Artigo de método

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

DOI:

10.3791/67258

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18 de outubro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Citryll B.V.

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neutrófilos desempenham um papel importante na defesa imunológica inata usando várias estratégias, incluindo a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) em um processo conhecido como NETose. No entanto, nas últimas duas décadas, ficou claro que o acúmulo de TNEs nos tecidos contribui para a fisiopatologia de múltiplas doenças inflamatórias e autoimunes. Portanto, o interesse no desenvolvimento de antagonistas da NETosis aumentou. Métodos variáveis e não padronizados para detectar e analisar a NETosis foram desenvolvidos concomitantemente, cada um com suas próprias vantagens e limitações. Aqui, descrevemos um método de microscopia em tempo real para a quantificação da liberação de NET humano, permitindo estudar a NETosis, bem como a inibição de NET de maneira de alto rendimento. A análise semiautomatizada baseada na área de superfície reconhece os NETs e os distingue dos neutrófilos ativados sem rede. Demonstramos que os indutores não fisiológicos de NETosis, ionóforo de cálcio e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), desencadeiam a liberação de NETs com diferentes características e cinéticas. Além disso, mostramos que essa abordagem permite estudar a liberação de NET em resposta a estímulos relevantes para a doença, incluindo complexos imunes, N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLF), cristais de urato monossódico e cristais de pirofosfato de cálcio. Para exemplificar a utilidade deste método para estudar antagonistas da NETosis, usamos o CIT-013, um inibidor de anticorpos monoclonais de primeira classe da liberação de NET. O CIT-013 tem como alvo as histonas citrulinadas H2A e H4 e inibe eficientemente a liberação de NET com um IC50 de 4,6 nM. Outros anticorpos anti-histonas testados não tinham essa capacidade inibitória da NETosis. Ao todo, demonstramos que este protocolo permite a quantificação de alto rendimento de NETs específica, confiável e reprodutível, aprimorando o estudo das características de liberação de NET, cinética e farmacologia de antagonistas de NETosis.

Introdução

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Os neutrófilos estão abundantemente presentes no sangue e migram para o tecido após infecção ou inflamação. Eles desempenham um papel importante na defesa imunológica inata, usando armamento extensivo para proteger o hospedeiro contra micróbios. Os neutrófilos matam patógenos por meio de fagocitose, degranulação, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e liberação de cromatina descondensada denominada armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) por um processo chamado NETosis1. Os TNEs são estruturas extracelulares da cromatina decoradas com, entre outras, proteínas granulares e calprotectina 2,3, e são liberados após estimulação com um amplo espectro de moléculas4. A NETose pode ser amplamente categorizada em duas vias principais: dependente ou independente da NADPH oxidase 5,6,7. Além disso, a citrulinação de arginina de caudas de histonas N-terminais pela peptidil arginina deiminase 4 (PAD4) tem sido intimamente ligada à NETose e promove a descondensação da cromatina, o que acaba levando à expulsão da cromatina descondensada para o ambiente extracelular.

Embora a liberação de TNE esteja envolvida na eliminação de patógenos, vários estudos mostraram que a liberação anormal e prolongada de TNE está ligada ao desenvolvimento de vários distúrbios inflamatórios, incluindo lesão pulmonar aguda8, artrite reumatoide (AR) 9, vasculite10 e hidradenite supurativa11. O papel prejudicial dos TNEs na doença é multifacetado, uma vez que os TNEs são pró-inflamatórios, são fonte de autoantígenos, são citotóxicos para os tecidos circundantes, desencadeiam imunotrombose e promovem a diferenciação dos osteoclastos e a erosão óssea 9,12,13. A inibição farmacológica da via NETosis por inibidores de PAD4 de moléculas pequenas demonstra que a terapêutica direcionada à NETosis tem potencial como tratamento para doenças nas quais o acúmulo de TNE é um importante impulsionador da patogênese14. Em vez de direcionar a enzima PAD4, usamos um anticorpo monoclonal anti-histona anticitrulinado humanizado NETosis de primeira classe, CIT-013, que se liga especificamente às histonas citrulinadas H2A e H415. O CIT-013 tem um mecanismo de ação duplo único, inibindo a liberação de NET e aumentando a fagocitose NET mediada por macrófagos16. O CIT-013 e as moléculas precursoras mostraram eficácia terapêutica em vários modelos de camundongos de inflamação associada ao TNE17.

Para estudar a liberação de NET, diferentes métodos foram desenvolvidos ao longo dos anos, como, mas não se limitando a 1) detecção de DNA usando um traçador de DNA impermeável à membrana plasmática em combinação com um leitor de placa imunofluorescente, 2) detecção baseada em ensaio imunoenzimático (ELISA) de DNA e DNA complexado com proteínas específicas de NET em sobrenadantes, 3) co-localização de moléculas associadas a NET com DNA extracelular via imuno-histoquímica, e 4) abordagens de citometria de fluxo para detectar neutrófilos em rede. Todos esses métodos têm suas próprias vantagens e limitações. Desenvolvemos uma abordagem de alto rendimento em tempo real para quantificação microscópica da liberação de NET humana, que usa um corante de DNA impermeável à membrana plasmática 16,18. O método descrito permite a investigação da cinética e das características da NETosis de maneira fácil, confiável e reprodutível e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis, como o CIT-013.

Protocolo

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Todos os doadores de sangue deram consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque, e o estudo foi realizado de acordo com as diretrizes éticas da Citryll para pesquisa em humanos.

NOTA: Todas as atividades com sangue humano e neutrófilos isolados precisam ser realizadas em condições estéreis em um gabinete de fluxo laminar. Quando as configurações de freio e aceleração para centrifugação não são mencionadas no protocolo, elas podem ser consideradas no máximo.

1. Isolamento de neutrófilos do sangue

  1. Colete sangue periférico de voluntários saudáveis em tubos de lítio-heparina e transfira o sangue para um novo tubo de 50 mL.
  2. Enxágue os tubos de heparina de lítio com 1x DPBS e transfira para o mesmo tubo de 50 mL para o qual o sangue foi transferido. Certifique-se de que a proporção final de sangue para DPBS seja de 1:1. Misture sangue e PPBS pipetando para obter uma solução homogênea.
  3. Adicione 13 mL de solução de gradiente de densidade a outro tubo fresco de 50 mL e adicione lentamente (com uma pipeta de 25 mL) o sangue diluído 1:1 sobre a solução de gradiente de densidade até um máximo de 50 mL.
  4. Centrifugue a 400 x g e temperatura ambiente (RT) por 40 min com aceleração e freio mínimos.
    NOTA: As camadas são formadas. As camadas de cima para baixo são as seguintes: 1. plasma; 2. células mononucleares do sangue periférico (PBMCs); 3. solução de gradiente de densidade; 4. Eritrócitos/neutrófilos.
  5. Primeiro, descarte o plasma com uma pipeta de 10 mL e, em seguida, descarte os PBMCs e a camada de solução de gradiente de densidade com uma pipeta de Pasteur de plástico, tanto quanto possível, sem perturbar a camada de eritrócitos / neutrófilos.
  6. Ressuspenda suavemente a camada de eritrócitos/neutrófilos agitando e ressuspenda com uma pipeta de 25 mL em 15 mL de 1x DPBS.
  7. Adicione 25 mL de solução de Dextrana a 6% / NaCl a 0,9%, misture dez vezes invertendo o tubo e coloque o tubo na posição vertical por 25 min em RT.
    NOTA: As camadas são formadas. As camadas de cima para baixo são as seguintes: 1. Neutrófilos; 2 eritrócitos.
  8. Transfira a camada de neutrófilos para um tubo novo de 50 mL com uma pipeta de 10 mL e centrifugue por 10 min a 500 x g e RT.
    NOTA: Tenha cuidado, pois o pellet de neutrófilos ainda contém alguns eritrócitos e não está firmemente preso ao tubo.
  9. Descarte o sobrenadante por decantação e ressuspenda o pellet celular com uma pipeta de 10 mL em 10 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 e 0,1 mM Na2EDTA; pH = 7,2) e, em seguida, adicione imediatamente 40 mL de tampão de lise ACK.
  10. Incubar em RT enquanto inverte continuamente o tubo até que a solução se torne translúcida (isso leva de 1 a 5 minutos e pode variar para cada doador) e centrifugue por 10 min a 350 x g e RT.
  11. Remova o sobrenadante e adicione lentamente e gota a gota 5 mL de meio de cultura contendo L-glutamina suplementada com 10% (v / v) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 50 U / mL de penicilina e 50 μg / mL de estreptomicina (referido como meio de cultura 10% a seguir) em cima do pellet de neutrófilos sem colocar os neutrófilos em suspensão. Isso removerá com eficiência a maioria dos eritrócitos do pellet de neutrófilos.
  12. Agite suavemente o tubo de 50 mL até que a maioria dos eritrócitos, presentes no topo do pellet de neutrófilos, seja ressuspensa no meio de cultura a 10%. Em seguida, remover o sobrenadante por decantação do tubo.
  13. Ressuspenda o pellet de neutrófilos em 10 mL de meio de cultura a 10% e, quando totalmente ressuspenso, adicione até 50 mL de meio de cultura a 10%. Centrifugue por 10 min a 350 x g e RT.
  14. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura a 10%.

2. Coloração de neutrófilos para verificar a pureza por citometria de fluxo

  1. Para determinar a concentração celular, dilua a suspensão de neutrófilos em solução de azul de tripano a 0,4% (proporção 1:1) e conte os neutrófilos com um contador de células de campo claro.
    NOTA: Outros métodos de contagem também podem ser usados.
  2. Transfira 1 x 105 neutrófilos em meio de cultura 10% para os poços de uma placa de fundo em V de 96 poços e centrifugue por 3 min a 400 x g e RT.
  3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 50 μL de 1x DPBS suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1% (p / v) e NaN3 a 0,1% (v / v) (doravante referido como tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)) contendo bloqueio do receptor Fc (50x diluído).
  4. Incube por 15 min em RT e adicione 50 μL de tampão FACS contendo 50x anticorpo anti-CD45 de camundongo conjugado com APC-Cy7 diluído, 600x anticorpo anti-CD16 de camundongo conjugado com PerCP-Cy5.5 diluído, anticorpo anti-CD66b de camundongo conjugado com FITC diluído 133x e corante de viabilidade fixável diluído 500x eFluor 506.
    NOTA: O CD45 é expresso em leucócitos. CD66b é expresso exclusivamente em granulócitos. O CD16 é altamente expresso em neutrófilos, pouco expresso em eosinófilos e não expresso em basófilos.
  5. Incubar por 30 min em RT no escuro e centrifugar por 3 min a 400 x g e RT.
  6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda os neutrófilos em 175 μL de tampão FACS e centrifugue por 3 min a 400 x g e RT. Repita esta etapa uma vez.
  7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de neutrófilos em 175 μL de tampão FACS. Analise amostras usando um sistema de citometria de fluxo e software associado.

3. Análise da pureza dos neutrófilos utilizando software de análise por citometria de fluxo

NOTA: A análise dos dados de citometria de fluxo foi realizada usando o software de análise de citometria de fluxo, conforme indicado na Tabela de Materiais.

  1. Execute o gating de acordo com o procedimento passo a passo a seguir.
    1. Defina um portão de tempo no gráfico FSC-A vs. Tempo para selecionar uma área com fluxo de célula adequado.
    2. Defina uma porta de célula no gráfico SSC-A vs. FSC-A para selecionar células e excluir detritos.
    3. Defina uma porta de célula viável no gráfico FSC-A vs. AmCyan-A para selecionar células viáveis.
    4. Defina uma porta leucocitária no gráfico FSC-A vs. APC-Cy7 para selecionar células CD45+.
    5. Defina uma porta de neutrófilos no gráfico FITC vs. PerCP-Cy5.5 para distinguir entre CD66b+CD16+ (neutrófilos), CD66b-CD16+ (eosinófilos) e CD66b-CD16- (basófilos, monócitos e linfócitos).
    6. Defina uma única porta de célula no gráfico FSC-H vs. FSC-A para selecionar neutrófilos únicos.
    7. Determine a pureza dos neutrófilos apresentando neutrófilos únicos como a frequência das células (na porta celular).
      NOTA: Para prosseguir, a pureza dos neutrófilos precisa exceder 85%.

4. Microscopia de imagem ao vivo

NOTA: Este ensaio é otimizado para várias placas de imagem de 96 poços e vários estímulos e antagonistas NETosis. O protocolo abaixo descreve uma visão geral da abordagem, que pode ser especificada usando as tabelas incluídas.

  1. Prepare uma solução de poli-L-lisina a 0,001% diluindo a poli-L-lisina a 0,01% em H2O estéril na proporção de 1:10.
  2. Adicione solução de poli-L-lisina a 0,001% a cada poço e incube pelo menos 1 h a 37 °C.
    NOTA: O volume por poço depende da placa de imagem de 96 poços (Tabela 1).
  3. Lave os poços 3 vezes com 200 μL de DPBS para remover o excesso de poli-L-lisina. Execute todas as etapas no gabinete de fluxo laminar. Remova a tampa da placa e seque os poços ao ar abrindo a placa no gabinete de fluxo laminar até secar (aproximadamente 1 h).
  4. Calcule o número de neutrófilos necessários para o experimento e transfira um excedente para um tubo de 15 mL. Centrifugue por 10 min a 350 x g e RT.
    NOTA: A quantidade de neutrófilos em cada poço varia de acordo com o tipo de placa de imagem de 96 poços (Tabela 1). A densidade celular é otimizada para permitir uma boa separação de células individuais, o que é necessário para uma análise adequada. Se a densidade de neutrófilos for muito alta, as células e os TNEs se sobreporão às células e TNEs adjacentes, o que afeta a qualidade da análise.
  5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os neutrófilos em um meio de cultura sem vermelho de fenol suplementado com 2% (v / v) de FBS, 50 U / mL de penicilina e 50 μg / mL de estreptomicina, 10 mM de HEPES e 1 mM de CaCl2 (doravante referido como tampão de ensaio NET).
  6. Prepare as seguintes soluções de trabalho.
    1. Preparar o corante de ADN 80 nM em tampão de ensaio NET.
    2. Prepare os estímulos NETosis no tampão de ensaio NET.
    3. Prepare os antagonistas da NETosis no tampão de ensaio NET.
      NOTA: Esteja ciente de que as concentrações das soluções de trabalho descritas acima são 4 vezes a concentração final necessária no poço. As concentrações recomendadas de estímulos NETosis e antagonistas NETosis variam (Tabela 2 e Tabela 3).
  7. Adicione 4x corante de DNA concentrado em tampão de ensaio NET a cada poço.
  8. Adicione 4x estímulos concentrados de NETosis no tampão de ensaio NET aos poços correspondentes e adicione tampão de ensaio NET apenas a poços sem estímulo ou a poços contendo complexos imunes revestidos (cIC; protocolo na tabela 2).
  9. Adicione 4x antagonistas NETosis concentrados no tampão de ensaio NET aos poços correspondentes. Adicione o tampão de ensaio NET apenas a poços sem antagonista.
  10. Adicione suspensão de neutrófilos a cada poço.
    NOTA: O volume de 4x corante de DNA concentrado, 4x estímulos concentrados de NETosis no tampão de ensaio NET, 4x antagonista de NETose concentrado no tampão de ensaio NET, o número de neutrófilos e o volume de suspensão de neutrófilos por poço dependem da placa de imagem de 96 poços (Tabela 1). Evite a formação de bolhas ao pipetar.
  11. Centrifugue a placa por 2 min a 100 x g e RT e insira a placa de imagem de 96 poços no sistema de análise de microscopia de células vivas colocado em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
    NOTA: A condensação pode se desenvolver na parte inferior da placa de imagem de 96 poços durante o primeiro minuto de incubação. Isso deve ser removido com um lenço de papel.

5. Configuração do software do sistema de análise de microscopia de células vivas para a aquisição

NOTA: As imagens de contraste de fase e imunofluorescência foram adquiridas por um sistema de análise de microscopia de células vivas controlado por seu software de análise.

  1. Abra o software do sistema de análise de microscopia de células vivas e clique em Conectar ao dispositivo. Digite o nome de usuário e a senha. Clique em Agendar para adquirir e clique no botão de adição (Iniciar adicionar embarcação). Em seguida, selecione Verificar ao agendar e clique em Avançar.
  2. Para criar uma nova embarcação do zero, selecione Novo na seção Criar embarcação e clique em Avançar. Selecione Padrão na seção Tipo de Digitalização e clique em Avançar.
  3. Selecione as seguintes configurações de varredura e clique em Avançar: Célula por célula: Nenhuma; Canais de imagem: contraste de fase e verde (tempo de aquisição 100 ms); Objetivo: 20x.
  4. Selecione o tipo apropriado de embarcação a ser escaneada na seção Seleção de embarcação e clique em Avançar.
    1. Se estiver usando uma placa de 96 poços #1, selecione Corning, placa, 96, N/A, 3603, Corning de 96 poços (Blk/Wht), Microplacas.
    2. Se estiver usando uma placa #2 de 96 poços, selecione Nunc, Plate, 96, N/A, 152028, Nunc opt bottom de 96 poços (Blk/Wht), Microplacas.
  5. Especifique o local da embarcação na gaveta e clique em Avançar. Na seção Padrão de varredura , selecione os poços que precisam ser verificados, selecione o número de imagens por poço (escaneie 4 imagens por poço para obter uma visão geral representativa) e clique em Avançar.
    NOTA: Não selecione poços vazios, pois isso afetará o foco automático.
  6. Forneça informações sobre a embarcação inserindo, entre outros, o nome da placa na seção do caderno da embarcação e clique em Avançar. Selecione Adiar análise até mais tarde na seção Configuração da análise e clique em Avançar.
  7. Defina o agendamento de varredura para a embarcação na seção Agendamento de varredura . Selecione Criar novo agendamento com varreduras em intervalos de e selecione 1 hora. Selecione Parar verificação e 00:05 horas após a primeira verificação. Clique em Avançar e clique em Adicionar à Programação quando as informações de digitalização estiverem corretas.
    1. Quando a programação de digitalização precisar ser editada, clique duas vezes na Programação de digitalização na parte superior da tela. Clique com o botão direito do mouse no Cronograma de digitalização e Edite e ajuste conforme desejado. Clique no ícone Disquete para salvar a programação de digitalização.
      NOTA: Ao criar imagens de vários vasos (placas) no mesmo experimento, vasos adicionais podem ser adicionados ao agendamento de varredura existente clicando no botão de adição (Iniciar adicionar recipiente), selecionando Varredura na programação e clicando em Avançar. Crie um novo recipiente do zero (consulte a etapa 5.2 deste protocolo), copie um recipiente existente ou use um recipiente escaneado anteriormente. Isso resulta em varredura sequencial na mesma frequência e configurações da placa anterior.

6. Análise de ensaio NET de microscopia de imagem ao vivo usando o software de análise de microscopia de células vivas

NOTA: O software de análise de microscopia de células vivas foi usado para analisar as imagens de contraste de fase e imunofluorescência (Tabela de Materiais). Quando não estiver usando este sistema, uma análise NET semelhante pode ser realizada usando um pacote de software de domínio público 4,18,19,20.

  1. Abra o software de análise de microscopia de células vivas e clique em Conectar ao dispositivo. Digite o nome de usuário e a senha e clique em Exibir verificações recentes. Abra o experimento de escolha para analisar clicando duas vezes no nome do recipiente do experimento.
  2. Clique em Iniciar análise e selecione Criar nova definição de análise. Clique em Avançar.
  3. Selecione Analisador Básico na seção de tipo de análise e clique em Avançar. Na seção Canal de imagem , selecione Verde, desmarque Fase e clique em Avançar.
  4. Abra a janela Camadas de imagem e selecione Verde e desmarque Fase. Desative o dimensionamento automático na seção Verde e defina manualmente min e max para o canal verde para distinguir NETs do plano de fundo.
    NOTA: O contraste de fase pode ser ativado e desativado quando necessário. Por exemplo, para determinar se os TNEs são expelidos no ambiente extracelular.
  5. Abra a janela Tempos de varredura da embarcação e selecione o tempo de varredura da embarcação apropriado em que as NETs devem estar presentes. Selecionar um conjunto de imagens que representem a variabilidade dentro do experimento (imagens de poços de controle positivo com NETs e imagens de poços de controle negativo sem NETs). Essas imagens serão usadas para visualizar e refinar a análise. Clique em Avançar.
  6. Abra a janela Configurações de Definição de Análise e comece a ajustar as configurações de análise para o canal verde de forma que as estruturas NET sejam delineadas sem criar NETs falsos positivos ou falsos negativos. Use as configurações a seguir e clique em Visualizar atual ou Visualizar tudo para aplicar as configurações às imagens atuais ou a todas, respectivamente.
    1. Para nome do objeto, selecione NETs.
    2. Para segmentação, selecione Sem subtração de fundo - Adaptável.
    3. Para o limite de GCU, selecione entre 3 e 5 (dependendo do experimento).
    4. Para divisão de borda, selecione LIGADO (entre -10 e 0).
    5. Para limpeza, selecione Preenchimento de furo: 100 μm2 e Ajustar tamanho: -1 pixels.
    6. Para filtros, selecione dependendo do experimento, mas os valores de corte recomendados são: Área: >200 μm2, Intensidade média: <24,6, Intensidade integrada: >7000.
      NOTA: As estruturas selecionadas com base nas configurações usadas são contornadas com magenta. Passar o mouse sobre essas estruturas fornecerá mais informações sobre os parâmetros dos objetos (ou seja, área, excentricidade, intensidade integrada e intensidade média), o que ajuda a otimizar a análise relacionada aos critérios de inclusão ou exclusão para parâmetros NET. Verifique várias imagens (de poços de controle positivo e negativo) para testar se as configurações de análise estão corretas.
  7. Quando as configurações da análise NET estiverem corretas, clique em Avançar. Selecione os pontos de tempo e poços a serem analisados na seção de tempos de varredura e poços e clique em Avançar. Insira o nome da definição na seção salvar e aplicar definição de análise e clique em Avançar. Clique em Concluir quando as informações da análise forem verificadas e corretas.
    NOTA: Ao analisar várias placas ou usar análises de experimentos anteriores, inicie a análise e selecione Copiar definição de análise existente ou Usar definição de análise existente e clique em Avançar. Selecione a definição de análise existente apropriada e clique em Avançar. Para o procedimento de análise subsequente, vá para a etapa 6.4 se a opção copiar definição de análise existente tiver sido escolhida ou a etapa 6.7 se a opção usar definição de análise existente tiver sido escolhida.
  8. Abra a análise do experimento clicando na análise dentro do recipiente de interesse. Abra a janela Métricas do gráfico .
  9. Clique no botão de adição (Criar métrica). Os dados podem ser apresentados como porcentagem de confluência NET (a porcentagem da área da imagem marcada como NET) ou porcentagem de neutrófilos de rede (número de NETs dividido pelo número de células).
    1. Ao apresentar dados como uma porcentagem de confluência NET, selecione Área na seção Métrica e selecione Confluência na seção Valor . Ao apresentar dados como neutrófilos de compensação percentual, selecione Contagem de objetos na seção Métrica e selecione Por imagem na seção Valor .
    2. Clique em OK. Selecione Confluência de área NETs (%) ou Contagem de objetos NETs por imagem (por imagem) na seção Métricas definidas pelo usuário . Selecione todos os pontos de tempo que precisam ser analisados na seção Selecionar Varreduras . Selecione todos os poços que precisam ser analisados na seção Selecionar poços e clique em Exportar dados.
  10. Selecione as seguintes configurações na seção Exportação de gráficos .
    1. Selecione Mostrar cada verificação como sua própria tabela (colunas: 1, 2... linhas: A, B...).
    2. Selecione Mostrar rótulos de linha e coluna.
    3. Selecione Todas as verificações em um arquivo e clique em Procurar para ajustar o local e o nome do arquivo.
    4. Selecione Incluir detalhes do experimento no cabeçalho.
    5. Selecione Dividir dados em imagens individuais.
  11. Clique em Exportar para exportar os dados como arquivo ".txt", que pode ser importado e analisado posteriormente em uma planilha.
    NOTA: Para determinar a porcentagem de neutrófilos de rede, o número de neutrófilos em t = 0 precisa ser determinado. Para fazer isso, continue com as etapas a seguir do protocolo.
  12. Vá para a etapa 6.1 para iniciar a análise adicional necessária para contar o número de neutrófilos para imagens em t = 0.
    1. Na etapa 6.3, selecione Fase e desmarque Verde na seção do canal de imagem.
    2. Na etapa 6.4, selecione t = 0 na seção de tempos de varredura do recipiente.
    3. Na etapa 6.5, desmarque Verde, selecione Fase e ajuste as Configurações do canal de fase quando necessário.
    4. Na etapa 6.6, adicione o Nome do objeto, selecione Confluência clássica na seção Segmentação e defina o ajuste de segmentação em 0 (Plano de fundo), ajuste o preenchimento do furo para 100 μm2 e ajuste a área para 50 μm2.
    5. Na etapa 6.7, selecione t = 0 na seção selecionar varreduras.
    6. Na etapa 6.8, abra a Análise de contagem de neutrófilos.
    7. Na etapa 6.9, selecione Contagem de objetos por imagem (por imagem) na seção Métricas definidas pelo usuário .
    8. Finalmente, use o seguinte cálculo para gerar a porcentagem de neutrófilos de rede: (número de NETs / número de neutrófilos em t = 0) x 100%.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia de alto rendimento em tempo real, em combinação com um corante de DNA impermeável, permite estudar a cinética, as características e as vias subjacentes da NETosis e permite a avaliação de potenciais inibidores da liberação de NET. Com essa abordagem, os TNEs foram definidos como estruturas positivas para corante de DNA com uma área de superfície significativamente maior em comparação com a área de superfície de neutrófilos saudáveis (Figura 1A), indicando que a cromatina foi expelida para o ambiente extracelular18. A análise baseada na área de superfície nos permitiu distinguir entre NETs e neutrófilos ativados com integridade da membrana plasmática comprometida, mostrando coloração brilhante de DNA intracelular (Figura 1A).

O ionóforo de cálcio (A23187) e o PMA são comumente usados para induzir a NETose in vitro. Apesar de serem estímulos não fisiológicos, eles são valiosos porque ativam vias distintas de NETosis e garantem indução consistente de NETosis com baixa variabilidade entre os doadores. A23187 desencadeia o influxo de cálcio, levando à ativação de PAD4 e liberação de NETs ricos em histonas citrulinadas, enquanto o PMA ativa o complexo NADPH oxidase, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e na subsequente liberação de NETs com baixos níveis de histonas citrulinadas 5,16,21. A velocidade e a magnitude da resposta da NETosis dependem da concentração de cada estímulo (Figura 1B, C), com A23187 induzindo NETosis mais rápida, e PMA resultando em uma proporção maior de neutrófilos liberando NETs (Figura 1D-F). Os TNEs resultantes da estimulação A23187 (Figura 1D; seta vermelha) foram distintos dos TNEs induzidos por PMA (Figura 1D; seta amarela) por serem mais difusos além da membrana plasmática de neutrófilos, enquanto os TNEs induzidos por PMA permaneceram mais adjacentes à membrana plasmática de neutrófilos. Além disso, a estimulação de A23187 resultou em neutrófilos positivos para corante de DNA permeáveis e sem rede (Figura 1D; seta azul), que não expeliam seu DNA para o espaço extracelular. A detecção de neutrófilos positivos para corante de DNA permeável sem rede foi dependente da concentração de A23187 (Figura 1G) e quase ausente, independentemente da concentração de PMA usada para estimular a NETose (Figura 1D, H). Além de usar os estímulos não fisiológicos da NETosis A23187 e PMA, este ensaio também é adequado para estudar os gatilhos relevantes da NETose para a doença. Por exemplo, neutrófilos ativados com complexos imunes solúveis (sIC) ou cristais presentes na doença de disposição de pirofosfato de cálcio (CPPD) apresentaram liberação de NET significativamente aumentada em comparação com nenhum estímulo. Uma tendência para níveis elevados de NET foi observada quando os neutrófilos foram ativados com cristais de imunocomplexos revestidos (cIC), fMLP e urato monossódico (MSU) (Figura 1I); no entanto, para esses estímulos, observamos uma variação considerável de doador para doador.

A inibição farmacológica da via NETosis e das enzimas associadas à NETosis mostrou que a terapêutica direcionada à NETosis pode ser um tratamento eficaz para doenças em que o acúmulo de NET impulsiona significativamente a patologia 14,17,22,23,24. Este ensaio NET de microscopia em tempo real é uma abordagem fácil, confiável e reprodutível para estudar antagonistas de NETosis de maneira de alto rendimento. Para exemplificar isso, usamos um anticorpo monoclonal humanizado de primeira classe, o CIT-013, que tem como alvo as histonas citrulinadas H2A e H4 com alta afinidade15,16. A23187 ativa a via NETosis, resultando em NETs contendo histonas citrulinadas que são subsequentemente direcionadas pelo CIT-013 para desempenhar sua função inibitória da NETosis16. De fato, a liberação de NET em resposta a A23187 foi completamente inibida pelo CIT-013 (Figura 2A e Vídeo Suplementar 1), com um IC50 de 4,6 nM (Figura 2B). A capacidade inibitória da NETosis do CIT-013 é única, uma vez que outros anticorpos comerciais direcionados a diferentes histonas (não) citrulinadas não foram capazes de inibir a liberação de NET ( Figura 2C ).

Anteriormente, mostramos que uma molécula precursora altamente semelhante de CIT-013 (diferindo dois aminoácidos, mas ligando epítopos semelhantes com igual afinidade) bloqueia a NETose em resposta a estímulos fisiológicos, como plaquetas ativadas, líquido sinovial de gota e líquido sinovial AR17. Aqui, mostramos que a liberação de NET induzida por sIC pode ser inibida por CIT-013 (Figura 2D). A relevância terapêutica da inibição da NETose induzida por esse estímulo é destacada pelo LES, AR e outras doenças autoimunes, onde os autoanticorpos no soro ou no líquido sinovial auxiliam na formação de CI, que desencadeia a NETose25,26.

Juntos, esses dados demonstram que essa abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real é adequada para estudar a cinética e as características da liberação de NET e permite o estudo de inibidores de NETose. Embora este método tenha sido otimizado para o uso de neutrófilos humanos, com modificações também pode ser adequado para estudar neutrófilos de outras espécies. Os dados gerados com este ensaio são a pedra angular da justificativa para o CIT-013 como uma terapia potente e eficaz para doenças causadas por TNE.

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Figura 1: Microscopia de alto rendimento em tempo real para estudar a liberação de NET. Neutrófilos isolados do sangue de voluntários saudáveis foram estimulados com A23187 ou PMA para desencadear a via NETosis. NET foi visualizada com microscopia de alto rendimento em tempo real usando um corante de DNA impermeável à membrana plasmática e quantificada com base na área de superfície com o software do sistema de análise de microscopia de células vivas. (A) Análise da área de superfície de neutrófilos saudáveis não estimulados (cinza), TNEs extracelulares e neutrófilos permeáveis sem rede com coloração de DNA intracelular (verde). (B, C) Quantificação da liberação de NET ao longo do tempo de neutrófilos estimulados com as concentrações indicadas de A23187 ou PMA (n = 2). (D) Imagens representativas da liberação NET em resposta a A23187 (setas vermelhas) e PMA (setas amarelas) em diferentes pontos de tempo. Exemplos de neutrófilos permeáveis sem rede são indicados com setas azuis. (E) Quantificação da liberação de NET ao longo do tempo apresentada como uma porcentagem da confluência de NET (n = 5). As estatísticas foram realizadas em t = 240 min. (F) Quantificação da liberação de NET ao longo do tempo apresentada como uma porcentagem de neutrófilos de rede (n = 2). (G, H) Quantificação de neutrófilos permeáveis não líquidos ao longo do tempo de neutrófilos que foram estimulados com as concentrações indicadas de A23187 ou PMA (n = 2). (I) Quantificação da liberação de NET em t = 240 min induzida por complexos imunes solúveis (sIC), IC revestido (cIC), fMLP, cristais de urato monossódico (MSU) e cristais presentes na doença de disposição de pirofosfato de cálcio (CPPD) (n = 8-28). Os resultados são relatados como média ± erro padrão da média. **P < 0,01 e ****P < 0,0001, ANOVA de medidas repetidas de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett (B), teste de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn (I). Os painéis A-F foram modificados com permissão de van der Linden et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: CIT-013 inibe a liberação de NET. (A) Quantificação da liberação de NET induzida por A23187 em t = 240 min na ausência (No Ab) ou presença de CIT-013 ou anticorpo de controle de isotipo (cIgG). (B) Inibição dependente da dose da liberação de NET induzida por A23187 com CIT-013 em t = 240 min (n = 3). Os dados foram normalizados para cIgG (definido como 100% NET release). (C) Quantificação da liberação de NET induzida por A23187 em t = 240 min na presença de concentrações indicadas de CIT-013, anticorpo anti-histona H4, anticorpo anti-histona H3 anti-citrulinado # 1 ou anticorpo anti-histona H3 citrulinado # 2 (n = 6). (D) Quantificação da liberação de NET em t = 240 min induzida por imunocomplexos solúveis (ICs) na presença de CIT-013 ou cIgG. Os resultados são relatados como média ± erro padrão da média. P < 0,0001, ANOVA unidirecional de medidas repetidas com comparações múltiplas de Tukey (A) ou teste de classificação com sinal de pares pareados de Wilcoxon bicaudal (D). Os painéis A, B e D foram modificados com permissão de van der Linden et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Placa de 96 poços #1Placa de 96 poços #2
Volume 0,001% de solução de poli-L-lisina por poço50 μL100 μL
Volume de suspensão de neutrófilos por poço50 μL87,5 μL
Número de neutrófilos por poço2 x 104 células3,5 x 104 células
Volume 4x corante de DNA concentrado (= 80 nM) em tampão de ensaio NET por poço50 μL87,5 μL
Volume 4x estímulos concentrados de NETosis em tampão de ensaio NET por poço50 μL87,5 μL
Volume 4x antagonistas concentrados de NETosis em tampão de ensaio NET por poço50 μL87,5 μL

Tabela 1: Volumes e números de células otimizados para diferentes placas de imagem de 96 poços.

Solução de trabalho de concentração (4x concentrado)Concentração final
Ionóforo de cálcio (A23187)50 μM12,5 μM
PMA16 nM4 nM
fMLP4 μM1 μM
Cristais de urato monossódico (MSU)400 μg/mL100 μg/mL
Cristais da doença de disposição do pirofosfato de cálcio (CPPD)400 μg/mL100 μg/mL
Imunocomplexos solúveis (sIC)1. Adicione 5 μg/mL de albumina sérica humana (HSA) na sepd a 282,5 μg/mL de anticorpo anti-HSA policlonal de coelho na sapd.
2. Incubar durante pelo menos 90 min a 37 °C.
3. Homogeneizar por vórtice e adicionar 50 μL de solução de sIC aos poços correspondentes.
Imunocomplexos revestidos (cIC)1. Adicione 10 μg/mL de HSA em DPBS nos poços correspondentes da placa de 96 poços.
2. Incubar durante a noite a 4 °C.
3. Lave os poços 3 vezes com 200 μL 0,05% Tween-20 em DPBS (doravante referido como PBS/0,05%Tween).
4. Bloqueie os poços com 200 μL de albumina de soro bovino a 1% (p / v) em PBS / 0,05% Tween (doravante denominado tampão de bloqueio).
5. Incube por 120 min em temperatura ambiente e agitação suave (400 rpm).
6. Lave os poços 3 vezes com 200 μL de PBS/0,05% de interpolação.
7. Adicione 50 μL de anticorpo anti-HSA policlonal de coelho no tampão de bloqueio aos poços correspondentes.
8. Incube por 60 min em temperatura ambiente e agitação suave (400 rpm).
9. Lave os poços 3 vezes com 200 μL de PBS / 0,05% de interpolação.
10. Por fim, lave os poços 3 vezes com 200 μL de DPBS. Os poços agora estão prontos para a etapa 4.7 do protocolo.

Tabela 2: Concentrações recomendadas para estímulos NETosis.

Solução de trabalho de concentração (4x concentrado)Concentração final
Anticorpo anti-lisozima de ovo de galinha (anticorpo controle; cIgG)80 nM20 nM
CIT-01380 nM20 nM

Tabela 3: Concentrações recomendadas para antagonista da NETose.

Vídeo Suplementar 1. Os neutrófilos foram estimulados com A23187 na presença de cIgG (esquerda) ou CIT-013 (direita), e a liberação de NET foi visualizada ao longo do tempo usando o corante de DNA impermeável à membrana plasmática. NET é inibida na presença do CIT-013. O filme é uma sobreposição de corante de DNA (verde) e contraste de fase. Este vídeo foi obtido com permissão de van der Linden et al.16. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

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Desde a descoberta dos TNEs em 2004, muitas estratégias foram desenvolvidas para investigar experimentalmente a liberação de TNE in vitro, sendo a microscopia de imunofluorescência a técnica mais comum para quantificar a NETosis27,28. Embora a microscopia seja útil para visualizar a liberação de NET, ela tem limitações, uma vez que a quantificação microscópica não automatizada de imagens de ponto de tempo fixo é bastante imprecisa e pode sofrer viés do observador. Outra técnica usada para estudar a liberação de NET é a citometria de fluxo de imagem multiespectral29,30, que mede um grande número de neutrófilos em rede e adota análise imparcial, mas se concentra em neutrófilos nos estágios iniciais da NETosis e não quantifica os neutrófilos que liberaram seus NETs. Muitos estudos sobre a cinética da NETosis usam um corante de DNA para quantificar a liberação de NET em combinação com um leitor de placa de fluorescência31. Esta técnica é incapaz de distinguir TNEs de neutrófilos ativados ou moribundos com coloração de DNA intracelular e, portanto, é inadequada para quantificação da liberação de NET e estudo de antagonistas de NETose. O exposto acima enfatiza que as abordagens atualmente em uso para estudar a NETosis são valiosas, mas têm suas limitações.

O método de microscopia em tempo real descrito neste estudo aborda muitos problemas encontrados em técnicas relatadas anteriormente. Ele oferece quantificação NET imparcial, semiautomatizada, de alto rendimento, reprodutível e precisa. De fato, essa abordagem minimiza os artefatos de pipetagem, como a morfologia esticada dos NETs18, e é capaz de distinguir NETosis de necrose e apoptose por meio da morfologia e cinética distintas da liberação de DNA18 , 32 . Além disso, essa abordagem oferece a oportunidade de estudar diferentes vias bioquímicas para a morte celular regulada, como a formação de NET em neutrófilos necroptóticos, que geram estruturas que atendem aos critérios funcionais e fenotípicos dos TNEs33.

Existem várias etapas críticas neste protocolo que precisam ser seguidas para a quantificação bem-sucedida de NETs. Primeiro, o número correto de células por poço é importante para a quantificação precisa do NET. Quando a densidade de neutrófilos é muito alta, as células e os NETs se sobrepõem às células adjacentes e aos NETs, o que os torna difíceis de distinguir e, como resultado, a quantificação se torna imprecisa. Em segundo lugar, é um pré-requisito usar uma baixa concentração de corante de ligação de DNA impermeável à membrana plasmática não tóxica para corar NETs quando secretado no ambiente extracelular. Os corantes de ligação ao DNA permeáveis à membrana plasmática podem facilmente induzir a ativação de neutrófilos ou a morte celular. Em terceiro lugar, várias imagens por poço devem ser verificadas para uma visão geral representativa da liberação de NET entre a população heterogênea de neutrófilos. Quarto, a imagem de contraste de fase de neutrófilos em t = 0 é necessária para corrigir o número de neutrófilos por imagem e calcular a porcentagem de neutrófilos de rede.

Embora essa abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real tenha muitas vantagens sobre outros ensaios de detecção de NET, existem limitações para esse método, pois, até onde sabemos, não há corantes fluorescentes disponíveis para detectar componentes NET adicionais para confirmar a liberação de NETs. Anticorpos marcados com fluorescência para detectar componentes adicionais do NET podem ser usados, mas podem ter efeitos indesejados, uma vez que os complexos imunes a anticorpos influenciam a ativação de neutrófilos e possivelmente a NETose. Portanto, preferimos não usar anticorpos adicionais nesta configuração de ensaio e recomendamos o uso de estímulos indutores de NETosis bem conhecidos. Quando estímulos NETosis ainda não estabelecidos são usados, defendemos o uso de um ELISA para detectar DNA complexado com proteínas específicas de NET, como histonas citrulinadas, antes do ensaio de imagem ao vivo. Em segundo lugar, a variação intra e inter-ensaio pode resultar da variabilidade de doador para doador, com neutrófilos de doadores saudáveis respondendo de maneira diferente a vários estímulos de NETosis devido à heterogeneidade dentro da população saudável. Para minimizar a variação do ensaio, os neutrófilos devem ser isolados dentro de 1 h a partir do sangue recém-coletado e usados imediatamente no experimento, uma vez que os neutrófilos têm vida curta e não podem ser criopreservados. Além disso, é importante que um protocolo de isolamento de neutrófilos seja validado e adotado para minimizar a ativação de neutrófilos. Os neutrófilos são células sensíveis e podem alterar sua capacidade de resposta a estímulos durante o processo de purificação devido ao estresse mecânico e outros tipos de estresse. O estado de ativação dos neutrófilos e a liberação de TNE podem ser influenciados pelo tipo de agulha, tubos de coleta de sangue utilizados, temperatura de incubação, velocidade de centrifugação e tempo desde a coleta de sangue até o isolamento dos neutrófilos 34,35,36,37. Um método adicional de isolamento de neutrófilos que pode ser considerado é descrito por Krémer et al.36 usando um método de seleção imunomagnética negativa sem lise de hemácias. Este método se assemelha a neutrófilos intocados no sangue total e pode ser adequado para evitar qualquer ativação de neutrófilos durante o processo de purificação. Todos os itens acima devem servir para alertar o campo de que os dados de diferentes grupos de pesquisa precisam ser comparados com muito cuidado.

No geral, o método de microscopia de alto rendimento em tempo real descrito permite a quantificação precisa de NETs de maneira reprodutível e eficiente e pode ser usado para estudar as características, magnitude e cinética da liberação de NET e permite a investigação da atividade de antagonistas de NETosis. Como exemplo deste último, usamos o anticorpo monoclonal anti-citrulinado humanizado H2A e H4 CIT-013, que está atualmente em desenvolvimento clínico.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores são funcionários da Citryll e têm interesses financeiros.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a Paul Vink por gerenciar parte do projeto referente ao método de microscopia de imagem ao vivo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A-23187 Ácido Livre (Calcimicina)Thermo FisherA1493
Cloreto de amônio (NH4Cl)Sigma AldrichA9434
Anti-Lisozima de ovo de galinha (anticorpo de controle; cIgG)CrownBioC0001
APC-Cy7-conjugado camundongo anti-humano CD45 anticorpo (Clone 2D1)Biolegend368515Use em 1 e micro; g/mL de concentração final
Sistema BD FACSCantoTM II + software FACSDiva (versão 8.0.1) BDn/aSistema de citometria de fluxo
Albumina sérica bovina (BSA) Fração VRoche10735108001
CaCl2 (1 M)VWRE506
Cristais de doença de disposição de pirofosfato de cálcio (CPPD)InvivoGenlrl-cppd
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter + software de análise (versão 3.3.9.5)Nexcelom Biociêncian/aContador de células de campo claro
CIT-013Citryll B.V.n/a
Placa Costar preta de 96 poços, fundo transparente Corning3603placa de 96 poços #1
Dextran T500Pharmacosmos551005009006
DPBS (1x)Gibco14190-144
Fetal Bovine Serum (FBS)SerenaS-FBS-SA-015
Ficoll GE Healthcare17-1440-02Solução de gradiente de densidade
anti-anticorpo CD66b humano de camundongo conjugado com FITC (Clone G10F5)eBioscience17-0666-42Use a 1,5 µ g/mL de concentração final
Corante de viabilidade fixável eFluor 506eBioscience65-0866-14
Software de análise de citometria de fluxoFLowJoVersão 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES (1M)Gibco15630-080
Albumina sérica humana (HSA)VWR31020
Humano TruStain FcX Biolegend422302Fc receptor block
IBIDI placa de 96 poços, fundo transparente IBIDI89626Placa de 96 poços #2
IncuCyte SX3 + software de análise (versão 2022B Rev1) Satoriusn/aSistema de análise microscópica de células vivas
Cristais de urato monossódicoInvivoGentlrl-msu
Anti-histona H3 de camundongo (citrulina R2 + R8 + R17) anticorpo Cayman17939Clone 11D3; referido como #1
Anti-histona de camundongo H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) anticorpo (Clone KM-2)Anticorpos absolutosAb01681-2.0
Na2EDTASigma AldrichE5134
NaCl (0,9%)B. Braun25900
Penicilina (5000 U/mL) - Estreptomicina (5000 µ g/mL)Gibco15070-063
PerCP-Cy5.5-conjugado camundongo anti-humano CD16 anticorpo (Clone 3G8)Biolegend302027Uso em 0,33 µ g/mL de concentração final
PMASigma AldrichP1585
Anticorpo policlonal anti-HSA de coelhoSigma AldrichA0433-2ml
Poli-L-lisina (0,01%)Sigma AldrichP4832
Bicarbonato de potássio (KHCO3)Sigma Aldrich237205
Coelho anti-histona H3 (citrulina R2 + R8 + R17) anticorpo Abcamab281584Multiclonal; referido como #2
RPMI 1640 com suplemento GlutaMAXTM Gibco61870-010Meio de cultura contendo L-glutamina
RPMI 1640 sem vermelho fenol Gibco11835-030Meio de cultura sem fenol vermelho
Azida de sódio (NaN3)Sigma AldrichS2002
Estéril H2OGibco15230204
Sytox Green Nucleid Acid Stain Thermo FisherS7020DNA corante
solução de azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Tween-20Sigma AldrichP1379
Tubos de sangue Vacutainer Li-Heparina (17 UI/mL)BD367526

Referências

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