Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Resumo

A optogenética oferece o potencial de imitar o controle espaço-temporal complexo da atividade enzimática até uma resolução subcelular. No entanto, a maioria das abordagens optogenéticas geralmente enfrenta desafios significativos na integração de vários recursos em uma única ferramenta aplicável a uma ampla gama de proteínas-alvo. Alcançar um controle preciso sobre a cinética ON/OFF, garantir o mínimo de vazamento no escuro e demonstrar desempenho eficiente em células de mamíferos com precisão subcelular são alguns dos desafios mais comuns enfrentados neste campo. Uma solução promissora está na aplicação de domínios sensíveis à luz racionalmente projetados para controlar alostericamente a atividade da proteína. Usando essa estratégia, geramos um método optogenético combinando todas as características desejadas. A abordagem envolve a incorporação do módulo de comutação alostérica regulado por luz (LightR) na proteína-alvo para regular a atividade enzimática usando luz azul (465 nm). O domínio LightR é gerado pela ligação de dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD), criando um grampo sensível à luz que pode ser incorporado a um pequeno loop flexível dentro do domínio catalítico de uma enzima. Em seu estado escuro, o grampo LightR está aberto, distorcendo assim o domínio catalítico da enzima e inativando-o. Após a exposição à luz azul, o domínio LightR fecha e restaura a estrutura e a atividade enzimática do domínio catalítico. Neste manuscrito, discutimos estratégias de design para gerar uma proteína quinase regulada por luz e demonstrar seu controle por luz azul, reversibilidade, cinética e regulação precisa no nível subcelular, permitindo uma precisão espaço-temporal apertada. Utilizando a tirosina quinase Src como modelo, apresentamos um protocolo para regular efetivamente a atividade da quinase LightR-Src. Também demonstramos a aplicabilidade do LightR em diferentes classes de enzimas, expandindo a utilidade do sistema de ferramentas na abordagem de questões mecanicistas de vias de sinalização em diferentes doenças.

Introdução

A capacidade da célula de interpretar sinais externos e convertê-los em respostas específicas em contextos fisiológicos ou patológicos é dirigida por grupos dedicados de proteínas. A contribuição de qualquer proteína para essas respostas complexas é frequentemente definida por sua localização subcelular, nível de expressão e tempo de ativação transitória, sustentada ou oscilatória. Dissecar o papel desses parâmetros individuais na regulação da sinalização exige métodos capazes de replicar o intrincado controle espaço-temporal da atividade proteica no nível subcelular. Técnicas tradicionais, como manipulação genética e inibidores de pequenas moléculas, ficam aquém nesse aspecto. Em contraste, as técnicas optogenéticas prometem o potencial para a dissecação de processos biológicos manipulando ou imitando processos fisiológicos e patológicos. No entanto, as ferramentas atuais geralmente carecem de ampla aplicabilidade ou controle subcelular. Várias estratégias existentes alcançam uma regulação rígida da localização e interações de proteínas; mas não têm controle direto sobre a atividade enzimática 1,2,3,4. Outros permitem a regulação da atividade enzimática, mas podem não ter controle subcelular ou ter aplicabilidade limitada em diferentes classes de enzimas 5,6,7,8,9. Neste artigo de protocolo, descrevemos um novo método de engenharia de proteínas que combina as vantagens da optogenética em uma ferramenta: regulação temporal rígida, cinética sintonizável, controle subcelular e ampla aplicabilidade enzimática¹⁰. Projetamos um domínio regulado por luz (LightR) que funciona como um interruptor alostérico quando inserido na proteína alvo de interesse. Essa estratégia permite um controle espaço-temporal rigoroso da ativação e desativação de uma proteína de interesse em células vivas.

Aqui, é discutida a estratégia de design e aplicação da ferramenta optogenética LightR em várias classes de enzimas. Este estudo oferece um protocolo passo a passo para o desenvolvimento, caracterização e aplicação da tirosina quinase regulada por luz Src (LightR-Src). O estudo demonstra ainda a sintonia da cinética de inativação do interruptor LightR. O interruptor LightR de inativação lenta pode manter a atividade enzimática com frequência reduzida de iluminação, enquanto a versão de ciclo rápido, FastLightR, requer iluminação mais frequente para ativação, mas mostra inativação rápida quando a iluminação é desligada. A ativação/inativação de FastLightR-Src em células vivas induz ciclos de espalhamento e retração celular. A disseminação celular induzida por FastLightR-Src concorda com o papel fisiológico da Src quinase ^11,12. Devido à cinética de inativação rápida, o FastLightR-Src também pode ser regulado em nível subcelular, resultando na estimulação de saliências locais e polarização celular. Para demonstrar a aplicabilidade da ferramenta LightR a outros tipos de enzimas, orientamos brevemente os leitores através de um sucesso semelhante com a quinase regulada por luz projetada bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) e uma DNA recombinase Cre específica do local (LightR-Cre). No geral, essa abordagem tem o potencial de avançar nossa compreensão de vias de sinalização complexas que moldam a fisiopatologia de diversas doenças.

Protocolo

1. Projeto e desenvolvimento do LightR (Figura 1)

1. Planejamento estratégico
   NOTA: O domínio LightR é composto por dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD) conectados em tandem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Os VVDs homodimerizam na presença de luz, e tal dimerização envolve uma mudança conformacional que traz o terminal N de um monômero VVD próximo ao terminal C de outro monômero VVD (Figura 1A). A conexão de dois domínios VVD com um vinculador flexível cria um domínio semelhante a uma pinça que será aberto no escuro e fechado após a iluminação com luz azul. A integração desse grampo no domínio catalítico de uma enzima permite a regulação da atividade mediada pela luz. Na escuridão, o grampo aberto distorce o domínio, desativando a enzima; A iluminação com a luz azul faz com que o grampo feche, restaurando a atividade da enzima (Figura 1B). Este conceito pode ser aplicado a enzimas de várias famílias, incluindo proteínas quinases e DNA recombinases¹⁰ (Figura 1C).
   1. Projeto de LightR
      1. Para conectar duas moléculas de VVD, use um ligante flexível de 22 aminoácidos (GGS)4G(GGS)3 entre cada monômero.
         NOTA: O ligante fornece flexibilidade e comprimento suficientes para acomodar a associação e dissociação de monômeros VVD.
      2. Adicione os ligantes GPGGSGG e GSGGPG aos terminais N e C do domínio LightR, respectivamente.
         NOTA: O comprimento e a composição dos ligantes podem precisar ser ajustados para uma proteína específica. Ligantes GSG mais curtos e Gly simples são usados rotineiramente quando é necessária uma regulamentação mais rígida. O tamanho do loop de inserção e sua proximidade com resíduos catalíticos também influenciarão a faixa dinâmica de regulação. Loops mais curtos são mais propensos a fornecer uma regulação mais rígida da atividade catalítica, mas podem resultar em menor atividade após a iluminação. A sequência do domínio LightR é fornecida na Tabela Suplementar 1.
   2. Inserção de LightR
      NOTA: Um local de inserção LightR adequado permitirá uma regulação rígida da função de domínio alvo sem bloquear estericamente suas interações ou causar mudanças estruturais irreversíveis que afetarão seu papel biológico. Uma estrutura cristalina da proteína alvo é um guia ideal na identificação de tais regiões de alça flexíveis para a inserção de LightR. Se necessário, a estrutura cristalina de um homólogo próximo pode ser suficiente. Alguns critérios gerais a serem considerados são fornecidos abaixo.
      1. Certifique-se de que a alça de inserção esteja estruturalmente acoplada aos elementos catalíticos críticos da enzima. Certifique-se de que a alça de inserção selecionada não seja um local de ligação existente para a proteína e que a inserção de LightR não interrompa potencialmente nenhuma interação funcional devido a efeitos estéricos.
      2. Como estratégia inicial, substitua um aminoácido no loop de inserção ao inserir o LightR. Direcione o meio da alça de inserção contendo um aminoácido polar ou pequeno (por exemplo, Glu, Arg, Lys, Gly) exposto ao solvente e não envolvido em interações intramoleculares.
         NOTA: Quando uma reposição de aminoácidos não resulta em uma proteína funcional, a otimização da construção LightR exigirá a substituição de vários aminoácidos ou de todo o loop de inserção. Avalie a funcionalidade de vários locais de inserção para LightR dentro do loop definido.
      3. Certifique-se de que a enzima alvo opere independentemente da regulação endógena. Consiga isso usando uma versão mutante constitutivamente ativa da enzima para o molde de inserção.
         NOTA: Enzimas do tipo selvagem também podem ser usadas para gerar construções LightR, mas isso pode resultar em um sistema controlado por AND que será regulado por mecanismos endógenos e luz.
      4. Controles positivos e negativos são vitais para a análise da atividade da enzima LightR. Use mutantes constitutivamente ativos de proteínas endógenas como controles positivos e versões mutantes cataliticamente inativas da enzima LightR alvo como controles negativos.
         NOTA: Ao selecionar mutações inativadoras, é crucial garantir que a mutação esteja suficientemente espaçada do local de inserção do LightR para evitar interromper a irreversibilidade do dobramento da enzima LightR. Com base nos critérios acima, o local de inserção LightR na quinase Src é selecionado em uma região de alça flexível que é estruturalmente acoplada ao motivo GXGXXG altamente conservado na região de alça G de ligação a ATP / rica em glicina por meio de uma fita beta. É importante ressaltar que ele está posicionado longe da bolsa de ligação do ATP e da região de ligação do substrato^10,17 (Figura 1C (i)).
         NOTA: Devido à homologia estrutural entre quinases, o local de inserção LightR em bRaf é selecionado no mesmo loop estrutural que o local de inserção em Src (Figura 1C (ii)).
         NOTA: Com base nos princípios declarados na Seção 1.1.2., o local de inserção do LightR na Cre recombinase, uma não quinase, é escolhido em uma das alças flexíveis distantes do núcleo catalítico, ou seja, o local de ligação ao DNA. No entanto, a alça de inserção ainda está estruturalmente acoplada a resíduos catalíticos críticos dentro do domínio de ligação ao DNA por meio de uma α-hélice para garantir o sucesso da funcionalidade LightR-Cre (Figura 1C (iii)). Todos os locais de inserção com controles positivos e negativos para diferentes enzimas descritas no protocolo atual são detalhados na Tabela Suplementar 2.
   3. Desenvolvimento do FastLightR.
      NOTA: A introdução da mutação I85V em ambos os VVDs no LightR permite uma dinâmica de ativação-inativação mais rápida, atribuída à rápida conversão do mutante para o estado escuro ^18,19. A geração de FastLightR-Src e FastLightR-bRaf com cinética de inativação rápida permite um controle temporal rígido de ativação e inativação. Ele permite alcançar a regulação subcelular de LightR-Src em células vivas.
      NOTA: A atividade da cre recombinase resulta em recombinação irreversível do DNA; portanto, as propriedades de reversibilidade do LightR não são aplicáveis.
      NOTA: Para simplificar a detecção da construção LightR, uma proteína fluorescente ou qualquer outra etiqueta adequada pode ser anexada ao terminal N ou C da proteína alvo. Este estudo usou mCherry-myc para LightR-Src, Venus para LightR-bRaf e miRFP670 para LightR-Cre recombinase.
2. Estratégia de clonagem
   NOTA: A abordagem de clonagem, ao contrário das abordagens tradicionais, é baseada na mutagênese dirigida ao local que não depende de locais de restrição específicos^10,20.
   1. Geração de um "Megaprimer"
      1. Otimize os genes LightR para garantir a expressão estável das duas sequências de DNA VVD em tandem de origem fúngica em células de mamíferos e para tornar as sequências o mais diferentes possível para clonagem sem erros usando PCR. Para executar a otimização do códon, siga as etapas 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Alinhe a sequência de aminoácidos de VVDs e os ligantes selecionados lado a lado para criar o mapa de sequência teórica de LightR.
      3. Cole a sequência em qualquer plataforma de otimização de códons online que utilize um algoritmo avançado para otimização de códons para determinar a melhor opção de sequência com complexidade mínima. Certifique-se de que o organismo alvo esteja selecionado, o quadro de leitura seja mantido e as sequências VVD sejam selecionadas para otimização.
      4. Obtenha o DNA LightR como um fragmento sintetizado personalizado (consulte a Tabela Suplementar 1) ou de uma construção LightR publicada anteriormente¹⁰.
      5. Amplifique o gene LightR para gerar "Megaprimer" usando a estratégia²⁰ descrita anteriormente descrita na Figura 1D. Sintetize o LightR "Megaprimer" via PCR seguindo as recomendações do fabricante para a DNA polimerase específica e usando a seguinte mistura de reação de PCR:
         5x tampão compatível com DNA polimerase: 10 μL
         100 μM Megaprimer direto: 0,5 μL
         100 μM Megaprimer reverso: 0,5 μL
         Mistura dNTP de 10 nM: 2 μL
         DNA polimerase (2000 unidades/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng DNA do molde: 1 μL
         Água de grau PCR: 35 μL
         NOTA: Aqui, são usadas DNA polimerase de partida a quente de alta fidelidade com temperaturas universais de recozimento de primer.
      6. Separe o megaprimer resultante por eletroforese em gel de agarose. O produto terá aproximadamente 1000 nucleotídeos de comprimento. Extirpar o megaprimer do gel de agarose e purificar com um kit de extracção em gel, seguindo as recomendações do fabricante ou utilizando uma técnica análoga.
   2. Inserção do gene LightR usando mutagênese dirigida ao local: Insira o LightR, substituindo um aminoácido desejado ou um pedaço de aminoácidos. O plasmídeo modelo será aquele em que o domínio LightR é inserido. Efectuar a reacção PCR como descrito anteriormente²⁰ utilizando a seguinte mistura.
      5x tampão compatível com DNA polimerase: 5 μL
      Mistura dNTP de 10 nM: 1 μL
      DNA polimerase (2000 unidades/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng DNA do modelo alvo: 1 μL
      Megaprimer extraído (massa calculada): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Água de grau de PCR: 2,5 μL
      NOTA: Massa do Megaprimer (ng) = razão molar desejada entre inserção / vetor x massa do vetor x razão entre a inserção e os comprimentos do vetor. A proporção molar de inserção / vetor desejada usada é 3/1.
   3. Após a conclusão da reação de PCR, adicione 1 μL de enzima DpnI (2000 unidades / mL) para digerir seletivamente apenas o DNA excedente e metilado e incubar a mistura a 37 ° C por 1-1,5 h. Isso aumentará significativamente o rendimento da construção modificada.
   4. Transforme 1-2 μL da reação de PCR em células competentes para DH5α seguindo os protocolos do fabricante.
   5. Bactérias transformadas em placa em placa de ágar Luria Broth (LB) com antibiótico apropriado para seleção. Incubar a placa a 37 °C durante a noite ou à temperatura ambiente (RT; 25-30 °C) durante 72 h.
      NOTA: As placas LB com colônias cultivadas nelas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 mês, e o protocolo pode ser pausado.
   6. PCR de triagem de colônia
      1. Para triagem de colônias baseada em PCR, projete primers que recozenem na inserção LightR e direcionem o DNA para gerar aproximadamente fragmentos de 400-700 pb.
      2. Adicione uma pequena quantidade de uma colônia da placa LB à mistura de PCR fornecida abaixo e prossiga para a termociclagem seguindo as recomendações do fabricante para a DNA polimerase específica.
         2x Taq RED Master Mix: 5 μL
         Água de grau PCR: 5 μL
         100 μM Primer direto: 0,5 μL
         100 μM Primer reverso: 0,5 μL
      3. Verifique se há colônias positivas por eletroforese em gel de agarose.
      4. Escolha as colônias que geraram o tamanho desejado do produto de PCR e inocule-as individualmente em 3 mL de caldo LB com o antibiótico, combinando a resistência ao antibiótico na estrutura do plasmídeo. Em seguida, incubar e agitar a 37 °C durante a noite.
      5. Extrair o ADN do plasmídeo da cultura líquida seguindo as instruções do fabricante do kit de purificação do plasmídeo para extracção do ADN do plasmídeo e verificar a presença da inserção por sequenciação.
         NOTA: Os primers de clonagem estão resumidos na Tabela Suplementar 3.

2. Plaqueamento celular e análise bioquímica da atividade da enzima LightR (Figura 2A)

1. Para análise bioquímica de LightR-quinases (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), coloque 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultura de células de 3,5 cm para cada grupo experimental. Consulte a Tabela Suplementar 4.
2. Incubar as células a 37 °C e 5 % de CO₂ durante 16-18 h.
3. No dia seguinte, transfecte as células com a construção de DNA selecionada, usando um reagente de transfecção adequado seguindo as recomendações do fabricante (Tabela Suplementar 4).
   NOTA: O reagente de transfecção ideal dependerá da construção, vetor e tipo de células usadas. Este estudo usou 2 μg de DNA em uma placa de 3,5 cm usando um reagente de transfecção. Testes empíricos devem ser feitos para determinar o reagente de transfecção ideal. Como as construções transfectadas expressarão proteínas reguladas pela luz azul, todas as etapas subsequentes do manuseio das células transfectadas devem ser realizadas sob luz vermelha. Embrulhe as placas com células transfectadas com papel alumínio antes de colocá-las na incubadora para evitar iluminação acidental.
4. Após 16-18 h de transfecção, exponha as células à luz azul¹⁰. Para fazer isso, coloque um sistema de lâmpada de painel de diodo emissor de luz (LED) de 465 nm na incubadora de cultura de tecidos. Coloque um painel de plexiglass perfurado 10 cm acima da lâmpada para obter a iluminação desejada de 3 mW/cm² (Suplementar File 1). Um painel perfurado é necessário para manter a circulação de ar ininterrupta na incubadora. Ilumine as células pelo período desejado.
5. Para ativação de LightR-Src e LightR-bRaf, use iluminação contínua. Para iluminação contínua, ligue e desligue o painel de LED manualmente.
6. Para manter o ciclo de ativação/inativação do FastLightR Src, use ciclos ON/OFF controlados manualmente ou por um microcontrolador.
   NOTA: Vários kits de ferramentas de software que fornecem um Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) para escrever e carregar o código necessário podem ser utilizados. Esses kits de ferramentas suportam programação C/C++ e oferecem acesso de entrada/saída de uso geral (GPIO), o que é essencial para controlar a iluminação pulsada. Uma descrição detalhada dos protocolos e códigos usados para esses fins é descrita no Arquivo Suplementar 1.
7. No final dos respectivos pontos de tempo do experimento (Tabela Suplementar 4), colha as células sob luzes vermelhas seguras. Aspire o meio e lave as células com PBS frio.
8. Para isolar a proteína, lise as células com 500 μL de tampão de amostra 2x Laemmli suplementado com 5% v / v 2-mercaptoetanol. Incubar o lisado a 100 °C durante 5 min. Analise os lisados celulares por eletroforese de gel de proteína e Western blotting²¹.
   NOTA: A composição do tampão 2x Laemmli é a seguinte: Para 500 mL: 5,18 g de Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS a 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8.
9. Avalie a atividade de LightR-Src avaliando o nível de fosforilação de p130cas endógena em Tyr249 e paxilina em TyrY118^22,23 (Figura 2). Avalie a atividade de LightR-bRaf avaliando o nível de fosforilação de MEK1 em Ser217/221 e ERK1/2 em TyrY202/204^24,25.

3. Análise funcional da atividade do LightR-Cre

1. Para a análise funcional da atividade do LightR-Cre, colocar 1 x 10⁶ células LinXE por placa de cultura de células de 3,5 cm. Incubar células a 37 °C e 5% de CO₂ por 16-18 h.
2. Transfectar as células seguindo o protocolo descrito na seção 2, Figura 2A e Tabela Suplementar 5. Co-transfecta um total de 2 μg de DNA, com uma proporção de 1:9 de LightR-Cre-iRFP670 e um plasmídeo repórter Floxed-STOP-mCherry².
3. Após 16-18 h após a transfecção, ilumine as células. Uma ativação eficiente do LightR-Cre precisa de iluminação prolongada. Portanto, para evitar fototoxicidade, use iluminação pulsada por 8 h com ciclos de 2 s ON e 20 s OFF utilizando um painel LED de 465 nm lamp sistema controlado por um microcontrolador conforme detalhado na seção 2 e Suplementar File 1.
4. Realize imagens usando microscopia de epifluorescência com uma objetiva de ar de 20x. Para visualização de LightR-Cre-iRFP670, use o conjunto de filtros Cy5 e para visualização de mCherry da expressão Floxed-mCherry, use o conjunto de filtros RFP.
   NOTA: Para imagens, é usado um microscópio de epifluorescência equipado com cubos de luz Cy5/RFP.

4. Preparação de amostras para imagens de células vivas

1. Placa 2 x 10⁵ células HeLa por placa de cultura de tecidos de 35 mm em meios de cultura de células e incubar durante 2 h a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Uma vez que as células tenham se ligado e a confluência seja de aproximadamente 60% -70%, co-transfecte as células HeLa com uma das seguintes misturas: (i) 0,85 μg de FastLightR-Src-mCherry-myc / 0,15 μg de Stargazin-iRFP, ou (ii) 0,75 μg de FastLightR-bRaf-Venus / 0,25 μg de mCherry-ERK2
   NOTA: Nos experimentos FastLightR-Src, o Stargazin-iRFP é usado para marcar a membrana plasmática para análise de espalhamento celular. Se uma expressão mais alta de FastLightR-Src for desejada, stargazin-iRFP pode ser omitido e 1 μg de FastLightR-Src pode ser usado. Nesses casos, um corante de membrana deve ser usado para visualizar as células. As colorações da membrana plasmática são usadas rotineiramente para rotular as membranas celulares.
3. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a iluminação acidental das células e incube por 16-18 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
4. Conclua todas as etapas a seguir sob iluminação de luz vermelha para evitar a ativação inadvertida das construções. A exposição à luz branca induzirá a ativação de LightR-quinases e poderá afetar os resultados subsequentes.
5. No mesmo dia, cubra 3 lamínulas redondas de vidro (25 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura) durante a noite com 5 mg / L de fibronectina em PBS a 37 ° C.
6. Enxágue as lamínulas com PBS 16-18 h após a transfecção e coloque ~ 1 x 10⁵ células HeLa transfectadas em cada lamínula. Incubar em meios de cultura celular por 2 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
   NOTA: A baixa densidade de semeadura é necessária para garantir que as células no campo de visão não se toquem.
7. Prepare o meio de imagem adicionando FBS ao meio de imagem L-15 da Levobitz até uma concentração final de 5%. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm e aquecê-la a 37 °C.
8. Pré-aqueça o óleo mineral a 37 °C.
9. Lave as lamínulas contendo as células com PBS duas vezes. Se estiver usando um corante de membrana, manche as células seguindo as instruções do fabricante antes de lavar as lamínulas.
10. Coloque cuidadosamente a lamínula em uma câmara de imagem de células vivas. Adicione 1 mL de meio de imagem L-15 à câmara.
11. Adicione 1 mL de óleo mineral em cima do meio para evitar a evaporação durante o processo de imagem.
12. Manter a câmara protegida da luz a 37 °C até estar preparada para a imagem.

5. Ativação global e imagem do FastLightR-Src (Figura 3)

1. Conecte um anel de luz de microscopia LED azul ao condensador do microscópio, posicionando-o aproximadamente 1.5 cm acima do suporte de amostra. Conecte o relé de controle AC/DC do anel de luz ao computador do microscópio.
   NOTA: Para os experimentos deste estudo, a iluminação foi controlada por meio de uma interface Transistor-Transistor Logic (TTL) por meio do software de imagem. A iluminação epifluorescente também pode ser usada para ativar globalmente as construções LightR se uma fonte de iluminação externa não estiver disponível. Os comprimentos de onda de excitação GFP, como o filtro de excitação de 490/20 nm, são eficazes na ativação do LightR.
2. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 ° C e selecione células que expressam FastLightR-Src-mCherry e Stargazin-iRFP (Figura 3B) ou FastLightR-bRaf-Venus e mCherry ERK-2 (Figura 5B).
3. Para o estudo de iluminação global e experimentos de imagem, use objetivas de alto desempenho compatíveis com microscópio (40x) com correção apocromática, correção de campo plano e alta abertura numérica.
   1. Para estudos baseados em iluminação global de Src quinase, use filtros de excitação de 561/10 nm e emissão de 595/40 nm para visualizar o FastLightR-Src-mCherry e use a excitação de 640/20 nm e o filtro de emissão de 655LP para visualizar stargazin-iRFP.
   2. Para estudos baseados em iluminação global de bRaf quinase, use filtros de excitação de 514/10 nm e emissão de 540/21 nm para visualizar o FastLightR-bRaf-Venus e use filtros de excitação de 561/10 nm e emissão de 595/40 nm para visualizar o mCherry-ERK-2.
   3. Use um espelho policrônico multibanda em todos os canais de imagem fluorescente.
4. Dependendo das condições experimentais, considere as seguintes recomendações.
   1. Visualize as células por pelo menos 10 minutos antes da iluminação para estabelecer uma atividade de linha de base das células.
      NOTA: Esta linha de base é necessária para determinar se a ativação da quinase FastLightR por iluminação induz alguma alteração no comportamento celular ou na localização da proteína. Pode-se também realizar períodos mais longos de imagem basal para fornecer maior significância estatística.
   2. Devido à rápida cinética de inativação de FastLightRs, incluir muitas células para imagens pode causar a desativação de Src / bRaf entre as posições do estágio e atenuar sua resposta. Para evitar esse erro, crie uma imagem de 4 células/min enquanto analisa a atividade do FastLightR-Kinase no protocolo descrito e crie uma imagem de cada célula selecionada a cada minuto por um total de 110 min (Arquivo Suplementar 2).
   3. Use iluminação pulsada em vez de iluminação contínua para reduzir os potenciais efeitos fototóxicos da luz azul. A iluminação por 12 s para cada uma das 4 células/min é eficaz (Arquivo Suplementar 2, Figura 3A).
      NOTA: Os ciclos de iluminação devem ser determinados empiricamente para diferentes construções e tipos de fontes de iluminação.
   4. Desligue a iluminação durante a imagem celular para evitar sangramento nos canais fluorescentes.
      NOTA: A imagem de muitas células ao mesmo tempo diminuirá o tempo total de iluminação disponível para a amostra, levando a uma resposta atenuada por ativação insuficiente.
5. Após a geração de imagens, salve os filmes como um arquivo . Formato de arquivo de pilha TIF para análise.
   NOTA: Devido à iluminação menos uniforme com epifluorescência GFP em comparação com a luz do anel, os experimentos usando epifluorescência GFP exigirão iluminação mais frequente. Isso resulta em menos células sendo fotografadas por experimento.

6. Ativação subcelular e imagem de FastLightR-Src (Figura 4)

1. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 ° C e selecione uma única célula expressando FastLightR-Src-mCherry e Stargazin-iRFP.
2. Selecione as regiões específicas (ROI) dentro da célula a ser iluminada. Este estudo escolhe uma pequena área na periferia da célula selecionada.
   NOTA: Para iluminação local, é usado um laser de 445 nm focado por um módulo TIRF no modo FRAP ou dispositivo de micro-espelho controlado por meio da interface TTL por meio do software de imagem. Qualquer sistema de iluminação padronizado funcionará para esses experimentos. Se for utilizado um sistema baseado em varrimento, determine a intensidade e homogeneidade do laser para uma ativação suficiente sem danificar a célula.
3. Crie imagens da célula selecionada a cada minuto por 20 minutos no estado basal antes da iluminação, 50 minutos durante a iluminação local e 20 minutos após a ativação por um total de 90 minutos (Arquivo Suplementar 2).
4. Para ativação e desativação, forneça um período de tempo adequado para a proteína-alvo para permitir a desativação completa da proteína LightR. Para FastLightR-Src, permita pelo menos 10 minutos de desativação para que a atividade residual seja removida e permita 20 minutos de desativação na configuração experimental demonstrada para iluminação local.
5. Após a geração de imagens, salve os filmes como . Formato de arquivo de pilha TIF para análise.

7. Análise de espalhamento celular

1. Prepare imagens para processamento e análise de dados. Certifique-se de que as imagens estejam em um arquivo . Formato de pilha TIF. Salve-os diretamente do software de imagem ou converta-os usando um programa de código aberto.
2. Baixe o pacote de script CellGeo dos arquivos compactados de dados suplementares²⁶.
   NOTA: O pacote CellGeo contém vários scripts diferentes. Escolha o pacote desejado na lista com base no tipo de análise, conforme abordado nas seções de protocolo 7 a 9.
3. Abra e execute o script intitulado MovThresh para criar uma máscara da célula.
   1. Selecione Arquivo > Importação (.tif) e selecione as imagens Stargazin-iRFP das células.
   2. Percorra os quadros usando a barra de rolagem no canto inferior esquerdo. Se o limite sugerido for apropriado, vá para a etapa 7.4.
   3. Se o limite sugerido não estiver alinhado com o comportamento da célula, escolha curvas suavizadas ou personalizadas abaixo de Seleção de curva. Crie a curva personalizada rolando pelos quadros e ajustando o limite no lado direito da janela.
   4. Clique em Re-Limite.
   5. Clique em Arquivo > Salvar como máscaras, Altere o nome do arquivo e salve-o usando a opção Salvar como .
4. Abra o arquivo de pilha recém-criado em um programa de análise de imagem de código aberto.
5. Selecione Imagem > Ajustar > limite > Aplicar.
6. Selecione Analisar > Analisar partículas > Verificar resultados da exibição -> OK.
7. Calcule a mudança na área de cada célula dividindo a área a qualquer momento pela área média da mesma célula antes da irradiação da luz azul.
8. Plote a mudança de área como um gráfico de linhas ou barras.
9. Calcule o valor médio e os intervalos de confiança de 90% para cada ponto de tempo de todas as células tratadas nas mesmas condições.

8. Análise da dinâmica da borda celular

1. Prepare os arquivos de pilha usando as etapas descritas na seção 7 do protocolo.
2. Abra e execute o script intitulado ProActive.
   1. Selecione Arquivo > Importar > Máscaras (.tif) e selecione a máscara criada por meio do script MovThresh .
   2. Selecione a atividade de interesse em analisar no canto inferior direito (Protrusivo, Retrátil ou Total).
   3. Selecione o tipo de normalização. Normalmente, a normalização de área é usada para essas análises.
   4. Selecione o quadro de referência inicial usando o controle deslizante à esquerda. O controle deslizante de atraso à direita determinará o intervalo de tempo entre dois pontos de tempo usados para medir a área ganha e perdida pela célula.
   5. Se o quadro selecionado e o número de atraso forem aditivamente maiores do que o número de quadros no filme, a imagem de visualização não será exibida. Redefina esses valores para serem menores que o número total de quadros.
3. Modifique o limite de protrusão ou retração marcando a caixa Curva suave na seção Resultados . Isso calcula a média dos limites em uma janela específica, o que pode resolver problemas em que pequenas flutuações são detectadas como atividade.
4. Selecione Executar o intervalo para calcular a atividade ao longo do tempo especificado pelos controles deslizantes de quadro e atraso.
5. Salve os dados numéricos selecionando Arquivo > Salvar como > Resultados(.mat) e use-os para determinar a atividade protrusiva ou retrativa média.
6. Determine os intervalos de confiança de 90% para cada ponto de tempo.
   NOTA: Isso salvará uma matriz de vários valores diferentes. O arquivo de texto "Como usar o ProActive" incluído no script fornece uma descrição detalhada do que cada valor representa e como eles foram determinados²⁶.
7. Salve a representação visual da atividade selecionando Arquivo > Salvar como > Imagens (.tif).

9. Análise de deslocamento do centróide

1. Para análise de deslocamento do centróide, use qualquer software que possa determinar as coordenadas do centróide.
2. No software de análise, abra a pilha de imagens mascaradas da célula de interesse, conforme descrito na seção 7 do protocolo.
3. Selecione Medir > Análise de Morfometria Integrada e, em seguida, clique em Preferências > Desenhar Marca de Centroide > Verificar e, em seguida, selecione Medir.
   1. Registre as coordenadas do centróide antes do movimento (A).
   2. Registre as coordenadas do centróide no final do experimento (B).
   3. Registre as coordenadas para o centro do padrão de iluminação (C).
4. Agora que os três pontos foram coletados, determine o ângulo BAC⁸. θ₁ corresponde ao ângulo ABC e θ₂ corresponde ao ângulo CBA (Figura 4Cii). Faça isso usando a seguinte equação:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   NOTA: Uma calculadora pode ser usada para determinar os ângulos e distâncias diretamente das coordenadas para facilitar o uso.
5. Determine o deslocamento do centróide multiplicando a distância percorrida pelo centróide da célula em pixels pelo fator de conversão em que 1 pixel é igual a 0,4 μm. A conversão específica de pixels para distância dependerá da ampliação e da configuração da câmera no sistema.
6. Uma vez que o ângulo de deslocamento e a distância do centróide tenham sido determinados, abra um software gráfico capaz de produzir imagens de coordenadas polares.
7. Insira o ângulo de deslocamento do centróide como a medida θ e a distância percorrida como o raio. Utilize a ANOVA para testar intervalos de confiança de 95%.
8. Plote os resultados e salve a imagem.

Resultados

O LightR-Src é projetado e gerado seguindo a estratégia descrita na Figura 1A,B. A análise bioquímica de LightR-Src acessa a fosforilação de substratos Src endógenos conhecidos, p130Cas (Y249)²² e paxilina (Y118)²³ em resposta à luz azul a 60 min de iluminação contínua (Figura 2B). Notavelmente, nenhuma ativação de fundo da Src quinase é observada quando LightR-Src é expresso apenas na escuridão por 16-18 h após a transfecção. Além disso, o mutante cataliticamente inativo de LightR-Src com mutação D388R não induz fosforilação do substrato Src, demonstrando que a fosforilação é realizada por LightR-Src ativo e não causada por efeito inespecífico da iluminação da luz azul (Figura 2B). Reconhecendo relatos de atividade oscilatória da quinase Src²⁷ em células vivas, investigamos se LightR-Src poderia ser ajustado para exibir ativação cíclica. O LightR-Src original exibiu cinética de desativação lenta (Figura 2C), levando à geração de uma nova variante, Fast-LightR-Src, abrigando a mutação I85V em ambos os VVDs. A Figura 2D ilustra que o Fast-LightR-Src mostra uma cinética de desativação marcadamente mais rápida e é completamente inativado dentro de 10 minutos após desligar a luz, em comparação com mais de uma hora para LightR-Src. Usando o FastLightR-Src, também conseguimos ciclos repetidos de ativação/inativação (Figura 2E). Esses resultados demonstram coletivamente a capacidade da ferramenta LightR de alcançar uma regulação específica e rigidamente controlada da atividade de Src em células vivas.

A aplicação do FastLightR-Src também permite avaliar os efeitos da ativação transitória do Src na morfodinâmica celular. A ativação do FastLightR-Src nas células HeLa induz a disseminação celular, e esse processo é interrompido assim que o FastLightR-Src é inativado. Após a ativação, observamos a translocação de FastLightR-Src do compartimento perinuclear para aderências focais e membrana plasmática, um comportamento exibido pela Src quinase do tipo selvagem^11,12. As células iluminantes que expressam o mutante cataliticamente inativo D388RLightR-Src não mostram tais efeitos de espalhamento ( Figura 3B, C ). Isso confirma ainda mais que o FastLightR-Src funciona de forma semelhante ao seu homólogo do tipo selvagem. A iluminação local de uma região celular resulta na ativação localizada de FastLightR-Src indicada pelo acúmulo local LightR Src na adesão focal e acompanhada pela formação de saliências locais da membrana (Figura 4B (i), (ii)) e deslocamento do centróide celular (Figura 4C (i), (ii)) resultando em movimento celular em direção à luz. Tendo estabelecido a aplicação da ferramenta LightR para a regulação da Src quinase, mostramos a ampla utilidade do LightR estendida à regulação da bRaf quinase e DNA recombinase Cre. A análise de LightR-bRaf mostra fosforilação induzida por luz do substrato endógeno de bRaf, MEK1 e fosforilação a jusante de ERK1/2 quinases^24,25 em níveis comparáveis aos do mutante bRaf constitutivamente ativo (V600E) (Figura 5A). Por outro lado, o D575RLightR-bRaf cataliticamente inativo não demonstra fosforilação de MEK1 e ERK1/2, comparável a amostras LightR-bRaf não iluminadas, confirmando assim a especificidade da regulação de LightR-bRaf. A imagem de células vivas demonstrou que ciclos repetidos de ativação/inativação de FastLightR-bRaf induzem a translocação repetida de ERK2 para dentro e para fora do núcleo, corroborando com os resultados conhecidos da ativação de bRaf²⁸ (Figura 5B). A ativação do LightR-Cre resulta na recombinação bem-sucedida de um gene repórter mCherry, demonstrando a aplicabilidade do LightR a diferentes classes de enzimas ( Figura 5C ).

Figura 1: Estratégia de desenvolvimento da abordagem LightR. (A) Estruturas cristalinas de dois monômeros vívidos no estado escuro (PDB: 2PD7) e o dímero no estado iluminado (PDB: 3RH8). (B) Representação de desenho animado do design LightR. Dois fotorreceptores VVD conectados em tandem inseridos no domínio catalítico interrompem a atividade catalítica da proteína no escuro. A dimerização do VVD em resposta à luz azul restaura a atividade da proteína. (C) Estruturas cristalinas de (i) domínios catalíticos Src (PDB 1Y57) e (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Estrutura da Cre recombinase (PDB 1MA7). As setas amarelas indicam o local de inserção do LightR e indicam o aminoácido substituído. (D) Diagrama esquemático da estratégia de clonagem para inserção do domínio LightR em uma sequência enzimática alvo¹⁹. Na Etapa 1, primers especificamente projetados são usados para a síntese de PCR de um fragmento LightR flanqueado por locais de recozimento no gene alvo antes e depois do local de inserção. Na Etapa 2, o fragmento LightR assim produzido é mostrado para ser usado como um "megaprimer" para inserção de LightR no gene da enzima alvo por mutagênese dirigida ao local de mudança rápida. Os painéis A-C foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et ^al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização bioquímica de LightR-Proteins. (A) Representação esquemática do protocolo experimental para caracterização bioquímica de LightR Src. (B) As células LinXE que expressam transitoriamente a construção LightR Src com um mCherry e uma etiqueta myc no terminal C foram continuamente iluminadas com luz azul por 60 min, usando uma configuração de LED de 465 nm. Os lisados celulares foram sondados quanto à fosforilação de substratos Src, paxilina e p130Cas. Os resultados do Western Blot mostram fosforilação da paxilina endógena e p130Cas em resposta à ativação de LightR-Src em células vivas. (C, D) As células LinXE que expressam transitoriamente as construções LightR-Src indicadas com a etiqueta tandem mCherry-myc no terminal C foram continuamente expostas à luz azul por tempos especificados (0 min e 30 min) e depois colocadas no escuro por períodos de tempo indicados. Os lisados celulares foram sondados para fosforilação de substratos de Src, mostrando a comparação da cinética de ativação e desativação entre (C) LightR-Src e (D) FastLightR-Src. (E) As células LinXE que expressam transitoriamente as construções LightR-Src indicadas com a etiqueta tandem mCherry-myc no terminal C foram continuamente expostas à luz azul por 20 minutos, seguidas de incubação repetida no escuro por 10 minutos e na luz por 20 minutos. Os lisados celulares foram coletados e sondados para fosforilação de substratos de Src, mostrando a eficiência da ciclagem de Src quinase entre os estados de ativação e inativação. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes com resultados semelhantes. Os números exibidos ao lado de cada painel de western blot B-E representam os pesos moleculares das proteínas, medidos em kilodaltons (kDa). Os painéis B-E foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et ^al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Controle de iluminação global e temporal e efeito na atividade do FastLightR-Src. (A) Representação em desenho animado do esquema experimental de iluminação cíclica global e temporal e as análises de dados subsequentes. (B, C) A regulação da morfologia celular e a localização de FastLightR-Src por luz azul são representadas em imagens representativas de células HeLa obtidas de uma série de lapso de tempo usando microscopia de fluorescência de campo amplo. Essas células estavam co-expressando transitoriamente FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 células) ou D388RLightR-Src-mCherry-myc cataliticamente inativo (N = 9 células) junto com Stargazin-iRFP670 (marcador de membrana plasmática). A imagem de células vivas foi realizada a cada minuto, enquanto as células eram iluminadas globalmente com luz azul (contornos azuis). (B) As setas amarelas destacam a localização do FastLightR-Src em estruturas que se assemelham a aderências focais. As imagens foram obtidas a partir de uma série de lapso de tempo de células HeLa usando microscopia de fluorescência de campo amplo. (C) A quantificação das mudanças na área celular induzidas pela ativação de FastLightR-Src vs. D388RLightR-Src é mostrada em cada painel. A janela de iluminação é indicada como retângulos azuis. Os gráficos representam intervalos de confiança médios ± 90%. Os painéis B e C foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et ^al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Controle de iluminação subcelular local e efeito na atividade do FastLightR-Src. (A) Representação em desenho animado do esquema experimental de controle de iluminação subcelular local. (B) (i) Sequência de lapso de tempo ilustrando uma célula HeLa expressando FastLightR-Src-mCherry, localmente iluminada com luz azul (representada por um círculo azul). As imagens foram capturadas a cada minuto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (objetiva de 60x). As imagens são apresentadas como imagens de contraste invertido obtidas em intervalos de tempo especificados. (ii) Imagens de projeção de células exibindo saliências formadas durante intervalos de tempo especificados. Limitar e mascarar a morfologia celular ao longo da linha do tempo experimental representa a plataforma para analisar a disseminação celular e a dinâmica da borda celular. A área iluminada especificada da célula é delineada por um círculo azul. (C) (i) Gráfico polar para células que representam a distância de migração do centróide (d) e o ângulo de desvio (θ) em relação à iluminação local da luz azul. Os pontos pretos representam células HeLa individuais expressando D388RLightR-Src cataliticamente inativo (N = 6 células) ou FastLightR-Src (N = 10 células). (ii) Representação esquemática demonstrando a distância de deslocamento do centróide (d) percorrida pelo centróide da célula desde o início (1) até a conclusão (2) da estimulação local da luz azul. O ângulo de desvio (θ) indica a extensão da divergência do movimento do centróide da célula em relação à localização da luz azul. O sombreamento cinza claro indica a região projetada pela célula em resposta à estimulação local do FastLightR-Src. A área iluminada especificada da célula é indicada por um círculo azul sólido. Os painéis B e C foram adaptados e modificados de Shaaya et ^al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ampla aplicabilidade da abordagem LightR. (A) Regulação do LightR-bRaf. As células LinXE que expressam transitoriamente LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus cataliticamente inativo ou bRaf (V600E)-Venus constitutivamente ativo foram expostas à luz azul contínua pelo período de tempo especificado. Os lisados celulares foram sondados para a fosforilação das proteínas indicadas. (B) Imagens representativas obtidas de uma série de lapso de tempo de imagens de células vivas usando microscopia de fluorescência de campo amplo ilustram a regulação da resposta global à luz azul em células LinXE que co-expressam transitoriamente FastLightR-bRaf-Venus e mCherry-ERK2. Essas células foram iluminadas globalmente com luz azul (pulsos de 50 ms a cada segundo, 50 pulsos por minuto) por durações especificadas delineadas em azul. Imagens de células vivas de mCherry-ERK2 foram realizadas a cada minuto. As setas amarelas destacam os estágios da localização nuclear de ERK2 induzida pela ativação da luz azul do bRaf projetado. (C) As células LinXE foram co-transfectadas transitoriamente com um repórter Floxed-stop-mCherry e LightR-Cre-iRFP670. As células foram submetidas a condições escuras ou luz azul pulsante (2 s ligado, 10 s desligado) por até 8 h. As imagens para todos os pontos de tempo de cada canal foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência de campo amplo (objetiva de 10x) em configurações idênticas e foram ajustadas para níveis consistentes de brilho e contraste para facilitar a comparação dos níveis de expressão de proteínas entre as amostras. O experimento foi repetido pelo menos três vezes, produzindo resultados semelhantes. A figura foi adaptada e modificada de Shaaya et ^al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: Sequência LightR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Descrição dos locais de inserção de LightR e lista de verificação para o design da proteína LightR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Primers para clonagem LightR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Condições de transfecção para análise bioquímica da atividade da LightR-Protein. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Condições de transfecção para análise baseada em imagem da atividade da LightR-Protein. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Iluminação pulsada usando o Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Configurações de iluminação do microscópio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nosso estudo apresenta uma abordagem optogenética para a investigação de diversas vias de sinalização e demonstra sua ampla aplicabilidade na abordagem de diferentes questões biológicas. O sistema de ferramentas LightR oferece várias vantagens essenciais: (1) Regulação alostérica da atividade da proteína, (2) Controle temporal rígido da atividade que pode ser ajustado para alcançar diferentes cinéticas de ativação e inativação, (3) Resolução espacial da atividade no nível subcelular, (4) Especificidade da modulação da sinalização e atividade biológica e (5) Ampla gama de aplicabilidade a várias proteínas-alvo. Notavelmente, o LightR integra de forma única todos esses benefícios em uma única ferramenta, proporcionando assim um avanço significativo.

O design do LightR como um interruptor alostérico oferece várias vantagens. A capacidade do LightR de controlar a atividade da proteína quando inserido em um pequeno loop flexível oferece versatilidade considerável para aplicação em várias proteínas com diversas estruturas e funções. Sendo um interruptor alostérico, o LightR regula apenas o domínio-alvo da proteína de interesse e não afeta os outros domínios da proteína. Portanto, esse método permite a regulação específica da atividade sem comprometer as funções essenciais da proteína, como interações com seus parceiros de ligação ou localização nativa dentro das células. Os sistemas optogenéticos de dois componentes foram aplicados com sucesso para a regulação da localização de proteínas, interações ou outras funções essenciais usando o controle mediado por luz de homo ou heterodimerização 29,30,31,32,33,34,35 . No entanto, esses sistemas geralmente requerem expressão equimolar otimizada de duas proteínas, tornando sua aplicação mais desafiadora. A regulação alostérica usando o sistema LightR é alcançada dentro de uma única proteína e, portanto, fornece uma abordagem muito mais versátil para a interrogação da sinalização celular.

A ampla gama de aplicabilidade da chave LightR para diferentes classes de proteínas é, em parte, alcançada por meio da otimização de diferentes módulos dentro do domínio LightR. Os ligantes que conectam LightR à proteína de interesse e o ligante que conecta dois domínios VVD dentro de LightR (ligante inter-VVD) podem influenciar a eficiência da regulação. A escolha do ligante flexível inter-VVD (GGS)4G(GGS)3 fornece flexibilidade e comprimento suficientes para garantir a associação e dissociação dos monômeros VVD dentro do domínio LightR. Este ligante garantiu a regulação bem-sucedida de todas as proteínas-alvo até agora. No entanto, nos casos em que o domínio LightR não inativa suficientemente a proteína no escuro, um ligante mais rígido pode ser introduzido que manterá os domínios VVD mais afastados para aumentar a abertura do grampo LightR, mantendo assim a enzima inativa. O ligante ainda deve manter flexibilidade suficiente para permitir a dimerização dos VVDs e a ativação da proteína alvo. Para conectar LightR à proteína de interesse, usamos ligantes flexíveis curtos, GPGGSGG e GSGGPG, adicionados aos terminais N e C do domínio LightR. Eles fornecem flexibilidade suficiente na conexão, evitando assim a interrupção irreversível da proteína alvo. No entanto, eles são curtos o suficiente para permitir a distorção da proteína-alvo no escuro, facilitando a restauração da função da proteína na luz. Esses ligantes suportam a regulação por LightR para muitas aplicações de proteínas. No entanto, em certos casos, quando esses ligantes podem não fornecer inativação suficiente da proteína no escuro, o encurtamento dos ligantes pode ser benéfico. Esse encurtamento do Linker pode reduzir a flexibilidade e aumentar a distorção causada pelo grampo LightR aberto no escuro, minimizando assim qualquer vazamento. No entanto, esse ajuste pode comprometer a atividade máxima da enzima devido a possíveis distorções estruturais no estado iluminado. Alternativamente, a substituição de vários aminoácidos na alça de inserção pode fornecer benefícios semelhantes de flexibilidade equilibrada nos casos em que a instabilidade conformacional não é uma preocupação significativa.

Muitos processos críticos de sinalização são ativados transitoriamente ou regulados de maneira oscilatória 36,37,38,39,40,41,42,43. A capacidade de ajuste da ferramenta LightR nos permite imitar padrões de sinalização complexos e, portanto, fornece uma abordagem poderosa para a interrogação de processos biológicos controlados temporalmente. Conseguimos isso modulando a cinética de desligamento do LightR por meio da introdução da mutação I85V em ambos os domínios VVD. Essa mutação reduz a meia-vida do dímero VVD no estado escuro de 18.000 s para 780 s¹⁹, facilitando assim a inativação mais rápida na enzima FastLightR.

A cinética de inativação rápida também permite a regulação da atividade da proteína na resolução subcelular. As enzimas LightR, com cinética lenta, podem dificultar a observação dos efeitos da ativação subcelular devido à difusão intracelular da construção ativada. Com a cinética de desligamento rápido, qualquer enzima FastLightR que se difundir além da zona de iluminação local será rapidamente inativada. Ao ativar seletivamente regiões subcelulares específicas, os pesquisadores podem obter informações sobre as funções locais das proteínas para uma melhor compreensão de sua contribuição para as complexas vias celulares e redes de sinalização.

Embora os FastLightRs sejam inestimáveis para o controle óptico espacial e temporalmente confinado das atividades proteicas dentro das células, ainda existem aplicações em que a cinética lenta pode ser desejável. LightR com cinética de desaceleração pode ser implementado em estudos onde é necessária atividade induzível por luz azul sustentada e aprimorada. Essas aplicações exigirão apenas pulsos de iluminação pouco frequentes para manter a atividade optogenética contínua, minimizando também problemas como fototoxicidade. Para diferentes cenários, uma ampla gama de modificações cinéticas^10,18 pode ser implementada sozinha ou em conjunto para oferecer uma solução promissora para ajustar o desempenho do LightR para otimizar sua aplicação em um experimento específico.

A aplicabilidade das enzimas LightR é determinada por sua capacidade de imitar a função biológica de suas contrapartes endógenas. Como tal, é fundamental avaliar sua especificidade de substrato, sinalização a jusante e localização subcelular. A especificidade da atividade de LightR-Src é confirmada através da fosforilação de substratos de Src, incluindo paxilina e p130Cas ^22,23. O FastLightR-Src se desloca entre a região perinuclear e as aderências focais sob iluminação cíclica, resultando em disseminação celular. Tal fenômeno se assemelha com sucesso a observações anteriores feitas com a quinase Src nativa e confirma ainda mais a eficácia da presente ferramenta na exploração da biologia Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf também demonstra especificidade no direcionamento de complexos de sinais, como MEK e ERK quinases^24,25. Além disso, o FastLightR-bRaf exibe oscilações cíclicas do ônibus nuclear ERK em resposta à luz azul, que é uma consequência conhecida da ativação do bRaf²⁸. A capacidade das enzimas LightR de imitar de perto as funções das proteínas endógenas fornece uma ferramenta inestimável para interrogar sua função.

A discussão acima descreve a capacidade das quinases LightR de replicar vias de sinalização celular precisas dentro de compartimentos celulares definidos. Em alinhamento com esse sucesso com as quinases, o LightR-Cre serve como um modelo ilustrativo que demonstra a funcionalidade da Cre recombinase original derivada do bacteriófago P1. A Cre recombinase pertence à família integrase de recombinases específicas do local e funciona facilitando a recombinação entre dois locais de reconhecimento chamados loxP no DNA alvo. Essa recombinação resulta em rearranjo de DNA por meio de um evento de cruzamento. Com base na orientação direcional do local loxP no DNA alvo, o evento de cruzamento pode levar à deleção, duplicação ou translocação de elementos cromossômicos⁴⁸. A cre recombinase tem sido amplamente utilizada para a geração de modelos in vivo de regulação gênica induzível ^49,50. No entanto, outros sistemas de cre recombinase espontâneos, quimicamente induzíveis ou optogeneticamente induzíveis fornecem controle limitado de quando e onde a recombinação de DNA é induzida no modelo animal. O LightR-Cre supera essas limitações, permitindo um controle temporal e espacial rígido da recombinação do DNA. Além disso, a capacidade de ajuste do LightR nos permite eliminar atividades de vazamento indesejadas e garantir a regulação do Cre com alta precisão. Essas capacidades abrem novas oportunidades para a modelagem da patologia da doença e o desenvolvimento de novas terapêuticas.

A regulação precisa de LightR em quinases e DNA recombinase fornece ainda mais provas de que essa ferramenta pode ser aplicada a várias proteínas com a mesma estratégia. Além de ativar várias classes de enzimas, o LightR pode potencialmente ser ligado a outros tipos de proteínas, onde a modulação alostérica pode ser aproveitada para localizar proteínas em regiões subcelulares específicas, induzir interações proteína-proteína, projetar biossensores induzíveis por luz azul e muito mais. Devido às vantagens alostéricas do direcionamento de domínio específico, os LightRs também podem ser combinados com outras abordagens quimiogenéticas e optogenéticas na mesma proteína para alcançar um maior grau de sintonia para estudar processos biológicos.

Aplicamos com sucesso LightR a várias outras proteínas (manuscritos em preparação). Apesar desse sucesso, o desenvolvimento de uma proteína LightR funcional pode enfrentar desafios potenciais, particularmente na seleção de um local de inserção apropriado e na imitação precisa da função biológica da proteína-alvo. Quando a estrutura cristalina não está disponível, os pesquisadores devem confiar em estruturas previstas ou informações de sequência de aminoácidos, necessitando de mais solução de problemas para projetar proteínas com vários locais de inserção ou substituições de aminoácidos. Além disso, a atividade da proteína projetada deve ser ajustada com precisão para replicar a função biológica dentro da célula com precisão. O sucesso nesses experimentos depende da imitação funcional precisa da proteína projetada, com seu homólogo endógeno, que geralmente requer solução de problemas rigorosa e pode variar com base no tipo de célula, classe e tipo de proteína-alvo, bem como na força e duração da ativação da luz azul.

Em conclusão, o sistema LightR representa uma ferramenta poderosa para alcançar um controle espaço-temporal preciso sobre a função da proteína. Sua robustez, sintonia e versatilidade o tornam inestimável para estudar processos celulares complexos, desvendar vias de sinalização e elucidar mecanismos reguladores de genes. Ao fornecer aos pesquisadores um controle sem precedentes sobre a atividade da proteína, o sistema LightR promete avançar nossa compreensão dos processos biológicos fundamentais e abrir caminho para intervenções terapêuticas inovadoras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#1.5 Lamínulas de Vidro 25 mm Redondas	Warner Instruments	64-0715
Tubos de 1,5 mL	Científica dos EUA	cc7682-3394
2x Tampão			Para 500 mL: 5.18 g de  Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de 20% SDS, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscópio Anel de Luz	Boli Optics	ML46241324	LED Azul, 60 mm de diâmetro, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Anticorpo	Sinalização Celular	9102
Anti-GAPDH Anticorpo	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Anticorpo	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Sinalização Celular	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Sinalização Celular	Anti-paxilina	2542
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204	Sinalização Celular	9101
Anti-fosfo-pY249 p130Cas	Sinalização Celular	4014
Anti-fosfo-Y118 Sinalização Celular de Paxilina		2541
Anto-fosfo-S217 / 221 Célula MEK	Sinalização	9121
Arduino Compatable Fonte de Alimentação	Computador Corporativo	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Câmara Celular Attofluor	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Inativado por Calor Triplo 0.1 µ m estéril filtrado
bRaf-V600E-Venus			Presente do Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicilina (Dissódico)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Corante de membrana plasmática vermelho escuro	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
células competentes DH5a	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Enzima Dpn1	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Ditiotreitol, Reagentes Cleland's
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Reagente de Transfecção	Promega	E2692	Reagente de Transfecção
Gel Verde Mancha de Ácido Nucleico	GoldBio	G-740-500
Tinta de Carregamento em Gel Roxo 6x	NEB	B7024A
GeneJET	Thermo Scientific	K0692	Kit de Extração de Gel
Kit Miniprep de Plasmídeo GeneJET	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Células HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	Relé de controle AC/DC para iluminação
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
	HQRP	884667106091218	Sistema de lâmpada de painel LED
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software para execução de Scripts CellGEO
Metamorph	Molecular Devices	Software de Análise de Imagem
MgCl2	Óleo	Fisher Chemical M33-500
	Sigma	Kit MiniPrep M5310
	Escolha do gene:	96-308
Mini-PROTEAN TGX Géis Pré-moldados 12 poços	Bio-Rad	4561085
Grau de Biologia Molecular Água	Corning	46-000-CV
Espelho Polichroic Multibanda	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS sem Ca e Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Presente do Laboratório do Dr. Channing Der, Tubos
de PCR UNC	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubos e Caps, Rigid Strip Individualmente Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polimerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Iluminador Padronizado	Mightex	DSI-G-00C
Primers	Membranas de PVDF IDT
BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Papel de Filtro Sanduíches
T0.25% Tripsina, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sódio	Corning	25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	Para eletroforese
Objetiva de Microscópio UPlanSApo 40x	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	Para interface TTL
β-Mercaptoetanol	Fisher Chemical	O3446I-100