Artigo de método

Elucidando alterações proteômicas específicas de tecidos e plasma na saúde e na doença

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DOI:

10.3791/67240

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23 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A proteômica é uma avaliação de alto rendimento das interações, função, composição e estruturas das proteínas e suas atividades celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar alterações proteômicas totais em várias amostras biológicas, incluindo plasma e tecidos. A metodologia aqui relatada é aplicável a todas as amostras biológicas contendo proteínas.

Resumo

Proteômica é o estudo em larga escala de proteínas expressas, com foco em sua estrutura, função, interações, abundância e modificações pós-traducionais dentro de um sistema biológico. Por exemplo, a fosfoproteômica, um subconjunto vital da proteômica total, é o estudo dos padrões de fosforilação e alterações nas proteínas. A metodologia aqui descrita ilustra uma abordagem proteômica total para elucidar alterações nos perfis gerais de expressão de proteínas, incluindo padrões de fosforilação, no plasma, cérebro, pulmão, baço e tecidos hepáticos coletados de modelos animais de pesquisa (ou seja, furões e camundongos). Esta técnica é aplicável a outros tipos de tecido, bem como a quase todas as amostras biológicas contendo proteínas (por exemplo, células cultivadas). Após a dissecção, os tecidos de interesse foram congelados rapidamente e armazenados a -80 °C. Os tecidos foram então homogeneizados usando um almofariz e pilão com nitrogênio líquido para preservar a integridade da proteína e as alterações de fosforilação. A proteína total foi extraída dos homogeneizados teciduais usando um tampão de lise com nuclease universal e inibidores de protease/fosfatase. As proteínas extraídas do tecido e do plasma equivalente foram convertidas em peptídeos totais por digestão controlada de protease usando um kit comercial de preparação de amostras por espectrômetro de massas. Os peptídeos foram analisados diretamente usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência/espectrometria de massa em tandem Orbitrap-tribrid. As identidades das proteínas constituintes foram reconstruídas a partir dos dados espectrais de massa do peptídeo, usando software de bioinformática proteômica, conforme combinado com uma biblioteca de sequências de aminoácidos específica da espécie. Em seguida, a análise deve incluir critérios de corte rígidos, especialmente usando apenas identificações de proteínas de alta confiança. Diferenças proteômicas estatisticamente significativas (mudança de >2 vezes; p < 0,05) podem ser determinadas entre os grupos controle e experimental.

Introdução

A proteômica, como a combinação de experimentação de proteoma e análise de dados, concentra-se na identificação e quantificação de proteínas, caracterizando-as com base na composição, interação, modificações pré-traducionais e pós-traducionais (por exemplo, fosforilação), localização subcelular e estrutura em condições fisiológicas1. A proteômica de expressão lida com comparações quantitativas de proteínas que diferem sob condições biológicas variáveis2. Também tem grande importância no traçado do perfil de um mapa das vias, redes e sistemas moleculares complexos e interconectados, que controlam diretamente as principais funções biológicas, como proliferação, diferenciação, senescência e mecanismos de morte celular. Com o avanço substancial da tecnologia experimental nos últimos anos, os métodos proteômicos evoluíram de abordagens convencionais - incluindo imuno-histoquímica e ensaio imunoenzimático - para técnicas de alto rendimento, como cromatografia líquida 3,4. As abordagens baseadas em proteômica estão ganhando força na determinação de fenótipos e subtipos únicos de doenças, bem como na identificação de novas interações alvo para medicamentos terapêuticos (farmacoproteômica). Por exemplo, a estratificação de pacientes se concentrou principalmente em abordagens genômicas para definir grupos homogêneos e orientar regimes de tratamento. O status de transcrição por si só, no entanto, não prevê o destino das proteínas traduzidas posteriormente (por exemplo, estabilidade ou modificação); e, portanto, os mecanismos não genômicos contribuem mais para o desenvolvimento, progressão, gravidade e resistência à terapêuticada doença 5,6,7.

Uma dessas áreas de pesquisa que se beneficiou muito das comparações quantitativas da expressão e atividade da proteína é a descoberta de biomarcadores no campo de doenças neurodegenerativas e traumatismo cranioencefálico (TCE). A base para a descoberta de biomarcadores é desenvolver técnicas de diagnóstico que facilitem a detecção precoce e alvos potenciais para intervenção. A proteômica quantitativa baseada em LC/MS-MS, juntamente com a bioinformática, auxiliou na descoberta de biomarcadores proteicos importantes, incluindo a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a ubiquitina carboxila-terminal hidrolase isoenzima L1 (UCH-L1), com impacto severo ou TCE penetrante 8,9. Por exemplo, os militares frequentemente sofrem incidentes de TCE durante suas missões, devido à exposição a explosões de bombas (ou seja, TBI de explosão). No entanto, a patobiologia subjacente dos deficits neurológicos causados pela LCT leve induzida por explosão permanece obscura. Portanto, entender os mecanismos moleculares e ultraestruturais da lesão cerebral induzida por explosão requer uma melhor identificação de substitutos de biomarcadores específicos. Com a observação de alterações proteômicas, estudos demonstraram que possíveis mecanismos de estresse oxidativo induzido por explosão no cérebro estão associados à disfunção mitocondrial, incluindo dinâmica de fissão-fusão prejudicada, diminuição da fosforilação oxidativa e atividades enzimáticas relevantes para a respiração compensada10. Insights sobre a patogênese precoce da desregulação induzida por explosão de modificações pós-traducionais, como acetilação, nitrosilação, desaminação e fosforilação, também podem fornecer uma caracterização adicional de seus efeitos na função da proteína implicada no dano axonal, inflamação e ruptura da barreira hematoencefálica11 , 12. Com o avanço das abordagens de biologia de sistemas, o mapeamento de informações totais de proteoma do cérebro e tecidos periféricos em diferentes espécies animais, incluindo roedores e furões, tornou-se um procedimento fundamental na pesquisa de lesões por explosão.

Neste artigo, nos concentramos no fluxo de trabalho da metodologia para avaliar aspectos quantitativos da proteômica de expressão e suas modificações pós-traducionais a partir de tecido ou plasma, que tem sido amplamente utilizado para monitorar fenômenos fisiológicos e condições patológicas. A utilização da metodologia abaixo permite consistência e confiabilidade na preparação da amostra e aquisição de dados. Com essa metodologia padronizada, comparações podem ser feitas para determinar padrões proteômicos preservados entre tipos de tecidos e padrões de fosforilação exclusivos de tecidos específicos. Junto com isso, a análise em vários modelos animais pré-clínicos e amostras clínicas humanas pode ser feita para obter padrões de fosforilação conservados que poderiam servir como biomarcadores e para adaptar os regimes de tratamento medicamentoso.

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Protocolo

A pesquisa foi conduzida sob um protocolo de uso de animais aprovado pela IACUC em uma instalação credenciada pela AAALAC International com uma Garantia de Bem-Estar Animal dos Serviços de Saúde Pública e em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e outros estatutos e regulamentos federais relacionados a animais de laboratório. Todos os suprimentos necessários para este procedimento estão listados na Tabela de Materiais. O procedimento é subdividido em sete componentes.

CUIDADO. Certifique-se de que os protocolos de segurança adequados sejam seguidos ao trabalhar com nitrogênio líquido para homogeneizar o tecido. O pessoal do laboratório usava luvas de freezer, avental de freezer, máscara cirúrgica e protetor facial durante a homogeneização do tecido congelado. Esta técnica de homogeneização pode ser utilizada para qualquer tipo de tecido, incluindo substâncias extremamente resistentes como ossos, simplesmente ajustando o tamanho do almofariz e do pilão de acordo. Consulte a Figura 1A para obter a configuração inicial do ambiente de trabalho. Consulte a Tabela de Materiais para obter os tamanhos usados na homogeneização de tecidos de camundongos e furões.

1. Moagem criogênica de tecidos com almofariz e pilão

  1. Pegue o peso de um tubo de coleta vazio e grave-o. Enquanto estiver no tubo de coleta, pesar o tecido usando uma balança analítica e registrar o peso em um caderno de laboratório. Subtraia o peso de um tubo vazio do tecido mais o peso do tubo para obter o mg de tecido usado.
    NOTA: Os tecidos que foram avaliados para estudos proteômicos incluem cérebro, pulmão, fígado e baço. Todo o tecido foi moído criogenicamente em forma de pó usando um almofariz e pilão.
  2. Despeje nitrogênio líquido no criopod, mas certifique-se de que esteja menos da metade cheio.
  3. Transfira o tubo contendo a amostra e o(s) tubo(s) de microcentrífuga de 1,5 mL vazio, previamente autoclavado, para o suporte de tubos localizado no criópode. Isso garante que a amostra permaneça congelada enquanto resfria o almofariz e o pilão, evitando que a amostra descongele ao transferir o tecido homogeneizado para o(s) tubo(s) vazio(s) de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Despeje nitrogênio líquido no almofariz e pilão para resfriar esses instrumentos antes de usar. O almofariz e o pilão ficam fora do criópode (Figura 1A, B).
  5. Transfira o tecido para a argamassa resfriada contendo nitrogênio líquido (Figura 1B).
  6. Coloque pressão repetidamente sobre o tecido congelado usando o pilão e faça um movimento giratório e de trituração com o pilão contra o tecido até que o tecido seja moído em um pó fino (Figura 1C).
    1. Certifique-se de que não seja aplicada força excessiva, o que corre o risco de as amostras derramarem da argamassa. Certifique-se de ter um controle firme sobre o pilão.
    2. Adicione nitrogênio líquido adicional à argamassa enquanto homogeneiza tecidos grandes para reduzir a chance de a amostra descongelar durante a moagem.
    3. Ao moer o tecido, verifique se ele não está descongelando. Se estiver descongelando, coloque nitrogênio líquido adicional na argamassa.
  7. Mergulhe as pontas das espátulas de metal no nitrogênio líquido para resfriá-las. Isso ajuda a transferir facilmente o tecido homogeneizado para o tubo de 1,5 mL. Isso evita que o tecido descongele e grude na espátula durante a transferência.
  8. Uma vez que o tecido é homogeneizado em um pó fino e as espátulas de metal são resfriadas, transfira cuidadosamente o pó de tecido homogeneizado para os novos tubos de 1,5 mL.
    1. Divida a amostra em alíquotas dependendo do número de ensaios a serem concluídos.
      NOTA: Por exemplo, quatro ensaios deveriam ser concluídos para as amostras neste estudo, de modo que o tecido homogeneizado foi igualmente aliquotado em quatro tubos de 1,5 mL.
    2. Armazene qualquer tecido homogeneizado extra em um tubo de coleta autoclavado de 5 mL com tampa de encaixe.
  9. Armazene os tecidos alíquotos em um freezer a -80 ° C até análises futuras, com um uso realista dentro de 1 ano para minimizar o ar e a leve oxidação de proteínas.
  10. Pese o tubo de coleta vazio.
  11. Subtraia o peso do tubo coletor vazio da medição inicial (tubo coletor mais amostra) para obter o peso da amostra de tecido.

2. Lise tecidual para isolamento de proteínas

  1. Coloque gelo seco em um recipiente de panela de gelo.
  2. Coloque um suporte para tubos no gelo seco e deixe esfriar.
  3. Retirar as amostras de tecido homogeneizado do congelador a -80 °C e colocá-las no suporte para tubos refrigerados. Isso evita que as amostras descongelem, o que pode causar degradação de proteínas e/ou alterações de fosforilação durante o processo de pesagem.
    1. Certifique-se de que os tubos de 1.5 mL contendo o sample permanecem congelados no suporte de tubos em gelo seco.
  4. Coloque um novo tubo canônico de 50 mL no gelo seco.
  5. Remova a tampa do tubo canônico de 50 mL e coloque espátulas plásticas descartáveis no tubo canônico de 50 mL para mantê-las frescas. Isso evita que a amostra grude nas espátulas durante sua transferência para os tubos de homogeneização.
  6. Para lise tecidual e isolamento de proteínas, use tubos de 2 mL contendo cinco esferas de cerâmica de 2,8 mm (referidos como tubos homogeneizadores neste protocolo).
  7. Rotule a tampa e a lateral do tubo de homogeneização com o ID da amostra usando uma caneta de marcação de tinta permanente.
  8. Coloque os tubos de homogeneização rotulados no rack de tubos localizado no gelo seco para manter os tubos frios e evitar o descongelamento da amostra.
  9. Colocar um tubo de homogeneização numa balança analítica e tarar a balança.
  10. Retorne o tubo de homogeneização para o suporte de tubos em gelo seco.
  11. Retirar a tampa do tubo de homogeneização que contém as esferas e, utilizando uma das espátulas de plástico arrefecidas, transferir 5 mg a 10 mg de amostra de tecido em pó para o respectivo tubo de homogeneização.
  12. Coloque a tampa de volta no tubo de homogeneização.
  13. Pesar o tubo de homogeneização na balança analítica e registar a quantidade de amostra no tubo de homogeneização.
    1. Use esse peso para determinar a quantidade de tampão de lise necessária para uma extração eficaz de proteínas totais.
  14. Uma vez que o peso é registrado, coloque o tubo de homogeneização contendo a amostra de volta no rack de tubos em gelo seco para mantê-lo frio.
  15. Descarte a espátula de plástico usada.
  16. Use uma espátula de plástico nova e limpa para cada amostra a ser transferida e pesada para evitar contaminação cruzada. Repita as etapas 2.9 a 2.15 para todas as amostras.
  17. Depois de transferir todas as amostras para tubos de homogeneização individuais, calcule a quantidade de Protein Lysis Master Mix necessária.
    1. Prepare o volume necessário de Protein Lysis Master Mix, que é calculado com base no número de amostras que precisam ser processadas e no peso de cada amostra em pó. Adicione 100 μL de Protein Lysis Master Mix por 5 mg de tecido a cada tubo.
    2. Consulte as diretrizes da empresa para volumes de reagentes para fazer o Master Mix de Lise de Proteína (consulte a Tabela de Materiais).
  18. Colocar os tubos de homogeneização contendo as amostras homogeneizadas em pó num bloco frio a 4 °C. Os tubos de homogeneização não podem mais permanecer no gelo seco. A colocação dos tubos de homogeneização no bloco frio evita que a solução de lise congele.
  19. Remova a tampa dos tubos de homogeneização e transfira a quantidade calculada de Protein Lysis Master Mix necessária para o respectivo tubo de homogeneização usando a pipeta de capacidade apropriada.
    1. Coloque a tampa de volta nos tubos de homogeneização e gire as tampas até que estejam bem apertadas.
  20. Coloque os tubos de amostra no homogeneizador e coloque-o em um programa de tecidos moles (velocidade de 4500 RPM, 2 x 30 s por ciclo, pausa de 30 s) a 4 ° C para homogeneização.
  21. Uma vez concluído o ciclo de homogeneização, remova os tubos do instrumento e coloque-os de volta no bloco frio de 4 °C.
    1. Inspecione visualmente os tubos de amostra. Certifique-se de que nenhuma amostra em pó ainda esteja visível. Se a amostra ainda for visualizada durante todo o Master Mix de Lise de Proteínas, complete a lise do tecido novamente no instrumento.
    2. Otimize as configurações para o tipo de tecido que está sendo utilizado. Por exemplo, tecido em pó derivado de órgãos fibrosos (por exemplo, coração) pode precisar de ciclos adicionais ou um RPM mais alto.
  22. Transferir os tubos de homogeneização para uma centrífuga. Insira as seguintes configurações na centrífuga: 16.000 g por 10 min a 4 °C e pressione Iniciar na centrífuga.
  23. Quando a centrifugação estiver concluída, transfira cuidadosamente os tubos de homogeneização de volta para o bloco frio de 4 °C.
  24. Rotule os novos tubos de 1,5 mL na tampa e na lateral com o sample ID e qualquer outra informação pertinente. Uma vez rotulados, coloque esses tubos de 1,5 mL em um bloco frio de 4 °C.
    NOTA: Os tubos foram rotulados com pelo menos o seguinte: ID do animal, ponto de tempo do estudo, tipo de animal e tipo de tecido.
  25. Transfira o lisado de proteína correspondente dos tubos de homogeneização para os respectivos tubos de 1,5 mL rotulados mantidos em um bloco frio a 4 ° C.
  26. Armazene amostras a -80 °C para análise posterior. Este é um ponto de parada seguro.

3. Quantificação total de proteínas

  1. Retire as amostras do congelador a -80 °C e descongele-as em gelo húmido num balde de gelo.
  2. Depois de descongelado, vortice todas as amostras e padrões do kit de quantificação de proteínas por pelo menos 3 s.
  3. Adicione 10 μL de cada réplica de padrão, amostras e espaços em branco apropriados em uma placa de microtitulação de 96 poços com base no layout esquemático (Figura 2A).
    NOTA: Para cada amostra de tecido, uma diluição de 1:100 do lisado de proteína em solução salina preferencialmente tamponada com fosfato é usada na análise do ensaio de proteína. O layout esquemático pode ser alterado dependendo do número de amostras usadas no ensaio de proteína. As amostras, padrões e espaços em branco apropriados são carregados em uma placa de microtitulação de 96 poços em triplicata para avaliar a precisão da concentração de proteínas, mas se muitas amostras precisarem caber em uma placa, duplicatas são aceitáveis.
    1. Para as amostras com uma baixa quantidade de tecido inicial (ou seja, menos de 5 mg), use apenas uma única réplica ou duplicatas para o ensaio de proteína para maximizar a quantidade de lisado de proteína disponível para a digestão subsequente da proteína.
    2. Certifique-se de que pipetas precisas e calibradas sejam usadas.
  4. Inverta o frasco de reagente de ensaio de proteína várias vezes para misturar bem e, em seguida, despeje-o em um reservatório de reagente de 10 mL.
  5. Usando uma pipeta multicanal de capacidade máxima de 200 μL, adicione 150 μL do reagente de ensaio de proteína à coluna 1.
  6. Pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar o reagente de ensaio de proteína com os 10 μL de conteúdo já existentes no poço para ajudar a reduzir o precipitado nos poços.
  7. Descarte as ponteiras da pipeta e coloque novas ponteiras na pipeta multicanal de capacidade máxima de 200 μL.
  8. Repita as etapas 3.5-3.7 até que o reagente de ensaio de proteína seja adicionado a toda a placa de 96 poços.
    1. Use ponteiras de pipeta novas para cada coluna de poços para evitar contaminação cruzada.
    2. Certifique-se de que pelo menos um alvéolo é deixado vazio, sem reagentes ou amostra adicionada para utilizar como valor de absorvância em branco para quantificação de proteínas.
  9. Uma vez que o reagente de ensaio de proteína tenha sido adicionado a todos os poços necessários, cubra a placa de 96 poços com uma vedação de placa de folha de alumínio.
  10. Vórtice a placa de 96 poços em um instrumento de vórtice por 1 min em velocidade média e, em seguida, incube-a à temperatura ambiente (RT) por 5 min antes de ler a placa.
  11. Inspecione a placa de 96 poços e a vedação de folha de alumínio. Se o reagente permanecer preso ao selo de folha de alumínio, coloque-o com uma balança apropriada dentro de uma centrífuga.
    1. Pressione e segure a centrifugação rápida até atingir aproximadamente 200 g.
    2. Retire a placa de 96 poços e inspecione visualmente a vedação da folha de alumínio para garantir que nenhum líquido permaneça na folha.
  12. Remova lentamente a vedação da folha de alumínio e coloque a tampa transparente de volta na placa de 96 poços (Figura 2B).
  13. Leia a placa de 96 poços em um espectrofotômetro a 660 nm, depois de permitir que a reação colorimétrica se desenvolva por 5 min.
    NOTA: As leituras de absorbância usando um espectrofotômetro UV/Visível são medidas à temperatura ambiente. O ensaio de proteína de 660 nm é baseado na ligação de um complexo de corante metálico patenteado à proteína em condições ácidas que causa uma mudança no máximo de absorção do corante, que é medido em 660 nm.
  14. Use as leituras de absorbância dos padrões conhecidos para criar a curva padrão usando software gráfico (Figura 2C-E), que é posteriormente aplicado para calcular as concentrações de proteína para todas as amostras.

4. Digestão de proteínas

CUIDADO. Certifique-se de que os protocolos de segurança adequados sejam seguidos ao trabalhar com os produtos químicos perigosos utilizados no protocolo abaixo. O pessoal do laboratório usava equipamento de proteção individual (EPI) e completou essas etapas em uma capela química. Revise todas as fichas de dados de segurança antes de trabalhar com esses produtos químicos.

  1. Rotule um novo conjunto de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com os IDs de amostra na tampa e na lateral dos tubos com tinta permanente. Inclua qualquer outra informação pertinente.
    1. Com base na equação da curva padrão, nas leituras de absorbância da amostra e no fator de diluição, calcule a concentração de proteína de cada amostra em microgramas por microlitro (μg/μL). Use este valor para calcular o volume necessário de lisado de amostra contendo 100 μg de proteína ( Figura 2C-E ). Transfira este volume calculado de lisado de amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Completar o volume final a 100 μL com o tampão de lise; Este é o volume inicial necessário para o protocolo de digestão.
    NOTA: O volume final da amostra de proteína mais tampão de lise deve ser igual a 100 μL.
  3. De acordo com a literatura publicada anteriormente, use 1,5 μL do plasma para digestão, o que é aproximadamente igual a 100 μg de proteína.
  4. Adicione 50 μL de solução de redução (10 mM de ditiotreitol) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, feche os topos e vore brevemente por 3 s. Em seguida, adicione 50 μL de solução de alquilação (30 mM de iodoacetamida) a cada amostra, feche os topos e vore por 3 s.
  5. Incubar amostras a 95 °C usando um bloco de calor por 11 min para reduzir e alquilar, respectivamente, a amostra de proteína. Isso cliva todas as pontes de dissulfeto e as cobre com um grupo acetamida, impedindo sua reforma e, assim, desnatura a proteína em um estado totalmente desdobrado e maximiza a exposição dos locais de digestão do peptídeo.
  6. Após a incubação, remova as amostras do bloco de calor e deixe-as esfriar até o RT.
  7. Enquanto espera que as amostras esfriem, reconstitua a mistura liofilizada de tripsina / lis-C protease (proporção 1: 1, 50 μg cada) com solução de reconstituição enzimática adicionando 515 μL do líquido a 1 frasco do reagente sólido, ou seja, 0,1 μg / μL cada. Evite o contato direto da pele com a solução de protease e todas as etapas posteriores, pois a tripsina pode ser um irritante e alérgeno grave.
  8. Uma vez que as amostras são resfriadas à RT, adicione 50 μL de mistura de tripsina / protease Lys-C reconstituída (2,5 μg cada) à solução de amostra de proteína reduzida e alquilada e vórtice brevemente.
  9. Incubar num termomixer a 37 °C e regular a 1000 rpm durante 3 h para digerir a amostra de proteína.
    NOTA: A protease Lys-C está incluída para ajudar a clivar quaisquer locais resistentes à digestão pela tripsina, devido ao dobramento ou sequência de aminoácidos (por exemplo, ligações Lys-Pro). Isso não apenas reduz cada proteína em vários peptídeos reconhecíveis de tamanho e carga total razoavelmente pequenos, mas também é altamente reprodutível se as mesmas condições de digestão forem seguidas de perto. O tempo de incubação de 3 h durante a digestão é o tempo mínimo que recomendamos para garantir a clivagem completa de todas as proteínas.
  10. Após as 3 h de incubação, retire do termomixer usando uma pinça para evitar queimaduras nos dedos.
  11. Adicione 50 μL de solução de parada de digestão (ácido trifluoroacético a 6% ou ácido fórmico em água) à amostra e vórtice brevemente.
    NOTA: Isso inibe a reação, uma vez que as duas proteases têm atividades máximas em um pH neutro 7-8.
  12. Armazene as amostras em um freezer a -80 °C, pois isso também interrompe qualquer atividade de protease residual. Este é um ponto de parada seguro.

5. Limpeza, secagem e ressuspensão de peptídeos

NOTA: Este procedimento é principalmente para remover os reagentes de digestão, especialmente sais não voláteis, que podem danificar prontamente o instrumento LC/MS-MS, bem como ajudar a isolar e concentrar os peptídeos produzidos. A limpeza do peptídeo é realizada usando colunas de rotação de dessalinização fornecidas pelo kit, que são pré-embaladas com uma resina de exclusão de tamanho (filtração em gel) que inicialmente captura os peptídeos e, em seguida, permite que especialmente os sais sejam lavados. Transferência completa dos reagentes do kit para as colunas de centrifugação em uma capela química, pois contêm solventes orgânicos tóxicos.

CUIDADO. Certifique-se de que os procedimentos de segurança adequados, incluindo o uso de EPI e os regulamentos de contenção de resíduos perigosos, sejam seguidos ao trabalhar com os produtos químicos perigosos no protocolo abaixo. Conclua estas etapas em uma capela de exaustão química e review todas as fichas de dados de segurança antes de trabalhar com esses produtos químicos.

  1. Retirar as amostras do congelador a -80 °C e permitir que as amostras cheguem à RT.
  2. Remova a tampa branca na parte inferior da coluna de limpeza de peptídeos, solte a tampa superior verde e coloque-a em um tubo de coleta de 2 mL.
  3. Coloque-os na centrífuga, feche a tampa, pressione start e centrifugue a 3000 g por 2 min para remover todo o líquido de condicionamento pré-embarque.
  4. Descarte o fluxo em um recipiente de resíduos perigosos e coloque a coluna de limpeza de peptídeos em um novo tubo de coleta de 2 mL.
  5. Rotule as tampas verdes da coluna de limpeza de peptídeos com os IDs de amostra, usando uma caneta marcadora de tinta permeaned.
  6. Transfira suavemente a preparação de digestão de proteínas, que tem aproximadamente 300 μL de volume, para a coluna de limpeza de peptídeos secos, usando uma pipeta de 200 μL (por exemplo, 150 μL duas vezes).
    1. Certifique-se de que nenhuma bolha seja observada no topo da resina da coluna de centrifugação. Se forem observadas bolhas, remova-as batendo suavemente na coluna ou usando uma ponta de pipeta limpa de 10 μL para dispersar a(s) bolha(s).
      NOTA: Bolhas de ar presas podem impedir a transição suave da amostra para a resina e, portanto, afetar negativamente a eficiência da limpeza e do rendimento do peptídeo.
  7. Coloque-os na centrífuga, feche a tampa, pressione Start e centrifugue a 1.500 g por 2 min.
  8. Descarte o fluxo em um recipiente de resíduos perigosos e coloque a coluna de limpeza de peptídeos em um novo tubo de coleta de 2 mL.
  9. Adicione 300 μL da solução de lavagem A (água, ácido trifluoroacético a 0,1% / TFA) no topo da resina da coluna, novamente usando uma pipeta de 200 μL.
    1. Certifique-se de que nenhuma bolha seja observada no topo da resina da coluna de centrifugação. Se forem observadas bolhas, remova-as batendo suavemente na coluna ou use uma ponta de pipeta limpa de 10 μL para dispersar a(s) bolha(s).
  10. Coloque-os na centrífuga, feche a tampa, pressione Start e centrifugue a 1.500 g por 2 min.
  11. Descarte o fluxo em um recipiente de resíduos perigosos e coloque a coluna de limpeza de peptídeos em um novo tubo de coleta de 2 mL.
  12. Adicione 300 μL de solução de lavagem B (5% de metanol, 0,1% de TFA) no topo da resina da coluna, novamente usando uma pipeta de 200 μL.
    1. Certifique-se de que nenhuma bolha seja observada no topo da resina da coluna de centrifugação. Se forem observadas bolhas, remova-as batendo suavemente na coluna ou use uma ponta de pipeta limpa de 10 μL para dispersar a(s) bolha(s).
  13. Coloque-os na centrífuga, feche a tampa, pressione Start e centrifugue a 1.500 g por 2 min.
  14. Descarte o fluxo em um recipiente de resíduos perigosos e coloque a coluna de limpeza de peptídeos em um novo tubo de coleta de 2 mL.
  15. Repita as etapas 5.12-5.14 mais uma vez para que a coluna seja lavada duas vezes com a solução de lavagem B.
  16. Transfira a coluna de limpeza de peptídeos para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL.
    1. Certifique-se de que os tubos de microcentrífuga de 2 mL usados nesta etapa sejam os tubos de coleta de baixa ligação a proteínas fornecidos pelo kit.
    2. Para conservar a quantidade disponível de tubos de coleta de baixa ligação a proteínas, use os de laboratório padrão para as etapas de lavagem anteriores.
  17. Adicione 300 μL de solução de eluição (50% de acetonitrila, 0,1% de TFA) no topo da resina da coluna, novamente usando uma pipeta de 200 μL.
    1. Certifique-se de que nenhuma bolha seja observada no topo da resina da coluna de centrifugação. Se forem observadas bolhas, remova-as batendo suavemente na coluna ou use uma ponta de pipeta limpa de 10 μL para dispersar a(s) bolha(s).
  18. Coloque-os na centrífuga, feche a tampa, pressione Start e centrifugue a 1.500 g por 3 min para coletar a amostra de peptídeo limpa no novo tubo de coleta de 2 mL de baixa ligação a proteínas.
    1. Se desejar, transfira 125 μL (aproximadamente metade) da solução peptídica limpa eluída para um frasco de vidro de 1 mL, usando uma pipeta de 200 μL e armazene a -80 ° C.
      NOTA: Esta alíquota pode ser usada posteriormente para análises adicionais, como a marcação de tag de massa em tandem (TMT) dos peptídeos, como feito por um kit disponível comercialmente, para quantificação mais precisa entre amostras, especialmente conjuntos preparados independentemente.
  19. Conservar a amostra restante, aproximadamente 175 μL, a -30 °C nos tubos de 2 ml de baixa ligação às proteínas até estar pronta para proceder à secagem e reconstituição. Este é um ponto de parada seguro.
  20. Para secar a amostra, descongele a amostra de peptídeo de -30 °C a RT. Se prosseguir com a secagem e reconstituição logo após a limpeza do peptídeo, ignore esta etapa.
  21. Abra os tubos de microcentrífuga de 2 mL e coloque-os em um concentrador de centrífuga a vácuo.
    1. Certifique-se de equilibrar o concentrador de centrífuga a vácuo se um número ímpar de amostras estiver sendo executado ao mesmo tempo.
    2. Feche a tampa do concentrador da centrífuga a vácuo e pressione Iniciar.
    3. Deixe as amostras correrem no concentrador de centrífuga a vácuo por 3 h, sem aplicação de aquecimento.
    4. Inspecione os tubos periodicamente para garantir que nenhum líquido permaneça dentro, pois isso pode interferir na ligação dos peptídeos à coluna de separação do instrumento LC/MS-MS.
    5. Se o líquido ainda for observado, continue girando as amostras por mais tempo.
    6. Verifique entre 30 min e 1 h para ver se o líquido permanece no tubo.
      NOTA: Os peptídeos são altamente estáveis durante este processo, pois estão sob condições de vácuo e não serão deteriorados por um curto período de secura ou calor moderado gerado apenas pela operação do concentrador de centrífuga a vácuo.
  22. Depois de seco, ressuspenda imediatamente a amostra em 50 μL de ácido fórmico a 0,1% em água de grau MS (por exemplo, 5 μL de ácido fórmico a 100% em 5 mL de água).
    1. Adicione 50 μL de ácido fórmico a 0,1% no fundo do tubo de 2 mL de baixa ligação a proteínas contendo a amostra de peptídeo seco, usando uma pipeta de 200 μL.
  23. Feche as tampas e depois vortex por 15 s.
  24. Transfira as amostras reconstituídas para os respectivos frascos de vidro de 1 mL, usando uma pipeta de 200 μL.
  25. Armazene os frascos de vidro contendo as amostras reconstituídas a -30 ° C e analise-os por abordagem baseada em LC-MS / MS o mais rápido possível.
    NOTA: As amostras de peptídeos congelados são estáveis a -30 °C para armazenamento de curto prazo e -80 °C para armazenamento mais longo.

6. Aquisição de dados de amostras de peptídeos em um instrumento UHPLC/MS-MS

CUIDADO. Certifique-se de que os protocolos de segurança adequados sejam seguidos ao trabalhar com um sistema de espectrômetro de massa em tandem tríbrido de ultra-alto desempenho/Orbitrap. O pessoal do laboratório usava EPI e passava por treinamento formal e prático de instrumentos fornecido pelo fabricante do UHPLC/MS-MS. Os principais cuidados são o manuseio adequado das fases móveis de solvente ácido e orgânico para o UHPLC e a fonte de ionização de alta tensão para o MS.

  1. Realize separações de peptídeos usando um sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC). A coluna LC é um projeto de separação rápida (RSLC) de fase reversa C18 com capacidade de eletrospray, com dimensões de 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, conforme colocado em linha após uma pré-coluna de proteção do mesmo material.
  2. Use as seguintes fases móveis UHPLC: 0,1% de ácido fórmico em água (solvente A), 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (solvente B) e 0,1% de ácido fórmico em 90% de água e 10% de metanol (solvente C).
    NOTA: Todos os solventes, bem como o ácido fórmico, usados para preparar as fases móveis são certificados como LC/MS e feitos apenas conforme necessário. O UHPLC possui uma unidade de filtragem e desgaseificação antes das bombas, para que as fases móveis não sejam filtradas manualmente e purgadas de ar.
  3. Defina as injeções programadas dos peptídeos totais preparados para as amostras de plasma e tecido em 3 μL para começar, o que equivale a ~ 3 μg de material peptídico conforme determinado pela quantidade inicial de proteína usada.
    NOTA: Isso deve produzir uma intensidade de sinal MS ideal para identificações máximas de proteínas. O volume de injeção pode ser aumentado para até 15 μL para aumentar ainda mais a saída do sinal ou diminuído para apenas 1 μL se a sobrecarga for aparente.
  4. Manter a coluna e o amostrador automático a 40 °C e 10 °C, respectivamente.
  5. Defina a taxa de fluxo de solvente para a aquisição proteômica em 0,3 μL / min constante, usando as nanobombas UHPLC, com um gradiente de separação linear das fases móveis da água (A) para a acetonitrila (B).
  6. Efectuar lavagens da seringa de injecção e do circuito de recolha de amostras (capacidade de 20 μL) utilizando a fase móvel de água e metanol (C), com a bomba de carga UHPLC inicialmente regulada para 5 μL/min.
  7. Durante a separação da amostra ao longo de 80 min no total, defina o gradiente LC (curvas lineares) da seguinte forma: Inicial - 5% B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 min - 95% B; 65-66 min - 2% B; e 66-80 min - 2% B. Da mesma forma, opere a bomba de carregamento a uma constante de 100% de A, mas ajuste a vazão linearmente da seguinte forma: Inicial - 5 μL/min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; e 61-80 min - 5 μL/min (Figura 3A).
  8. Injete amostras de peptídeos desconhecidos como execuções duplicadas sequenciais.
  9. Para evitar o transporte, realizar pelo menos duas injeções sequenciais em branco de ácido fórmico a 0,1% em água entre as amostras usando um gradiente LC truncado (curvas lineares) ao longo de 35 min no total da seguinte forma: Inicial - 5% B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; e 31-35 min - 2% B (Figura 3B).
    1. Certifique-se de que as configurações para o gradiente LC da bomba de carga permaneçam inalteradas.
    2. Para amostras de peptídeos com altos níveis de contaminantes endógenos, como fígado (por exemplo, ácidos biliares), inclua um terceiro branco a cada 3 a 5 amostras e no final da execução para ajudar a limpar a coluna LC. Consiste na injeção de 1 a 2 μL de solução contendo 25% de acetonitrila, isopropanol, metanol e água.
    3. Alternativamente, ou em combinação com a etapa acima, execute um gradiente LC aprimorado de alteração percentual (ou seja, gangorra) ao longo de 35 min no total como uma lavagem do sistema da seguinte forma: Inicial - 2% B; 0-3 min - 2% B; 3-4 min - 95% B; 4-10 min - 95% B; 10-11 min - 2% B; e 11-15 min - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 min - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; e 31-35 min - 2% B (Figura 3C).
  10. Realizar a detecção dos peptídeos, ou seja, massas moleculares correspondentes, à medida que são separados e eluídos da coluna LC, usando um sistema Orbitrap e um espectrômetro de massa quadrupolo tandem (MS-MS) combinado com armadilha de íons.
    1. Antes de executar as execuções de amostra, conecte a coluna LC diretamente na face da fonte de ionização de nano spray (NSI) intercambiável do instrumento MS, localizada no canto frontal superior esquerdo do dispositivo.
      NOTA: Isso expõe a agulha de eletrospray embutida da coluna LC que fornece os peptídeos, suspensos dentro de microgotículas carregadas de solvente de fase móvel LC, na entrada do tubo de transferência de íons do detector.
    2. Além disso, para melhorar a eficiência da volatilização por eletrospray, ligue a unidade de aquecimento integrada da fonte NSI e ajuste-a para 40 °C.
  11. Além disso, antes da execução da amostra, verifique se há uma entrada externa satisfatória de nitrogênio comprimido e gás hélio no instrumento MS. Consiga isso usando tanques de cilindros de aço de tamanho 300 de grau de pureza ultra-alta de cada gás, que têm os medidores reguladores ajustados em pressões de fluxo estáticas de 60 e 40 psi, respectivamente.
  12. Se o instrumento MS emitir avisos sobre a instabilidade da entrada de gás nitrogênio, aumente a pressão até um máximo de 100 psi. Certifique-se de que os tanques estejam pelo menos 10-20% cheios, que é uma leitura do medidor de válvula superior de ~ 250-500 psi; e se não, troque-os por novos. Cair abaixo de 10% da capacidade total tem o risco de atrair contaminantes para o instrumento MS, que podem se depositar no fundo dos tanques de gás.
  13. Faça o método do espectrômetro de massa de antemão usando um modelo de software de controle fornecido que é projetado para a detecção ideal de peptídeos e suas modificações pós-traducionais (Figura 3D-H) e insira as seguintes condições padrão:
    1. Defina o período total de detecção para 80 min.
    2. Defina o modo de detecção geral para peptídeos.
    3. Defina a fonte NSI para o modo positivo (ou seja, carga dos íons peptídicos).
    4. Defina a tensão da agulha de nano-spray para 2000 V e mantenha-a estática.
    5. Defina a entrada de gás nitrogênio para o NSI e defina os detectores para estático.
    6. Defina a temperatura do tubo de transferência de íons para 275 °C.
    7. Detecte as massas de todos os peptídeos (ou seja, íons pais; MS1) definindo a faixa de varredura para 350-2000 m/z, a lente RF para 30%, o tempo máximo de injeção para Auto e o analisador de massa orbitrap para uma resolução de 120.000.
      NOTA: A capacidade alternativa de armadilha de íons do instrumento não é usada aqui para rastrear as massas peptídicas, pois é menos sensível para monitorar esse tipo de molécula em comparação com o orbitrap.
    8. Defina os filtros de íons para discriminar entre os peptídeos com vários estados de carga em um intervalo de 2 a 7. Isso permite que o instrumento, ao registrar os dados, converta automaticamente as taxas de massa sobre carga (m/z) inerentemente detectadas das moléculas em suas massas exatas. Da mesma forma, um peptídeo com apenas um único estado de carga (m/z = 1) não requer nenhum fator de conversão para obter sua massa exata.
    9. Defina as portas de exclusão dinâmica para os íons para 1 passagem com duração de 60 s, tolerância de massa de ±10 ppm e para descartar quaisquer moléculas com átomos isotópicos naturais presentes (por exemplo, 14C).
    10. Detectar as massas de fragmentos de confirmação de identidade gerados para os peptídeos (ou seja, íons filhos; MS2) configurando o instrumento para a aquisição dependente de dados (modo DDA).
    11. Capture todos os peptídeos (ou seja, íons pais) por isolamento quadrupolo, usando uma configuração para a janela de tolerância à variabilidade de massa de m / z = 1,6.
    12. Execute a fragmentação dos peptídeos capturados definindo o modo de impacto de elétrons para HCD (ou seja, dissociação colisional de alta energia usando nitrogênio e gás hélio como agente de transferência de elétrons), energia de colisão para 30%, faixa de varredura para Auto, tempo máximo de injeção para Auto e o analisador de massa Orbitrap para uma resolução de 30.000.
    13. Adquira os dados finais (íons MS1 e MS2) definindo a forma do pico do sinal para um formato de centróide.
  14. Mantenha determinações de massa precisas para peptídeos detectados calibrando rotineiramente o instrumento, geralmente antes de cada execução de lote de amostra, conforme descrito abaixo.
    1. Coloque o instrumento MS em um status de fonte de íons desligado, usando o software de controle, e troque a fonte NSI pela fonte alternativa de ionização por eletrospray aquecida internamente (HESI) do dispositivo. Esta é a fonte usada para aplicações que podem exigir volumes de injeção de amostra muito grandes e uma alta taxa de fluxo correspondente (1-2500 μL/min) para a bomba LC, por exemplo, experimentos metabolômicos e farmacocinéticos de medicamentos.
    2. Selecione a opção de verificação de calibração completa no software de controle.
    3. Encha uma seringa de vidro de 500 μL com um êmbolo revestido de Teflon e uma agulha romba de aço inoxidável com uma solução padrão MS disponível comercialmente e, em seguida, conecte a linha do tubo capilar de PTFE à fonte HSEI (enquanto estiver desligado).
      NOTA: O padrão usado aqui contém uma mistura de moléculas naturais e sintéticas (16 no total, por exemplo, cafeína) que abrangem uma faixa de massa de m / z = 50-2800 e cobrem uma ampla gama de possíveis tipos de ligações químicas, especialmente aquelas associadas a peptídeos (por exemplo, grupos amida).
    4. Inicie uma infusão constante do padrão MS na fonte HSEI (enquanto estiver ligado), usando uma taxa de 3-5 μL / min, conforme feito usando uma bomba de seringa. Assim que um padrão estável de picos padrão for observado na janela de visualização ao vivo do software de controle, ative a verificação de calibração automatizada.
      NOTA: Se nenhum problema for encontrado com a sensibilidade e precisão das determinações de massa para o padrão, uma calibração completa bem-sucedida normalmente leva < 40 min. Da mesma forma, somente se o instrumento passar por todos os parâmetros de hardware MS verificados é considerado confiável para a execução de amostras.
    5. Confirme o sucesso da calibração redefinindo a fonte NSI e a coluna LC e, em seguida, executando uma solução padrão de [Glu 1]-Fibrinopeptídeo B humano (Glu-Fib) em quantidades totais injetadas cobrindo 1-10 ng (por exemplo, 1, 2, 6 e 10 ng). Use os mesmos métodos de separação LC e detecção de MS descritos acima para as amostras desconhecidas.
    6. Verifique o padrão Glu-Fib para o tempo de retenção LC apropriado (~ 20 min), presença de íons MS1 e MS2 (m / z = 1285,54, 813,39, 785,84, 445,12, 333,19 e 175,12) e linearidade das áreas de pico crescentes com a quantidade injetada.
    7. Em seguida, gere tabelas de sequência, usando o software de controle e captura de dados, para executar o peptídeo desconhecido e amostras em branco que contêm colunas para inserir o tipo de amostra, nome do arquivo, ID da amostra, caminho de dados, método do instrumento LC/MS, posição do frasco e volume de injeção (Figura 3D-E).
    8. Salve os arquivos de dados MS resultantes (extensão: RAW; 500 - 800 GB cada) na pasta de caminho designada no disco rígido do computador instrumento. Em seguida, transfira esses arquivos para um computador de estação de trabalho que seja poderoso o suficiente para acionar o software de bioinformática, conforme descrito posteriormente, que converte os dados espectrais de massa de peptídeos extremamente extensos e complexos (ou seja, sinais MS1 e MS2) em perfis de composição de proteínas totais correspondentes.

7. Conversão de dados brutos de MS em resultados representativos do proteoma total

NOTA: Os dados brutos de MS capturados para amostras de peptídeos são processados em perfis de composição de proteínas totais (proteoma), usando software de bioinformática. Em resumo, o software de bioinformática reconstrói as proteínas originais na amostra, combinando os dados brutos de MS com seus espectros de peptídeos MS1 e MS2 conhecidos encontrados em uma biblioteca de referência de proteoma específica para espécies baseada na web, por meio de uma cobertura extensa e exclusiva da sequência de aminoácidos da proteína. As abundâncias relativas de cada proteína identificada são determinadas pelo programa usando as intensidades de sinal MS1 de seus peptídeos únicos correspondentes. As abundâncias determinadas podem ser comparadas de forma confiável entre as amostras, mas somente se forem executadas no mesmo lote de preparação e usando configurações idênticas de LC e MS. Caso contrário, as técnicas quantitativas absolutas mencionadas anteriormente com base em recuperações de íons padrão / repórter interno, como a marcação seletiva de TMT dos peptídeos dentro de cada amostra, terão que ser empregadas.

  1. Baixe no disco rígido do computador da estação de trabalho o arquivo de referência do proteoma da biblioteca baseada na web.
    1. Encontre-o usando o banco de dados localizado no site da Uniprot para as espécies de amostra de interesse (por exemplo, furões / Mustela furo). Isso é chamado de arquivo FASTA. Use a ferramenta de pesquisa Proteomas e a visualização de tabela para localizar e baixar o arquivo de referência do proteoma.
    2. Para maximizar o número possível de identificações de proteínas geradas, selecione as entradas revisadas por pares (Swiss-Prot) e não revisadas (TrEMBL) do comitê para o banco de dados Uniprot ao criar o arquivo FASTA. Da mesma forma, escolha a opção de incluir todas as isoformas revisadas para as proteínas.
  2. Abra o software de bioinformática, ou seja, Proteome Discoverer, na guia Página inicial e selecione a guia Administração .
  3. Vá para a subguia Manter arquivos FASTA e baixe no programa o arquivo FASTA específico da espécie acima gerado para seus experimentos.
  4. Volte para a guia Página inicial e clique em Novo estudo/análise e, na caixa de diálogo, digite um nome de estudo no campo Nome do estudo e selecione uma pasta de arquivos para salvar o estudo no campo Diretório raiz do estudo .
  5. Deixe os campos Fluxo de trabalho de processamento e Fluxo de trabalho de consenso em branco por enquanto, pois eles serão selecionados para mais tarde.
  6. Clique em OK para salvar e sair da caixa de diálogo, que abrirá a página Definição do estudo .
  7. Vá para a guia Definição do estudo e digite os detalhes do projeto na caixa Descrição do estudo localizada no meio do lado esquerdo.
  8. Vá para a guia Arquivos de entrada e clique em Adicionar arquivos.
    1. Isso abrirá uma caixa de diálogo na qual os arquivos de dados brutos necessários a serem processados nos resultados do perfil de composição total de proteínas (proteoma) podem ser selecionados e baixados do disco rígido do computador.
  9. Clique nos arquivos de dados brutos do MS que agora estão listados na guia Arquivos de entrada , que podem ser selecionados e destacados individualmente ou todos de uma vez.
  10. Arraste-os e solte-os na seção Arquivos para análise da caixa Análise localizada no meio direito como parte da subcaixa Etapa de processamento .
  11. Vá para a guia Fluxos de trabalho e clique em Editar, que se encontra ao lado do cabeçalho Etapa de processamento da caixa Análise localizada no lado direito do meio.
  12. Clique em Abrir comum e, na pasta ProcessingWF_Tribrid , selecione o arquivo de fluxo de trabalho de processamento designado especificamente para subidentificações de fosfoproteínas, conforme obtido na detecção de MS baseada em fragmentação de HCD (Figura 4A).
    NOTA: Um diagrama de etapas de processamento contendo nós editáveis aparecerá na caixa Árvore de fluxo de trabalho . Haverá dois nós, conforme descrito abaixo, que são marcados com pontos de exclamação indicando que há uma entrada obrigatória de informações específicas do experimento pelo usuário.
  13. No diagrama de árvore de fluxo de trabalho de processamento, clique e abra o nó RC do Spectrum Files .
    1. Na categoria Parameters of Spectrum Files RC , localize e selecione no parâmetro Protein Database o arquivo FASTA, que foi gerado anteriormente usando o site da Uniprot, para a biblioteca de referência específica da espécie de espectros de peptídeos MS que será pesquisada para identificar as proteínas de interesse experimental.
  14. Clique e abra o nó Sequest HT e faça as três alterações a seguir:
    1. No parâmetro Protein Database , selecione o mesmo arquivo FASTA, conforme descrito acima.
    2. No parâmetro Nome da enzima , selecione Tripsina (completa) ou, alternativamente, Lys-C, que são as proteases principais e de backup usadas para preparar o resumo original do peptídeo.
    3. No parâmetro Modificações dinâmicas , certifique-se de que pelo menos Phospho / +79.966 Da (S, T, Y) foi selecionado.
      1. Use a última configuração para revelar peptídeos associados a proteínas que são modificadas pós-traducionalmente por fosforilação, procurando por perdas de espectros de MS correspondentes de um (s) grupo (s) fosfato (m/z = 79,97).
      2. Encontre os locais de aminoácidos ocupados por fosfato (ou seja, serina, treonina ou tirosina) pelas alterações esperadas em seus padrões de fragmentação de MS2.
      3. Adicione outras modificações pós-traducionais de proteína de interesse rotineiro da mesma maneira ao nó Sequest HT neste ponto, por exemplo, metilação, acetilação, miristilação, se a perda de massa exata dos grupos relacionados for conhecida. Da mesma forma, expanda a busca pelos locais de fosforilação para outros aminoácidos relatados com menos frequência, por exemplo, histidina.
        NOTA: Os nós Spectrum Files RC e Sequest HT da árvore de fluxo de trabalho para a etapa de processamento são os únicos dois que exigem que os parâmetros sejam ajustados.
    4. Deixe o resto como suas configurações padrão, pois elas já foram otimizadas pelo fabricante para produzir o maior número de identificações de proteínas designadas de interesse. Da mesma forma, isso se aplica a todos os outros nós na árvore de fluxo de trabalho.
    5. Certifique-se de que os nós Percolator e IMP-ptmRS estejam incluídos no final da árvore de fluxo de trabalho.
      NOTA: O coador usa ajuste reiterativo para refinar bastante os resultados finais. O IMP-ptmRS é essencial para relatar a identificação apropriada e a localização do local de todas as modificações pós-traducionais da proteína, incluindo a fosforilação.
  15. Volte para a guia Fluxos de trabalho e clique em Editar encontrado ao lado do cabeçalho da Etapa de consenso da caixa Análise localizada no canto superior direito. Isso abrirá o diagrama de árvore de fluxo de trabalho para a etapa de consenso.
  16. Clique em Open Common e, na pasta ConsensusWF , selecione o arquivo de fluxo de trabalho de consenso que produzirá o formato de saída desejado para os resultados do perfil de composição de proteínas (proteoma) (Figura 4B).
    NOTA: Um diagrama de etapas de consenso contendo nós editáveis será aberto na caixa Árvore de fluxo de trabalho . O diagrama utilizado para processar os dados é gerado pela modificação do fluxo de trabalho de consenso básico, onde os nós Feature Mapper e Precursor Ions Quantifier em linha foram adicionados como uma ramificação do nó inicial do MSF Files , para facilitar a quantificação das abundâncias relativas de proteínas. Embora todos os nós no fluxo de trabalho já contenham parâmetros otimizados estabelecidos pelo fabricante, há alguns contendo entradas muito importantes para verificar a seleção adequada, conforme descrito abaixo.
  17. No diagrama de árvore do fluxo de trabalho, clique e abra o nó Quantificador de Íons Precursores . Este é o nó essencial para quantificar as abundâncias relativas de cada proteína identificada.
    1. Na categoria Configurações Gerais de Quantificação , localize e selecione no parâmetro Peptídeos a serem usados a opção Exclusivo + Navalha .
      NOTA: Peptídeos únicos são aqueles que contêm sequências de aminoácidos exclusivas de uma única proteína; e, portanto, são usados para determinar especificamente sua quantidade com base nas intensidades de sinal do MS. Os peptídeos de navalha são aqueles compartilhados entre grupos de proteínas; e, portanto, são usados para puxar as abundâncias relativas calculadas em concordância.
    2. Na categoria Normalização e Escala, altere os parâmetros Modo de Normalização e Modo de Escala para a opção Nenhum , pois esse tipo de ajuste é muito restrito para uma aplicação confiável em todo o proteoma.
      NOTA: Essas configurações são ativadas apenas quando se deseja normalizar as abundâncias relativas calculadas de proteínas selecionadas de interesse em relação àquelas que são estavelmente intrínsecas à célula, por exemplo, genes de manutenção e, em seguida, expressar os valores resultantes como uma proporção escalonada.
    3. Em seguida, clique e abra o nó Filtro de Peptídeos e Proteínas e, na categoria Filtros de Peptídeos , altere os parâmetros PSM Confiança Peptídica Pelo Menos e Manter Confiança Inferior para as opções Alta e Falsa , respectivamente. Isso define as correspondências de peptídeos usadas para fazer as identificações de proteínas para o maior nível de significância de ajuste (ou seja, ≥ 95%).
      NOTA: Alternativamente, o primeiro parâmetro pode ser definido como Médio para relaxar o rigor das correspondências peptídicas e, assim, aumentar muito a saída de acertos de proteínas; mas isso, inversamente, leva a um risco muito alto de gerar muitas identificações falsas. Da mesma forma, nunca deve ser o caso de um valor "Baixo" ser usado como uma opção aceitável para ambos os parâmetros.
    4. Esses são os únicos nós da etapa de consenso que precisam ter parâmetros ajustados, deixe o restante como usando suas configurações padrão.
      NOTA: No geral, o fluxo de trabalho da etapa de consenso lida com todas as análises post-hoc, ou seja, determinação das abundâncias relativas de proteínas, confidências de identificação (ou seja, taxas de descoberta falsa e pontuações de correspondência espectral de peptídeos) e cobertura de peptídeos mapeada. Estatísticas de resultados e distribuições de dados também são fornecidas como tabelas finais.
  18. Depois que os fluxos de trabalho de processamento e etapa de consenso acima estiverem em vigor, salve todo o estudo e clique no ícone Executar (engrenagens) localizado na parte superior da caixa Análise . Se vários arquivos de dados brutos do MS estiverem sendo processados de uma só vez, antes de iniciar a execução do processamento, clique e marque o ícone Por arquivo próximo (quadrado).
    NOTA: O processamento de um arquivo de dados brutos MS em um arquivo de resultado de proteoma total normalmente leva de 20 a 40 minutos, mas pode produzir uma lista contínua de muitos milhares de identificações de proteínas que variam de correspondências de baixa, média a alta confiança (ou seja, com uma ponderação para altos acertos), juntamente com as modificações de fosfato que estão presentes em cada entidade (Figura 4C). Os principais parâmetros de saída de resultados para as proteínas identificadas são FDR (confiança), Mestre (se a entrada do arquivo / biblioteca FASTA foi revisada), Acesso #, Descrição, % de Cobertura, Cobertura de Sequência, Correspondências Espectrais de Peptídeos (por exemplo, número de peptídeos únicos), Características Físicas (por exemplo, MW em kDa), Abundâncias Relativas e Modificações (ou seja, grupos de fosforilação).
    1. Coluna organizar os resultados totais do proteoma em ordem crescente ou decrescente ou totalmente filtrados, usando o ícone Funil na barra de ferramentas (Figura 4C), de acordo com os interesses de pesquisa, por exemplo, mostrar apenas aqueles com uma identificação de alta confiança (proteína FDR) ou um alto grau de correspondência de peptídeos (por exemplo, por % de cobertura e/ou número de únicos encontrados).
    2. Se as informações de modificação pós-tradução forem especificamente desejadas, filtre as proteínas identificadas com fosforilação para análise posterior.
    3. Salve os resultados filtrados, sem alterar o nome do arquivo, pois eles podem ser restaurados para a saída original simplesmente removendo os filtros aplicados e atualizando a janela.

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Resultados

Visualização dos resultados do proteoma total por processamento opcional em gráficos de vulcões
Os resultados totais do proteoma para cada amostra podem ser prontamente pesquisados por acesso # ou descrição para proteínas específicas de interesse de pesquisa e as abundâncias relativas associadas são calculadas e comparadas entre os grupos de tratamento para diferenças significativas (por exemplo, como por valores p derivados do teste t). Alternativamente, pode ser de grande valor exploratório procurar...

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Discussão

O método acima utilizou tecidos que foram congelados em nitrogênio líquido para interromper imediatamente toda a atividade biológica antes de transferir para -80 ° C para armazenamento de longo prazo. Uma vez que todas as amostras foram coletadas, ocorreu a homogeneização do tecido. Durante a homogeneização, é fundamental manter todos os tecidos e ferramentas frios para evitar a reativação ou degradação das proteínas. Além disso, durante a extração inicial da proteína do tecido homogenei...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado em parte por uma nomeação para o Programa de Associateship do Conselho Nacional de Pesquisa administrado pelo Escritório de Bolsas de Estudo das Academias Nacionais de Ciências, Engenharia e Medicina, e pelo Programa do Instituto de Ciência e Educação de Oak Ridge no Instituto de Pesquisa do Exército Walter Reed.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de ensaio de proteína de 660 nmPierce / Thermo Scientific22662Para que o BCA determine as concentrações de proteína das amostras, contém o reagente de ensaio de proteína Pierce 660nm e os padrões de ensaio de proteína pré-diluída
Acetonitrila, grau Optima LC/MSThermo Fisher Científico047138.K2Acetonitrila ultrapura usada para cromatografia líquida/espectrometria de massa
Placa de folha de alumínio - seloBeckman Coulter538619Selo usado durante o desenvolvimento da placa de ensaio de proteína
Leitor multimodo BioTek Synergy Neo2 / Espectrômetro UV-VisAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195Instrumento leitor de placas de espectrofotômetro/ensaio usado para completar leituras de absorbância de 660nm para determinar concentrações de proteínas 
Solução de descarga de instrumentos ChromaCare LC-MSThermo Fisher CientíficoT111101000Solução contendo 25% de acetonitrila, isopropranol, metanol e uso de água para ajudar a limpar o sistema LC após a execução das amostras
Tubo CK28 PrecellysBertin Corp / TecnologiasP000911LYSK0A.0Tecidos homogeneizados são colocados nesses tubos para lise tecidual e isolamento de proteínas usando o instrumento Precellyis. Estes são os tubos utilizados por nosso laboratório referidos no protocolo como "tubos homogeneizadores".
CriopodBrooks / Azenta Ciências da Vidahttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierRecipiente usado para armazenar nitrogênio líquido para argamassa de resfriamento durante a homogeneização do tisuse
Kit de preparação de amostras EasyPep Mini MSThermo Fisher CientíficoA40006Um kit pode processar 20 amostras, o conteúdo inclui a solução de lise para extração de proteínas, nuclease universal suplementada na solução de extração e regeantes necessários para as etapas 1.4 e 1.5
Coluna EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 µ m de diâmetro e 2 µ m tamanho de partícula)Thermo Fisher CientíficoES901Coluna LC de eletrospray usada para a separação de peptídeos antes da detecção de MS
Solução de calibração FlexMixPierce / Thermo ScientificRolamento A39239Mistura de 16 moléculas padrão usadas para calibrar a precisão e a sensibilidade do detector do instrumento MS antes das execuções da amostra
Ácido fórmico, grau LC/MSThermo Fisher Científico85178Ácido fórmico ultrapuro usado para acificar todas as soluções e amostras de LC a uma concentração final de 0,1% (v/v)
Interrompa a protease e Coquetel Inibidor de Uso Único de Fosfatase (100x)Thermo Fisher Científico78442Suplementado no tampão de extração para evitar a degradação de proteínas e fosfoproteínas na amostra
Metanol, grau Optima LC/MSThermo Fisher Científico047192.K2Metanol ultrapuro utilizado para cromatografia líquida/espectrometria de massa
Argamassa de Porcelana, 150 mLThermo Fisher CientíficoFB961CCapacidade de 150 mL, usada para homogeneizar tecidos menores de furões (ou seja, cérebro)
Argamassa de Porcelana, 275 mLThermo Fisher CientíficoFB961DCapacidade de 275 mL, usada para homogeneizar grandes tecidos de furões (ou seja, fígado)
Argamassa de Porcelana, 50 mLThermo Fisher CientíficoFB961ACapacidade de 50 mL, usada para homogeneizar tecidos de camundongos
Pilão de Porcelana, 50 mLThermo Fisher CientíficoFB961KPara uso com argamassa de 50 mL
Pilões de Porcelana, 150 mLThermo Fisher CientíficoFB961MPara uso com argamassa de 150 mL
Pilões de Porcelana, 275 mLThermo Fisher CientíficoFB961NPara uso com argamassa de 275 mL
PrecellysBertin Corp / Tecnologiashttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/Instrumento utilizado para homogeneizar amostras de tecidos. As seguintes configurações foram usadas: 4500 RPM, 2 x 30 s por ciclo, pausa de 30 s. 
Reagente de ensaio de proteínaPierce / Thermo Scientific22662Reagente de Ensaio de Proteína usado nas etapas 3.4- 3.8
Descobridor de ProteomaThermo Fisher CientíficoCSW0064764Software de bioinformática para análise de dados proteômicos/fosfoproteômicos
Frascos de injeção LC com tampa de rosca SureSTART MSCERT (0.02– Capacidade de 1,5 mL)Thermo Fisher Científico6PMCK39TRCertificados para aplicação de alta performance, frascos de vidro com tampa de rosca (PTFE, septos pré-cortados) usados para conter amostras para injeção no instrumento LC/MS     
Sistema Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)Thermo Fisher CientíficoLC: discountinued/MS: FETD2-10002, pelo pedido especialInstrumento de cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS) de desempenho ultra-alto usado para separar e detectar por peso molecular os peptídeos nas amostras
Nuclease Universal para Lise Celular, 100kU, 400 µ LPierce / Thermo Scientific88702Nuclease universal adicional foi comprada 
Vacufuge PlusEppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748Vacufuge usado para secar amostras de peptídeos antes da reconstituição. 
Água, grau Optima LC/MSThermo Fisher Científico047146.K2Água ultrapura usada para cromatografia líquida/espectrometria de massa

Referências

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