Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Resumo

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Resumo

A lesão intestinal de isquemia-reperfusão (I/R) é uma condição aguda caracterizada por danos teciduais resultantes da restrição do fluxo sanguíneo para os vasos mesentéricos, levando a patologias locais e sistêmicas com mau prognóstico. Tanto a isquemia quanto a reperfusão desencadeiam uma série de respostas celulares e moleculares, com células inflamatórias servindo como reguladores-chave da patologia. Essas interações com o endotélio isquêmico são mediadas por múltiplos receptores de adesão. Vários modelos animais foram estabelecidos para mimetizar essa patologia e investigar as vias moleculares envolvidas. Neste estudo, um modelo microcirúrgico de lesão de I/R é combinado com microscopia intravital para visualizar o rolamento de leucócitos, adesão e formação de armadilha extracelular de neutrófilos (NET). Este modelo é aplicado a camundongos transgênicos deficientes em PAR1 endotelial (F2r) para avaliar o impacto de PAR1 no rolamento de leucócitos e na formação de NET 1 h após a isquemia e imediatamente após a reperfusão. In vivo, a coloração de leucócitos de laranja de acridina foi empregada e os TNEs foram visualizados usando uma coloração de ácido nucleico. Curiosamente, a adesão leucocitária reduzida e a formação de NET foram observadas em camundongos sem o receptor PAR1 endotelial. Este modelo permite a análise in vivo dos principais reguladores envolvidos na lesão de I/R.

Introdução

A isquemia mesentérica aguda (IAM) é uma patologia^rara1 com alto risco de^mortalidade2, caracterizada pela redução do fluxo sanguíneo no mesentério devido a trombos no eixo celíaco, ou na artéria mesentérica superior ou inferior. Em 60%-70% dos casos, as oclusões agudas da artéria mesentérica superior por trombose ou embolização são responsáveis pela isquemia intestinal aguda³. Em contraste, em 5-15% dos casos, a trombose venosa mesentérica é responsável por isquemia mesentérica envolvendo a veia mesentérica superior e, mais raramente, a veia mesentérica inferior⁴. A hipóxia e a desnutrição decorrentes da isquemia levam a distúrbios do metabolismo energético no nível celular⁵. Por exemplo, a função mitocondrial prejudicada ativa múltiplas vias de sinalização, iniciando mecanismos de morte celular⁶. Embora a reperfusão rápida permita a restauração do metabolismo aeróbio, a restauração do fluxo sanguíneo para uma região isquêmica geralmente causa lesão tecidual extensa devido à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)⁷, sobrecarga de cálcio⁸, disfunção endotelial⁹ e respostas inflamatórias¹⁰.

Muitos modelos animais experimentais que empregam oclusão vascular temporária da artéria mesentérica superior foram estabelecidos para elucidar os mecanismos moleculares durante a lesão de isquemia-reperfusão (I/R)¹¹. O uso de tais modelos em combinação com a microscopia intravital (MIV) é fundamental para obter informações sobre as interações celulares subjacentes e a progressão da doença¹¹. A disfunção da barreira intestinal é observada logo após a isquemia12, com o epitélio perdendo sua^{integridade13}, resultando em translocação bacteriana para locais extraintestinais, como linfonodos mesentéricos, baço, fígado e^rim12,14. A reperfusão agrava ainda mais a lesão da mucosa¹⁵. Uma resposta inflamatória nas arteríolas se manifesta pela adesão firme e rolante dos leucócitos na camada de células endoteliais, que é dependente de moléculas como L-selectina¹⁶, P-selectina (CD62P)¹⁷, plaquetas GPIIb/IIIa e fibrinogênio¹⁸. Curiosamente, a adesão de leucócitos às vênulas mesentéricas é influenciada pela presença de microbiota intestinal¹⁹ e sinalização do receptor Toll-like 4¹⁰. A lesão de I/R também desencadeia a formação de armadilha extracelular de neutrófilos (TNE)¹⁰. O direcionamento terapêutico do DNA extracelular, originado de leucócitos ativados, como neutrófilos, melhora o resultado da lesão intestinal I/R²⁰. No fígado, a lesão de I / R é inflamada por micrófagos residentes²¹, e a inibição do microRNA atenua notavelmente a apoptose²². É importante notar que a lesão de I/R no mesentério resulta em disbiose intestinal, que é reversível e resolvida após a revascularização²³.

O endotélio também é influenciado pelos efeitos prejudiciais da lesão de I/R, com ROS desempenhando um papel fundamental no processo²⁴. Observa-se adesão leucocitária à camada de células endoteliais, dano endotelial e alterações do metabolismo do óxido nítrico (NO)⁹. No entanto, as vias moleculares envolvidas ainda não foram totalmente exploradas.

O receptor ativado por protease 1 (PAR1, F2r) é um receptor de membrana expresso por uma variedade de células, incluindo células endoteliais, e é ativado durante condições inflamatórias²⁵. Sua ativação ocorre quando as serina proteases clivam o receptor no terminal N, expondo o ligante ligado que, por sua vez, ativa o receptor ligando-se à segunda alça extracelular da molécula²⁶. A via de sinalização do receptor endotelial da proteína C (EPCR)-PAR1 impacta a homeostase endotelial do NO e facilita a restauração do fluxo sanguíneo na isquemia periférica²⁷.

Neste estudo, a lesão de I / R foi aplicada a um modelo genético de camundongo caracterizado por deficiência de PAR1 específica de células endoteliais para visualizar o rolamento de leucócitos, adesão e formação de NET. A combinação de um modelo genético de camundongo e microscopia intravital após microcirurgia I/R fornece informações valiosas, destacando os tipos específicos de células envolvidas na progressão da doença. A aplicação de lesão de I / R a modelos genéticos de camundongos é fundamental na identificação de potenciais alvos terapêuticos que podem ser usados para melhorar o curso da doença. Além disso, foi demonstrada a significância do PAR1 endotelial na NETosis.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem ratinhos foram aprovados pelo comité local sobre a legislação dos animais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemanha; G21-1-041). 6-8 semanas de idade macho e fêmea B6. Camundongos FVB-F2rtm1a (EUCOMM) Tg / Cdh5-cre) 7Mlia / Tarc foram usados para o estudo. A regulação específica da célula endotelial de F2r (PAR1) ocorre através do promotor VE-Caderina Cre²⁸. Neste estudo, flox-F2r x VE-Caderina Cre⁺ (F2R^ΔEC) exibiu expressão reduzida de F2r (PAR1) nas células endoteliais, e flox-F2r x VE-Caderina Cre^- (WT) expressam níveis normais de F2r endotelial (PAR1). Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para a cirurgia

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos necessários (tesoura extra estreita reta, pinça, pinça vascular, etc.).
2. Prepare o sistema de anestesia à base de oxigênio e isoflurano com um cone nasal e uma placa de aquecimento.

2. Preparação animal

1. Pese o animal.
2. Realizar anestesia: Anestesie camundongos por meio de injeção intraperitoneal (ip) de uma solução contendo midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,5 mg/mL) e fentanil (0,5 mg/kg) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
3. Remova os pelos da área de operação do pescoço e abdômen com um barbeador elétrico para pequenos animais.
4. Posicione o mouse em decúbito dorsal na almofada de aquecimento e conecte-o ao sistema de oxigênio por meio de um cone nasal. Prenda os membros do mouse a uma almofada aquecida com fita cirúrgica. Certifique-se de que a membrana do cone do nariz de látex se encaixe firmemente sobre a cabeça do mouse. Monitore a temperatura corporal do animal por via retal usando um termômetro específico para roedores.
5. Aplique creme depilatório para remover qualquer resíduo de pêlos da área cirúrgica do pescoço e limpe a pele da área de operação com etanol a 70%.
6. Realize um teste de pinça do dedo do pé (reflexo pedal) para garantir que o animal esteja totalmente anestesiado.

3. Procedimento cirúrgico

1. Implante de cateter na veia jugular
   1. Faça uma incisão transversal (~0,5 cm) sobre a traqueia, remova a pele que cobre o pescoço e isole a veia jugular direita.
   2. Use um fio de seda de cerca de 5 cm, feche a extremidade distal da veia e fixe-a com uma pinça cirúrgica. Coloque três fios de seda cerca de 2 cm abaixo da veia: um próximo à extremidade distal e dois próximos à extremidade proximal da veia jugular. Dê um nó cirúrgico, mas não feche o vaso.
   3. Prepare um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno, 0,61 mm de diâmetro externo) preenchido com NaCl a 0,9% e conectado com uma seringa de 1 mL. Use uma tesoura para fazer um orifício entre o segundo e o terceiro nós e implante o cateter na veia jugular. Aspire a seringa para garantir que haja sangue no cateter.
   4. Fixe o cateter na veia amarrando o fio de seda, certificando-se de que esteja bem preso. Use fita adesiva para prender a seringa.
   5. Prepare a laranja de acridina: diluir 1:4 a solução estoque de 2 mg/mL com solução salina estéril (concentração final de 0,5 mg/mL) em uma seringa de 1 mL. Mantenha a seringa no escuro e injete 50 μL no mouse.
   6. Preparar o corante de ácido nucleico: diluir 1:1000 a 5 mM de solução salina estéril (concentração final de 5 μM) em uma seringa de 1 mL. Mantenha a seringa no escuro e injete 50 μL no mouse.
   7. Injete in vivo laranja de acridina (50 μg / μL, 50 μL por camundongo) através do cateter da veia jugular para visualizar leucócitos corados e um corante fluorescente de DNA extracelular de forma semelhante às armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (5 μM, 50 μL por camundongo). TNEs e leucócitos são visualizados simultaneamente.
2. Modelo de lesão I/R mesentérica
   1. Desinfete a pele abdominal com etanol a 70%.
   2. Realize uma laparotomia de 3-5 cm ao longo da linha alba usando uma tesoura cirúrgica.
   3. Usando duas pontas de algodão umedecidas com solução salina, remova suavemente o intestino e identifique um local com cobertura mínima de gordura. Posicione os ramos do intestino delgado em uma massa preta para reduzir o sinal de fundo.
   4. Adquira os vídeos antes de I/R (pré-isquemia).
   5. Faça uma compressa de umidade com NaCl e coloque o intestino nela. Certifique-se de que o intestino esteja cercado pela compressa e mantenha a umidade durante a etapa 5.6.
   6. Ocluir a artéria mesentérica superior com uma pequena pinça vascular.
   7. Empurre suavemente o intestino de volta para a cavidade abdominal usando cotonetes umedecidos com solução salina e use uma sutura 7-0 para fechar a parede abdominal para evitar perda de umidade e temperatura. Manter a isquemia por 60 min, verificando a anestesia pelo menos a cada 20 min.
   8. Após 1 h, inicie a reperfusão removendo a pinça.
      NOTA: A execução adequada do procedimento de isquemia resulta em uma mudança visível. Inicialmente, a área afetada parecerá pálida ou branca devido à falta de fluxo sanguíneo. Após a remoção da pinça, o fluxo sanguíneo retornará gradualmente à região isquêmica, que recuperará sua cor normal, significando uma oclusão bem-sucedida. É imperativo observar de perto o camundongo continuamente durante todo o estágio de isquemia.
   9. Após o período isquêmico, aplique algumas gotas de solução salina na área cortada e, em seguida, remova suavemente os clipes microvasculares usando um aplicador de clipe.
   10. Usando pontas de algodão umedecidas com solução salina, remova suavemente o intestino novamente, posicione os pequenos ramos da veia sobre uma massa preta, injete 50 μL de laranja de acridina novamente e capture os vídeos da mesma veia no mesmo local (pós-isquemia).

4. Microscopia de epifluorescência de vídeo intravital de alta velocidade

1. Visualize leucócitos e TNEs com um microscópio de fluorescência de campo amplo de alta velocidade equipado com um condensador de longa distância, um monocromador, uma objetiva de imersão em água de 10x e uma câmera de dispositivo de carga acoplada. A aquisição das imagens foi realizada com tempo de exposição de 30 ms e filtros Alexa Fluor 488 (495/519) e Vermelho de Rodamina (570/590).
2. Use software de imagem para aquisição e análise de imagens.
3. Quantifique o recrutamento celular dentro de uma região de interesse de 0,06 mm².
4. Quantifique os leucócitos aderentes como células que permanecem estacionárias ou ligadas ao revestimento endotelial por um período de observação de 20 s.
5. Identifique NETs como estruturas extracelulares marcadas com corantes fluorescentes de leucócitos e ácidos nucleicos extracelulares.
6. Eutanásia dos animais por luxação cervical ao final do experimento (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).

5. Isolamento de células endoteliais hepáticas (LEC) e RT-PCR quantitativo

1. Isole LECs por meio de classificação magnética de células (MACS)²⁹.
2. Isole o RNA total.
3. Realize a síntese de DNA complementar (cDNA)²⁷ misturando 2 μg de RNA total com 2 μL de tampão RT, 0,8 μL de mistura dNTP, 2 μL de primers aleatórios RT, 1 μL de transcriptase reversa e 4,2 μL de H₂O estéril.
4. A transcrição do cDNA foi realizada aplicando as seguintes condições: 25 °C por 10 min, 37 °C por 120 min, 85 °C por 5 min.
5. Use 20 ng de cDNA para qPCR.
6. Use os seguintes primers: F2r (para frente): TGAACCCCCGCTCATTCTTTTTC, F2r (reverso): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (para frente): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (reverso): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilizar as seguintes condições: 95 °C 30 s, 45 ciclos de (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 25 s), 60 °C a 95 °C durante 6 s com ΔΤ 1 °C.

Resultados

Para estudar os efeitos dependentes das células endoteliais no rolamento e adesão de leucócitos, bem como na formação de NET, inicialmente, a eficácia da deficiência de F2r induzível por VE-Caderina Cre foi examinada em células endoteliais. A classificação magnética de células foi empregada para isolar as células endoteliais hepáticas. Posteriormente, o RNA foi isolado, seguido por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os camundongos F2r^ΔEC , nos quais a Cre recombinase expressa sob o controle do promotor VE-Caderina está ausente, mostraram níveis de mRNA F2r (PAR1) significativamente reduzidos (aprox. em um terço) em comparação com os controles WT (Figura 1).

Após a confirmação da deficiência na linhagem de camundongos, a lesão I/R mesentérica foi realizada para examinar o impacto da PAR1 expressa pelas células endoteliais vasculares no rolamento e adesão dos leucócitos, visualizada por microscopia intravital (Figura 2A,B). Após 1 h de isquemia, a pinça foi removida e o vaso foi autorizado a reperfundir. O rolamento e a adesão dos leucócitos foram observados e registrados (corados de verde, indicados por setas brancas). Embora ambos os grupos tenham mostrado aumento do número de leucócitos aderentes após a lesão de I/R, a deficiência de F2r endotelial (PAR1) resultou em uma adesão leucocitária acentuada, mas não significativamente diminuída, ao endotélio mesentérico ativado por I/R, sugerindo um papel ativo da ativação endotelial de PAR1 no recrutamento de leucócitos para as vênulas mesentéricas isquêmicas (Figura 2C).

O próximo objetivo foi examinar se a expressão endotelial de PAR1 regula a formação de NET induzida por lesão de I/R. Portanto, os ácidos nucléicos extracelulares foram corados com um corante impermeável às células³⁰ e visualizados os TNEs gerados usando microscopia intravital (indicada por setas pretas) (Figura 2A,B). Após a lesão de I/R, os TNEs foram observados apenas no grupo WT expressando níveis normais de PAR1 nas células endoteliais, indicando um papel regulador de PAR1 na NETosis (Figura 2C,D). Notavelmente, quando a expressão endotelial de F2r foi suprimida, nenhum NETs estava presente nas vênulas mesentéricas lesionadas por I / R.

Figura 1: Expressão de mRNA F2r (PAR1). Expressão de células endoteliais hepáticas F2r de camundongos WT (n = 6) e F2r^ΔEC (n = 9) em relação ao gene de manutenção L32. Os dados são apresentados como mediana com intervalo de confiança de 95%. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar dois grupos independentes, *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: PAR1 endotelial afeta a adesão leucocitária e a formação de NET em vênulas mesentéricas lesadas por I/R. Imagens representativas de microscopia intravital de leucócitos aderentes corados com laranja de acridina (setas brancas) e NETs corados com Sytox Orange (setas pretas) de camundongos WT e F2r^ΔEC antes (pré) e depois (pós) lesão de I/R (A) 10x e (B) 20x de aumento. Barras de escala: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adesão leucocitária e (D) NETs por mm² de camundongos WT (n = 7) e F2r^ΔEC (n = 4) antes (pré) e depois (pós) lesão de I / R. Todos os dados foram representados como mediana com intervalo de confiança de 95%. As comparações estatísticas foram realizadas por meio do teste ANOVA de duas vias, **p< 0,01, e dos testes de comparações múltiplas de Sídák para comparar as médias de diferentes genótipos em cada momento (pré e pós-isquemia). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A lesão mesentérica I/R combinada com microscopia intravital foi aplicada a um modelo genético de camundongo com deficiência de F2r (PAR1) em células endoteliais para a análise in vivo de leucócitos e TNEs após 1 h de isquemia. O modelo de lesão mesentérica I/R é frequentemente utilizado em roedores, com tempos de isquemia e reperfusão variando de minutos a várias horas^23,31, influenciando o desfecho inflamatório³² e a mortalidade³³. O modelo também depende de vários fatores, incluindo microbiota^19,34, receptores imunológicos 10,35,36,37, sexo ^38,39 e idade³⁵. Além de variar os tempos de I/R, outra variável nesse modelo é a resposta diferencial de diferentes partes do intestino à lesão, com o intestino delgado apresentando maior dano à mucosa do que o cólon⁴⁰. O posicionamento do clipe microvascular acometendo a região isquêmica é crucial para a reprodutibilidade do método^32,33. É importante ressaltar que a oclusão da artéria mesentérica superior combinada com a interrupção do fluxo colateral produz taxas de mortalidade consistentemente relacionadas à duração da isquemia⁴¹.

Neste estudo, os camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia, e a adesão leucocitária in vivo e a formação de TNE foram visualizadas imediatamente após a reperfusão para examinar a resposta inflamatória precoce desencadeada pelo estado isquêmico na ausência de expressão endotelial de F2r . A aplicação desses métodos a modelos genéticos de camundongos permite a investigação de como certas moléculas-alvo afetam o comportamento celular e a resposta inflamatória após a isquemia e durante a reperfusão.

Existem várias etapas críticas no protocolo, incluindo a manutenção da integridade intestinal. O manuseio do intestino deve ser feito com cuidado para evitar danos aos tecidos. Para isso, cotonetes úmidos são a ferramenta apropriada para separar temporariamente o intestino da cavidade abdominal. É crucial que o intestino permaneça úmido até que seja reposicionado no abdômen. Pequenas lesões no manuseio podem desencadear a ativação de vários tipos de células, como plaquetas e células endoteliais, o que pode afetar os resultados.

Para consistência, é crucial visualizar o mesmo local dos segmentos intestinais antes e depois da isquemia. Isso pode ser desafiador porque o intestino é reposicionado na cavidade abdominal após a isquemia. Para resolver esse problema, uma abordagem é colocar um pequeno pedaço de compressa úmida na parte do intestino que foi visualizada antes da isquemia.

Para visualizar o rolamento e a adesão de leucócitos, bem como a formação de NET in vivo, os camundongos foram injetados com um corante de fluorescência de leucócitos e um ácido nucleico através da veia jugular. O corante leucocitário (ver Tabela de Materiais) é um corante de fluorescência metacromático permeável às células que se liga aos glóbulos brancos, mas não aos glóbulos vermelhos, e tem sido amplamente utilizado para corar leucócitos in vivo^17,42. O corante é aplicado por via intravenosa e fornece forte coloração de leucócitos em segundos. No entanto, a especificidade pode ser uma limitação, pois também cora outras células nucleadas, como as células endoteliais. No entanto, as células circulatórias retêm a coloração por mais tempo devido a um efeito de lavagem⁴³. O corante de fluorescência de ácido nucleico (ver Tabela de Materiais) é uma coloração de ácido nucleico impermeável a células comumente usada para visualizar a formação de NET 30,44,45. Também pode ser aplicado por via intravenosa, liga-se com alta afinidade e é rápido e fácil de usar. Novamente, a especificidade é uma desvantagem, pois o corante se ligará a qualquer célula com uma membrana não intacta. Idealmente, ele deve ser combinado com um marcador de neutrófilos (por exemplo, CD15, CD11b) ou um marcador de NETose (por exemplo, anticorpos anti-citH3) para aumentar a especificidade. Esses corantes permitem imagens in vivo de leucócitos nas vênulas mesentéricas de animais de laboratório.

A principal limitação da técnica é a presença de gordura visceral, que restringe a visualização dos capilares intestinais e dificulta muito a aquisição da imagem. Para evitar essa complicação, é necessário usar animais experimentais jovens (6-8 semanas de idade) que tenham reduzido a formação de gordura visceral. Além disso, a análise histológica ex vivo é dificultada pelo uso de coloração in vivo . Outra limitação é o impacto da microbiota intestinal e da dieta neste modelo, que pode variar fortemente entre diferentes criações de camundongos⁴⁶. Para suprir essa limitação, o estudo de modelos de camundongos gnotobióticos poderia ser considerado¹⁰.

Neste estudo, a resposta celular imediata foi investigada após a isquemia, e a redução da deposição de leucócitos para o endotélio mesentérico ativado e a formação de NET foram observadas in vivo. A degradação do TNE por administração intravenosa de DNase 1 h após a isquemia reduz a resposta pró-inflamatória precoce e melhora a ruptura da barreira intestinal⁴⁷. É importante notar que o tratamento com trombomodulina, uma glicoproteína transmembrana que inibe a atividade da trombina⁴⁸, melhorou a sobrevida de camundongos com lesão intestinal grave de I / R, atenuando a resposta inflamatória da disfunção endotelial e reduzindo o intenso acúmulo de histonas em órgãos remotos⁴⁹. Aqui, o receptor de trombina endotelial demonstrou influenciar o resultado de I / R, destacando a importância de combinar o modelo de lesão de I / R intestinal com microscopia intravital em camundongos geneticamente modificados para investigar mediadores importantes da patologia da doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laranja acridina	Sigma-Aldrich	Placa de 96 poços A-6014
Multiply PCR-Platten	Sarstedt	721977202.00
Sistemas de anestesia para roedores	GROPPLER medizintechnik	Uni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVM	B Braun Melsungen	53402101
massa preta	Staedtler		massa de modelar
CD146 Microesferas, rato	Miltenyi Biotec	130-092-007
cellSens	Olympus	Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3	câmera
dispositivo de carga acoplada com software	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2	câmera
cotonetes	Bö ttger	09-119-9100
Hemostat Curvado 125mm/5"	Indigo Instruments	22466
Creme depilatório	Balea	não aplicável
Dorbene Vet	zoetis
Dumont Fórceps	Fine Science Tools	11251-35
Etanol p.a. 99,5 %	Roth	5504.20
Tesoura Extra Estreita – Straight/Sharp-Sharp/10.5	FST	14088-10
Fentanyl	Janssen-Cilag GmBH
Fórceps "Dumont #5" (Inox, ponta 0.1mm, comprimento 11 cm)	FST	11251-20
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-236
Graphpadprism	Graphpad	Prism 10	software
isoflurano	Piramal	4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml	BioRad	1725125.00
Fita médica Leukofix	BSNMedical	0213600
Kit de Dissociação do Fígado, mouse	Miltenyi Biotec	130-105-807
Colunas de separação LS MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µ m	Miltenyi Biotec	130-098-463
Microseal B Seal Seals	Biorad	MSB1001
Midazolam	hameln	5918501.00
NaCl		Braun 2350748
Porta-agulhas	FST	12001-13
Sutura de Seda Trançada Não Absorvível, Tamanho: 7/0, 91 Metros	Ferramentas de Ciência Fina	18020-70
Microscópio de fluorescência Olympus BX51WI	Microscópio	Olympus
PCR para tiras de tubo	Sarstedt	72985002.00
Tampas de tubo PCR	Sarstedt	65989002.00
Cateter de plietileno	Smith Medical Deutschland GmbH	800/100/100
Prolene (8648G), polipropileno 6-0, Matéria	Johnson & Johnson Medical GmbH	8695H
Relia Prep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6112
Kit de Inscrição Reversa (cDNA de Alta Capacidade)	Applied Biosystems	4368813.00
Escala escolar	KERN & SOHN GmbH	EMB 500-1
Tesoura de Mola - Inclinada para o Lado	FST	15006-09
Microscópio Estéreo	Leica	M50
Straight Hemostats 135mm/5.5"	Indigo Instruments	22468
Seringa 1 mL	Braun	9166017V
SYTOX Laranja	Thermo Fisher Scientific	S11368
Controlador de Temperatura TC-1000	FMI Fö hr Medical Instruments GmbH	não aplicável
Pinça de tecido - 1x2 dentes	FST	18057-14
braçadeira vascular	Fine Science Tools	18055-02
Vetiva mini	WAHL	1584-0480