Engenharia Biomédica e de Saúde (Minas Saint Etienne, França)	TV26U
Azophloxine	Sigma
Peróxido de benzoíla	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1,5 mg/mL
Croceína Brillant	Aldrich
CTVox	Bruker-DataViewer
	Lâmina	Skyscan-Diamond
	Struers	MOD13
Serra de diamante	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 solução de diamante	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 solução de diamante	Struers	40600373
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma
Dibutil Ftalato	Chimie-Plus Laboratoires	28656
Software DragonFly	ORS	2022.1.0.1231.
Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco alta glicose, GlutaMAX(TM), piruvato	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma
Eritrosina B	Sigma
Etanol absoluto	VWR
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Cloreto férrico hexahidratado (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Soro Fetal Bovino (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Ácido fucsina	Merck	1.05231.0025
Solução Salina Balanceada Hank's (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxilina	Sigma	86.118.9
Prensa isostática	Nova Suisse	Pmax 1500 bar
Granulometria de difração a laser	Malvern	Mastersizer 3000
Prolabo Verde Claro
Carbonato de lítio	Sigma	A13149
Pano de polimento MD-Mol	Struers	40500077
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilciclohexano	VWR	8.06147.1000
Metilmetacrilato	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Fosfato de sódio monobásico (NAH2PO4)	Sigma	71496
Argamassa	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimetilanilina	Sigma	803060
Estação de nanoindentação	Anton Paar	NHT2
ND-Nap pano de polimento	Struers	40500080
OATS Conjunto de sistema de transferência de autoenxerto osteocondral, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
Conjunto de sistema de transferência de autoenxerto osteocondral OATS, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Laranja G	Ral	Paraformaldeído M15
(PFA)	Sigma	P6148
Moldes de embutir descartáveis Peel-a-way	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicilina/Estreptomicina (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Ácido fosfomolíbdico	Sigma	221856-100 g
Ácido fosfotúngstico	Aldrich	12863-5
Máquina de polir	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Microespectrômetro Raman	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâ tinais	Labonord
Microscópio eletrônico de varredura	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
Folhas de SiC / Papéis de moagem	Struers	40400008 (# 320), 40400011 (# 1000), 40400122 (# 2000), 40400182 (# 4000)
Tinta prateada	Ciências de microscopia eletrônica	12686-15
Stub padrão com copo de Faraday, padrões de carbono, alumínio e silício	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 frasco	Corning	430639
Xileno	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1