É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

1.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 de setembro de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Resumo

A lesão intestinal de isquemia-reperfusão (I/R) é uma condição aguda caracterizada por danos teciduais resultantes da restrição do fluxo sanguíneo para os vasos mesentéricos, levando a patologias locais e sistêmicas com mau prognóstico. Tanto a isquemia quanto a reperfusão desencadeiam uma série de respostas celulares e moleculares, com células inflamatórias servindo como reguladores-chave da patologia. Essas interações com o endotélio isquêmico são mediadas por múltiplos receptores de adesão. Vários modelos animais foram estabelecidos para mimetizar essa patologia e investigar as vias moleculares envolvidas. Neste estudo, um modelo microcirúrgico de lesão de I/R é combinado com microscopia intravital para visualizar o rolamento de leucócitos, adesão e formação de armadilha extracelular de neutrófilos (NET). Este modelo é aplicado a camundongos transgênicos deficientes em PAR1 endotelial (F2r) para avaliar o impacto de PAR1 no rolamento de leucócitos e na formação de NET 1 h após a isquemia e imediatamente após a reperfusão. In vivo, a coloração de leucócitos de laranja de acridina foi empregada e os TNEs foram visualizados usando uma coloração de ácido nucleico. Curiosamente, a adesão leucocitária reduzida e a formação de NET foram observadas em camundongos sem o receptor PAR1 endotelial. Este modelo permite a análise in vivo dos principais reguladores envolvidos na lesão de I/R.

Introdução

A isquemia mesentérica aguda (IAM) é uma patologiarara1 com alto risco demortalidade2, caracterizada pela redução do fluxo sanguíneo no mesentério devido a trombos no eixo celíaco, ou na artéria mesentérica superior ou inferior. Em 60%-70% dos casos, as oclusões agudas da artéria mesentérica superior por trombose ou embolização são responsáveis pela isquemia intestinal aguda3. Em contraste, em 5-15% dos casos, a trombose venosa mesentérica é responsável por isquemia mesentérica envolvendo a veia mesentérica superior e, mais raramente, a veia mesentérica inferior4. A hipóxia e a desnutrição decorrentes da isquemia levam a distúrbios do metabolismo energético no nível celular5. Por exemplo, a função mitocondrial prejudicada ativa múltiplas vias de sinalização, iniciando mecanismos de morte celular6. Embora a reperfusão rápida permita a restauração do metabolismo aeróbio, a restauração do fluxo sanguíneo para uma região isquêmica geralmente causa lesão tecidual extensa devido à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)7, sobrecarga de cálcio8, disfunção endotelial9 e respostas inflamatórias10.

Muitos modelos animais experimentais que empregam oclusão vascular temporária da artéria mesentérica superior foram estabelecidos para elucidar os mecanismos moleculares durante a lesão de isquemia-reperfusão (I/R)11. O uso de tais modelos em combinação com a microscopia intravital (MIV) é fundamental para obter informações sobre as interações celulares subjacentes e a progressão da doença11. A disfunção da barreira intestinal é observada logo após a isquemia12, com o epitélio perdendo suaintegridade13, resultando em translocação bacteriana para locais extraintestinais, como linfonodos mesentéricos, baço, fígado erim12,14. A reperfusão agrava ainda mais a lesão da mucosa15. Uma resposta inflamatória nas arteríolas se manifesta pela adesão firme e rolante dos leucócitos na camada de células endoteliais, que é dependente de moléculas como L-selectina16, P-selectina (CD62P)17, plaquetas GPIIb/IIIa e fibrinogênio18. Curiosamente, a adesão de leucócitos às vênulas mesentéricas é influenciada pela presença de microbiota intestinal19 e sinalização do receptor Toll-like 410. A lesão de I/R também desencadeia a formação de armadilha extracelular de neutrófilos (TNE)10. O direcionamento terapêutico do DNA extracelular, originado de leucócitos ativados, como neutrófilos, melhora o resultado da lesão intestinal I/R20. No fígado, a lesão de I / R é inflamada por micrófagos residentes21, e a inibição do microRNA atenua notavelmente a apoptose22. É importante notar que a lesão de I/R no mesentério resulta em disbiose intestinal, que é reversível e resolvida após a revascularização23.

O endotélio também é influenciado pelos efeitos prejudiciais da lesão de I/R, com ROS desempenhando um papel fundamental no processo24. Observa-se adesão leucocitária à camada de células endoteliais, dano endotelial e alterações do metabolismo do óxido nítrico (NO)9. No entanto, as vias moleculares envolvidas ainda não foram totalmente exploradas.

O receptor ativado por protease 1 (PAR1, F2r) é um receptor de membrana expresso por uma variedade de células, incluindo células endoteliais, e é ativado durante condições inflamatórias25. Sua ativação ocorre quando as serina proteases clivam o receptor no terminal N, expondo o ligante ligado que, por sua vez, ativa o receptor ligando-se à segunda alça extracelular da molécula26. A via de sinalização do receptor endotelial da proteína C (EPCR)-PAR1 impacta a homeostase endotelial do NO e facilita a restauração do fluxo sanguíneo na isquemia periférica27.

Neste estudo, a lesão de I / R foi aplicada a um modelo genético de camundongo caracterizado por deficiência de PAR1 específica de células endoteliais para visualizar o rolamento de leucócitos, adesão e formação de NET. A combinação de um modelo genético de camundongo e microscopia intravital após microcirurgia I/R fornece informações valiosas, destacando os tipos específicos de células envolvidas na progressão da doença. A aplicação de lesão de I / R a modelos genéticos de camundongos é fundamental na identificação de potenciais alvos terapêuticos que podem ser usados para melhorar o curso da doença. Além disso, foi demonstrada a significância do PAR1 endotelial na NETosis.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem ratinhos foram aprovados pelo comité local sobre a legislação dos animais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemanha; G21-1-041). 6-8 semanas de idade macho e fêmea B6. Camundongos FVB-F2rtm1a (EUCOMM) Tg / Cdh5-cre) 7Mlia / Tarc foram usados para o estudo. A regulação específica da célula endotelial de F2r (PAR1) ocorre através do promotor VE-Caderina Cre28. Neste estudo, flox-F2r x VE-Caderina Cre+ (F2RΔEC) exibiu expressão reduzida de F2r (PAR1) nas células endoteliais, e flox-F2r x VE-Caderina Cre- (WT) expressam níveis normais de F2r endotelial (PAR1). Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para a cirurgia

  1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos necessários (tesoura extra estreita reta, pinça, pinça vascular, etc.).
  2. Prepare o sistema de anestesia à base de oxigênio e isoflurano com um cone nasal e uma placa de aquecimento.

2. Preparação animal

  1. Pese o animal.
  2. Realizar anestesia: Anestesie camundongos por meio de injeção intraperitoneal (ip) de uma solução contendo midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,5 mg/mL) e fentanil (0,5 mg/kg) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  3. Remova os pelos da área de operação do pescoço e abdômen com um barbeador elétrico para pequenos animais.
  4. Posicione o mouse em decúbito dorsal na almofada de aquecimento e conecte-o ao sistema de oxigênio por meio de um cone nasal. Prenda os membros do mouse a uma almofada aquecida com fita cirúrgica. Certifique-se de que a membrana do cone do nariz de látex se encaixe firmemente sobre a cabeça do mouse. Monitore a temperatura corporal do animal por via retal usando um termômetro específico para roedores.
  5. Aplique creme depilatório para remover qualquer resíduo de pêlos da área cirúrgica do pescoço e limpe a pele da área de operação com etanol a 70%.
  6. Realize um teste de pinça do dedo do pé (reflexo pedal) para garantir que o animal esteja totalmente anestesiado.

3. Procedimento cirúrgico

  1. Implante de cateter na veia jugular
    1. Faça uma incisão transversal (~0,5 cm) sobre a traqueia, remova a pele que cobre o pescoço e isole a veia jugular direita.
    2. Use um fio de seda de cerca de 5 cm, feche a extremidade distal da veia e fixe-a com uma pinça cirúrgica. Coloque três fios de seda cerca de 2 cm abaixo da veia: um próximo à extremidade distal e dois próximos à extremidade proximal da veia jugular. Dê um nó cirúrgico, mas não feche o vaso.
    3. Prepare um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno, 0,61 mm de diâmetro externo) preenchido com NaCl a 0,9% e conectado com uma seringa de 1 mL. Use uma tesoura para fazer um orifício entre o segundo e o terceiro nós e implante o cateter na veia jugular. Aspire a seringa para garantir que haja sangue no cateter.
    4. Fixe o cateter na veia amarrando o fio de seda, certificando-se de que esteja bem preso. Use fita adesiva para prender a seringa.
    5. Prepare a laranja de acridina: diluir 1:4 a solução estoque de 2 mg/mL com solução salina estéril (concentração final de 0,5 mg/mL) em uma seringa de 1 mL. Mantenha a seringa no escuro e injete 50 μL no mouse.
    6. Preparar o corante de ácido nucleico: diluir 1:1000 a 5 mM de solução salina estéril (concentração final de 5 μM) em uma seringa de 1 mL. Mantenha a seringa no escuro e injete 50 μL no mouse.
    7. Injete in vivo laranja de acridina (50 μg / μL, 50 μL por camundongo) através do cateter da veia jugular para visualizar leucócitos corados e um corante fluorescente de DNA extracelular de forma semelhante às armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (5 μM, 50 μL por camundongo). TNEs e leucócitos são visualizados simultaneamente.
  2. Modelo de lesão I/R mesentérica
    1. Desinfete a pele abdominal com etanol a 70%.
    2. Realize uma laparotomia de 3-5 cm ao longo da linha alba usando uma tesoura cirúrgica.
    3. Usando duas pontas de algodão umedecidas com solução salina, remova suavemente o intestino e identifique um local com cobertura mínima de gordura. Posicione os ramos do intestino delgado em uma massa preta para reduzir o sinal de fundo.
    4. Adquira os vídeos antes de I/R (pré-isquemia).
    5. Faça uma compressa de umidade com NaCl e coloque o intestino nela. Certifique-se de que o intestino esteja cercado pela compressa e mantenha a umidade durante a etapa 5.6.
    6. Ocluir a artéria mesentérica superior com uma pequena pinça vascular.
    7. Empurre suavemente o intestino de volta para a cavidade abdominal usando cotonetes umedecidos com solução salina e use uma sutura 7-0 para fechar a parede abdominal para evitar perda de umidade e temperatura. Manter a isquemia por 60 min, verificando a anestesia pelo menos a cada 20 min.
    8. Após 1 h, inicie a reperfusão removendo a pinça.
      NOTA: A execução adequada do procedimento de isquemia resulta em uma mudança visível. Inicialmente, a área afetada parecerá pálida ou branca devido à falta de fluxo sanguíneo. Após a remoção da pinça, o fluxo sanguíneo retornará gradualmente à região isquêmica, que recuperará sua cor normal, significando uma oclusão bem-sucedida. É imperativo observar de perto o camundongo continuamente durante todo o estágio de isquemia.
    9. Após o período isquêmico, aplique algumas gotas de solução salina na área cortada e, em seguida, remova suavemente os clipes microvasculares usando um aplicador de clipe.
    10. Usando pontas de algodão umedecidas com solução salina, remova suavemente o intestino novamente, posicione os pequenos ramos da veia sobre uma massa preta, injete 50 μL de laranja de acridina novamente e capture os vídeos da mesma veia no mesmo local (pós-isquemia).

4. Microscopia de epifluorescência de vídeo intravital de alta velocidade

  1. Visualize leucócitos e TNEs com um microscópio de fluorescência de campo amplo de alta velocidade equipado com um condensador de longa distância, um monocromador, uma objetiva de imersão em água de 10x e uma câmera de dispositivo de carga acoplada. A aquisição das imagens foi realizada com tempo de exposição de 30 ms e filtros Alexa Fluor 488 (495/519) e Vermelho de Rodamina (570/590).
  2. Use software de imagem para aquisição e análise de imagens.
  3. Quantifique o recrutamento celular dentro de uma região de interesse de 0,06 mm².
  4. Quantifique os leucócitos aderentes como células que permanecem estacionárias ou ligadas ao revestimento endotelial por um período de observação de 20 s.
  5. Identifique NETs como estruturas extracelulares marcadas com corantes fluorescentes de leucócitos e ácidos nucleicos extracelulares.
  6. Eutanásia dos animais por luxação cervical ao final do experimento (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).

5. Isolamento de células endoteliais hepáticas (LEC) e RT-PCR quantitativo

  1. Isole LECs por meio de classificação magnética de células (MACS)29.
  2. Isole o RNA total.
  3. Realize a síntese de DNA complementar (cDNA)27 misturando 2 μg de RNA total com 2 μL de tampão RT, 0,8 μL de mistura dNTP, 2 μL de primers aleatórios RT, 1 μL de transcriptase reversa e 4,2 μL de H2O estéril.
  4. A transcrição do cDNA foi realizada aplicando as seguintes condições: 25 °C por 10 min, 37 °C por 120 min, 85 °C por 5 min.
  5. Use 20 ng de cDNA para qPCR.
  6. Use os seguintes primers: F2r (para frente): TGAACCCCCGCTCATTCTTTTTC, F2r (reverso): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (para frente): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (reverso): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilizar as seguintes condições: 95 °C 30 s, 45 ciclos de (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 25 s), 60 °C a 95 °C durante 6 s com ΔΤ 1 °C.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Para estudar os efeitos dependentes das células endoteliais no rolamento e adesão de leucócitos, bem como na formação de NET, inicialmente, a eficácia da deficiência de F2r induzível por VE-Caderina Cre foi examinada em células endoteliais. A classificação magnética de células foi empregada para isolar as células endoteliais hepáticas. Posteriormente, o RNA foi isolado, seguido por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os camundongos F2rΔEC , nos quais a Cre recombinase expressa sob o con...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A lesão mesentérica I/R combinada com microscopia intravital foi aplicada a um modelo genético de camundongo com deficiência de F2r (PAR1) em células endoteliais para a análise in vivo de leucócitos e TNEs após 1 h de isquemia. O modelo de lesão mesentérica I/R é frequentemente utilizado em roedores, com tempos de isquemia e reperfusão variando de minutos a várias horas23,31, influenciando o desfecho inflamatóri...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não divulgam conflito de interesses.

Agradecimentos

C.R. agradece o financiamento da Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz e ReALity (projeto MORE), do BMBF Cluster4Future CurATime (projeto MicrobAIome; 03ZU1202CA), da Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) e do Fundo de Inovação "Microbiome" da Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) (81X2210129). C.R. é cientista do Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK). C.R. é membro do Centro de Biologia Vascular Translacional (CTVB), do Centro de Pesquisa em Imunoterapia (FZI) e da Potentialbereich EXPOHEALTH da Johannes Gutenberg-University Mainz. C.R. é membro da Unidade de Pesquisa DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. foi premiado com uma bolsa do Gutenberg Research College da Johannes Gutenberg-University Mainz. K.K. é apoiado pelo Programa de Excelência "Promoção de Mulheres Cientistas" do DZHK e é membro do Young DZHK. Z.G e O.D. são estudantes de doutorado na Escola de Pesquisa de Biomedicina Translacional de Mainz (TransMed).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Laranja acridinaSigma-Aldrich   Placa de 96 poços A-6014
Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Sistemas de anestesia para roedoresGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
massa pretaStaedtlermassa de modelar
CD146 Microesferas, ratoMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3câmera
dispositivo de carga acoplada com softwareHamamatsu PhotonicsORCA-R2câmera
cotonetesBö ttger09-119-9100
Hemostat Curvado 125mm/5"Indigo Instruments 22466
Creme depilatórioBaleanão aplicável
Dorbene Vetzoetis
Dumont FórcepsFine Science Tools11251-35
Etanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Tesoura Extra Estreita – Straight/Sharp-Sharp/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Fórceps "Dumont #5" (Inox, ponta 0.1mm, comprimento 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10software
isoflurano Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Fita médica LeukofixBSNMedical0213600
Kit de Dissociação do Fígado, mouseMiltenyi Biotec130-105-807
Colunas de separação LS MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µ mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun 2350748
Porta-agulhasFST12001-13
Sutura de Seda Trançada Não Absorvível, Tamanho: 7/0, 91 Metros Ferramentas de Ciência Fina18020-70
Microscópio de fluorescência Olympus BX51WIMicroscópioOlympus
PCR para tiras de tuboSarstedt72985002.00
Tampas de tubo PCRSarstedt65989002.00
Cateter de plietilenoSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), polipropileno 6-0, Matéria Johnson & Johnson Medical GmbH8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Kit de Inscrição Reversa (cDNA de Alta Capacidade)Applied Biosystems4368813.00
Escala escolar KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Tesoura de Mola - Inclinada para o LadoFST15006-09
Microscópio EstéreoLeicaM50
Straight Hemostats 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Seringa 1 mLBraun9166017V
SYTOX LaranjaThermo Fisher ScientificS11368
Controlador de Temperatura TC-1000FMI Fö hr Medical Instruments GmbHnão aplicável
Pinça de tecido - 1x2 dentesFST18057-14
braçadeira vascularFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480
de

Referências

  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Adesão de LeucócitosPAR1 EndotelialCamundongos Germ-FreeMicroscopia de FluorescênciaRolamento de Leucócitos
Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.