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Preparação de hidrogéis de peptídeos automontados mecanicamente estáveis

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DOI:

10.3791/67267

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6 de setembro de 2024

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1The First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2The National Engineering Research Center for Bioengineering Drugs and the Technologies, Institute of Translational Medicine, Nanchang University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta três métodos de preparação rápidos e simples que utilizam condições ambientais para desencadear a automontagem de peptídeos em hidrogéis. Além disso, a caracterização de hidrogéis peptídicos é descrita, demonstrando que hidrogéis peptídicos mecanicamente estáveis podem ser formados sob essas condições diretas.

Resumo

Os hidrogéis peptídicos são géis de rede tridimensionais altamente hidrofílicos formados pela automontagem de nanofibras ou polímeros, criando redes de bloqueio de água. Sua morfologia se assemelha muito à da matriz extracelular, permitindo que eles exibam as funções biológicas dos peptídeos e as propriedades de gelificação responsivas. Essas características únicas levaram à sua ampla aplicação em engenharia de tecidos, cultura de células tridimensionais, terapia do câncer, medicina regenerativa e outros campos biomédicos. Este artigo descreve três métodos para preparar hidrogéis peptídicos ECF-5 usando peptídeos automontáveis com processos de gelificação ambientalmente responsivos: (1) gelificação responsiva ao pH: níveis variados de pH induzem a protonação ou desprotonação de resíduos de aminoácidos, alterando as interações eletrostáticas entre moléculas peptídicas e promovendo sua automontagem em hidrogéis; (2) Adição de íons metálicos: íons metálicos polivalentes quelatam com resíduos de aminoácidos carregados negativamente, atuando como pontes entre peptídeos para formar um hidrogel em rede; (3) Troca de solventes: peptídeos hidrofóbicos são inicialmente dissolvidos em solventes orgânicos apolares e, posteriormente, induzem a automontagem em hidrogéis após a transição para um ambiente aquoso polar. Esses métodos utilizam procedimentos experimentais convencionais para facilitar a automontagem do peptídeo em hidrogéis. Ao projetar sequências de peptídeos para se alinharem com condições específicas de indução de gelificação, é possível obter micro/nanoestruturas e funções biológicas finamente ajustadas, destacando o potencial significativo dos hidrogéis peptídicos no domínio biomédico.

Introdução

Através do desenho de sequências peptídicas, interações não covalentes entre peptídeos induzem a automontagem, levando à formação de estruturas micro e nanométricas ordenadas, incluindo nanotubos, nanofitas, nanofibras e estruturas esféricas1. Quando automontadas em fibras/fitas micro e nanométricas, essas estruturas exibem macroscopicamente propriedades de hidrogel. Os hidrogéis de automontagem de peptídeos diferem dos hidrogéis poliméricos porque se automontam por meio de interações não covalentes, sua forma de gel é reversível e respondem prontamente a condições específicas para a transição entre as fases2 da solução e do gel. Por exemplo, peptídeos de aminoácidos aromáticos podem ser induzidos a gelatinizar com base na troca de solvente 3,4,5, peptídeos RADA16 formam géis por meio de interações eletrostáticas catiônicas e aniônicas6 e o peptídeo E1Y9 é induzido a formar um hidrogel via íons Ca2+ 7. Os aminoácidos naturais podem ser metabolizados pelo corpo humano e oferecem excelente biocompatibilidade, uma característica que os hidrogéis poliméricos não conseguem alcançar8. As proteínas são as moléculas que executam funções biológicas, e as diferenças nas sequências de peptídeos criam suas funções biológicas específicas. Portanto, incorporar sequências peptídicas biofuncionais específicas e dotá-las de propriedades de automontagem pode projetar hidrogéis de automontagem de peptídeos com funções e morfologias biológicas únicas 9,10,11. Este artigo apresenta três métodos para a preparação de hidrogéis peptídicos, onde o processo de gelificação é desencadeado pela capacidade de resposta ambiental. Também discute brevemente métodos para caracterizar as propriedades mecânicas e a morfologia dos hidrogéis peptídicos.

O pH regula a carga de aminoácidos, desencadeando a gelificação de alguns peptídeos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (por exemplo, arginina, lisina, histidina) são regulados pelo pH para atingir estados positivos ou neutros. Os aminoácidos carregados negativamente são regulados pelo pH para atingir estados negativos ou neutros, afastando-se de seu ponto isoelétrico e, assim, alterando sua hidrofilicidade em soluções aquosas. Portanto, o controle das interações eletrostáticas e hidrofóbicas entre os peptídeos facilita sua automontagem ordenada. Zhang et al. projetaram um peptídeo anfifílico de automontagem responsivo ao pH, KKFKFEFEF acoplado ao metotrexato, que responde a ambientes levemente ácidos tanto in vitro quanto in vivo, permitindo uma transição de fase sol-gel. Isso leva a uma captação celular eficiente e endocitose, fornecendo drogas anticâncer e melhorando a eficácia da quimioterapia12. Shen et al.13 projetaram o peptídeo FF8 (KRRFFRRK), que se auto-monta facilmente em fibras a um pH superior a 9,4. Em condições neutras, os microrganismos neutralizam suas cargas positivas devido a interações eletrostáticas com suas membranas fosfolipídicas carregadas negativamente, coordenando-se com as moléculas de fosfolipídios para se automontarem, causando ruptura da membrana e aumentando os efeitos bactericidas13.

O desencadeamento da automontagem supramolecular de peptídeos em hidrogéis usando metais de coordenação é um método relativamente raro14. Quando os íons metálicos interagem eletrostaticamente com os peptídeos, eles formam pontes de sal que conectam as moléculas de peptídeos, levando a interações não covalentes e automontagem, o que resulta em propriedades de gelificação. Por exemplo, Abul-Haija et al.15 projetaram o tripeptídeo FFD, que faz a transição de um líquido para um hidrogel após a adição de íons de cobre. Tao et al.16 desenvolveram o ácido glutâmico e o peptídeo E3F3 rico em fenilalanina, que se auto-montam em hidrogéis fibrosos na presença de íons de zinco e é usado para a administração de medicamentos para a próstata.

A formação de hidrogéis peptídicos por troca solvente é a condição desencadeante de automontagem supramolecular mais comum. Depois que os peptídeos hidrofóbicos se dissolvem em solventes orgânicos, seus grupos hidrofóbicos são totalmente expostos. Quando transferidos para uma fase aquosa, os grupos hidrofóbicos se aproximam e as moléculas de água facilitam a formação de ligações peptídicas de hidrogênio, levando a uma rápida automontagem e fácil formação de hidrogéis. Por exemplo, Zhang et al.17 projetaram um peptídeo que poderia se dissolver de forma estável em altas concentrações em solventes orgânicos polares e, após diluição com água, auto-montado em estruturas de folha de β para formar hidrogéis de fibra peptídica. Shen et al.13 projetaram um peptídeo redutor ECF-5 (ECAFF), pré-dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e depois injetado em uma fase aquosa para formar um hidrogel redutor, usado para a remoção direcionada de espécies reativas de oxigênio produzidas por isquemia-reperfusão, que posteriormente se degradaram em uma solução após a eliminação.

Este estudo selecionou três estratégias simples, rápidas e altamente generalizáveis de preparação de hidrogel peptídico com base em experiências anteriores: (1) método de resposta de pH: os peptídeos são dissolvidos em uma solução com um pH distante de seu ponto isoelétrico e, em seguida, o pH é ajustado para próximo ao ponto isoelétrico. Essa mudança permite que certos peptídeos de automontagem formem fibras e criem hidrogéis peptídicos; (2) Método de adição de íons metálicos: cátions de coordenação são adicionados a peptídeos de automontagem solúveis em água e carregados negativamente. A quelação da coordenação do metal entre os peptídeos leva à sua automontagem em hidrogéis; (3) Método de troca de solvente: peptídeos de alta concentração são dissolvidos em solventes orgânicos e depois diluídos em uma fase aquosa, induzindo o comportamento de gelificação.

Protocolo

Os detalhes dos plasmídeos, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Método de resposta de pH

  1. Adicione 5 mg de peptídeos ECF-5 a 400 μL de água deionizada. Sonicar a 40 kHz durante 30 min e misturar bem.
  2. Adicione 40 μL de hidróxido de sódio (1 M, filtrado através de um filtro de 0,22 μm) à solução peptídica. Vortex e misture bem. Continue a sonicação por 15 min até que a solução esteja completamente esclarecida.
  3. Adicione 60 μL de ácido clorídrico. Rapidamente vórtice e garanta uma mistura completa. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por mais de 30 min para facilitar a formação de hidrogel.
    NOTA: Substitua a água deionizada pela solução tampão desejada, se necessário. Se as partículas sólidas forem grandes, pulverize-as com antecedência. Sonicate para obter uma mistura homogênea de partículas no líquido. Se o peptídeo for intolerante a condições alcalinas, adicione primeiro a solução de ácido clorídrico 1 M e repita as etapas acima. Ajuste as quantidades de ácido e base conforme necessário para chegar perto do ponto isoelétrico ou do pH desejado, garantindo que as propriedades de formação de gel sejam mantidas.

2. Método de adição de íons metálicos

  1. Preparação do material
    1. Prepare 0,15 M de Tris e 0,1 M de tampão NaCl em pH 7,4. Filtrar através de um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C durante uma semana.
    2. Preparar uma solução peptídica de auto-montagem ECF-5 a uma concentração de 10 mg/ml utilizando o tampão preparado no passo 1.1.1. Dissolver por sonicação e conservar a 4 °C.
    3. Prepare uma solução de cloreto de cálcio a 50 mg/ml com água desionizada. Conservar a 4 °C.
  2. Formação de hidrogel de peptídeo induzida por adição de íons metálicos
    1. Adicionar 40 μL de solução de cloreto de cálcio a 460 μL da solução peptídica ECF-5. Vortex e misture bem. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por mais de 2 h.
      NOTA: Evite usar tampão fosfato, pois pode levar à precipitação de íons cálcio.

3. Método de troca de solvente

  1. Preparação de materiais
    1. Pesar 10 mg de pó liofilizado do peptídeo ECF-5. Adicione-o a 100 μL de DMSO. Misturar bem por ultra-sons e conservar a 4 °C.
    2. Preparar uma solução tampão PBS a 10 mM. Filtre e esterilize. Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 1 semana.
  2. Formação de hidrogel peptídico induzido por solvente
    1. Introduza rapidamente 1 mL de PBS no peptídeo solubilizado em DMSO. Vortex e misture bem. Deixe repousar em temperatura ambiente por 5 min.
    2. Adicione 500 μL de PBS, deixe descansar por 15 min, descarte o sobrenadante e retenha o gel inferior. Repita esse processo três vezes para remover o DMSO.
      NOTA: Se o DMSO afetar experimentos subsequentes, considere dissolver o peptídeo em uma concentração mais alta de DMSO para minimizar seu impacto.

4. Caracterização reomecânica do hidrogel

  1. Análise reológica
    1. Coloque o hidrogel em uma placa paralela de alumínio de 25 mm. Realizar análise reológica dinâmica de varredura de tempo dos hidrogéis peptídicos usando um reômetro18.
  2. Análises de frequência e varredura de deformação
    1. Realizar análises de frequência e varredura de deformação18 sistematicamente usando uma deformação controlada de 0,3% e uma frequência de 10 rad/s. Certifique-se de que o controle de temperatura esteja ajustado para 25 °C.

5. Caracterização da morfologia das fibras por microscopia de força atômica (AFM)

  1. Preparação de materiais
    1. Prepare uma solução de etanol a 95% e adicione 5% de APTES. Conservar a -20 °C e utilizar no prazo de 1 mês.
    2. Aplique adesivo dupla face para remover uma camada de mica. Cole as superfícies de mica usando a solução APTES e deixe repousar por 5 min. Enxágue abundantemente com água pura antes de usar.
    3. Dilua e misture bem o hidrogel. Solte-o na superfície de mica modificada e deixe a adsorção estática por 5 min. Enxágue a superfície com água pura e seque-a antes de usar.
  2. Método de detecção
    1. Utilize um AFM multimodo equipado com um scanner para examinar as morfologias da fibra ou do hidrogel do peptídeo. Use cantilevers de silício com uma constante nominal de mola de 48 N/m.
    2. Inicialize o instrumento para posicionar a agulha. Selecione o modo de toque para digitalizar a amostra para adquirir imagens.

Resultados

Os três métodos descritos neste artigo para preparar hidrogéis peptídicos permitem uma produção rápida, acessível e direta. A função do hidrogel está relacionada à sua sequência peptídica. Aqui, o peptídeo ECF-5 é usado como um exemplo representativo para demonstrar suas características físicas, incluindo morfologia microscópica e propriedades mecânicas.

Conforme mostrado na Figura 1A e na Figura Suplementar 1, o peptídeo ECF-5 contém uma sequência semelhante à glutationa e uma sequência de dipeptídeo fenilalanil, que lhe conferem as propriedades redutoras da glutationa e a capacidade de se auto-montar. O peptídeo ECF-5 foi pré-dissolvido em DMSO e depois rapidamente misturado com uma solução aquosa. Nesta fase, o peptídeo passou por uma rápida automontagem, formando um gel sólido em poucos minutos. Quando a concentração final do peptídeo excede 1%, o gel pode ser coletado com uma pinça.

A imagem de microscopia de força atômica (AFM) da superfície do gel revelou uma rede de numerosas fibras peptídicas com poros densos que retêm a água. Após a diluição, a morfologia das fibras individuais, conforme mostrado na Figura 1D, exibe uma altura de aproximadamente 3,5 nm, formando bandas de fibras mais largas altamente consistentes. Isso é consistente com a morfologia da fibra observada na rede de gel. Além disso, em condições neutras, os íons metálicos de cálcio também podem induzir o peptídeo a formar um hidrogel, embora esse processo seja relativamente mais lento e resulte em um gel mais macio.

O comportamento macroscópico dos hidrogéis preparados usando os três métodos - resposta de pH, adição de metal e troca de solvente - é ilustrado na Figura 2A. Em comparação com a água deionizada, todos os hidrogéis exibiram propriedades semissólidas. A reologia é comumente usada para diferenciar hidrogéis de sóis.

A viscoelasticidade macroscópica dos hidrogéis ECF-5 obtidos por meio desses três métodos de gelificação foi comparada por meio de técnicas reológicas. Conforme mostrado na Figura 2, o hidrogel ECF-5 exibiu a viscoelasticidade característica dos hidrogéis típicos. Em uma deformação de 0,3%, a relação entre o módulo de armazenamento (G') e o módulo de perda (G'') em diferentes frequências é representada. O hidrogel ECF-5 apresentou fraca correlação com a frequência. O módulo de armazenamento (G') dos hidrogéis obtidos pelos três métodos foi de aproximadamente 10 kPa, que é cerca de 10 vezes maior que o módulo de perda (G'') e demonstrou propriedades típicas de hidrogel semi-sólido (Figura 2B). Isso indica que os hidrogéis ECF-5, independentemente do método de preparação, exibem viscoelasticidade típica do hidrogel.

Os gráficos do módulo de armazenamento (G') e do módulo de perda (G'') versus o nível de deformação a 10 rad/s (Figura 2C) mostraram que G' e G'' permaneceram quase constantes na faixa de deformação de 0,1% a 10%, com G' sendo cerca de 10 vezes maior que G''. Isso sugere que os hidrogéis ECF-5 são hidrogéis viscoelásticos típicos capazes de suportar tensões.

figure-results-1
Figura 1: Hidrogéis peptídicos ECF-5. (A) Estrutura química do ECF-5. (B) Morfologia macroscópica do hidrogel peptídico ECF-5 na concentração de 1%. (C) Microestrutura da superfície do hidrogel. (D) Morfologia microscópica das fibras peptídicas ECF-5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Morfologia macroscópica e caracterização reológica de hidrogéis. (A) Morfologia macroscópica de hidrogéis sob três diferentes condições de hidrogel induzido, todas com uma concentração final de peptídeo ECF-5 de 3 mg / mL. Dependência da frequência (B) e da deformação (B) do módulo de armazenamento (G') e do módulo de perda (G'') do hidrogel ECF-5 sob três condições de indução na concentração de 1%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise LC-MS do peptídeo ECAFF. (A) O pico no tempo de retenção de 13,238 min é o pico do produto. O eluato da coluna foi monitorado a 220 nm e uma taxa de fluxo de 1 mL / min com ácido trifluoroacético a 0,1% em acetonitrila a 100%. O rendimento do ECF-5 é de 97,33%. (B) ESI/espectrometria de massa confirma que o peso molecular do ECF-5 é 616,1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nas últimas décadas, após a descoberta de sequências de peptídeos de automontagem derivadas de proteínas amilóides, vários peptídeos de automontagem foram projetados com base em suas propriedades, demonstrando um potencial significativo para aplicações em biomedicina e ciência de materiais19. Os hidrogéis peptídicos exibiram capacidades únicas de biofuncionalização em cultura de tecidos, administração de medicamentos e tratamento de tumores20.

Este artigo descreve métodos de preparação simples e rápidos para três tipos de hidrogéis peptídicos: resposta de pH, adição de íons metálicos e troca de solvente. Os peptídeos automontáveis geram diferentes interações não covalentes com base em suas características de sequência, sendo as interações hidrofóbicas a força predominante, seguidas pelas interações eletrostáticas. Essas interações resultam em propriedades variáveis de automontagem e promovem a transição de um estado solúvel para um insolúvel. Por exemplo, tanto os aminoácidos quanto os peptídeos têm pontos isoelétricos específicos nos quais sua solubilidade é mínima. Quando o pH se desvia significativamente de seu ponto isoelétrico, sua solubilidade aumenta, permitindo a automontagem. Assim, o ajuste do pH da solução pode desencadear a automontagem de certos peptídeos13. No entanto, peptídeos com pontos isoelétricos altamente polares podem exibir estruturas instáveis e são propensos à desamidação ou hidrólise.

Na formação de hidrogéis peptídicos induzidos por íons metálicos, os peptídeos normalmente contêm aminoácidos carregados negativamente, como ácido glutâmico e ácido aspártico. Esses peptídeos podem se conectar usando íons metálicos como pontes sob a influência de íons metálicos divalentes, desencadeando assim a automontagem. Alternativamente, peptídeos com resíduos de histidina podem formar ligações de coordenação com certos cátions metálicos divalentes, induzindo a automontagem. Os íons metálicos facilitam a automontagem do peptídeo, reduzindo a repulsão eletrostática entre os peptídeos e aumentando sua atração mútua, levando à formação de hidrogéis peptídicos14. Embora este método seja adequado para aplicações que requerem íons metálicos específicos, pode não ser necessário na maioria das condições fisiológicas e os íons metálicos não podem ser facilmente removidos.

Alguns peptídeos altamente hidrofóbicos são primeiro dissolvidos em solventes orgânicos solúveis em água e, em seguida, adicionados a uma fase aquosa originalmente insolúvel para formar rapidamente hidrogéis peptídicos. No entanto, muitos solventes orgânicos podem ter efeitos prejudiciais em aplicações biológicas, especialmente em concentrações mais altas. Os métodos aqui descritos são aplicados especificamente a peptídeos automontados. Os peptídeos são projetados com base nos mecanismos de desencadeamento mencionados acima para alcançar as funções biológicas desejadas, minimizando os efeitos adversos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nos. 11674344 e 22201026) e pelo Key Research Program of Frontier Sciences, CAS (Grant No. QYZDJ-SSW-SLH019).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-Aminopropil) trietoxissilanoAladdinA107147/
Microscopia de Força AtômicaBrukerMultimode Nanoscope VIII/
CaCl < sub > 2 < / sub >AladdinC290953
/ Difenilalanina (FF)personalizávelpeptídeo chinês> 95%
DMSOSigma-aldrich34869/
Peptídeos ECF-5Sequência de peptídeos chineses: Pureza ECAFF> 95%
Ácido clorídricoAladdinH399657 /
MicaSigma-aldrichAFM-71856-02/
Fosfato TampoladoSalino AladdinP492453/
ReômetroAnton Paar GmbHMCR302/
CantileversMikroMaschXSC11/
Cloreto de SódioAladdinC111549/
Hidróxido de SódioAladdinS140903/
Cloridrato de TRISAladdinT431531/
Pureza de Silício

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