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Artigo de método

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

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⸱

DOI:

10.3791/67261

⸱

4 de outubro de 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Resumo

A optogenética oferece o potencial de imitar o controle espaço-temporal complexo da atividade enzimática até uma resolução subcelular. No entanto, a maioria das abordagens optogenéticas geralmente enfrenta desafios significativos na integração de vários recursos em uma única ferramenta aplicável a uma ampla gama de proteínas-alvo. Alcançar um controle preciso sobre a cinética ON/OFF, garantir o mínimo de vazamento no escuro e demonstrar desempenho eficiente em células de mamíferos com precisão subcelular são alguns dos desafios mais comuns enfrentados neste campo. Uma solução promissora está na aplicação de domínios sensíveis à luz racionalmente projetados para controlar alostericamente a atividade da proteína. Usando essa estratégia, geramos um método optogenético combinando todas as características desejadas. A abordagem envolve a incorporação do módulo de comutação alostérica regulado por luz (LightR) na proteína-alvo para regular a atividade enzimática usando luz azul (465 nm). O domínio LightR é gerado pela ligação de dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD), criando um grampo sensível à luz que pode ser incorporado a um pequeno loop flexível dentro do domínio catalítico de uma enzima. Em seu estado escuro, o grampo LightR está aberto, distorcendo assim o domínio catalítico da enzima e inativando-o. Após a exposição à luz azul, o domínio LightR fecha e restaura a estrutura e a atividade enzimática do domínio catalítico. Neste manuscrito, discutimos estratégias de design para gerar uma proteína quinase regulada por luz e demonstrar seu controle por luz azul, reversibilidade, cinética e regulação precisa no nível subcelular, permitindo uma precisão espaço-temporal apertada. Utilizando a tirosina quinase Src como modelo, apresentamos um protocolo para regular efetivamente a atividade da quinase LightR-Src. Também demonstramos a aplicabilidade do LightR em diferentes classes de enzimas, expandindo a utilidade do sistema de ferramentas na abordagem de questões mecanicistas de vias de sinalização em diferentes doenças.

Introdução

A capacidade da célula de interpretar sinais externos e convertê-los em respostas específicas em contextos fisiológicos ou patológicos é dirigida por grupos dedicados de proteínas. A contribuição de qualquer proteína para essas respostas complexas é frequentemente definida por sua localização subcelular, nível de expressão e tempo de ativação transitória, sustentada ou oscilatória. Dissecar o papel desses parâmetros individuais na regulação da sinalização exige métodos capazes de replicar o intrincado controle espaço-temporal da atividade proteica no nível subcelular. Técnicas tradicionais, como manipulação genética e inibidores de pequenas moléculas, ficam aquém nesse aspecto. Em contraste, as técnicas optogenéticas prometem o potencial para a dissecação de processos biológicos manipulando ou imitando processos fisiológicos e patológicos. No entanto, as ferramentas atuais geralmente carecem de ampla aplicabilidade ou controle subcelular. Várias estratégias existentes alcançam uma regulação rígida da localização e interações de proteínas; mas não têm controle direto sobre a atividade enzimática 1,2,3,4. Outros permitem a regulação da atividade enzimática, mas podem não ter controle subcelular ou ter aplicabilidade limitada em diferentes classes de enzimas 5,6,7,8,9. Neste artigo de protocolo, descrevemos um novo método de engenharia de proteínas que combina as vantagens da optogenética em uma ferramenta: regulação temporal rígida, cinética sintonizável, controle subcelular e ampla aplicabilidade enzimática10. Projetamos um domínio regulado por luz (LightR) que funciona como um interruptor alostérico quando inserido na proteína alvo de interesse. Essa estratégia permite um controle espaço-temporal rigoroso da ativação e desativação de uma proteína de interesse em células vivas.

Aqui, é discutida a estratégia de design e aplicação da ferramenta optogenética LightR em várias classes de enzimas. Este estudo oferece um protocolo passo a passo para o desenvolvimento, caracterização e aplicação da tirosina quinase regulada por luz Src (LightR-Src). O estudo demonstra ainda a sintonia da cinética de inativação do interruptor LightR. O interruptor LightR de inativação lenta pode manter a atividade enzimática com frequência reduzida de iluminação, enquanto a versão de ciclo rápido, FastLightR, requer iluminação mais frequente para ativação, mas mostra inativação rápida quando a iluminação é desligada. A ativação/inativação de FastLightR-Src em células vivas induz ciclos de espalhamento e retração celular. A disseminação celular induzida por FastLightR-Src concorda com o papel fisiológico da Src quinase 11,12. Devido à cinética de inativação rápida, o FastLightR-Src também pode ser regulado em nível subcelular, resultando na estimulação de saliências locais e polarização celular. Para demonstrar a aplicabilidade da ferramenta LightR a outros tipos de enzimas, orientamos brevemente os leitores através de um sucesso semelhante com a quinase regulada por luz projetada bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) e uma DNA recombinase Cre específica do local (LightR-Cre). No geral, essa abordagem tem o potencial de avançar nossa compreensão de vias de sinalização complexas que moldam a fisiopatologia de diversas doenças.

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Protocolo

1. Projeto e desenvolvimento do LightR (Figura 1)

  1. Planejamento estratégico
    NOTA: O domínio LightR é composto por dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD) conectados em tandem de Neurospora crassa13,14,15,16. Os VVDs homodimerizam na presença de luz, e tal dimerização envolve uma mudança conformacional que traz o terminal N de um monômero VVD próximo ao terminal C de outro monômero VVD (Figura 1A). A conexão de dois domínios VVD com um vinculador flexível cria um domínio semelhante a uma pinça que será aberto no escuro e fechado após a iluminação com luz azul. A integração desse grampo no domínio catalítico de uma enzima permite a regulação da atividade mediada pela luz. Na escuridão, o grampo aberto distorce o domínio, desativando a enzima; A iluminação com a luz azul faz com que o grampo feche, restaurando a atividade da enzima (Figura 1B). Este conceito pode ser aplicado a enzimas de várias famílias, incluindo proteínas quinases e DNA recombinases10 (Figura 1C).
    1. Projeto de LightR
      1. Para conectar duas moléculas de VVD, use um ligante flexível de 22 aminoácidos (GGS)4G(GGS)3 entre cada monômero.
        NOTA: O ligante fornece flexibilidade e comprimento suficientes para acomodar a associação e dissociação de monômeros VVD.
      2. Adicione os ligantes GPGGSGG e GSGGPG aos terminais N e C do domínio LightR, respectivamente.
        NOTA: O comprimento e a composição dos ligantes podem precisar ser ajustados para uma proteína específica. Ligantes GSG mais curtos e Gly simples são usados rotineiramente quando é necessária uma regulamentação mais rígida. O tamanho do loop de inserção e sua proximidade com resíduos catalíticos também influenciarão a faixa dinâmica de regulação. Loops mais curtos são mais propensos a fornecer uma regulação mais rígida da atividade catalítica, mas podem resultar em menor atividade após a iluminação. A sequência do domínio LightR é fornecida na Tabela Suplementar 1.
    2. Inserção de LightR
      NOTA: Um local de inserção LightR adequado permitirá uma regulação rígida da função de domínio alvo sem bloquear estericamente suas interações ou causar mudanças estruturais irreversíveis que afetarão seu papel biológico. Uma estrutura cristalina da proteína alvo é um guia ideal na identificação de tais regiões de alça flexíveis para a inserção de LightR. Se necessário, a estrutura cristalina de um homólogo próximo pode ser suficiente. Alguns critérios gerais a serem considerados são fornecidos abaixo.
      1. Certifique-se de que a alça de inserção esteja estruturalmente acoplada aos elementos catalíticos críticos da enzima. Certifique-se de que a alça de inserção selecionada não seja um local de ligação existente para a proteína e que a inserção de LightR não interrompa potencialmente nenhuma interação funcional devido a efeitos estéricos.
      2. Como estratégia inicial, substitua um aminoácido no loop de inserção ao inserir o LightR. Direcione o meio da alça de inserção contendo um aminoácido polar ou pequeno (por exemplo, Glu, Arg, Lys, Gly) exposto ao solvente e não envolvido em interações intramoleculares.
        NOTA: Quando uma reposição de aminoácidos não resulta em uma proteína funcional, a otimização da construção LightR exigirá a substituição de vários aminoácidos ou de todo o loop de inserção. Avalie a funcionalidade de vários locais de inserção para LightR dentro do loop definido.
      3. Certifique-se de que a enzima alvo opere independentemente da regulação endógena. Consiga isso usando uma versão mutante constitutivamente ativa da enzima para o molde de inserção.
        NOTA: Enzimas do tipo selvagem também podem ser usadas para gerar construções LightR, mas isso pode resultar em um sistema controlado por AND que será regulado por mecanismos endógenos e luz.
      4. Controles positivos e negativos são vitais para a análise da atividade da enzima LightR. Use mutantes constitutivamente ativos de proteínas endógenas como controles positivos e versões mutantes cataliticamente inativas da enzima LightR alvo como controles negativos.
        NOTA: Ao selecionar mutações inativadoras, é crucial garantir que a mutação esteja suficientemente espaçada do local de inserção do LightR para evitar interromper a irreversibilidade do dobramento da enzima LightR. Com base nos critérios acima, o local de inserção LightR na quinase Src é selecionado em uma região de alça flexível que é estruturalmente acoplada ao motivo GXGXXG altamente conservado na região de alça G de ligação a ATP / rica em glicina por meio de uma fita beta. É importante ressaltar que ele está posicionado longe da bolsa de ligação do ATP e da região de ligação do substrato10,17 (Figura 1C (i)).
        NOTA: Devido à homologia estrutural entre quinases, o local de inserção LightR em bRaf é selecionado no mesmo loop estrutural que o local de inserção em Src (Figura 1C (ii)).
        NOTA: Com base nos princípios declarados na Seção 1.1.2., o local de inserção do LightR na Cre recombinase, uma não quinase, é escolhido em uma das alças flexíveis distantes do núcleo catalítico, ou seja, o local de ligação ao DNA. No entanto, a alça de inserção ainda está estruturalmente acoplada a resíduos catalíticos críticos dentro do domínio de ligação ao DNA por meio de uma α-hélice para garantir o sucesso da funcionalidade LightR-Cre (Figura 1C (iii)). Todos os locais de inserção com controles positivos e negativos para diferentes enzimas descritas no protocolo atual são detalhados na Tabela Suplementar 2.
    3. Desenvolvimento do FastLightR.
      NOTA: A introdução da mutação I85V em ambos os VVDs no LightR permite uma dinâmica de ativação-inativação mais rápida, atribuída à rápida conversão do mutante para o estado escuro 18,19. A geração de FastLightR-Src e FastLightR-bRaf com cinética de inativação rápida permite um controle temporal rígido de ativação e inativação. Ele permite alcançar a regulação subcelular de LightR-Src em células vivas.
      NOTA: A atividade da cre recombinase resulta em recombinação irreversível do DNA; portanto, as propriedades de reversibilidade do LightR não são aplicáveis.
      NOTA: Para simplificar a detecção da construção LightR, uma proteína fluorescente ou qualquer outra etiqueta adequada pode ser anexada ao terminal N ou C da proteína alvo. Este estudo usou mCherry-myc para LightR-Src, Venus para LightR-bRaf e miRFP670 para LightR-Cre recombinase.
  2. Estratégia de clonagem
    NOTA: A abordagem de clonagem, ao contrário das abordagens tradicionais, é baseada na mutagênese dirigida ao local que não depende de locais de restrição específicos10,20.
    1. Geração de um "Megaprimer"
      1. Otimize os genes LightR para garantir a expressão estável das duas sequências de DNA VVD em tandem de origem fúngica em células de mamíferos e para tornar as sequências o mais diferentes possível para clonagem sem erros usando PCR. Para executar a otimização do códon, siga as etapas 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Alinhe a sequência de aminoácidos de VVDs e os ligantes selecionados lado a lado para criar o mapa de sequência teórica de LightR.
      3. Cole a sequência em qualquer plataforma de otimização de códons online que utilize um algoritmo avançado para otimização de códons para determinar a melhor opção de sequência com complexidade mínima. Certifique-se de que o organismo alvo esteja selecionado, o quadro de leitura seja mantido e as sequências VVD sejam selecionadas para otimização.
      4. Obtenha o DNA LightR como um fragmento sintetizado personalizado (consulte a Tabela Suplementar 1) ou de uma construção LightR publicada anteriormente10.
      5. Amplifique o gene LightR para gerar "Megaprimer" usando a estratégia20 descrita anteriormente descrita na Figura 1D. Sintetize o LightR "Megaprimer" via PCR seguindo as recomendações do fabricante para a DNA polimerase específica e usando a seguinte mistura de reação de PCR:
        5x tampão compatível com DNA polimerase: 10 μL
        100 μM Megaprimer direto: 0,5 μL
        100 μM Megaprimer reverso: 0,5 μL
        Mistura dNTP de 10 nM: 2 μL
        DNA polimerase (2000 unidades/mL): 1 μl (0,02 U/μL)
        50 ng DNA do molde: 1 μL
        Água de grau PCR: 35 μL
        NOTA: Aqui, são usadas DNA polimerase de partida a quente de alta fidelidade com temperaturas universais de recozimento de primer.
      6. Separe o megaprimer resultante por eletroforese em gel de agarose. O produto terá aproximadamente 1000 nucleotídeos de comprimento. Extirpar o megaprimer do gel de agarose e purificar com um kit de extracção em gel, seguindo as recomendações do fabricante ou utilizando uma técnica análoga.
    2. Inserção do gene LightR usando mutagênese dirigida ao local: Insira o LightR, substituindo um aminoácido desejado ou um pedaço de aminoácidos. O plasmídeo modelo será aquele em que o domínio LightR é inserido. Efectuar a reacção PCR como descrito anteriormente20 utilizando a seguinte mistura.
      5x tampão compatível com DNA polimerase: 5 μL
      Mistura dNTP de 10 nM: 1 μL
      DNA polimerase (2000 unidades/mL): 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng DNA do modelo alvo: 1 μL
      Megaprimer extraído (massa calculada): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Água de grau de PCR: 2,5 μL
      NOTA: Massa do Megaprimer (ng) = razão molar desejada entre inserção / vetor x massa do vetor x razão entre a inserção e os comprimentos do vetor. A proporção molar de inserção / vetor desejada usada é 3/1.
    3. Após a conclusão da reação de PCR, adicione 1 μL de enzima DpnI (2000 unidades / mL) para digerir seletivamente apenas o DNA excedente e metilado e incubar a mistura a 37 ° C por 1-1,5 h. Isso aumentará significativamente o rendimento da construção modificada.
    4. Transforme 1-2 μL da reação de PCR em células competentes para DH5α seguindo os protocolos do fabricante.
    5. Bactérias transformadas em placa em placa de ágar Luria Broth (LB) com antibiótico apropriado para seleção. Incubar a placa a 37 °C durante a noite ou à temperatura ambiente (RT; 25-30 °C) durante 72 h.
      NOTA: As placas LB com colônias cultivadas nelas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 mês, e o protocolo pode ser pausado.
    6. PCR de triagem de colônia
      1. Para triagem de colônias baseada em PCR, projete primers que recozenem na inserção LightR e direcionem o DNA para gerar aproximadamente fragmentos de 400-700 pb.
      2. Adicione uma pequena quantidade de uma colônia da placa LB à mistura de PCR fornecida abaixo e prossiga para a termociclagem seguindo as recomendações do fabricante para a DNA polimerase específica.
        2x Taq RED Master Mix: 5 μL
        Água de grau PCR: 5 μL
        100 μM Primer direto: 0,5 μL
        100 μM Primer reverso: 0,5 μL
      3. Verifique se há colônias positivas por eletroforese em gel de agarose.
      4. Escolha as colônias que geraram o tamanho desejado do produto de PCR e inocule-as individualmente em 3 mL de caldo LB com o antibiótico, combinando a resistência ao antibiótico na estrutura do plasmídeo. Em seguida, incubar e agitar a 37 °C durante a noite.
      5. Extrair o ADN do plasmídeo da cultura líquida seguindo as instruções do fabricante do kit de purificação do plasmídeo para extracção do ADN do plasmídeo e verificar a presença da inserção por sequenciação.
        NOTA: Os primers de clonagem estão resumidos na Tabela Suplementar 3.

2. Plaqueamento celular e análise bioquímica da atividade da enzima LightR (Figura 2A)

  1. Para análise bioquímica de LightR-quinases (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), coloque 1 x 106 células LinXE por placa de cultura de células de 3,5 cm para cada grupo experimental. Consulte a Tabela Suplementar 4.
  2. Incubar as células a 37 °C e 5 % de CO2 durante 16-18 h.
  3. No dia seguinte, transfecte as células com a construção de DNA selecionada, usando um reagente de transfecção adequado seguindo as recomendações do fabricante (Tabela Suplementar 4).
    NOTA: O reagente de transfecção ideal dependerá da construção, vetor e tipo de células usadas. Este estudo usou 2 μg de DNA em uma placa de 3,5 cm usando um reagente de transfecção. Testes empíricos devem ser feitos para determinar o reagente de transfecção ideal. Como as construções transfectadas expressarão proteínas reguladas pela luz azul, todas as etapas subsequentes do manuseio das células transfectadas devem ser realizadas sob luz vermelha. Embrulhe as placas com células transfectadas com papel alumínio antes de colocá-las na incubadora para evitar iluminação acidental.
  4. Após 16-18 h de transfecção, exponha as células à luz azul10. Para fazer isso, coloque um sistema de lâmpada de painel de diodo emissor de luz (LED) de 465 nm na incubadora de cultura de tecidos. Coloque um painel de plexiglass perfurado 10 cm acima da lâmpada para obter a iluminação desejada de 3 mW/cm2 (Suplementar File 1). Um painel perfurado é necessário para manter a circulação de ar ininterrupta na incubadora. Ilumine as células pelo período desejado.
  5. Para ativação de LightR-Src e LightR-bRaf, use iluminação contínua. Para iluminação contínua, ligue e desligue o painel de LED manualmente.
  6. Para manter o ciclo de ativação/inativação do FastLightR Src, use ciclos ON/OFF controlados manualmente ou por um microcontrolador.
    NOTA: Vários kits de ferramentas de software que fornecem um Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) para escrever e carregar o código necessário podem ser utilizados. Esses kits de ferramentas suportam programação C/C++ e oferecem acesso de entrada/saída de uso geral (GPIO), o que é essencial para controlar a iluminação pulsada. Uma descrição detalhada dos protocolos e códigos usados para esses fins é descrita no Arquivo Suplementar 1.
  7. No final dos respectivos pontos de tempo do experimento (Tabela Suplementar 4), colha as células sob luzes vermelhas seguras. Aspire o meio e lave as células com PBS frio.
  8. Para isolar a proteína, lise as células com 500 μL de tampão de amostra 2x Laemmli suplementado com 5% v / v 2-mercaptoetanol. Incubar o lisado a 100 °C durante 5 min. Analise os lisados celulares por eletroforese de gel de proteína e Western blotting21.
    NOTA: A composição do tampão 2x Laemmli é a seguinte: Para 500 mL: 5,18 g de Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS a 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8.
  9. Avalie a atividade de LightR-Src avaliando o nível de fosforilação de p130cas endógena em Tyr249 e paxilina em TyrY11822,23 (Figura 2). Avalie a atividade de LightR-bRaf avaliando o nível de fosforilação de MEK1 em Ser217/221 e ERK1/2 em TyrY202/20424,25.

3. Análise funcional da atividade do LightR-Cre

  1. Para a análise funcional da atividade do LightR-Cre, colocar 1 x 106 células LinXE por placa de cultura de células de 3,5 cm. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 por 16-18 h.
  2. Transfectar as células seguindo o protocolo descrito na seção 2, Figura 2A e Tabela Suplementar 5. Co-transfecta um total de 2 μg de DNA, com uma proporção de 1:9 de LightR-Cre-iRFP670 e um plasmídeo repórter Floxed-STOP-mCherry2.
  3. Após 16-18 h após a transfecção, ilumine as células. Uma ativação eficiente do LightR-Cre precisa de iluminação prolongada. Portanto, para evitar fototoxicidade, use iluminação pulsada por 8 h com ciclos de 2 s ON e 20 s OFF utilizando um painel LED de 465 nm lamp sistema controlado por um microcontrolador conforme detalhado na seção 2 e Suplementar File 1.
  4. Realize imagens usando microscopia de epifluorescência com uma objetiva de ar de 20x. Para visualização de LightR-Cre-iRFP670, use o conjunto de filtros Cy5 e para visualização de mCherry da expressão Floxed-mCherry, use o conjunto de filtros RFP.
    NOTA: Para imagens, é usado um microscópio de epifluorescência equipado com cubos de luz Cy5/RFP.

4. Preparação de amostras para imagens de células vivas

  1. Placa 2 x 105 células HeLa por placa de cultura de tecidos de 35 mm em meios de cultura de células e incubar durante 2 h a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Uma vez que as células tenham se ligado e a confluência seja de aproximadamente 60% -70%, co-transfecte as células HeLa com uma das seguintes misturas: (i) 0,85 μg de FastLightR-Src-mCherry-myc / 0,15 μg de Stargazin-iRFP, ou (ii) 0,75 μg de FastLightR-bRaf-Venus / 0,25 μg de mCherry-ERK2
    NOTA: Nos experimentos FastLightR-Src, o Stargazin-iRFP é usado para marcar a membrana plasmática para análise de espalhamento celular. Se uma expressão mais alta de FastLightR-Src for desejada, stargazin-iRFP pode ser omitido e 1 μg de FastLightR-Src pode ser usado. Nesses casos, um corante de membrana deve ser usado para visualizar as células. As colorações da membrana plasmática são usadas rotineiramente para rotular as membranas celulares.
  3. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a iluminação acidental das células e incube por 16-18 h a 37 ° C e 5% de CO2.
  4. Conclua todas as etapas a seguir sob iluminação de luz vermelha para evitar a ativação inadvertida das construções. A exposição à luz branca induzirá a ativação de LightR-quinases e poderá afetar os resultados subsequentes.
  5. No mesmo dia, cubra 3 lamínulas redondas de vidro (25 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura) durante a noite com 5 mg / L de fibronectina em PBS a 37 ° C.
  6. Enxágue as lamínulas com PBS 16-18 h após a transfecção e coloque ~ 1 x 105 células HeLa transfectadas em cada lamínula. Incubar em meios de cultura celular por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.
    NOTA: A baixa densidade de semeadura é necessária para garantir que as células no campo de visão não se toquem.
  7. Prepare o meio de imagem adicionando FBS ao meio de imagem L-15 da Levobitz até uma concentração final de 5%. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm e aquecê-la a 37 °C.
  8. Pré-aqueça o óleo mineral a 37 °C.
  9. Lave as lamínulas contendo as células com PBS duas vezes. Se estiver usando um corante de membrana, manche as células seguindo as instruções do fabricante antes de lavar as lamínulas.
  10. Coloque cuidadosamente a lamínula em uma câmara de imagem de células vivas. Adicione 1 mL de meio de imagem L-15 à câmara.
  11. Adicione 1 mL de óleo mineral em cima do meio para evitar a evaporação durante o processo de imagem.
  12. Manter a câmara protegida da luz a 37 °C até estar preparada para a imagem.

5. Ativação global e imagem do FastLightR-Src (Figura 3)

  1. Conecte um anel de luz de microscopia LED azul ao condensador do microscópio, posicionando-o aproximadamente 1.5 cm acima do suporte de amostra. Conecte o relé de controle AC/DC do anel de luz ao computador do microscópio.
    NOTA: Para os experimentos deste estudo, a iluminação foi controlada por meio de uma interface Transistor-Transistor Logic (TTL) por meio do software de imagem. A iluminação epifluorescente também pode ser usada para ativar globalmente as construções LightR se uma fonte de iluminação externa não estiver disponível. Os comprimentos de onda de excitação GFP, como o filtro de excitação de 490/20 nm, são eficazes na ativação do LightR.
  2. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 ° C e selecione células que expressam FastLightR-Src-mCherry e Stargazin-iRFP (Figura 3B) ou FastLightR-bRaf-Venus e mCherry ERK-2 (Figura 5B).
  3. Para o estudo de iluminação global e experimentos de imagem, use objetivas de alto desempenho compatíveis com microscópio (40x) com correção apocromática, correção de campo plano e alta abertura numérica.
    1. Para estudos baseados em iluminação global de Src quinase, use filtros de excitação de 561/10 nm e emissão de 595/40 nm para visualizar o FastLightR-Src-mCherry e use a excitação de 640/20 nm e o filtro de emissão de 655LP para visualizar stargazin-iRFP.
    2. Para estudos baseados em iluminação global de bRaf quinase, use filtros de excitação de 514/10 nm e emissão de 540/21 nm para visualizar o FastLightR-bRaf-Venus e use filtros de excitação de 561/10 nm e emissão de 595/40 nm para visualizar o mCherry-ERK-2.
    3. Use um espelho policrônico multibanda em todos os canais de imagem fluorescente.
  4. Dependendo das condições experimentais, considere as seguintes recomendações.
    1. Visualize as células por pelo menos 10 minutos antes da iluminação para estabelecer uma atividade de linha de base das células.
      NOTA: Esta linha de base é necessária para determinar se a ativação da quinase FastLightR por iluminação induz alguma alteração no comportamento celular ou na localização da proteína. Pode-se também realizar períodos mais longos de imagem basal para fornecer maior significância estatística.
    2. Devido à rápida cinética de inativação de FastLightRs, incluir muitas células para imagens pode causar a desativação de Src / bRaf entre as posições do estágio e atenuar sua resposta. Para evitar esse erro, crie uma imagem de 4 células/min enquanto analisa a atividade do FastLightR-Kinase no protocolo descrito e crie uma imagem de cada célula selecionada a cada minuto por um total de 110 min (Arquivo Suplementar 2).
    3. Use iluminação pulsada em vez de iluminação contínua para reduzir os potenciais efeitos fototóxicos da luz azul. A iluminação por 12 s para cada uma das 4 células/min é eficaz (Arquivo Suplementar 2, Figura 3A).
      NOTA: Os ciclos de iluminação devem ser determinados empiricamente para diferentes construções e tipos de fontes de iluminação.
    4. Desligue a iluminação durante a imagem celular para evitar sangramento nos canais fluorescentes.
      NOTA: A imagem de muitas células ao mesmo tempo diminuirá o tempo total de iluminação disponível para a amostra, levando a uma resposta atenuada por ativação insuficiente.
  5. Após a geração de imagens, salve os filmes como um arquivo . Formato de arquivo de pilha TIF para análise.
    NOTA: Devido à iluminação menos uniforme com epifluorescência GFP em comparação com a luz do anel, os experimentos usando epifluorescência GFP exigirão iluminação mais frequente. Isso resulta em menos células sendo fotografadas por experimento.

6. Ativação subcelular e imagem de FastLightR-Src (Figura 4)

  1. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 ° C e selecione uma única célula expressando FastLightR-Src-mCherry e Stargazin-iRFP.
  2. Selecione as regiões específicas (ROI) dentro da célula a ser iluminada. Este estudo escolhe uma pequena área na periferia da célula selecionada.
    NOTA: Para iluminação local, é usado um laser de 445 nm focado por um módulo TIRF no modo FRAP ou dispositivo de micro-espelho controlado por meio da interface TTL por meio do software de imagem. Qualquer sistema de iluminação padronizado funcionará para esses experimentos. Se for utilizado um sistema baseado em varrimento, determine a intensidade e homogeneidade do laser para uma ativação suficiente sem danificar a célula.
  3. Crie imagens da célula selecionada a cada minuto por 20 minutos no estado basal antes da iluminação, 50 minutos durante a iluminação local e 20 minutos após a ativação por um total de 90 minutos (Arquivo Suplementar 2).
  4. Para ativação e desativação, forneça um período de tempo adequado para a proteína-alvo para permitir a desativação completa da proteína LightR. Para FastLightR-Src, permita pelo menos 10 minutos de desativação para que a atividade residual seja removida e permita 20 minutos de desativação na configuração experimental demonstrada para iluminação local.
  5. Após a geração de imagens, salve os filmes como . Formato de arquivo de pilha TIF para análise.

7. Análise de espalhamento celular

  1. Prepare imagens para processamento e análise de dados. Certifique-se de que as imagens estejam em um arquivo . Formato de pilha TIF. Salve-os diretamente do software de imagem ou converta-os usando um programa de código aberto.
  2. Baixe o pacote de script CellGeo dos arquivos compactados de dados suplementares26.
    NOTA: O pacote CellGeo contém vários scripts diferentes. Escolha o pacote desejado na lista com base no tipo de análise, conforme abordado nas seções de protocolo 7 a 9.
  3. Abra e execute o script intitulado MovThresh para criar uma máscara da célula.
    1. Selecione Arquivo > Importação (.tif) e selecione as imagens Stargazin-iRFP das células.
    2. Percorra os quadros usando a barra de rolagem no canto inferior esquerdo. Se o limite sugerido for apropriado, vá para a etapa 7.4.
    3. Se o limite sugerido não estiver alinhado com o comportamento da célula, escolha curvas suavizadas ou personalizadas abaixo de Seleção de curva. Crie a curva personalizada rolando pelos quadros e ajustando o limite no lado direito da janela.
    4. Clique em Re-Limite.
    5. Clique em Arquivo > Salvar como máscaras, Altere o nome do arquivo e salve-o usando a opção Salvar como .
  4. Abra o arquivo de pilha recém-criado em um programa de análise de imagem de código aberto.
  5. Selecione Imagem > Ajustar > limite > Aplicar.
  6. Selecione Analisar > Analisar partículas > Verificar resultados da exibição -> OK.
  7. Calcule a mudança na área de cada célula dividindo a área a qualquer momento pela área média da mesma célula antes da irradiação da luz azul.
  8. Plote a mudança de área como um gráfico de linhas ou barras.
  9. Calcule o valor médio e os intervalos de confiança de 90% para cada ponto de tempo de todas as células tratadas nas mesmas condições.

8. Análise da dinâmica da borda celular

  1. Prepare os arquivos de pilha usando as etapas descritas na seção 7 do protocolo.
  2. Abra e execute o script intitulado ProActive.
    1. Selecione Arquivo > Importar > Máscaras (.tif) e selecione a máscara criada por meio do script MovThresh .
    2. Selecione a atividade de interesse em analisar no canto inferior direito (Protrusivo, Retrátil ou Total).
    3. Selecione o tipo de normalização. Normalmente, a normalização de área é usada para essas análises.
    4. Selecione o quadro de referência inicial usando o controle deslizante à esquerda. O controle deslizante de atraso à direita determinará o intervalo de tempo entre dois pontos de tempo usados para medir a área ganha e perdida pela célula.
    5. Se o quadro selecionado e o número de atraso forem aditivamente maiores do que o número de quadros no filme, a imagem de visualização não será exibida. Redefina esses valores para serem menores que o número total de quadros.
  3. Modifique o limite de protrusão ou retração marcando a caixa Curva suave na seção Resultados . Isso calcula a média dos limites em uma janela específica, o que pode resolver problemas em que pequenas flutuações são detectadas como atividade.
  4. Selecione Executar o intervalo para calcular a atividade ao longo do tempo especificado pelos controles deslizantes de quadro e atraso.
  5. Salve os dados numéricos selecionando Arquivo > Salvar como > Resultados(.mat) e use-os para determinar a atividade protrusiva ou retrativa média.
  6. Determine os intervalos de confiança de 90% para cada ponto de tempo.
    NOTA: Isso salvará uma matriz de vários valores diferentes. O arquivo de texto "Como usar o ProActive" incluído no script fornece uma descrição detalhada do que cada valor representa e como eles foram determinados26.
  7. Salve a representação visual da atividade selecionando Arquivo > Salvar como > Imagens (.tif).

9. Análise de deslocamento do centróide

  1. Para análise de deslocamento do centróide, use qualquer software que possa determinar as coordenadas do centróide.
  2. No software de análise, abra a pilha de imagens mascaradas da célula de interesse, conforme descrito na seção 7 do protocolo.
  3. Selecione Medir > Análise de Morfometria Integrada e, em seguida, clique em Preferências > Desenhar Marca de Centroide > Verificar e, em seguida, selecione Medir.
    1. Registre as coordenadas do centróide antes do movimento (A).
    2. Registre as coordenadas do centróide no final do experimento (B).
    3. Registre as coordenadas para o centro do padrão de iluminação (C).
  4. Agora que os três pontos foram coletados, determine o ângulo figure-protocol-1BAC8. θ1 corresponde ao ângulo figure-protocol-2ABC e θ2 corresponde ao ângulo figure-protocol-3CBA (Figura 4Cii). Faça isso usando a seguinte equação:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    NOTA: Uma calculadora pode ser usada para determinar os ângulos e distâncias diretamente das coordenadas para facilitar o uso.
  5. Determine o deslocamento do centróide multiplicando a distância percorrida pelo centróide da célula em pixels pelo fator de conversão em que 1 pixel é igual a 0,4 μm. A conversão específica de pixels para distância dependerá da ampliação e da configuração da câmera no sistema.
  6. Uma vez que o ângulo de deslocamento e a distância do centróide tenham sido determinados, abra um software gráfico capaz de produzir imagens de coordenadas polares.
  7. Insira o ângulo de deslocamento do centróide como a medida θ e a distância percorrida como o raio. Utilize a ANOVA para testar intervalos de confiança de 95%.
  8. Plote os resultados e salve a imagem.

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Resultados

O LightR-Src é projetado e gerado seguindo a estratégia descrita na Figura 1A,B. A análise bioquímica de LightR-Src acessa a fosforilação de substratos Src endógenos conhecidos, p130Cas (Y249)22 e paxilina (Y118)23 em resposta à luz azul a 60 min de iluminação contínua (Figura 2B). Notavelmente, nenhuma ativação de fundo da Src quinase é observada quando LightR-Src é expresso apenas na escuridão po...

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Discussão

Nosso estudo apresenta uma abordagem optogenética para a investigação de diversas vias de sinalização e demonstra sua ampla aplicabilidade na abordagem de diferentes questões biológicas. O sistema de ferramentas LightR oferece várias vantagens essenciais: (1) Regulação alostérica da atividade da proteína, (2) Controle temporal rígido da atividade que pode ser ajustado para alcançar diferentes cinéticas de ativação e inativação, (3) Resolução espacial da atividade no nível subcelular, (4)...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Mark Shaaya por sua contribuição para o desenvolvimento de enzimas LightR e protocolos associados. pCAG-iCre foi um presente de Wilson Wong (plasmídeo Addgene # 89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry foi um presente de Mositoshi Sato (plasmídeo Addgene # 122963), a construção bRaf-Venus com mutação V600E foi um presente do Dr. John O'Bryan (MUSC); O gene ERK2 do pCEFL-ERK2 (um presente do laboratório do Dr. Channing Der, UNC) foi clonado no backbone mCherry-C1 para obter o plasmídeo mCherry-ERK2; e pmiRFP670-N1 foi um presente de Vladislav Verkhusha (plasmídeo Addgene # 79987). O trabalho foi apoiado por bolsas do NIH R33CA258012, R35GM145318 e P01HL151327 para AK. Este trabalho foi ainda apoiado pela bolsa de treinamento T32 VBST T32HL144459 para NL.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#1.5 Lamínulas de Vidro 25 mm RedondasWarner Instruments 64-0715
Tubos de 1,5 mL Científica dos EUAcc7682-3394
2x TampãoPara 500 mL: 5.18 g de  Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de 20% SDS, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldadoBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Microscópio Anel de LuzBoli OpticsML46241324LED Azul, 60 mm de diâmetro, 5 W
Agarose GoldBiotechA-201
Anti-Erk 1/2 AnticorpoSinalização Celular9102
Anti-GAPDH AnticorpoinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry AnticorpoinvitrogenM11217
Anti-MEKSinalização Celular9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
Sinalização CelularAnti-paxilina2542
Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204Sinalização Celular9101
Anti-fosfo-pY249 p130CasSinalização Celular4014
Anti-fosfo-Y118 Sinalização Celular de Paxilina2541
Anto-fosfo-S217 / 221 Célula MEK Sinalização9121
Arduino Compatable Fonte de AlimentaçãoComputador CorporativoLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎
Câmara Celular AttofluorinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-products100-106Inativado por Calor Triplo 0.1 µ m estéril filtrado 
bRaf-V600E-VenusPresente do Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicilina (Dissódico)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Corante de membrana plasmática vermelho escuroinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
células competentes DH5a NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Enzima Dpn1 NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Ditiotreitol, Reagentes Cleland's 
EGTAAcros 
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronectina de plasma bovino Sigma F1141
FuGENE(R) 6 Reagente de Transfecção PromegaE2692Reagente de Transfecção
Gel Verde Mancha de Ácido Nucleico GoldBioG-740-500
Tinta de Carregamento em Gel Roxo 6x NEBB7024A
GeneJET Thermo Scientific K0692Kit de Extração de Gel 
Kit Miniprep de Plasmídeo GeneJETThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
Células HEK 293T ATCC CRL-11268
Células HeLa ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot RelayDigital LoggersDLI 705020645490Relé de controle AC/DC para iluminação
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
HQRP884667106091218Sistema de lâmpada de painel LED 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aSoftware para execução de Scripts CellGEO
MetamorphMolecular DevicesSoftware de Análise de Imagem
MgCl2 ÓleoFisher Chemical M33-500
Sigma Kit MiniPrep M5310
Escolha do gene:96-308
Mini-PROTEAN TGX Géis Pré-moldados 12 poçosBio-Rad4561085
Grau de Biologia Molecular Água Corning 46-000-CV 
Espelho Polichroic Multibanda89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS sem Ca e Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Presente do Laboratório do Dr. Channing Der, Tubos
de PCR UNC labForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubos e Caps, Rigid Strip Individualmente Attached Dome Caps 
Phusion Plus DNA PolimeraseThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Iluminador PadronizadoMightexDSI-G-00C
Primers Membranas de PVDF IDT
BioRad1620219Immun-Blot PVDF/Papel de Filtro Sanduíches 
T0.25% Tripsina, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sódioCorning 25-053-CI
Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 Para eletroforese 
Objetiva de Microscópio UPlanSApo 40xOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501Para interface TTL
β-MercaptoetanolFisher Chemical O3446I-100
Laemmli de Anticorpo A000066409910250Kit de extração de gel Sistema de Luz de Crescimento LED Mineral

Referências

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