Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

Resumo

IDH1-mutante gliomas difusos de baixo grau são tumores raros e difíceis de cultivar. Apresentamos um método simples de explante não enzimático que preserva a expressão da proteína mutante IDH1 e sustenta as culturas por meses. É importante ressaltar que essa técnica funciona com tumores criopreservados, oferecendo um recurso valioso para a pesquisa de gliomas.

Resumo

Os gliomas difusos, os tumores cerebrais primários mais prevalentes, são categorizados em graus baixos e altos com base em critérios histopatológicos e mutações genéticas. Os gliomas difusos de baixo grau constituem um subconjunto, afetando predominantemente adultos jovens e predispondo a gliomas de alto grau. Existem dois tipos principais de gliomas difusos de baixo grau: astrocitomas e oligodendrogliomas, cada um definido por características genéticas e histológicas distintas. Esses tumores apresentam caracteristicamente uma variante mutante da enzima metabólica IDH1, interrompendo a diferenciação celular. Eles são heterogêneos, compreendendo células-tronco proliferativas e células gliais quiescentes mais diferenciadas.

Modelos de tumores in vitro específicos do paciente têm um potencial significativo para desvendar mecanismos oncogênicos e adaptar a seleção de medicamentos para terapia personalizada. No entanto, a ausência de modelos in vitro confiáveis especificamente para gliomas de baixo grau com mutação IDH1 tem dificultado a pesquisa fundamental e translacional. Aqui, apresentamos um método simples para cultivar tumores mutantes em IDH1 como explantes em meios definidos sem a necessidade de dissociação enzimática. Esses explantes podem ser sustentados por longos períodos, mantendo a expressão da proteína mutante IDH1, bem como marcadores para células progenitoras de oligodendrócitos, como ASCL1 (MASH1), OLIG1 e OLIG2 e para astrócitos (GFAP, SOX9). Eles também podem ser estabelecidos a partir de tumores congelados no DMSO. Essas culturas podem servir como uma plataforma valiosa para triagem de drogas, videomicroscopia e estudos genéticos, facilitando assim os avanços na compreensão e tratamento desses tumores desafiadores. Eles também oferecem o potencial de derivar linhagens celulares mutantes de IDH1.

Introdução

Os gliomas difusos são os tumores cerebrais primários mais frequentes. Atualmente, esses tumores são incuráveis, apesar do tratamento muito intenso (cirurgia, rádio e quimioterapia)¹. Evidências crescentes apóiam a hipótese de que a gliomagênese se origina de células-tronco adultas ou progenitoras gliais residentes no cérebro². Embora os glioblastomas representem o tipo mais agressivo, os gliomas difusos de baixo grau (DLGG, tumores de grau 2) também são prevalentes (15% dos gliomas difusos)^1,3. Os DLGGs crescem lentamente e migram ao longo dos tratos de substância branca, uma marca registrada dessa neoplasia 'difusa' < classe sup = "ref">4. Esses DLGG muitas vezes recorrem apesar do tratamento, progredindo para malignidades de alto grau (graus 3 e 4)⁵.

DLGG são caracterizados por uma mutação missense no gene da isocitrato desidrogenase 1 ou 2 (IDH1 ou IDH2), resultando na produção aberrante do oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG). Isso interrompe a diferenciação celular por meio de desregulações epigenéticas⁶. Os gliomas mutantes IDH1 são classificados em subtipos: os astrocitomas geralmente têm mutações em ATRX e P53, enquanto os oligodendrogliomas são caracterizados por deleções 1p19q⁷. Esses tumores exibem uma heterogeneidade de células tumorais. O sequenciamento e a imunocaracterização de RNA de célula única revelaram uma população diversificada de células tumorais, exibindo fenótipos semelhantes a células-tronco, astrócitos e oligodendrócitos dentro desses tumores^8,9.

Em contraste com o glioblastoma, que se beneficia de culturas e linhagens celulares de longo prazo prontamente disponíveis, existe uma notável escassez de ferramentas celulares adaptadas para investigar tumores mutantes IDH1¹. Isso representa um obstáculo significativo para o avanço do desenvolvimento terapêutico e aprofundamento de nossa compreensão da gliomagênese mutante IDH1 e progressão da doença. As linhagens celulares tradicionais cultivadas em soro, embora utilizadas há muito tempo, replicam inadequadamente os tumores originais, exibindo perfis transcricionais alterados. Alternativamente, as condições de cultura sem soro, seja em modelos tumoróides 2D ou 3D, preservam de forma mais eficaz os perfis transcricionais das células tumorais e seus fenótipos in vivo, como invasão no tecido cerebral normal^10,11.

Além disso, as culturas de células de curto prazo derivadas da peça cirúrgica de um paciente preservam o perfil molecular e a diversidade celular do tumor, representando melhor as características biológicas dos tumores em comparação com as linhagens celulares¹². Aqui, apresentamos um método não enzimático direto para cultura de cultura de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1 como explantes derivados de ressecções de pacientes frescos ou congelados, com o objetivo de atender à necessidade de modelos in vitro aprimorados para pesquisa de glioma e desenvolvimento terapêutico. Eles também oferecem o potencial de derivar linhagens celulares mutantes de IDH1.

Protocolo

Os fragmentos tumorais utilizados neste protocolo foram obtidos de uma coleção bem caracterizada e eticamente aprovada, com consentimento do paciente. Esta pesquisa foi conduzida no âmbito do projeto intitulado Gliomacult: Caracterização e Culturas Primárias de Gliomas de Baixo Grau (Projeto No. RECH/P722/1-5) e foi aprovado pelo conselho científico do biobanco de tumores em 28 de agosto de 2023.

1. Preparação das placas de cultura

NOTA: Execute estas etapas sob uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos estéril.

1. Pelo menos 1 h antes da cultura, prepare placas de poli-D-lisina (PDL) e laminina revestidas com 24 poços.
   1. Diluir 10 mg de pó de PDL em 100 ml de tampão borato (pH 8,4) para uma concentração final de 100 μg/ml. Uma vez dissolvido, filtre a solução (0,22 μm) para esterilidade. O PDL está pronto para uso; prepare alíquotas de 3 mL e guarde-as a -20 °C.
   2. Descongele o tubo de laminina de 1-2 mg/ml a 4 °C para evitar a formação de gel. Preparar alíquotas de 50 μL e armazená-las a -20 °C.
      NOTA: Deve-se evitar o descongelamento e o congelamento repetidos.
   3. Revestimento de placas
      1. Etapa opcional: colocar lamínulas estéreis Ø, 13 mm, adequadas para placas de cultura de células, em uma placa de 24 poços, uma lamínula por poço.
         NOTA: Esta etapa é para imunocoloração adicional de explantes de glioma.
      2. Para o revestimento dos poços, misture os 3 mL da solução de PDL em 9 mL de 1x PBS e adicione 50 μL de laminina. Adicione 500 μL desta solução a cada poço para uma concentração de revestimento de 1-2 μg/cm². Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente, de preferência com balanço lento (15 RPM), durante pelo menos 1 h.
      3. Imediatamente antes da cultura, remover a solução de PDL-laminina e enxaguar duas vezes com 1x PBS.
         estéril NOTA: Não deixe os poços secarem.

2. Mídia

1. Cultive explantes mutantes de IDH1 em um meio definido composto por DMEM/F12 suplementado com L-glutamina, juntamente com uma mistura de reposição de soro composta por N2 e B27 sem vitamina A. Use antibióticos, incluindo ciprofloxacina, gentamicina e fungos, para evitar contaminação bacteriana e fúngica. Além disso, incorpore os fatores de crescimento heparina, EGF e FGF2 no meio, filtre-o (0,2 μm) e armazene-o por até 2 semanas a 4 °C.
   NOTA: Para obter detalhes sobre os ingredientes e a preparação do meio, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais.

3. Preparação do explante

1. Antes do processamento da amostra, prepare o espaço de trabalho e as ferramentas estéreis conforme ilustrado em Figura 1A. Higienize uma embalagem fria borrifando-a com etanol 70%. Esterilize tesouras e pinças imergindo-as em etanol a 70% e enxaguando-as com PBS.
2. Transfira imediatamente a ressecção do tumor para cultura em gelo, idealmente dentro de 2 h após a extração cirúrgica (Figura 1B).
   NOTA: A amostra do tumor deve ter um diâmetro mínimo de 9-10 mm para garantir melhores resultados. O tecido é transportado sem meio de cultura, pois este método é preferido para fins histológicos. A ausência de líquido impede a formação de cristais de gelo durante o congelamento instantâneo, preservando assim a integridade do tecido para exame histológico subsequente, se necessário.
3. Coloque a placa de cultura com a amostra do tumor sobre a bolsa fria e enxágue suavemente com 1X PBS para remover o excesso de sangue.
4. O tumor ressecado freqüentemente exibe tamanho e heterogeneidade significativos, compreendendo massa tumoral, tecido infiltrado e componentes não tumorais (Figura 1C). Selecione porções que exibem uma cor cinza com uma textura macia ou gelatinosa para isolamento de células tumorais, pois tendem a conter mais células tumorais. Por outro lado, evite regiões duras e brancas, pois elas podem conter menos células tumorais adequadas para cultura (Figura 1D), bem como áreas enegrecidas, pois provavelmente são resultado de eletrocautério e podem não fornecer resultados confiáveis para análise.
5. Transfira as amostras selecionadas para um microtubo de 1,5 mL ou criovial para picar. Adicione 1 mL de meio estéril ao microtubo de 1,5 mL ou criovial e pique a amostra com a tesoura estéril até obter pequenos pedaços (1-2 mm³).
   NOTA: Aproximadamente 1-2 min de corte são necessários para obter fragmentos minúsculos, normalmente 1-2 mm³ de tamanho (Figura 1E).
6. Com uma tesoura estéril, apare cuidadosamente a extremidade de uma ponta de pipeta azul de 1.000 μL para criar uma abertura ampla, com aproximadamente 3-4 mm de diâmetro. Empregando esta ponta modificada, pipete 50-200 μL dos fragmentos de tecido picados e distribua-os uniformemente em cada poço. Como os pedaços menores tendem a se assentar rapidamente, homogeneize suavemente a suspensão em cada poço para garantir uma distribuição uniforme.
   NOTA: Evite a superlotação e mantenha o equilíbrio não introduzindo um número excessivo de fragmentos em cada poço (Figura 1F).
7. Incubar os fragmentos tumorais a 37°C em uma incubadora de 5% de CO2 com 100% de umidade. Troque o meio todos os dias se a atividade metabólica do tumor (indicada pelo rápido amarelecimento do meio) e o número de fragmentos em cada poço exigirem. Durante as trocas de meio, tenha cuidado aspirando delicadamente o meio usando uma pipeta equipada com uma ponta de 200 μL, garantindo evitar perturbar quaisquer fragmentos tumorais aderentes.

Figura 1: Procedimento de cultura de explante tumoral. Uma ressecção difusa de glioma de baixo grau foi obtida de um paciente de 44 anos diagnosticado com astrocitoma de grau II de acordo com a classificação da OMS de 2021. O tumor exibiu uma mutação IDH1 (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) e uma mutação TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), juntamente com a ausência de coloração ATRX. Não foram detectadas mutações nos sítios de ligação Ets/TCF (C250T e C228T) do gene TERT. (A) A superfície de trabalho compreende uma bolsa fria, proporcionando um ambiente que minimiza a degradação da amostra e mantém a viabilidade dos componentes biológicos. Esses cuidados são importantes para preservar a qualidade e a integridade do tecido. (B) O transporte da amostra do hospital para o laboratório deve ser feito no gelo. (C) Fragmento de ressecção do tumor. As setas mostram as peças mais adequadas para a cultura. (D) A dissecção do tumor é realizada para selecionar a parte mais relevante a ser picada. Em nossa experiência, a substância branca geralmente tem menos probabilidade de gerar explantes bem-sucedidos. (E) Fragmentos tumorais de aproximadamente 1-2 mm³ de diâmetro em tubo de 15 mL após serem picados mecanicamente com tesoura. (F) O número de pedaços de tumor necessários para a semeadura adequada é mostrado para poços em uma placa de 24 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Criopreservação e descongelamento de tumores picados

NOTA: A criopreservação garante backup em caso de contaminação e perda de culturas de explantes ou para processar as amostras tumorais posteriormente.

1. Criopreservação: Prepare o meio de congelamento (solução de DMSO a 20% v/v) adicionando 2 mL de DMSO a 8 mL de meio de cultura celular.
2. Combine 1 volume da suspensão tumoral picada com um volume igual do meio de congelamento DMSO a 20% para obter uma concentração final de 10% de DMSO. Pipete cuidadosamente a mistura para cima e para baixo para garantir uma mistura completa e, em seguida, dispense aproximadamente 1 mL em criogeniais.
3. Transfira rapidamente os criogenianos para um recipiente criogênico para redução gradual da temperatura, seguido de incubação durante a noite a -80 °C antes do armazenamento final em nitrogênio líquido.
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada imediatamente após as células serem colocadas no meio de congelamento, pois certos crioprotetores, como o DMSO, podem ser prejudiciais se as células forem expostas a eles em temperatura ambiente por mais tempo do que o necessário.
4. Descongelamento: Remova os criogeniais do nitrogênio líquido e coloque-os imediatamente em banho-maria a 37 °C até que cerca de 80% das células tenham descongelado.
5. Para remover o DMSO, pipete rapidamente a suspensão em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de PBS 1x pré-aquecido e centrifugue a 300 × g por 5 min.
6. Remova o sobrenadante e repita a lavagem com 1X PBS seguido de centrifugação (etapa 4.5). Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e adicione a quantidade apropriada de meio para transferir para uma placa de 24 poços de PDL-Laminina pré-revestida e coloque na incubadora.
7. Após 24 h, verifique se as células estão ligadas. Após alguns dias, remova os fragmentos não aderentes substituindo os meios de cultura.

5. Passagem da cultura

NOTA: Uma vez estabelecidos, os explantes podem ser usados para videomicroscopia ou imunocoloração. Alternativamente, se as células tumorais migraram para fora do explante e parecem saudáveis, o explante pode ser passado por dissociação enzimática e semeado novamente em poços para experimentação posterior. No entanto, é importante observar que este protocolo não foi projetado para passagens repetidas. Normalmente, apenas uma única passagem pode ser tentada antes que as células tumorais se tornem senescentes ou morram. Nem todas as culturas de explante resultarão em uma passagem bem-sucedida.

1. Para a passagem, remova o meio antigo, enxágue com 1X PBS e adicione (125 μL) 0,05% de tripsina-EDTA aos poços e incube por 3-4 min a 37 °C, seguido pela adição de 6,5 μL de inibidor de tripsina, 12 μL de 20 mM CaCl₂ (diluição final para 2mM) e 1 μL de DNAse I.
   NOTA: O tempo de incubação necessário para a dissociação pode variar dependendo da cultura. É importante verificar se as células estão descoladas após pelo menos 3 min. Normalmente, o explante pode não ser totalmente dissociado em uma suspensão unicelular, e pequenos aglomerados são frequentemente retidos, o que pode gerar novas culturas de explante.
2. Com um p1000 ajustado em 500-600 μL, lave suavemente para desagregar os explantes. Evite a formação de bolhas.
3. Adicione 5 mL de 1x PBS e centrifugue por 5 min a 300 × g. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em meio fresco pré-aquecido e contar para a semeadura.
4. Identifique culturas com potencial para gerar linhagens celulares observando as células em divisão sob um microscópio de contraste de fase. Essas células em divisão normalmente têm uma morfologia arredondada e cromossomos visíveis, conforme mostrado em Figura 2A.

Resultados

Após alguns dias, alguns fragmentos tumorais aderirão às superfícies dos poços, iniciando o crescimento das células dos explantes. O tempo entre o plaqueamento inicial e o aparecimento das células tumorais em crescimento é diferente de amostra para amostra. As culturas iniciais geralmente contêm detritos celulares substanciais, dificultando a avaliação da presença de células viáveis. Consequentemente, a cultura deve ser mantida por um período mínimo de 4 semanas. Uma vez que as células começam a crescer, células alongada...

Discussão

O desenvolvimento de modelos in vitro e pré-clínicos para gliomas de baixo grau com mutação IDH1 é particularmente desafiador devido ao crescimento lento desses tumores e à complexidade de replicar as extensas alterações genômicas e epigenômicas causadas pela mutação IDH. Além disso, essas células tumorais infiltrativas interagem ativamente com as células circundantes, incluindo células imunológicas, endoteliais, gliais e neuronais, potencialmente dependendo delas para sobreviver. Essa interação complexa é difícil de rep...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-ASCL1	BD Pharmingen™	Diluição 556604	1:500
Anti-ATRX	Sigma-Aldrich		HPA001906 Diluição 1:100
Anti-CD68	Agilent	M081401-2	Diluição 1:500
Anti-GFAP	Aves Labs		AB_2313547 Diluição 1:500
Anti-IBA1	Fujifilm Wako Anticorpos	019-19741	Dilituion 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) camundongo Anticorpo monoclonal	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Pharmingen™	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Systems®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Diluição 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	Diluição EPR14335-78	1:100
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Albumina de Soro Bovino (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacina HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Recipiente de Congelamento de Células, para 12 x Frascos Criogênicos de 1 mL ou 2 mL
Lamínula de cobertura Ø, 13 mm	Karl Hecht™ Assistente™
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, sem glutamina	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Tamponado com Fosfato Salino (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning®
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning	®	353047	Placa de Cultura de Células Multipoços tratada com TC, com Tampa, Estéril
Fungin	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
Humano EGF	PeproTech	AF-100-15-1MG
Humano FGF-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Suplemento (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Soro acrodisc 37 mm filtro de seringa com GF/0.2 µ m Supor	PALL Corporation	4525
Inibidor de tripsina	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 microscópio	Zeiss		microscópio de epifluorescência de campo amplo reto