Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Summary

Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.

Abstract

Células excitáveis, como células neuronais e musculares, podem ser alvos primários em tratamentos baseados em eletroporação emergentes. No entanto, eles podem ser afetados por pulsos elétricos mesmo em terapias onde não são os alvos primários, e isso pode causar efeitos colaterais adversos. Portanto, para otimizar os tratamentos baseados em eletroporação de tecidos excitáveis e não excitáveis, é necessário estudar os efeitos dos pulsos elétricos nas células excitáveis, seus canais iônicos e excitabilidade in vitro. Para isso, foi desenvolvido um protocolo para monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo celular excitável simples de células HEK com pico tet-on geneticamente modificadas. Com o uso de um corante potenciométrico fluorescente, as mudanças na voltagem transmembrana foram monitoradas em microscópio de fluorescência, e parâmetros relevantes das respostas celulares foram extraídos automaticamente com uma aplicação MATLAB. Dessa forma, as respostas das células excitáveis a diferentes pulsos elétricos e a interação entre excitação e eletroporação puderam ser avaliadas de forma eficiente.

Introduction

Na eletroporação, pulsos elétricos de alta voltagem causam um aumento na permeabilidade da membrana plasmática para moléculas que, de outra forma, seriam mal executadas¹. As técnicas baseadas em eletroporação são hoje amplamente utilizadas em aplicações em medicina², biotecnologia³ e tecnologia de alimentos⁴.

Células excitáveis, como células neuronais e musculares, estão entre os principais alvos em tratamentos baseados em eletroporação emergentes no coração, cérebro e músculos esqueléticos⁵. Além disso, eles podem ser afetados por pulsos elétricos mesmo em terapias onde não são os alvos primários, e isso pode causar efeitos colaterais adversos, como dor, espasmos musculares e danos nos nervos⁶. Ou seja, pulsos elétricos podem causar estimulação elétrica de células excitáveis: eles ativam canais iônicos dependentes de voltagem e desencadeiam potenciais de ação (AP). No entanto, em campos elétricos mais altos, a membrana plasmática das células torna-se permeabilizada e ocorre corrente iônica adicional através de poros/defeitos⁷. Essa corrente iônica adicional afeta a excitabilidade celular em uma interação complexa entre excitação e eletroporação. Portanto, para otimizar os tratamentos baseados em eletroporação de tecidos excitáveis e não excitáveis, é necessário estudar os efeitos dos pulsos elétricos nas células excitáveis, seus canais iônicos e excitabilidade in vitro.

Em um estudo recente⁸, exploramos células renais embrionárias humanas (HEK) geneticamente modificadas desenvolvidas por Cohen et ^al.9,10, como uma ferramenta valiosa para estudar a eletroporação em células excitáveis. Nessas células não excitáveis, um complemento mínimo de canais de sódio e potássio (Na_V1,5 e K_ir2,1) necessários para a excitabilidade é expresso. A expressão de K_ir2.1 nessas células é controlada por um sistema tet-on induzido por doxiciclina que permite o estabelecimento de duas variantes celulares: S-HEK de pico excitável (contendo Na_V1.5 e K_ir2.1) e células NS-HEK não excitáveis sem pico (contendo apenas canais de Na_V1.5). Isso nos permite comparar os efeitos dos pulsos elétricos em variantes excitáveis e não excitáveis do mesmo tipo de células. Em comparação com células excitáveis primárias isoladas, células excitáveis diferenciadas de células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas e linhagens celulares derivadas de tecidos excitáveis, as células S-HEK têm várias vantagens: são fáceis de manusear, cultivar e propagar, têm canais de sódio e potássio bem definidos e geram APs robustos⁸.

Projetamos um protocolo para monitorar mudanças na voltagem transmembrana (TMV) desencadeadas por pulsos elétricos de diferentes amplitudes com o uso de um corante potenciométrico fluorescente. Dessa forma, podemos estudar como a eletroporação afeta a geração de AP em células S-HEK e outras alterações no TMV em células S-HEK e NS-HEK. Resumidamente, as células S-HEK ou NS-HEK são expostas a um único pulso elétrico de 100 μs a cada 2 min, e as mudanças relativas na fluorescência são registradas por aproximadamente 3 s em torno de cada aplicação de pulso. Os pulsos aplicados são de tensão crescente, primeiro acionando APs nas células e, em um campo elétrico mais alto, eletroporação. O intervalo de 2 minutos entre a aplicação do pulso foi escolhido para minimizar os possíveis efeitos cumulativos de pulsos consecutivos, mantendo os experimentos curtos o suficiente para não deteriorar as células. O processamento da imagem foi automatizado com um aplicativo MATLAB personalizado para extrair parâmetros relevantes das respostas de fluorescência do corante potenciométrico, avaliando assim as mudanças no TMV (APs e despolarização sustentada devido à eletroporação) em células S-HEK e NS-HEK.

Protocol

1. Preparação de reagentes e cultura celular

1. Prepare o meio de cultura celular suplementando a glicose média-alta de Eagle modificada de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U / mL, estreptomicina 100 μg / mL), 2 μg / mL de puromicina, 5 μg / mL de blasticidina e 200 μg / mL de genética.
2. Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ e 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4. Filtre-o através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
3. Prepare a solução de Tyrode com 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM de glicose, pH 7,3. Prepare a solução de tirodo com baixo teor de potássio com 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM de glicose, pH 7,3. Filtre ambas as soluções através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
4. Prepare 1 mg / mL de solução estoque de poli-L-lisina adicionando 5 mL de PBS em um frasco contendo 5 mg de poli-L-lisina.
5. Preparar 2 mg/ml de solução de reserva de doxiciclina em água destilada e filtrá-la através de um filtro de membrana esterilizante com um tamanho de poro de 0,22 μm.
6. Preparar a solução-mãe de corante potenciométrico ElectroFluor630 4 mM em etanol puro (adicionar 25 μL de etanol puro ao tubo contendo 100 nM - 73 μg do corante).
7. Cultura de células HEK geneticamente modificadas em um frasco T25 em 6 mL do meio de cultura celular, conforme descrito anteriormente⁸. Os ingredientes do meio de cultura são sensíveis à luz; Assim, mantenha o meio protegido da luz (embrulhe o frasco do meio em papel alumínio) e execute a passagem em condições de pouca luz.
8. Passar as células de 3 em 3 a 4 dias, semeando 3 x 10⁵ ou 5 x 10⁵ células num novo balão T25. Conte as células usando um hemocitômetro. Manter as células em um frasco mestre como células NS-HEK não excitáveis sem adição de doxiciclina porque elas não toleram a expressão sustentada de K_ir2.1. Use células de passagens inferiores a 14 nos experimentos.

2. Preparação da amostra

1. Revestimento de poli-L-lisina de lâminas de câmara de vidro de cobertura
   1. Pipete 1 mL de PBS para um poço das lâminas da câmara de vidro de cobertura de 2 poços, adicione 10 μL de solução estéril de poli-L-lisina a 1 mg / mL e misture bem com uma pipeta.
   2. Incubar durante 1,5 h à temperatura ambiente em condições estéreis numa campânula de fluxo laminar. Remova o PBS com poli-L-lisina sem qualquer lavagem adicional.
2. Semeando as células
   1. Preparar uma diluição de 1:10 da solução-mãe de doxiciclina num meio de cultura num tubo de 1,5 ml. Para cada poço são necessários 30 μL de diluição de doxiciclina 1:10 (3 μL de solução estoque de doxiciclina e 27 μL de meio de cultura), prepare o volume final dependendo do número total de poços experimentais.
   2. Remover o meio de cultura do balão T25 e tripsinizar as células com 2,5 ml de solução de tripsina-EDTA numa incubadora de CO₂ a 37 °C durante 2 min.
   3. Adicione 2,5 ml de meio de cultura fresco e, pipetando suavemente, retire as células da superfície. Misture bem a suspensão celular.
   4. Conte as células com um hemocitômetro e determine a densidade das células em suspensão.
   5. Calcule o volume de suspensão de células tripsinizadas necessário para estabelecer a cultura. Para cultura de 2 dias, semeie 2,5 x 10⁵ células, e para cultura de 3 dias, semeie 1 x 10⁵ células por poço. Ajuste o número exato de células, se necessário.
   6. Calcule o volume do meio de cultura subtraindo o volume da suspensão celular calculado anteriormente de 1470 μL. Os 30 μL restantes representam o volume de diluição de doxiciclina 1:10. O volume total em cada poço será de 1500 μL (células, doxiciclina e meio de cultura).
   7. Para preparar amostras com células S-HEK excitáveis, pipetar o volume calculado de meio de cultura e suspensão de células tripsinizadas em um poço e adicionar 30 μL de diluição de doxiciclina 1:10. Use apenas um poço das câmaras de dois poços, pois o experimento leva muito tempo (cerca de 40 min). Misture bem pipetando suavemente antes de colocar as câmaras na incubadora de CO₂ .
   8. Para preparar amostras com células NS-HEK não excitáveis, pipetar o volume calculado do meio de cultura para um poço e adicionar 90% do volume calculado de suspensão celular para células S-HEK sem doxiciclina. As células NS-HEK crescem um pouco mais rápido do que as células S-HEK.
   9. Incubar as câmaras numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C durante 2-3 dias antes da experiência. Para amostras com doxiciclina, esse tempo de incubação é suficiente para tornar as células excitáveis.
3. Rotulando as células
   1. Antes do experimento, pipetar 3 μL de solução de estoque de corante potenciométrico para um tubo de 1,5 mL e deixar o tubo aberto à temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar para permitir que o etanol evapore e o corante potenciométrico seque (aproximadamente 15 min). Adicionar 997 μl de meio de cultura a frio (de um frigorífico a 4 °C) ao tubo e dissolver o corante até uma concentração final de 12 μM.
   2. Remova o meio de cultura do poço e adicione 1 mL de solução de corante potenciométrico às células. Refrigere-os a 4 °C e incube por 20 min.
   3. Remova a solução de corante potenciométrico e guarde-a no tubo para posterior reutilização (para até seis experimentos sequenciais em 1 dia).
   4. Lave suavemente as células 3x com solução de Tyrode e, após a última lavagem, pipete 1 mL de solução de Tyrode com baixo teor de potássio no poço.

3. Eletroestimulação e eletroporação

1. Configure a sincronização da entrega de pulso com aquisição de imagem usando um sinal TTL do sistema de microscópio que aciona o gerador de pulso. Para geração de pulsos de alta tensão, use um gerador de pulso personalizado¹¹ ou qualquer gerador de pulso que possa ser acionado externamente com um sinal TTL.
   NOTA: Na configuração experimental apresentada, o software LAS X é usado para aquisição de imagem, que pode ser configurado para enviar um sinal TTL em um tempo pré-selecionado durante uma aquisição de lapso de tempo.
2. Coloque dois eletrodos de fio Pt / Ir paralelos, com 0,8 mm de diâmetro e 5 mm de distância entre as bordas internas, na parte inferior da câmara e fixe a câmara sob o microscópio.
3. Conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Conecte a saída do gerador de pulsos a um osciloscópio usando uma sonda de tensão e corrente para permitir a verificação de que os pulsos foram entregues corretamente durante o experimento.
4. Focalize as células em campo claro. Visualize as células localizadas aproximadamente no meio entre os eletrodos.
5. Inicie a primeira aquisição de imagens de fluorescência no modo de lapso de tempo com uma objetiva de 40x, registrando o sinal de fluorescência em todo o campo de visão. A câmera deve ser rápida o suficiente para adquirir um curso de tempo claro de um potencial de ação (idealmente superior a 25 quadros / s).
   1. Adquira 80 imagens em modo de lapso de tempo, com pelo menos 25 quadros/s para resolver o curso em tempo real do potencial de ação. A duração total da aquisição da imagem resulta em cerca de 3 s. Durante a aquisição da imagem, ilumine as células com um comprimento de onda de excitação de 635 nm, tempo de exposição de 10 ms e detecte a emissão em cerca de 700 nm. Nesta primeira aquisição, não aplique nenhum pulso - esta aquisição será usada para corrigir as aquisições subsequentes para fotobranqueamento de corantes. Após esta aquisição, aguarde 2 min.
      NOTA: Este experimento usa 27,8 quadros / s, ou seja, período de 36 ms, que é o tempo desde o início da primeira aquisição de imagem até o início da próxima aquisição de imagem na gravação de lapso de tempo).
6. A cada 2 minutos, registre um lapso de tempo da mesma forma que na etapa 3.5. Para essas aquisições, aplique um único pulso de 100 μs no momento da aquisição da 10ª imagem (a 324 ms). Adquira imagens com as seguintes tensões de pulso: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V e 200 V. Estime o campo elétrico ao qual as células são expostas como a relação tensão-distância do eletrodo aplicada (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 e 400 V/cm).
   NOTA: Em campos elétricos mais baixos, os pulsos acionarão potenciais de ação; Em campos elétricos mais altos, eles acionam a eletroporação, que se manifesta como uma despolarização prolongada. A duração do experimento em cada amostra de células é de aproximadamente 40 min (20 min para marcação e 20 min para microscopia).

4. Análise dos dados

1. Exporte as gravações de lapso de tempo para o formato tiff.
2. Coloque gravações de lapso de tempo de todas as tensões aplicadas durante um experimento individual (uma amostra de células) em uma única pasta. Renomeie as gravações de lapso de tempo de forma que o campo elétrico E possa ser reconhecido pelo aplicativo MATLAB: Vcm (por exemplo, 126Vcm para 126 V/cm). As partes restantes do nome podem ser arbitrárias. Para a aquisição no início do experimento em que nenhum pulso é aplicado, renomeie usando a frase 000Vcm. Um exemplo dos nomes de gravação de lapso de tempo: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm, etc.
3. Abra o aplicativo, que pode ser baixado em
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Clique em Selecionar pasta de dados para escolher a pasta que contém as gravações de lapso de tempo de um experimento.
4. Selecione os pixels a serem usados para análise de dados posterior. Para fazer isso, use dois controles deslizantes para determinar o limite baixo para uma imagem clara das membranas (em roxo) e o limite alto para eliminar detritos (pontos grandes com alta fluorescência) da análise (em verde).
5. Selecione Analisar Dados. Na guia Análise, uma tabela com os parâmetros extraídos é exibida. No lado direito da tabela, gráficos de fluorescência relativa no tempo aparecem para cada E usado. Selecione gráficos para um determinado E no menu suspenso no lado esquerdo acima da tabela.
6. Examine todos os gráficos e execute a correção manual no caso de detecção de pico falso. Selecione Limpar picos automáticos na parte inferior da guia Análise e os picos que foram detectados automaticamente serão apagados. Clique no gráfico para determinar manualmente um novo ponto de horário de pico.
7. Selecione Executar novamente a detecção de pico automático na parte inferior da guia Análise para executar a detecção automática de pico novamente. Os parâmetros extraídos agora serão ajustados para o novo pico.
8. Selecione Exportar dados no canto inferior direito da guia Análise para exportar dados para a mesma pasta na forma de um arquivo .mat, arquivo de planilha e imagens PNG para cada E usado.

Results

Alterações no TMV em células excitáveis in vitro desencadeadas por pulsos elétricos podem ser monitoradas opticamente com este protocolo, e os sinais de fluorescência podem ser analisados para extrair seus parâmetros relevantes.

A configuração experimental é mostrada na Figura 1A. Um sinal típico de pulso elétrico de 100 μs usado em experimentos é mostrado na Figura 1B. As células nas câmaras que são colocadas sob o microscópio normalmente se parecem com as células da Figura 1C (imagem de campo claro) e da Figura 1D (imagem de fluorescência). Realizamos um experimento onde a cada 2 min, um pulso elétrico com tensão crescente é aplicado às mesmas células. Observe que o tempo de interpulso de 2 minutos pode não ser suficientemente longo para permitir o resselamento completo e a recuperação das membranas celulares, especialmente ao usar pulsos da maior amplitude, que estão associados a eletroporação proeminente. Assim, alguns efeitos cumulativos dos pulsos podem ser esperados. Para evitar esses efeitos cumulativos, o atraso entre pulsos pode ser estendido, mas às custas de reduzir o número de amplitudes de pulso testadas e evitar manter as células no microscópio por muito tempo.

Depois de capturar imagens de fluorescência em experimentos, analise-as com o aplicativo MATLAB personalizado. Primeiro, determine os limites de pixel (Figura 2A); Ajustando o limite baixo, obtemos uma imagem clara das membranas ao redor das células (em roxo) e, ajustando o limite alto, removemos o sinal de detritos (verde). Em seguida, o aplicativo determina a intensidade média de fluorescência de todos os pixels de limite para cada pulso consecutivo fornecido para obter um sinal dependente do tempo da mudança relativa na fluorescência F / F0. Este sinal é corrigido para fotobranqueamento de corante subtraindo a inclinação da diminuição linear de F determinada do registro de lapso de tempo de controle no qual nenhum pulso foi aplicado (Figura 2B). Após a correção do sinal, os parâmetros das respostas são extraídos na forma de uma tabela no aplicativo e um gráfico do sinal de fluorescência corrigido (Figura 2C). Em casos raros, o algoritmo não detecta um pico óbvio ou detecta sinais de ruído espúrios como falsos positivos. Para esses casos, o usuário tem a opção de selecionar manualmente o ponto correspondente no sinal de fluorescência como pico ou remover o pico falso detectado (Figura 2D - remoção de um pequeno pico que foi detectado de forma anômala antes da aplicação do pulso elétrico).

Usando o aplicativo MATLAB, podemos obter imagens das respostas do TMV a pulsos elétricos em células S-HEK excitáveis (Figura 3A) e NS-HEK não excitáveis (Figura 3B). Os seguintes parâmetros de resposta são extraídos (Tabela 1): número de picos (NoPeaks), tempo médio pico a pico (quando mais de um pico é detectado, MPPT), resposta máxima (MR), tempo até o primeiro pico (TtFP) e tempo desde o pico até 25%, 50%, 75% e 90% de recuperação (T25, T50, T75, T90, respectivamente). Esses parâmetros permitem a avaliação das respostas a diferentes pulsos elétricos (por exemplo, determinar o número de picos desencadeados por pulsos elétricos de diferentes E, Figura 3C) e a interação entre excitação e eletroporação.

Figura 1: A configuração, a forma de onda e as células S-HEK. (A) A imagem da câmara no estágio do microscópio. (B) Exemplo da forma de onda de um pulso usado no estudo (tensão (U) ao longo do tempo). (C, D) A imagem das células S-HEK ((C): campo claro, (D): fluorescência), barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Aplicação de análise de dados. (A) A imagem da interface do aplicativo - limiar. (B) O gráfico do sinal bruto e corrigido de mudança de fluorescência. (C) A imagem da interface do aplicativo - dados extraídos. (D) Correção manual da detecção de pico (remoção de um pequeno pico que foi detectado de forma anômala antes da aplicação do pulso elétrico, marcado com uma seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos. (A, B) Desencadeando mudanças no TMV em (A) S-HEK excitável e (B) NS-HEK não excitável com pulsos elétricos de 100 μs de diferentes amplitudes, resultados de experimentos representativos. Para maior clareza, apenas as respostas aos pulsos selecionados na sequência de pulsos aplicada são mostradas. (C) Os parâmetros das respostas TMV desencadeadas pelos pulsos de 100 μs de diferentes amplitudes: O exemplo mostra o número de picos. Os resultados são expressos como média ± SE, número de experimentos: N = 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Índice	Força E (V/cm)	Sem picos (-)	MPPT (MS)	SR (-)	TtFP (MS)	T25 (MS)	T50 (MS)	T75 (MS)	T90 (MS)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

Tabela 1: Parâmetros das respostas do TMV desencadeadas pelos pulsos de 100 μs de diferentes amplitudes.

Discussion

As células S-HEK são um modelo celular excitável simples com canais de sódio e potássio bem definidos, Na_V1,5 e K_ir2,1⁹. Isso nos permite realizar estudos aprofundados de como as células excitáveis respondem aos pulsos elétricos aplicados e vincular os dados experimentais a modelos matemáticos baseados nas características teóricas bem conhecidas dos canais expressos nas células S-HEK. Em nosso estudo anterior⁸, descrevemos as respostas dessas células a pulsos de 100 μs de aumento de E tanto experimentalmente quanto teoricamente. Em E mais baixo, as células S-HEK respondem com potenciais de ação únicos ou múltiplos, enquanto em E mais alto, os APs se tornam prolongados e se transformam em uma despolarização sustentada. Uma vez que a despolarização sustentada é claramente visível também em uma versão não excitável dessas células (NS-HEK), ela é atribuída à eletroporação e ao aumento associado na corrente iônica não seletiva.

O uso do corante potenciométrico fluorescente mostrou-se uma forma muito eficaz de estudar PAs e eletroporação em células excitáveis. Em comparação com os métodos eletrofisiológicos clássicos, como patch clamp, as medições ópticas são muito mais convenientes, eficientes em termos de tempo e não requerem habilidades técnicas especiais. Além disso, o uso de pulsos elétricos de alta tensão não interfere nas medições, o que pode se tornar um problema nas medidas de patch clamp¹². No entanto, as principais desvantagens deste protocolo estão relacionadas à natureza do corante. Devido ao seu fotobranqueamento, o sinal de fluorescência capturado precisa de correção. O corante se difunde espontaneamente na célula, de modo que o sinal das membranas diminui com o tempo. Por esse motivo, o corante é adequado para monitorar potenciais de ação e outras mudanças de curto prazo no TMV (~ 3 s nesses experimentos). Como o corante permite imagens raciométricas¹³, essas imagens podem evitar alguns problemas com a difusão do corante, mas às custas de uma velocidade de imagem mais baixa atingível. Nesta configuração experimental, a imagem raciométrica seria muito lenta para capturar corretamente a forma dos potenciais de ação. Além disso, as mudanças medidas na fluorescência do corante fornecem informações qualitativas sobre a mudança no TMV; no entanto, o corante pode ser calibrado para permitir medições quantitativas.

A análise automatizada de imagens usando um aplicativo MATLAB personalizado nos permite analisar uma grande quantidade de dados e extrair com eficiência características valiosas das respostas do TMV em um curto período de tempo. O aplicativo está configurado para capturar o sinal de fluorescência das membranas de todas as células no campo de visão. Isso melhora a relação sinal-ruído, mas às custas da perda de informações sobre como o TMV muda no nível da célula individual. Na configuração experimental dada, o sinal de células individuais era muito barulhento para permitir medições úteis. Além disso, as membranas das células adjacentes eram difíceis de distinguir. No entanto, as células HEK expressam endogenamente junções comunicantes através das quais estão eletricamente conectadas. A modelagem matemática, apresentada no estudo anterior⁸, demonstrou que, devido às suas conexões elétricas, as células dentro do campo de visão estão próximas o suficiente para acionar a PA simultaneamente. Além disso, o PA é propagado ao longo da monocamada celular em alta velocidade (aproximadamente 34 mm / s, estimado com base em imagens com ampliação objetiva de 5x) ^{8 , 9} . Considerando o comprimento lateral do campo de visão (~0,33 mm), o AP percorreria esse comprimento em aproximadamente 10 ms, o que é menor do que nosso período de aquisição de imagem. Assim, o efeito de propagação AP não pode ser visto com essa ampliação e velocidade de gravação. No entanto, a propagação do PA dos eletrodos para o campo de visão pode causar um atraso entre o pulso aplicado e o PA capturado⁸.

No estudo anterior⁸, assim como nesta publicação, são descritos os efeitos de pulsos de duração de 100 μs na interação entre excitabilidade e eletroporação. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para estudar pulsos elétricos com outros parâmetros (de diferentes durações, voltagem, número, taxa de repetição ou forma) ou outras células excitáveis.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de 1,5 mL	Ratiolab	5615000
Sistema de Cobertura de Vidro Alemão Nunc Lab-Tek II com Câmara de 2 Poços #1.5	Thermo Fisher Scientific
ADP305 Sonda de tensão diferencial	Teledyne LeCroy
AP015 Sonda de corrente	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific
incubadora de CO2	PHCbi	MCO -230AICUV
Doxiciclina	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio de crescimento de glicose média alta	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)Sondas	potenciométricas	31795
Soro fetal bovino	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Glutamina	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Capuz de fluxo laminar	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Penicilina– estreptomicina	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Bromidrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
Gerador de pulsos	Feito sob medida		, veja a referência11
Puromicina	Thermo Fisher Scientific
T25 25cm² Frasco de cultura de tecidos	TPP	90026
Tet-on spiking HEK	American Type Culture Collection ATCC	CRL-3479
Thunder Imager Sistema de células vivas para microscopia de fluorescência	Leica Microsystems
Solução de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Osciloscópio	Teledyne LeCroy