Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.
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Artigo de método
Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células excitáveis, como células neuronais e musculares, podem ser alvos primários em tratamentos baseados em eletroporação emergentes. No entanto, eles podem ser afetados por pulsos elétricos mesmo em terapias onde não são os alvos primários, e isso pode causar efeitos colaterais adversos. Portanto, para otimizar os tratamentos baseados em eletroporação de tecidos excitáveis e não excitáveis, é necessário estudar os efeitos dos pulsos elétricos nas células excitáveis, seus canais iônicos e excitabilidade in vitro. Para isso, foi desenvolvido um protocolo para monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo celular excitável simples de células HEK com pico tet-on geneticamente modificadas. Com o uso de um corante potenciométrico fluorescente, as mudanças na voltagem transmembrana foram monitoradas em microscópio de fluorescência, e parâmetros relevantes das respostas celulares foram extraídos automaticamente com uma aplicação MATLAB. Dessa forma, as respostas das células excitáveis a diferentes pulsos elétricos e a interação entre excitação e eletroporação puderam ser avaliadas de forma eficiente.
Introdução
Na eletroporação, pulsos elétricos de alta voltagem causam um aumento na permeabilidade da membrana plasmática para moléculas que, de outra forma, seriam mal executadas1. As técnicas baseadas em eletroporação são hoje amplamente utilizadas em aplicações em medicina2, biotecnologia3 e tecnologia de alimentos4.
Células excitáveis, como células neuronais e musculares, estão entre os principais alvos em tratamentos baseados em eletroporação emergentes no coração, cérebro e músculos esqueléticos5. Além disso, eles podem ser afetados por pulsos elétricos mesmo em terapias onde não são os alvos primários, e isso pode causar efeitos colaterais adversos, como dor, espasmos musculares e danos nos nervos6. Ou seja, pulsos elétricos podem causar estimulação elétrica de células excitáveis: eles ativam canais iônicos dependentes de voltagem e desencadeiam potenciais de ação (AP). No entanto, em campos elétricos mais altos, a membrana plasmática das células torna-se permeabilizada e ocorre corrente iônica adicional através de poros/defeitos7. Essa corrente iônica adicional afeta a excitabilidade celular em uma interação complexa entre excitação e eletroporação. Portanto, para otimizar os tratamentos baseados em eletroporação de tecidos excitáveis e não excitáveis, é necessário estudar os efeitos dos pulsos elétricos nas células excitáveis, seus canais iônicos e excitabilidade in vitro.
Em um estudo recente8, exploramos células renais embrionárias humanas (HEK) geneticamente modificadas desenvolvidas por Cohen et al.9,10, como uma ferramenta valiosa para estudar a eletroporação em células excitáveis. Nessas células não excitáveis, um complemento mínimo de canais de sódio e potássio (NaV1,5 e Kir2,1) necessários para a excitabilidade é expresso. A expressão de Kir2.1 nessas células é controlada por um sistema tet-on induzido por doxiciclina que permite o estabelecimento de duas variantes celulares: S-HEK de pico excitável (contendo NaV1.5 e Kir2.1) e células NS-HEK não excitáveis sem pico (contendo apenas canais de NaV1.5). Isso nos permite comparar os efeitos dos pulsos elétricos em variantes excitáveis e não excitáveis do mesmo tipo de células. Em comparação com células excitáveis primárias isoladas, células excitáveis diferenciadas de células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas e linhagens celulares derivadas de tecidos excitáveis, as células S-HEK têm várias vantagens: são fáceis de manusear, cultivar e propagar, têm canais de sódio e potássio bem definidos e geram APs robustos8.
Projetamos um protocolo para monitorar mudanças na voltagem transmembrana (TMV) desencadeadas por pulsos elétricos de diferentes amplitudes com o uso de um corante potenciométrico fluorescente. Dessa forma, podemos estudar como a eletroporação afeta a geração de AP em células S-HEK e outras alterações no TMV em células S-HEK e NS-HEK. Resumidamente, as células S-HEK ou NS-HEK são expostas a um único pulso elétrico de 100 μs a cada 2 min, e as mudanças relativas na fluorescência são registradas por aproximadamente 3 s em torno de cada aplicação de pulso. Os pulsos aplicados são de tensão crescente, primeiro acionando APs nas células e, em um campo elétrico mais alto, eletroporação. O intervalo de 2 minutos entre a aplicação do pulso foi escolhido para minimizar os possíveis efeitos cumulativos de pulsos consecutivos, mantendo os experimentos curtos o suficiente para não deteriorar as células. O processamento da imagem foi automatizado com um aplicativo MATLAB personalizado para extrair parâmetros relevantes das respostas de fluorescência do corante potenciométrico, avaliando assim as mudanças no TMV (APs e despolarização sustentada devido à eletroporação) em células S-HEK e NS-HEK.
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Protocolo
1. Preparação de reagentes e cultura celular
- Prepare o meio de cultura celular suplementando a glicose média-alta de Eagle modificada de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U / mL, estreptomicina 100 μg / mL), 2 μg / mL de puromicina, 5 μg / mL de blasticidina e 200 μg / mL de genética.
- Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 e 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,4. Filtre-o através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
- Prepare a solução de Tyrode com 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM de glicose, pH 7,3. Prepare a solução de tirodo com baixo teor de potássio com 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 30 mM de glicose, pH 7,3. Filtre ambas as soluções através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
- Prepare 1 mg / mL de solução estoque de poli-L-lisina adicionando 5 mL de PBS em um frasco contendo 5 mg de poli-L-lisina.
- Preparar 2 mg/ml de solução de reserva de doxiciclina em água destilada e filtrá-la através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
- Preparar a solução-mãe de corante potenciométrico ElectroFluor630 4 mM em etanol puro (adicionar 25 μL de etanol puro ao tubo contendo 100 nM - 73 μg do corante).
- Cultura de células HEK geneticamente modificadas em um frasco T25 em 6 mL do meio de cultura celular, conforme descrito anteriormente8. Os ingredientes do meio de cultura são sensíveis à luz; Assim, mantenha o meio protegido da luz (embrulhe o frasco do meio em papel alumínio) e execute a passagem em condições de pouca luz.
- Passar as células de 3 em 3 a 4 dias, semeando 3 x 105 ou 5 x 105 células num novo balão T25. Conte as células usando um hemocitômetro. Manter as células em um frasco mestre como células NS-HEK não excitáveis sem adição de doxiciclina porque elas não toleram a expressão sustentada de Kir2.1. Use células de passagens inferiores a 14 nos experimentos.
2. Preparação da amostra
- Revestimento de poli-L-lisina de lâminas de câmara de vidro de cobertura
- Pipete 1 mL de PBS para um poço das lâminas da câmara de vidro de cobertura de 2 poços, adicione 10 μL de solução estéril de poli-L-lisina a 1 mg / mL e misture bem com uma pipeta.
- Incubar durante 1,5 h à temperatura ambiente em condições estéreis numa campânula de fluxo laminar. Remova o PBS com poli-L-lisina sem qualquer lavagem adicional.
- Semeando as células
- Preparar uma diluição de 1:10 da solução-mãe de doxiciclina num meio de cultura num tubo de 1,5 ml. Para cada poço são necessários 30 μL de diluição de doxiciclina 1:10 (3 μL de solução estoque de doxiciclina e 27 μL de meio de cultura), prepare o volume final dependendo do número total de poços experimentais.
- Remover o meio de cultura do balão T25 e tripsinizar as células com 2,5 ml de solução de tripsina-EDTA numa incubadora de CO2 a 37 °C durante 2 min.
- Adicione 2,5 ml de meio de cultura fresco e, pipetando suavemente, retire as células da superfície. Misture bem a suspensão celular.
- Conte as células com um hemocitômetro e determine a densidade das células em suspensão.
- Calcule o volume de suspensão de células tripsinizadas necessário para estabelecer a cultura. Para cultura de 2 dias, semeie 2,5 x 105 células, e para cultura de 3 dias, semeie 1 x 105 células por poço. Ajuste o número exato de células, se necessário.
- Calcule o volume do meio de cultura subtraindo o volume da suspensão celular calculado anteriormente de 1470 μL. Os 30 μL restantes representam o volume de diluição de doxiciclina 1:10. O volume total em cada poço será de 1500 μL (células, doxiciclina e meio de cultura).
- Para preparar amostras com células S-HEK excitáveis, pipetar o volume calculado de meio de cultura e suspensão de células tripsinizadas em um poço e adicionar 30 μL de diluição de doxiciclina 1:10. Use apenas um poço das câmaras de dois poços, pois o experimento leva muito tempo (cerca de 40 min). Misture bem pipetando suavemente antes de colocar as câmaras na incubadora de CO2 .
- Para preparar amostras com células NS-HEK não excitáveis, pipetar o volume calculado do meio de cultura para um poço e adicionar 90% do volume calculado de suspensão celular para células S-HEK sem doxiciclina. As células NS-HEK crescem um pouco mais rápido do que as células S-HEK.
- Incubar as câmaras numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C durante 2-3 dias antes da experiência. Para amostras com doxiciclina, esse tempo de incubação é suficiente para tornar as células excitáveis.
- Rotulando as células
- Antes do experimento, pipetar 3 μL de solução de estoque de corante potenciométrico para um tubo de 1,5 mL e deixar o tubo aberto à temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar para permitir que o etanol evapore e o corante potenciométrico seque (aproximadamente 15 min). Adicionar 997 μl de meio de cultura a frio (de um frigorífico a 4 °C) ao tubo e dissolver o corante até uma concentração final de 12 μM.
- Remova o meio de cultura do poço e adicione 1 mL de solução de corante potenciométrico às células. Refrigere-os a 4 °C e incube por 20 min.
- Remova a solução de corante potenciométrico e guarde-a no tubo para posterior reutilização (para até seis experimentos sequenciais em 1 dia).
- Lave suavemente as células 3x com solução de Tyrode e, após a última lavagem, pipete 1 mL de solução de Tyrode com baixo teor de potássio no poço.
3. Eletroestimulação e eletroporação
- Configure a sincronização da entrega de pulso com aquisição de imagem usando um sinal TTL do sistema de microscópio que aciona o gerador de pulso. Para geração de pulsos de alta tensão, use um gerador de pulso personalizado11 ou qualquer gerador de pulso que possa ser acionado externamente com um sinal TTL.
NOTA: Na configuração experimental apresentada, o software LAS X é usado para aquisição de imagem, que pode ser configurado para enviar um sinal TTL em um tempo pré-selecionado durante uma aquisição de lapso de tempo. - Coloque dois eletrodos de fio Pt / Ir paralelos, com 0,8 mm de diâmetro e 5 mm de distância entre as bordas internas, na parte inferior da câmara e fixe a câmara sob o microscópio.
- Conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Conecte a saída do gerador de pulsos a um osciloscópio usando uma sonda de tensão e corrente para permitir a verificação de que os pulsos foram entregues corretamente durante o experimento.
- Focalize as células em campo claro. Visualize as células localizadas aproximadamente no meio entre os eletrodos.
- Inicie a primeira aquisição de imagens de fluorescência no modo de lapso de tempo com uma objetiva de 40x, registrando o sinal de fluorescência em todo o campo de visão. A câmera deve ser rápida o suficiente para adquirir um curso de tempo claro de um potencial de ação (idealmente superior a 25 quadros / s).
- Adquira 80 imagens em modo de lapso de tempo, com pelo menos 25 quadros/s para resolver o curso em tempo real do potencial de ação. A duração total da aquisição da imagem resulta em cerca de 3 s. Durante a aquisição da imagem, ilumine as células com um comprimento de onda de excitação de 635 nm, tempo de exposição de 10 ms e detecte a emissão em cerca de 700 nm. Nesta primeira aquisição, não aplique nenhum pulso - esta aquisição será usada para corrigir as aquisições subsequentes para fotobranqueamento de corantes. Após esta aquisição, aguarde 2 min.
NOTA: Este experimento usa 27,8 quadros / s, ou seja, período de 36 ms, que é o tempo desde o início da primeira aquisição de imagem até o início da próxima aquisição de imagem na gravação de lapso de tempo).
- Adquira 80 imagens em modo de lapso de tempo, com pelo menos 25 quadros/s para resolver o curso em tempo real do potencial de ação. A duração total da aquisição da imagem resulta em cerca de 3 s. Durante a aquisição da imagem, ilumine as células com um comprimento de onda de excitação de 635 nm, tempo de exposição de 10 ms e detecte a emissão em cerca de 700 nm. Nesta primeira aquisição, não aplique nenhum pulso - esta aquisição será usada para corrigir as aquisições subsequentes para fotobranqueamento de corantes. Após esta aquisição, aguarde 2 min.
- A cada 2 minutos, registre um lapso de tempo da mesma forma que na etapa 3.5. Para essas aquisições, aplique um único pulso de 100 μs no momento da aquisição da 10ª imagem (a 324 ms). Adquira imagens com as seguintes tensões de pulso: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V e 200 V. Estime o campo elétrico ao qual as células são expostas como a relação tensão-distância do eletrodo aplicada (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 e 400 V/cm).
NOTA: Em campos elétricos mais baixos, os pulsos acionarão potenciais de ação; Em campos elétricos mais altos, eles acionam a eletroporação, que se manifesta como uma despolarização prolongada. A duração do experimento em cada amostra de células é de aproximadamente 40 min (20 min para marcação e 20 min para microscopia).
4. Análise dos dados
- Exporte as gravações de lapso de tempo para o formato tiff.
- Coloque gravações de lapso de tempo de todas as tensões aplicadas durante um experimento individual (uma amostra de células) em uma única pasta. Renomeie as gravações de lapso de tempo de forma que o campo elétrico E possa ser reconhecido pelo aplicativo MATLAB: Vcm (por exemplo, 126Vcm para 126 V/cm). As partes restantes do nome podem ser arbitrárias. Para a aquisição no início do experimento em que nenhum pulso é aplicado, renomeie usando a frase 000Vcm. Um exemplo dos nomes de gravação de lapso de tempo: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, etc.
- Abra o aplicativo, que pode ser baixado em
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Clique em Selecionar pasta de dados para escolher a pasta que contém as gravações de lapso de tempo de um experimento. - Selecione os pixels a serem usados para análise de dados posterior. Para fazer isso, use dois controles deslizantes para determinar o limite baixo para uma imagem clara das membranas (em roxo) e o limite alto para eliminar detritos (pontos grandes com alta fluorescência) da análise (em verde).
- Selecione Analisar Dados. Na guia Análise, uma tabela com os parâmetros extraídos é exibida. No lado direito da tabela, gráficos de fluorescência relativa no tempo aparecem para cada E usado. Selecione gráficos para um determinado E no menu suspenso no lado esquerdo acima da tabela.
- Examine todos os gráficos e execute a correção manual no caso de detecção de pico falso. Selecione Limpar picos automáticos na parte inferior da guia Análise e os picos que foram detectados automaticamente serão apagados. Clique no gráfico para determinar manualmente um novo ponto de horário de pico.
- Selecione Executar novamente a detecção de pico automático na parte inferior da guia Análise para executar a detecção automática de pico novamente. Os parâmetros extraídos agora serão ajustados para o novo pico.
- Selecione Exportar dados no canto inferior direito da guia Análise para exportar dados para a mesma pasta na forma de um arquivo .mat, arquivo de planilha e imagens PNG para cada E usado.
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Resultados
Alterações no TMV em células excitáveis in vitro desencadeadas por pulsos elétricos podem ser monitoradas opticamente com este protocolo, e os sinais de fluorescência podem ser analisados para extrair seus parâmetros relevantes.
A configuração experimental é mostrada na Figura 1A. Um sinal típico de pulso elétrico de 100 μs usado em experimentos é mostrado na Figura 1B. As células nas câmaras que são colocadas sob o microscóp...
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Discussão
As células S-HEK são um modelo celular excitável simples com canais de sódio e potássio bem definidos, NaV1,5 e Kir2,19. Isso nos permite realizar estudos aprofundados de como as células excitáveis respondem aos pulsos elétricos aplicados e vincular os dados experimentais a modelos matemáticos baseados nas características teóricas bem conhecidas dos canais expressos nas células S-HEK. Em nosso estudo anterior8, descrev...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Agência de Pesquisa e Inovação da Eslovênia (ARIS) no âmbito do programa de pesquisa P2-0249, do programa de infraestrutura I0-0022 e do projeto de pesquisa J2-2503. O trabalho foi parcialmente apoiado pelo ARIS e pela Universidade de Ljubljana por meio de financiamento para Programas de Pesquisa de Start-ups. O trabalho foi parcialmente apoiado pela União Europeia e pela ARIS por meio do financiamento NextGenerationEU e NOO dentro do projeto MN-0023. O trabalho foi parcialmente apoiado pela União Europeia através da ERC Starting Grant (n.º 101115323 - REENCARNAÇÃO) e da bolsa Marie Skłodowska-Curie (n.º 893077 - EPmIC). No entanto, as opiniões expressas são apenas do autor e não refletem necessariamente as da União Europeia ou do Conselho Europeu de Investigação. Nem a União Europeia nem a autoridade que concede o auxílio podem ser responsabilizadas por eles. Os autores agradecem ao grupo de Adam E. Cohen, da Universidade de Harvard, por gentilmente fornecer as células HEK com pico e Duša Hodžić por sua ajuda no laboratório de cultura de células.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL | Ratiolab | 5615000 | |
| Sistema de Cobertura de Vidro Alemão Nunc Lab-Tek II com Câmara de 2 Poços #1.5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| ADP305 Sonda de tensão diferencial | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 Sonda de corrente | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | ||
| incubadora de CO2 | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich/Merck | D9891 | |
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio de crescimento de glicose média alta | Sigma-Aldrich/Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Sondas | potenciométricas | 31795 | |
| Soro fetal bovino | Sigma-Aldrich/Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Glutamina | Sigma-Aldrich/Merck | G7513 | |
| Capuz de fluxo laminar | Iskra Pio | MC 15-2 | |
| MATLAB | Mathworks | ||
| Penicilina– estreptomicina | Sigma-Aldrich/Merck | P07681 | |
| Bromidrato de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich/Merck | P9155-5MG | |
| Gerador de pulsos | Feito sob medida | , veja a referência11 | |
| Puromicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| T25 25cm² Frasco de cultura de tecidos | TPP | 90026 | |
| Tet-on spiking HEK | American Type Culture Collection ATCC | CRL-3479 | |
| Thunder Imager Sistema de células vivas para microscopia de fluorescência | Leica Microsystems | ||
| Solução de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich/Merck | T3924 | |
| WavePro 7300A Osciloscópio | Teledyne LeCroy |
Referências
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- Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
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Reimpressões e permissões
