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Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

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DOI:

10.3791/67246

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16 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a construção de um sistema organ-on-chip (OOC) projetado para mimetizar a pneumonectomia. Este sistema investiga a correlação potencial entre o comprometimento do glicocálice e as complicações após a pneumonectomia.

Resumo

O glicocálice endotelial (GCX), uma camada rica em carboidratos que reveste a superfície luminal das células endoteliais, desempenha um papel fundamental na regulação das respostas celulares aos estímulos. É composto por proteínas transmembranares que servem como mecanotransdutores para respostas celulares. Embora mantenha naturalmente sua estrutura e estabilidade em condições homeostáticas, a exposição a tensões de alto cisalhamento pode induzir danos com inúmeras consequências. Os efeitos gerais do estresse de cisalhamento nas células endoteliais foram explorados, mas a extensão e o impacto do estresse de cisalhamento nos sistemas vasculares, especificamente pós-pneumonectomia, não foram bem estudados. Para investigar isso, uma abordagem abrangente foi realizada, envolvendo a criação de um modelo CAD de vasculatura pulmonar pré e pós-pneumonectomia. Utilizando simulação computacional de fluidos, regiões-chave de tensão e pressão de cisalhamento elevadas foram identificadas e replicadas em um sistema organ-on-chip (OOC). As células endoteliais microvasculares do pulmão humano (HLMVECs) foram semeadas em um molde na forma das seções selecionadas para caracterizar os efeitos da tensão de cisalhamento elevada in vitro. Após a experimentação, os HLMVECs foram imunomarcados para avaliar qualitativamente a saúde do GCX sob estresses normais e aumentados induzidos pela pneumonectomia. A integração de modelagem computacional e análise experimental aprimora nossa compreensão de como as mudanças na tensão de cisalhamento afetam o GCX, esclarecendo seus efeitos na função vascular e complicações pós-cirúrgicas.

Introdução

A pneumonectomia é uma intervenção cirúrgica invasiva e de alto risco realizada para extração do pulmão direito ou esquerdo1. Este procedimento é normalmente utilizado como uma opção de tratamento para várias doenças graves, como câncer de pulmão, tuberculose pulmonar e lesões pulmonares traumáticas2. Embora o procedimento seja promissor, ele apresenta riscos significativos, destacados pelo aumento das taxas de complicações pós-operatórias, variando de arritmias a edemas pulmonares1.

As pneumonectomias têm um impacto profundo na dinâmica cardiovascular, direcionando todo o débito cardíaco do coração para o pulmão remanescente3. Sabe-se que esse redirecionamento do fluxo sanguíneo aumenta a pressão e as tensões de cisalhamento dentro da vasculatura pulmonar remanescente4. Com essas vastas alterações nos padrões de fluxo sanguíneo, o glicocálice endotelial (GCX) desempenha um papel fundamental na detecção dessas mudanças nos padrões de fluxo sanguíneo5.

O GCX é uma camada gelatinosa que regula as atividades bioquímicas em resposta a mudanças em seu ambiente 6,7. Sua expressão demonstrou aumentar com a exposição prolongada ao fluxo uniforme e diminuir com a exposição ao fluxo perturbado em comparação com a cultura estática 8,9. O GCX exibe uma espessura variável variando de 0,1-1 μm em toda a vasculatura e funciona como uma camada essencial de mecanotransdução que reveste as células endoteliais dos vasos sanguíneos10. A rede é composta por uma densa camada de açúcares, lipídios e proteínas, conforme mostrado na Figura 1. Esses açúcares se ligam para formar glicanos, que podem existir livremente na corrente sanguínea ou ligados a proteínas ou lipídios, resultando na formação de proteoglicanos, glicoproteínas ou glicolipídios 7,11. Os proteoglicanos são compostos por cadeias de glicosaminoglicanos (GAG), que se ligam à membrana celular por meio de proteínas ou receptores plasmáticos. Esses GAGs incluem sulfato de heparano (HS), ácido hialurônico (HA), sulfato de condroitina (CS), sulfato de dermatano e sulfato de queratana12. O sulfato de heparano é o GAG predominante, representando mais de 50% do total de GAGs encontrados no GCX. Essas cadeias laterais podem se ligar a proteínas centrais incorporadas, que incluem glipicanos (ancorados por glicosilfosfatidilinositol) e sindecanos (com um domínio que atravessa a membrana), juntamente com CD44 (um receptor de adesão de superfície). Os complexos descritos acima desempenham um papel crucial na regulação dos fatores de crescimento, reações anti-inflamatórias, facilitando a dilatação dos vasos e controlando a permeabilidade vascular13.

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Figura 1: Diagrama de componentes GCX. Esquema representando os componentes do glicocálice endotelial. Este esquema exibe o glicocálice apical, que é encontrado no lúmen do vaso, mostrando seus proteoglicanos e glicoproteínas ligados à membrana. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora a conexão precisa entre pneumonectomias e danos ao GCX não seja bem estudada, existe uma correlação plausível entre os padrões de fluxo sanguíneo alterados induzidos por pneumonectomias e a integridade do GCX. Sabe-se que o fluxo sanguíneo perturbado na vasculatura inflige danos ao GCX6. Nossa hipótese é que o aumento do fluxo perturbado e as mudanças no estresse de cisalhamento na vasculatura remanescente após uma pneumonectomia podem causar danos ao GCX ao longo do tempo. Essa deterioração acelerada pode catalisar complicações e morbidades pós-operatórias, aumentando os riscos inerentes à saúde geral do paciente13.

Esse protocolo teve como objetivo modelar a vasculatura pulmonar após a pneumonectomia, seguindo o procedimento geral descrito na Figura 2. Simulações de fluidos foram conduzidas em um modelo de design auxiliado por computador replicando a vasculatura pulmonar humana com e sem pneumonectomia. Os modelos de pneumonectomia foram criados projetando a vasculatura pulmonar 3D em software de modelagem 3D, com base em dimensões derivadas de tomografias computadorizadas e dados da literatura, simplificando-os ainda mais para simulações de fluxo em software de dinâmica de fluidos computacional (CFD). As simulações identificaram áreas específicas de interesse, escolhidas por áreas onde a tensão de cisalhamento foi aumentada nos modelos de pneumonectomia quando comparados ao controle. Essas áreas de interesse foram escolhidas para replicar para a construção de um modelo in vitro . O modelo in vitro utilizou um desenho de câmara fluídica para simular múltiplas seções da vasculatura com geometria normal e geometria de pneumonectomia para simular a diferença nas condições de fluxo.

Células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HLMVECs) foram cultivadas em substratos de polidimetilsiloxano revestidos com fibronectina (PDMS), moldados para imitar uma região de bifurcação selecionada. Os meios de cultura de células endoteliais microvasculares foram perfundidos através do sistema usando uma bomba peristáltica. Finalmente, as células e o GCX foram fixados, imunomarcados com um anticorpo de coloração GCX e visualizados usando um microscópio fluorescente para avaliar sua condição após a exposição ao fluxo de fluido. Uma linha do tempo geral do protocolo pode ser encontrada na Tabela 1.

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Figura 2: Sequência de desenvolvimento OOC. Sequência do desenvolvimento de um novo sistema OOC para estudar os efeitos da pneumonectomia pulmonar (1) Tomografia computadorizada gerada da vasculatura pulmonar humana. (2) Geometria de tomografia computadorizada usada para identificar regiões de interesse para o modelo CAD 3D. (3) Simulações de escoamento de fluidos para determinação de geometrias de interesse para o modelo in vitro . (4) Molde PDMS modelado contendo áreas de interesse dos resultados da simulação (5) Molde inserido em caixa de acrílico para fixar o molde para perfusão (6) Configuração concluída da câmara de fluxo (7) Configuração completa da câmara de fluxo transferida para a incubadora (8) Imagens de campo claro e fluorescentes tiradas após exposição à tensão de cisalhamento. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Cronograma geral do protocolo. Sequência geral de etapas de execução dentro do protocolo com duração média (h) de cada etapa. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Protocolo

Este estudo utilizou dados de imagens de tomografia computadorizada (TC) da literatura anterior14 que foram coletados de acordo com os padrões éticos institucionais e federais. Todos os dados de imagem referenciados tiveram consentimento informado dos participantes, após aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) para garantir a proteção dos direitos e privacidade dos participantes.

1. Modelagem da vasculatura pulmonar em software CAD

  1. Pesquise geometrias fisiológicas dos vasos primários a serem modelados.
  2. Use imagens de TC do paciente dos vasos a serem modelados para escolher geometrias específicas para replicar, mostradas na Figura 2.
    NOTA: Para este protocolo, foram utilizadas tomografias computadorizadas de pulmão de condição clínica da literatura anterior14. Este protocolo também permite o uso de quaisquer dados de tomografia computadorizada para gerar modelos in vitro .
    1. Abra um visualizador DICOM e importe as imagens de TC. Navegue pelas fatias para identificar os vasos de interesse. Salve as imagens relevantes para análise posterior.
      NOTA: O vaso replicado para este protocolo foi a vasculatura pulmonar, pois a aplicação deste protocolo é modelar o glicocálice endotelial em condições saudáveis e pós-pneumonectomia. Outros locais podem ser usados para diferentes aplicações.
  3. Usando o ImageJ FIJI v1.54f15, meça os diâmetros dos vasos a partir de imagens de TC ou valores da literatura.
    1. Abrir ImageJ FIJI e Importar as imagens CT salvas: selecione Arquivo > Abrir.
    2. Selecione a ferramenta Linha na barra de ferramentas para desenhar uma linha que abranja o comprimento da barra de escala na imagem de TC.
    3. Em seguida, selecione Analisar > Definir escala. Insira a distância conhecida (por exemplo, se a barra de escala na imagem for de 10 mm, insira 10 como a distância conhecida). Insira a unidade de comprimento (por exemplo, mm). Clique em OK.
  4. Use a ferramenta de linha para medir diâmetros. Para fazer isso, selecione a ferramenta Linha na barra de ferramentas e desenhe uma linha abrangendo o diâmetro do recipiente. Em seguida, selecione Analisar > Medir para obter o valor do diâmetro.
  5. Repita as etapas 1.3 e 1.4 para todos os recipientes de interesse e registre as medições.
  6. Compile as medições de vasos em tipos de segmento para facilitar a modelagem.
    1. Crie uma planilha para categorizar as medidas dos vasos e rotule cada linha com o nome do vaso, a medida e o tipo de segmento (por exemplo, artéria, veia).
  7. Crie uma tabela de referência para comprimentos e diâmetros de segmentos vasculares com base na literatura e nas medições radiográficas.
  8. Gere um modelo 3D usando software de modelagem 3D para replicar a geometria e as dimensões das imagens de TC.
    1. Abra o software e crie um novo arquivo de peça: selecione Arquivo > Nova peça > e selecione Esboço > Criar esboço e desenhe o perfil usando as dimensões do ImageJ.
    2. Utilize varreduras de superfície e lofting para geometria 3D: para varreduras, selecione Recursos > Ressalto/Base varrido. Para lofts, selecione Operações > Saliência/Base em loft.
    3. Refine o modelo para corresponder às medidas exatas.
  9. Identifique as variações do modelo a serem desenvolvidas, como um modelo de controle e um modelo de pneumonectomia.
    1. Descreva as diferentes condições (por exemplo, normal vs. pneumonectomia) e liste as mudanças estruturais necessárias para cada variação.
  10. Duplique o modelo original para modificação para criar os modelos experimentais de acordo com seus parâmetros (ou seja, pneumonectomia direita e esquerda).
    1. Salve o modelo original e selecione Arquivo > Salvar como cópia para criar cópias para cada condição experimental.
    2. Modifique cada cópia de acordo com os parâmetros definidos (por exemplo, pneumonectomia direita e esquerda).
  11. Converta o modelo de um arquivo de peça em um arquivo Parasolid para simulações de dinâmica de fluidos computacional (CFD).
    1. Selecione Arquivo > Salvar como. Escolha Parasolid (*.x_t) no menu suspenso de tipo de arquivo e salve o arquivo no diretório desejado.

2. Simulação de fluxo de fluido

NOTA: Esta etapa é útil para localizar regiões de tensão de cisalhamento modificada após a pneumonectomia para selecionar a geometria vascular a ser replicada para o sistema in vitro . Além disso, a licença de software deve suportar o Módulo de Importação.

  1. Configure um novo estudo de fluxo laminar em estado estacionário.
    1. Selecione Assistente de Modelo > 3D (dimensão espacial) > fluxo de fluido > fluxo monofásico > fluxo laminar (spf) > selecione Adicionar para adicionar a interface de física de fluxo laminar > selecione Estudo > escolha Estacionário em Estudo Geral > selecione Concluído.
  2. Adicione geometria do modelo CAD.
    1. Importar arquivo Parasolid. Selecione Faces de cobertura e, na janela de desenho, selecione a circunferência da parede interna do recipiente em cada entrada e saída abertas. Essas serão as bordas delimitadoras das faces da tampa. Selecione Formar união e construir tudo.
    2. Selecione Remover detalhes e verifique se todas as opções estão selecionadas em Detalhes a serem removidos e, em seguida, selecione Construir tudo para remover a geometria desnecessária.
  3. Criando a Malha 1 (parede do vaso em malha + domínio do fluido em malha).
    1. Defina o tamanho como predefinido: extra fino, calibre para dinâmica de fluidos.
    2. Defina o Tamanho 1 como predefinido: extra fino, calibre para dinâmica de fluidos, para Seleção de entidade geométrica, especifique Limite e Manual. Na janela de desenho, selecione todas as faces externas visíveis do domínio da parede do recipiente, incluindo a face em forma de anel ao redor da face da tampa. Não selecione as faces da tampa na entrada e nas saídas.
      NOTA: Selecione a face da tampa no final da seção removida à direita e à esquerda dos modelos de pneumonectomia, pois eles são considerados limites geométricos após uma pneumonectomia.
    3. Em Refinamento de canto, selecione Domínio e manual. Na janela de desenho, selecione [Domínio] 1 (parede do vaso) e [Domínio] 2 (fluido).
    4. Em Seleção de limite, certifique-se de que os limites sejam os mesmos especificados na "Seleção de entidade geométrica" de "Tamanho 1".
    5. Em Tetraédrico Livre 1, selecione Restante para Nível de entidade Geométrica em Seleção de Domínio.
    6. Em Camadas de limite 1 e Seleção de entidade geométrica, especifique Domínio e selecione Manual na janela de desenho [Domínio] 1 e [Domínio] 2. As propriedades da camada de limite serão a mesma seleção especificada no tamanho 1.
    7. Construa a malha selecionando Compilar tudo em Malha 1.
  4. Criando Malha 2 (somente domínio de fluido em malha).
    1. Clique com o botão direito do mouse em Malha 1, selecione Importar para criar "Malha 2" e exclua Importar 2.
    2. Em Importar 1, selecione Sequência de geração de malha para selecionar automaticamente Malha 1. Verifique se a opção Criar malha de origem automaticamente, Importar elementos de domínio e Importar domínios sem malha estão marcados e selecione Importar. Todas as configurações definidas na Malha 1 serão transferidas para a Malha 2.
    3. Clique com o botão direito do mouse em Malha 2 e selecione Excluir entidades. Para Excluir entidades 1, em Seleção de entidade geométrica , selecione Domínio, selecione Manual, na janela de desenho, selecione [Domínio] 1 (parede do recipiente) e, em seguida, selecione Construir tudo para deixar somente a geometria do fluido, pois a superfície da malha do domínio do fluido estará na interface entre o fluxo de fluido e a parede interna dos vasos.
  5. Adicionar material de fluxo: Crie um novo material usando propriedades de sangue da literatura. Clique com o botão direito do mouse em Materiais e selecione Material em branco. Selecione Domínio na seleção de nível de entidade geométrica, selecione Todos os domínios. Selecione Não sólido para Tipo de material, adicione as propriedades do material do sangue, incluindo viscosidade e densidade.
  6. Configure as condições e parâmetros de contorno do estudo de fluxo laminar.
    1. Selecione Fluxo Laminar (spf), em Seleção de Domínio, selecione Todos os domínios. Apenas o [Domínio] 1 será listado. O domínio 1, neste caso, é a geometria do fluido, não a parede do vaso. As propriedades do fluido 1 são preenchidas automaticamente a partir do material definido na etapa 5.
    2. Defina os valores iniciais 1 pressão para pressão arterial fisiológica. Defina a condição de limite para a Parede 1 como sem deslizamento.
    3. Selecione Entrada 1 na janela de desenho e defina a condição de limite como Fluxo totalmente desenvolvido. Certifique-se de que a opção Aplicar condição em cada seleção separada esteja marcada.
    4. Em Fluxo totalmente desenvolvido, selecione Taxa de fluxo e insira a velocidade.
    5. Para Saída 1, selecione todas as saídas na janela de gráfico e certifique-se de que a condição de limite esteja definida como Pressão.
    6. Em Condições de pressão, selecione Total e insira a pressão. Selecione Média e Suprimir refluxo.
  7. Configure e execute o estudo.
    1. Para Etapa 1: Estacionário em estudo, certifique-se de que a seção Física e variáveis corresponda ao estudo pretendido e que o componente de seleção de malha 1 esteja definido como Malha 2. Selecione Compute.
  8. Analise os resultados da tensão de cisalhamento.
    1. Clique com o botão direito do mouse em Pressão (spf) e selecione Duplicar. Renomeie como Tensão de cisalhamento.
    2. Em Tensão de cisalhamento, selecione Superfície e altere o conjunto de dados para Estudo 1/Solução 1 (sol1).
    3. Em Expressão, digite spf.sr*spf.mu defina as unidades como Pa.
      NOTA: Isso significa "taxa de cisalhamento de fluxo monofásico * viscosidade de fluxo monofásico".
    4. Em seguida, selecione Plotar e clique com o botão direito do mouse em Transparência 1 e selecione Desativar.
    5. Clique com o botão direito do mouse em Tensão de cisalhamento e selecione Volume para alterar o conjunto de dados para Estudo 1/Solução 1 (sol1).
    6. Em Expressão, digite spf.sr*spf.mu e defina as unidades como Pa.
    7. Selecione Plotar, clique com o botão direito do mouse em Superfície e selecione Desativar para analisar visualmente o "Volume 1" para determinar as áreas de interesse do vaso a serem estudadas no modelo OOC

3. Preparação de moldes PDMS

  1. Usando os resultados da simulação de fluidos, escolha geometrias para controle e pneumonectomia selecionando áreas que exibem diferenças significativas na tensão de cisalhamento entre os modelos de controle e pneumonectomia e replique-as como moldes negativos no CAD. As dimensões dos modelos CAD de controle e vasculatura de pneumonectomia são mostradas nas Figuras 3 e na Figura 4.
  2. Além disso, projete plugues para a entrada e saída do molde para evitar vazamentos durante a semeadura celular.
  3. Usando uma impressora 3D, imprima os moldes e os plugues usando filamento PLA.
  4. Obtenha os moldes de ácido polilático (PLA) que foram impressos em 3D (controle + pneumonectomia) (Figura 5A).
  5. Pese 10 partes de base de elastômero de silicone e 1 parte de agente de cura de elastômero de silicone para fazer um total de 30 mL de mistura (relação massa/massa de 10:1) para preencher os moldes com uma espessura de 3 mm (Figura 5B).
    NOTA: Não misture soluções de estoque durante o processo de pesagem. Use materiais de pesagem separados para cada reagente.
  6. Despeje a base de elastômero e o agente de cura juntos e misture bem
    NOTA: Isso pode ser feito em um barco de pesagem.
  7. Despeje a solução bem misturada nos moldes (cerca de 15 mL para a metade do molde) ( Figura 5C ).
  8. Desgaseifique o PDMS colocando-o em uma câmara de vácuo por 30 a 60 minutos ou até que não haja bolhas (Figura 5D).
  9. Remova o PDMS da câmara de vácuo e catalise em temperatura ambiente por 48 h.
    NOTA: Não foi utilizado um forno para cura devido à capacidade térmica dos moldes de PLA.
  10. Extraia o PDMS do molde de PLA.
  11. Enxágue o molde de PLA generosamente com água DI para garantir que nenhuma impureza permaneça em sua superfície para que possa ser usado novamente.

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Figura 3: Desenho CAD 3D da vasculatura de controle. Dimensões, em mm, do modelo de vasculatura controle em vista superior e lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Desenho CAD 3D da vasculatura da pneumonectomia. Dimensões, em mm, do modelo de vasculatura de pneumonectomia em vista superior e lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Criação de moldes PDMS. Criação de moldes PDMS. (A) Moldes de PLA impressos em 3D para experimentos de controle (laranja) e pneumonectomia (verde). (B) Balança com materiais de fabricação PDMS. (C) Despejar a mistura PDMS (base 10:1 + agente de cura) nos moldes impressos em 3D. (D) Desgaseificação do PDMS em uma câmara de vácuo. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Cultura celular e semeadura

  1. Use a técnica asséptica adequada de acordo com os protocolos do laboratório local.
  2. Pulverize com etanol a 70% e traga todos os materiais e componentes necessários para o gabinete de biossegurança (BSC) (Figura 6A), incluindo pedaços de PDMS e quatro pedaços de fita dupla face.
  3. Coloque dois pedaços de fita dupla-face em cada placa de cultura de células (Figura 6B).
  4. Coloque cada metade da vasculatura PDMS em sua própria placa de cultura de células em cima da fita dupla-face (Figura 6C).
  5. Esterilize ainda mais todos os componentes por exposição à luz UV por 20 min no BSC.
  6. Descongele a tripsina, os meios de cultura HLMVEC e 20 μg/mL de fibronectina a 37 °C, se necessário.
  7. Coloque várias gotas de 30 μL de 20 μg / mL de fibronectina ao longo da vasculatura do PDMS usando uma micropipeta. Inclinando o PDMS se necessário, use uma ponta de pipeta para revestir uniformemente o PDMS (Figura 7A).
  8. Incube as peças PDMS por 30 min enquanto estiver no BSC.
  9. Após a incubação, aspire a solução de fibronectina e deixe os pedaços de PDMS secarem no BSC (Figura 7B).
  10. Traga um frasco confluente de células HLMVEC da incubadora (37 °C, 5% CO2) para o BSC.
  11. Aspirar os meios de cultura HLMVEC do balão de cultura. Enxágüe brevemente com tripsina ou PBS estéril.
  12. Aspirar a lavagem e adicionar 3 ml de tripsina ao balão. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 5 min. Observar as células ao microscópio para confirmar que todas as células estão separadas do balão.
  13. Adicione 9 mL de meio de cultura completo HLMVEC para interromper a ação da tripsina.
  14. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e, em seguida, lave o frasco com 10 mL de meio de cultura HLMVEC para coletar as células restantes.
  15. Transfira para o tubo de 50 mL. Centrifugue as células a 220 x g por 5 min.
  16. Quando terminar, confirme visualmente o pellet celular na parte inferior do tubo. Pulverize o tubo com etanol 70% e leve-o para o gabinete de biossegurança. Aspire o sobrenadante, deixando o chumbinho.
  17. Ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio de cultura HLMVEC fresco e conte as células usando um hemocitômetro. Calcule o número total de células usando as equações abaixo, onde AH é o número de células contadas por quadrado do hemocitômetro. Mantenha as células no gelo.
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  18. Traga a concentração de células para 2 x 106 células / mL com meio de cultura HLMVEC.
  19. Coloque os plugues impressos em 3D nas extremidades de cada metade da vasculatura para eliminar o vazamento da suspensão celular do molde PDMS, conforme mostrado na Figura 5 (4 plugues totais, 2 por peça PDMS) (Figura 7C).
  20. Semeie 300 μL de suspensão de células HLMVEC (600 k células) usando uma micropipeta em cada peça de PDMS ( Figura 7D ).
  21. Transfira suavemente as peças de PDMS contendo células HLMVEC para a incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 1-2 h para anexar ( Figura 7E ).
  22. Inspecione com um microscópio para confirmar visualmente a fixação bem-sucedida do HLMVEC aos substratos PDMS.
  23. Retorne as metades da vasculatura do PDMS para o BSC.
  24. Remova os quatro tampões, adicione meio de cultura HLMVEC suficiente para submergir as metades da vasculatura do PDMS e devolva as placas de cultura contendo as vasculaturas do PDMS para a incubadora (Figura 7F).
  25. 6-10 h após a semeadura, pipetar manualmente os meios de cultura HLMVEC ao redor do PDMS para a vasculatura para refrescar o meio mais próximo das células.

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Figura 6: Fixação de moldes PDMS a placas. Etapas básicas para anexar a vasculatura PDMS às placas de cultura de células. (A) Materiais necessários para colocar as metades da vasculatura PDMS em placas de cultura. (B) Dois pedaços de fita adesiva dupla face são colocados diagonalmente em cada placa de cultura estéril. (C) Metades da vasculatura PDMS montadas em cima do adesivo de dupla face. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Semeando HLMVECs em moldes PDMS. Etapas para semear HLMVECs na vasculatura PDMS. (A) Preencha a vasculatura 150-300 μL com 20 μg / mL de fibronectina. (B) Aspire o excesso de fibronectina usando a técnica de toque inclinado. (C) Tampe as extremidades da metade da vasculatura PDMS com plugues impressos em 3D. (D) Semeie células 500-600K em meio de 300 μL em cada metade da vasculatura. (E) Coloque as metades do PDMS na incubadora por 1-2 h para facilitar a fixação das células. (F) Cubra as metades do PDMS com mídia e remova os plugues. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Montagem e execução do sistema de fluxo

  1. Execute o procedimento de fluxo quando as células nas metades da vasculatura do PDMS estiverem totalmente confluentes, conforme determinado pela inspeção visual ao microscópio.
  2. Calibre a bomba peristáltica de acordo com o protocolo do fabricante antes de realizar um experimento.
  3. Autoclave todos os componentes autoclaváveis, incluindo a tubulação de fluxo, conectores de tubulação, reservatório de seringa e rolha de borracha.
  4. Mergulhe os blocos de acrílico, parafusos, plugues, peças de tubo Masterflex L/S 16 de 16 polegadas de comprimento e a tampa da placa de placa de Petri de 15 mm em etanol a 70% por 15 min e tratamento UV por 20 min em um BSC, virando na metade.
  5. Depois que todos os outros equipamentos e materiais estiverem esterilizados, traga as metades da vasculatura do PDMS para o BSC.
  6. Aspire o meio HLMVEC da placa de Petri contendo as metades da vasculatura (Figura 8A, B).
  7. Coloque as metades do PDMS nos dois blocos de policarbonato, certificando-se de que estejam alinhadas (Figura 8C).
  8. Aplique selante de silicone nas extremidades da vasculatura, onde o tubo será preso às metades do PDMS, e coloque o tubo de uma polegada de comprimento nas duas extremidades da vasculatura inferior (Figura 8D).
  9. Vire o bloco de acrílico superior (contendo a metade superior da vasculatura PDMS) no bloco acrílico inferior (contendo a metade inferior da vasculatura PDMS) (Figura 8E).
  10. Aparafuse os blocos de acrílico junto com o bloco rosqueado na parte inferior e tampe as extremidades livres dos tubos de uma polegada de comprimento com os plugues impressos em 3D (Figura 8F).
  11. Remova um tampão e injete suavemente 500 μL de meio de cultura HLMVEC na vasculatura, inclinando-o para evitar bolhas de ar e, em seguida, recoloque o tampão.
  12. Coloque todo o chip montado na incubadora para permitir que o silicone cure por 1-2 h.
  13. Traga o chip montado e todos os outros materiais estéreis para o BSC e conecte tudo para configurar o sistema de fluxo de acordo com a Figura 9. Certifique-se de que a tubulação que passa pela bomba peristáltica até a entrada da vasculatura esteja conectada ao fundo do reservatório da seringa. Isso permitirá que a gravidade alimente a tubulação e reduza as bolhas de ar no sistema.
  14. Prepare suavemente o sistema de fluxo com meio HLMVEC. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, injete 30 mL de meio na parte superior do reservatório da seringa (Figura 10B). Opere a bomba peristáltica em uma vazão baixa para encher a tubulação. Continue a adicionar mídia ao reservatório até que o sistema esteja totalmente preparado e todas as bolhas sejam removidas.
    NOTA: Bolhas de ar podem cisalhar as células durante o experimento de fluxo.
  15. Conecte a tubulação à entrada do reservatório (a partir da saída do molde vascular) usando um encaixe preso a uma rolha de borracha colocada na parte superior do reservatório (Figura 10C).
  16. Retire o sistema de fluxo da bomba peristáltica e coloque-o na bandeja de metal. Transporte cuidadosamente toda a configuração do BSC para a incubadora (37 °C, 5% CO2). Alimente a tubulação para a bomba peristáltica pela parte traseira da incubadora.
  17. Reconecte a bomba peristáltica e ajuste a taxa de fluxo desejada para emular a taxa de fluxo sanguíneo através do modelo vascular.
  18. Ligue a bomba e certifique-se de que não haja vazamentos. Deixe o sistema funcionar por 24 h ou a duração desejada. Verifique se há vazamentos periodicamente.

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Figura 8: Construindo o cavaco de fluxo. Construindo o chip de fluxo. (A) Aspirar o meio da placa de cultura de células. (B) O PDMS cai pela metade após a aspiração do meio. (C) Remova as metades do PDMS da placa com outros materiais necessários para construir o chip (plugue, filtro de seringa, peças de tubo de 1/2", selante de silicone, parafusos 10x e blocos de acrílico). (D) Coloque as metades do PDMS nos blocos de acrílico e aplique selante de silicone nos locais marcados em vermelho. (E) Coloque a tubulação nos respectivos recortes. (F) Conecte as metades da câmara de fluxo e conecte o plugue e o filtro da seringa. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-8
Figura 9: Configuração do sistema de fluxo. Configuração do sistema de fluxo. O sistema de fluxo completo é construído utilizando tubulação, conectores de tubulação, uma bomba peristáltica, um reservatório de seringa, um suporte e o chip de fluxo. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-9
Figura 10: Escorva do sistema de fluxo. Preparando o sistema de fluxo com meios. (A) Configuração simples do sistema de fluxo sem meio. (B) A rolha de borracha removida do reservatório da seringa e o meio é adicionado continuamente até que o tubo esteja cheio e haja 20-30 mL de excesso de meio no reservatório. (C) Sistema de fluxo preparado com meio HLMVEC. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Fixação e coloração

  1. Lave cada metade da vasculatura PDMS em PBS por 5 minutos. Adicione o suficiente para submergir toda a seção vascular.
  2. Aspire o PBS da vasculatura inclinando a placa e permitindo que o PBS escorra, depois aspire o escoamento a vácuo.
  3. Adicione 600 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS a cada metade vascular e incube em temperatura ambiente (RT) por 20 minutos.
  4. Aspire a solução de PFA para um recipiente de resíduos adequado usando o método da etapa 2.
  5. Lave as células fixas 3x em PBS por 5 min cada usando o procedimento da etapa 2.
    NOTA: Descarte cada uma dessas lavagens em um recipiente de lixo adequado para formaldeído.
  6. Tampe as extremidades das metades da vasculatura PDMS com os plugues limpos impressos em 3D.
  7. Prepare albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS para bloqueio.
  8. Encha as metades vasculares com 600 μL de solução de bloqueio e incube por 30 min em RT.
  9. Remova os plugues e aspire a solução de bloqueio.
  10. Prepare uma diluição de 1:200 de lectina de aglutinina de gérmen de trigo (WGA) com uma biotina conjugada (anticorpo primário) em solução de BSA a 3% para corar GCX9.
  11. Substitua os tampões para tapar as extremidades da vasculatura e adicione 500 μL de solução de anticorpo primário a cada metade vascular.
  12. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h.
  13. Aspire o anticorpo primário suavemente seguindo a técnica usada anteriormente.
  14. Lave 3 vezes com PBS por 5 min cada.
  15. Prepare a diluição 1:500 do conjugado de estreptavidina WGA (anticorpo secundário) em solução de BSA a 3%.
  16. Substitua os tampões para tapar as extremidades da vasculatura e adicione 500 μL de solução de anticorpos secundários a cada metade vascular.
  17. Repita as etapas 6.12-6.14.
  18. Adicione o meio de montagem DAPI à superfície vascular dispensando gotas de 30 μL em intervalos para preencher completamente a vasculatura.
  19. Coloque lamínulas de vidro no PDMS para cobrir os canais vasculares.
  20. Sele as bordas da lamínula usando esmalte transparente.
  21. Cubra as placas com papel alumínio e armazene a 4 °C até a obtenção de imagens.

7. Exames de imagem

  1. Ligue o microscópio e abra o viewaplicativo no computador conectado.
  2. Abra o microscópio e aumente a luz. Anexe a plataforma adequada para encaixar as amostras (suporte de placa de Petri versátil).
  3. Coloque uma amostra no porta-pratos dentro do microscópio com a área de interesse centralizada acima da objetiva.
  4. Abaixe a luz e feche a tampa do microscópio.
  5. No software do microscópio, selecione a opção Capturar imagem estática .
  6. Escolha o tipo de amostra, use versátil.
  7. Selecione a objetiva apropriada na seção de lentes para melhor visualização.
  8. No software do microscópio, ajuste a posição da objetiva para alinhar com uma região de interesse (ROI).
  9. Selecione o foco automático e as células devem entrar em foco.
  10. Ajuste manualmente o foco para esclarecer totalmente a imagem.
  11. Ajuste o brilho e a exposição para visualizar as células com mais clareza.
  12. Ative multicor e cor no software.
  13. Nas configurações de CH , ative CH1 Floor DAPI e CH2 Floor GFP.
  14. Ajuste o brilho de cada canal separadamente para visualizar claramente as imagens.
  15. Selecione Z-Stack no software do microscópio.
  16. Ajuste o foco para o plano mais alto da imagem e selecione definir para definir o limite superior
  17. Ajuste o foco para o plano mais baixo da imagem e selecione definir para definir o limite inferior
  18. Selecione uma espessura de fatia conforme desejado e pressione Iniciar captura para tirar a imagem.
    NOTA: Essas imagens também serão enviadas para o software de análise de microscópio para modificações posteriores.

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Resultados

Os resultados do estudo de simulação de fluido em estado estacionário de fluxo laminar mostraram um aumento na tensão de cisalhamento em certas bifurcações nos modelos de pneumonectomia quando comparados ao modelo controle, mostrado na Figura 11. Visualizadas na etapa 2.8 do protocolo, as áreas vermelhas denotam áreas de alta tensão de cisalhamento, enquanto as áreas azuis mostram áreas de baixa tensão de cisalhamento.

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Discussão

A modelagem vascular é um novo campo importante para exploração. A criação bem-sucedida de um modelo vascular preciso é uma grande promessa para o avanço no campo da engenharia de tecidos e desenvolvimento de medicamentos. Este artigo descreve um novo método para gerar um sistema vascular OOC que pode ser utilizado para emular uma pneumonectomia ou qualquer outro sistema vascular ou geometria para estudar uma ligação potencial entre o comprometimento do GCX e as complicações pós-pneumone...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de expressar nossa mais profunda gratidão ao Departamento de Engenharia Biomédica do Instituto Politécnico de Worcester por seu apoio e orientação. Gostaríamos de agradecer especialmente a Megan Ouellette, John Martel e Sudish Vengat por seus esforços colaborativos e ideias inovadoras que melhoraram muito a qualidade e a viabilidade desta pesquisa. Além disso, gostaríamos de agradecer a Samantha Cocchiaro e Udaya Rattan por suas contribuições no laboratório e seu apoio e assistência essenciais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
# 8-32 x 3/4 pol. Parafuso de Máquina Zincado de Cabeça Redonda Combo (Pacote com 8)Everbilt204274613-
0,25% EDTA-tripsinaThermoFisher Scientific25200056 -
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cônico de 15mLThermo Científico12-565-269-
Prato 35x10mm, Nunclon DeltaThermo Científico153066-
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cônico de 50mLThermo Científico12-565-271-
Rolhas de borracha variadasMarca de pescador14-132
Frascos tratados com cultura de células BioLite (25 cm ^ 2)Thermo Científico12-556-009-
Frascos tratados com cultura de células BioLite (75 cm ^ 2)Thermo Científico12-556-010-
COMSOL MultifísicaCOMSOLN/A-
Adesivo de dupla face 3M16758005-
Tampa de Vidro Científica Richard-Allan da Epredia Thermo Científico22-050-218-
Soro fetal bovinoThermoFisher Scientific A5256701 -
FibronectinaThermoFisher Scientific 33016015 20 μ Diluição g/mL
Banhos-maria de controle digital Fisherbrand Isotemp: Modelo 210Marca de pescador15-462-10Q-
Seringa Estéril Fisherbrand (60mL)Marca de pescador14-955-461-
Células endoteliais microvasculares do pulmão humanoSigma Aldrich540-05A -
Microscópio Fluorescente Keyence BZX810KeyenceN/A-
Kit de Elastômetro de Silicone Krayden Dow Sylgard 184. Claro, (1,1 LB)Dow4019862-
Folha de acrílico fundido Marga Cipta 1/2' de espessura, 48x96'Marga CiptaN/A-
Cabeça de Bomba Masterflex L/S Easy-Load IIMasterFlex77200-50
Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, Silicone Curado com Platina, L/S 16; 25 pésMasterFlex96410-16-
Bomba peristáltica padrão Masterflex L/SMasterflex07522-20
Micropipeta 0,2 a 2 μ LMarca de pescadorFBE00002-
Micropipeta 10 a 100 μ LMarca de pescadorFBE00100-
Micropipeta 100 a 1000 μ LMarca de pescadorFBE01000-
Micropipeta 5 a 50 μ LMarca de pescadorFBE00050-
Meio de Crescimento de Células Endoteliais Microvasculares (500ml)Sigma - Aldrich111-500-
Filtros de seringa estéreis NalgeneThermo Científico725-2520-
Microscópio Fluorescente Nikon Eclipse TS-100NikonNI-TS100
Solução salina tamponada com fosfato (DPBS, 10X), fórmula de DulbeccoThermo CientíficoJ61917. K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Preto 1kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Microscópio híbrido rebelde, vertical e invertido, descubra o ecoECO76376-746-
Selante de SiliconeLoctite908570-
SolidWorksDassault SystèmesN/A
Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (10mL)Marca de pescador13-678-11E-
Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (25mL)Marca de pescador13-678-11-
Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (50mL)Marca de pescador13-678-11F-
Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (5mL)Marca de pescador13-678-11D-
Estreptavidin, Alexa Fluor 488 ConjugadoInvitrogen S32354
Estreptavidin, Alexa Fluor 488 ConjugadoInvitrogenS32354-
Reservatório de seringasBD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumina, Bovino, Fração V, 35% soln., Grau de Reagente, Livre de Ácidos Graxos, com azida como preservatiThermo CientíficoN12H004-
Conectores de tubulaçãoMarca de pescador01-000-161-
Meio de Montagem Anti-desbotamento VECTASHIELD com DAPI VectashieldH-1200-10-
Incubadora de CO2 revestida de água VWRAvantar 10810-744-
Anticorpo biotinilado WGAVetorB-1025-

Referências

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