Artigo de método

Dispositivo de pulmão artificial para enxerto de superfície de feixe de fibras in situ

DOI:

10.3791/67271

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28 de março de 2025

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1Department of Chemistry and Chemical & Biomedical Engineering, University of New Haven, 2Advanced Respiratory Technologies, LLC, 3Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 4Department of Cardiac Surgery, Vanderbilt University Medical Center, 5Auburn University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este estudo investigou a atividade anti-incrustante de fibras ocas pulmonares artificiais revestidas por primer no dispositivo pulmonar. Embora essa abordagem de modificação da superfície das fibras seja prática, a eficácia do processo de revestimento depende da cobertura do enxerto nas camadas do tapete de fibra dentro do feixe.

Resumo

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Embora a alta relação área-volume de superfície do feixe de fibras pulmonares artificiais aumente as trocas gasosas, a grande área de superfície, o arranjo denso e a química da superfície das fibras são os principais contribuintes para a trombose. Para mitigar isso, é essencial modificar uniformemente os produtos químicos da superfície para reduzir efetivamente a incrustação de proteínas inespecíficas, o que pode ajudar a limitar a trombose e diminuir o risco de tromboembolismo ou sangramento causado por anticoagulantes sistêmicos.

Neste estudo, exploramos a aplicação e as propriedades anti-incrustantes de enxertos de polímero zwitteriônico em feixes de fibras de polipropileno. O processo de enxerto envolveu o primer do dispositivo pulmonar artificial com moléculas de polissulfobetaína zwitteriônicas e ligantes de polidopamina para revestimento in situ . O desempenho anti-incrustante foi avaliado usando ensaio imunoenzimático de fibrinogênio padrão (ELISA) e ensaios de incrustação de lactato desidrogenase plaquetária. A espectroscopia de fotoelétrons de raios-X confirmou o revestimento da superfície, e reduções significativas na incrustação foram observadas nas fibras revestidas em comparação com as não revestidas, demonstrando a utilidade do processo de enxertia e a promessa de seus efeitos anti-incrustantes.

No entanto, diferenças na aparência do revestimento nas fibras dentro do feixe foram observadas com o revestimento pelo processo de primer, o que pode afetar o desempenho geral do anti-incrustante. Abordar esse problema pode aumentar ainda mais a eficiência anti-incrustante dos feixes de fibras pulmonares modificados por meio de enxerto in situ .

Introdução

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As fibras pulmonares artificiais, também conhecidas como membranas de fibras ocas, são materiais essenciais para a fabricação de dispositivos de oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) que fornecem suporte respiratório a pacientes gravemente enfermos. Várias camadas dessas fibras formam um feixe denso que serve como unidade de troca gasosa. A superfície da fibra polimérica, no entanto, ativa a cascata de coagulação do sangue - levando à formação de coágulos (trombose). A trombose em superfícies artificiais é impulsionada principalmente pela ativação da cascata de coagulação, uma série complexa de reações enzimáticas que levam à formação de um coágulo sanguíneo. Quando o sangue entra em contato com materiais estranhos, como os de dispositivos médicos (por exemplo, pulmões artificiais, stents, cateteres), a cascata de coagulação é desencadeada 1,2. Esse processo começa com a exposição do sangue às superfícies do material artificial, que ativa o caminho intrínseco da cascata. Essa ativação leva à geração de trombina, uma enzima chave que converte o fibrinogênio em fibrina, formando a base estrutural de um coágulo. Simultaneamente, as plaquetas são ativadas e agregadas no local, reforçando ainda mais o coágulo. O resultado é a trombose, que pode obstruir o fluxo sanguíneo e levar a complicações graves, como acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio.

Para prevenir trombose em superfícies artificiais, anticoagulantes tradicionais, como heparina, varfarina e novos anticoagulantes orais diretos (AODs), são comumente usados 3,4. Esses medicamentos funcionam interferindo em várias etapas da cascata de coagulação. Por exemplo, a heparina aumenta a atividade da antitrombina III, um inibidor natural da trombina, enquanto a varfarina inibe a síntese de fatores de coagulação dependentes da vitamina K. No entanto, o uso de anticoagulantes apresenta vários desafios. Primeiro, eles aumentam o risco de sangramento, que pode ser fatal em certas situações. Em segundo lugar, a eficácia dos anticoagulantes pode ser variável, exigindo monitoramento regular e ajustes de dose, principalmente com varfarina. Além disso, o uso prolongado de anticoagulantes está associado a efeitos adversos, como osteoporose e necrose da pele. A necessidade de anticoagulação sistêmica também limita o uso de dispositivos médicos em pacientes com alto risco de sangramento.

Como a trombose pode impedir as trocas gasosas através da membrana da fibra oca, revestimentos anti-incrustantes têm sido aplicados às fibras pulmonares usando vários métodos, como revestimento por imersão e eletrofiação, para evitar a bioincrustação 5,6. Os fabricantes de pulmão artificial normalmente processam fibras ocas que são obtidas comercialmente de fabricantes de fibras e as montam nos pulmões por meio de etapas, incluindo agrupamento das fibras em torno de um núcleo sólido, envasamento (colagem) das extremidades do feixe, incorporação de feixes em vasos em uma cápsula de invólucro com canais de gás e fluxo sanguíneo e limpeza pós-montagem. Embora o revestimento de fibras que não foram implantadas no pulmão possa ser mais flexível, uma modificação da superfície no estágio de pré-empacotamento será submetida a várias etapas de fabricação que exigem interações mecânicas e químicas entre o revestimento da superfície e os ambientes do processo a jusante, o que pode levar a fibras desnudadas em um dispositivo onde a alta cobertura de revestimento é essencial para limitar a trombose. Alternativamente, o revestimento pode ser aplicado ao feixe em vaso. Uma vantagem da capacidade de revestir pulmões acabados é que é uma abordagem de modificação prática e fácil para a engenharia de superfície do dispositivo de pulmão artificial e muitos outros dispositivos. Mas, em geral, o método de aplicação de revestimentos, seja por spray ou imersão, é menos crítico para a prevenção de trombose do que a eficácia do próprio revestimento. Por exemplo, fibras ocas usadas em dispositivos médicos podem ser revestidas por imersão durante a extrusão, depois tricotadas em esteiras, enroladas em feixes e incorporadas a um dispositivo pulmonar artificial acabado. Alternativamente, os revestimentos podem ser aplicados após a fabricação do dispositivo. Os fatores-chave, no entanto, são a aplicação efetiva, durabilidade e eficácia do revestimento antitrombótico5. Isso ocorre porque, na ausência de anticoagulação sistêmica, a função desses revestimentos é uma peça essencial do quebra-cabeça para prevenir a formação de coágulos, necessitando da necessidade de uma propriedade anti-incrustante altamente eficiente e duradoura para garantir a prevenção eficaz da trombose.

Apesar da aplicação de revestimentos antitrombogênicos e da administração simultânea de anticoagulantes em baixas doses até o momento, o módulo pulmonar artificial deve ser substituído somente após um período relativamente curto de uso, variando de dias a 3 semanas 7,8, devido à trombose. A eficiência de troca gasosa de suas membranas de fibras se deteriora após um tempo relativamente curto devido à incrustação por uma estrutura de coágulo sanguíneo membranoso (composta de fibrina, células únicas e aglomerados de células) que cobre grandes áreas das fibras, aumentando sua barreira de difusão gasosa9. Em geral, o tipo de revestimento e o método de aplicação 10,11,12,13,14,15,16,17,18 utilizado dependem das propriedades desejadas, como biocompatibilidade e durabilidade. Vários exemplos de revestimentos anti-incrustantes têm sido usados em fibras pulmonares artificiais. Eles incluem silicone que é amplamente utilizado devido à sua biocompatibilidade19, durabilidade e resistência à bioincrustação; poliuretano (PU) devido à sua biocompatibilidade e resistência à bioincrustação20; quitosana devido às suas propriedades biocompatíveis e antimicrobianas21,22, heparina que inativa a trombina23,8 e revestimentos hidrofílicos à base de polímeros24, incluindo poli(etilenoglicol)25,26, poli(acrilato de 2-metoxietila)27 e fosforilcolina28,29.

Os revestimentos zwitteriônicos representam uma estratégia promissora para reduzir a trombose em superfícies artificiais sem a necessidade de anticoagulação sistêmica 5,6. Esses revestimentos são compostos de moléculas com cargas positivas e negativas, que se equilibram e resultam em uma superfície altamente hidrofílica e não incrustante. A natureza zwitteriônica desses revestimentos reduz a adsorção de proteínas e a adesão plaquetária, ambas etapas críticas no início da cascata de coagulação. Ao impedir a interação inicial entre as proteínas do sangue e a superfície artificial, os revestimentos zwitteriônicos inibem efetivamente a ativação da cascata de coagulação e reduzem o risco de trombose. Essa abordagem não apenas minimiza a necessidade de anticoagulantes sistêmicos, mas também oferece uma solução mais biocompatível para o uso prolongado de dispositivos médicos.

Neste estudo, avaliamos a eficácia do primer do pulmão artificial com um revestimento de poli (metacrilato de sulfobetaine) (pSBMA) de incrustação ultrabaixa combinado com uma camada de polidopamina adesiva de superfície (pDOPA). Após a preparação do dispositivo, ele foi posicionado lado a lado a cada 10 minutos por 2 h durante o processo de revestimento. Para avaliar possíveis variações no revestimento ao longo do feixe de fibras, medimos a incrustação de fibrinogênio e plaquetas nas fibras localizadas na superfície e dentro do feixe. Além disso, analisamos o impacto do fluxo no desempenho anti-incrustante, comparando os dados de incrustação dos pulmões antes e depois da exposição ao fluxo. Para aplicações antibioincrustantes de longo prazo envolvendo fluxo de meio complexo, os revestimentos zwitteriônicos devem não apenas inibir a incrustação do sangue total - uma tarefa desafiadora - mas também manter sua eficácia sob estresse hemodinâmico durante todo o período de aplicação. Esses revestimentos precisam fornecer forte repulsão estérica contra a adsorção de proteínas não específicas e atingir uma densidade de empacotamento de superfície adequada para formar uma barreira de filme de hidratação entre o substrato e o meio complexo. Além disso, eles devem permanecer firmemente presos à superfície sem o desprendimento dos ligantes que ancoram o revestimento ao substrato30. O protocolo descrito aqui foi projetado para garantir a aplicação de revestimentos que atendam a esses requisitos críticos para proteção de superfície eficaz e durável.

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Protocolo

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O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de New Haven.

1. Revestimento do circuito pulmonar artificial

NOTA: O circuito pulmonar artificial foi revestido seguindo uma abordagem de enxerto DOPA-SBMA zwitteriônico em duas etapas. Os detalhes do feixe de fibras/oxigenador são informações proprietárias. Em experimentos em que os efeitos do fluxo na atividade anti-incrustante do pulmão revestido foram o foco, o oxigenador e o circuito da tubulação (tubulação Tygon de 5/16" com conectores de policarbonato conjugáveis) foram submetidos a uma solução salina tamponada com fosfato de 24 h (PBS; pH 7,34, temp. ~ 37 ° C) fluxo limitado pela vazão máxima de nossa bomba de 1,22 L / min. Para contextualizar, as taxas de fluxo exatas nos oxigenadores dependem das necessidades do paciente e da situação clínica específica, mas geralmente variam de 2 a 7 L/min em pacientes adultos. O PBS foi usado neste caso para permitir uma quantificação fácil da incrustação do marcador chave de coagulação sanguínea nas fibras revestidas após o fluxo. Quaisquer efeitos de confusão da incrustação do sangue total, se o fluxo sanguíneo total fosse usado para avaliar os efeitos da taxa de cisalhamento na atividade anti-incrustante das fibras revestidas, seriam eliminados usando PBS. As seguintes etapas foram usadas para revestir o pulmão artificial:

  1. Limpe o circuito pulmonar recirculando metanol a 30% em água deionizada (DI) por 20 min, seguido de recirculação de metanol a 10% em água DI e água DI por 20 min.
  2. Seque o circuito com ar doméstico filtrado em baixo fluxo por 2 h antes da exposição ao plasma de ozonólise ultravioleta (UVO).
  3. Coloque o circuito pulmonar limpo em um gerador de plasma UVO (UVO-Cleaner), feche-o e ligue o instrumento gerador de plasma UVO para interação de plasma com o dispositivo por 20 min.
  4. Após a exposição ao plasma, o dispositivo deve prosseguir para a etapa de revestimento sem demora para limitar o rearranjo da cadeia superficial e a ocultação de locais reativos gerados a partir da interação do plasma.
  5. Enquanto as superfícies do dispositivo estão sendo modificadas, prepare uma nova solução de revestimento. Em 600 mL de tampão TRIS (pH 8,5), dissolva 1,2 g de dopamina-HCl seguido de dissolução do monômero de metacrilato de sulfobetaine (SBMA) na proporção de 1:15 DOPA: SMBA.
  6. Adicione 5 mM de gotículas de periodato de sódio (20 μL) à solução de revestimento e misture. Use um copo de vidro, uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação a 150 rpm para ajudar na mistura.
    NOTA: Adicione a solução de revestimento ao dispositivo no máximo 20 minutos após a preparação. Portanto, se vários pulmões forem revestidos, uma maneira fácil de preparar os dispositivos - por exemplo, o uso de bombas para escorva - pode ser útil.
  7. Prepare o dispositivo pulmonar com a solução de revestimento usando uma seringa de grande volume (60 cc) para aspirar e preencher o circuito. Com uma extremidade do circuito presa, prepare-a da outra, garantindo que as bolhas de ar possam ser guiadas para fora do circuito através de um conector de acesso ao circuito.
  8. Quando estiver totalmente preparado, coloque o dispositivo sob uma fonte de luz UV durante 2 h e agite a solução reorientando as extremidades do dispositivo preparado para cima e para baixo a cada 10 minutos.
  9. Após o tratamento com luz UV, drene o circuito e enxágue suavemente todas as amostras com água deionizada (DI) aplicando primer com uma seringa de 60 cc e drenando repetidamente. Quando o efluente do enxágue DI estiver claro, armazene o dispositivo preparado com água DI em uma geladeira a 4 ° C para autópsia e análises de superfície.

2. Autópsia pulmonar

  1. Circuito de drenagem e pulmão seco com fluxo de ar filtrado e suave em uma coifa química.
  2. Realize a autópsia do dispositivo fixando-os em um torno de bancada com base giratória. Use uma serra de fita para seccionar as conexões de entrada/saída para o invólucro do dispositivo e as placas frontais frontal e traseira do invólucro, cortando cuidadosamente ao longo de suas periferias usando uma faca X-acto de nível industrial e um martelo.
  3. Depois de remover as placas frontais, as camadas de fibra são acessíveis. Seque cuidadosamente as fibras para acessar amostras de fibra fosca em qualquer local dentro do feixe (por exemplo, a superfície e dentro). Manuseie as amostras com uma pinça nas bordas e transfira-as para tubos de 60 mL cheios de água deionizada para limitar a contaminação da amostra.

3. Avaliação da incrustação de proteínas em materiais revestidos do circuito pulmonar

  1. Teste de adsorção de fibrinogênio.
    1. Tamanho da incubação (~ 1 cm x 1 cm) amostras de fibra fosca padronizadas em 1 mL de 3 mg / mL de fibrinogênio em placas de poço por mais de 90 min a 37 ° C com agitação a 60 rpm.
    2. Lave (3x) as amostras com tampão PBS, transfira-as para novos poços e adicione 1 mL de 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) a cada poço. Incube por mais 90 min, depois lave novamente com tampão PBS (3x) e transfira as amostras para novos poços.
    3. Nos novos poços, adicione 1 mL de diluição 1:1000 de anticorpo fibrinogênio conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) em PBS em cada poço e incube por 30 min. Em seguida, lave (3x) as amostras com tampão PBS e transfira-as para novos poços.
    4. Nos novos poços, adicione 500 μL de 1 mg/mL de o-fenilenodiamina (OPD) em tampão citrato-fosfato 0,1 M com peróxido de hidrogênio a 0,03%, pH de 5,0 em intervalos de 30 s e incube longe da luz por 30 min.
    5. Interrompa a reação de peroxidase e OPD adicionando 500 μL de 1 N HCL a cada poço.
    6. Remova e transfira o sobrenadante de cada poço para uma cubeta. Medir a absorvância do sobrenadante utilizando um espectrofotómetro UV-visível a 492 nm.
  2. Teste de adesão plaquetária.
    1. Descongele o kit de ensaio de lactato desidrogenase (LDH) por 20 min.
    2. Enquanto o descongelamento está em andamento, prepare o plasma humano adulto agrupado para obter plasma rico em platina (PRP).
    3. Para preparar o PRP, centrifugue tubos de amostra de plasma humano descongelados em um giro forte a 483 x g para separar o plasma em duas regiões, nas quais o terço inferior é PRP e os dois terços superiores do tubo conterão o plasma pobre em plaquetas (PPP).
    4. Remova os grânulos de plaquetas formados na parte inferior do tubo, bem como os dois terços superiores no plasma sanguíneo centrifugado e disperse o grânulo nos dois terços superiores do plasma, agitando suavemente os tubos.
    5. Adicione cloreto de cálcio (0,2 M) ao PRP (1:1 v/v) para reverter os efeitos dos citratos antes do teste.
    6. Incube as amostras (~ 1 cm x 1 cm) em 500 μL de PRP por 90 min a 37 ° C, depois enxágue três vezes com tampão PBS e transfira-as para novos poços.
    7. Adicione 300 μL de PBS e 10 μL de tampão de lise 10x e incube por 45 min.
    8. Adicione 50 μL da mistura de reação e incube por 30 minutos longe da luz.
    9. Adicione 50 μL de HCL para interromper as reações do poço.
    10. Para detectar a atividade de LDH de lisados de plaquetas adsorvidas, meça a absorbância de luz pelas soluções de poços desenvolvidas em comprimentos de onda de 490 nm e 680 nm e subtraia a leitura de 680 nm dos 490 nm para analisar a adesão plaquetária.

4. Efeitos do fluxo na atividade anti-incrustante

  1. Prepare o circuito pulmonar artificial com PBS e certifique-se de que não haja vazamentos. Em seguida, fixe o circuito na bomba de rolos e recircule o PBS por 24 h.
    NOTA: Uma taxa de fluxo de 1,22 L/min foi a mais alta possível.
  2. Para simular a temperatura normotérmica do sangue que fluiria através do dispositivo pulmonar, incubar o pulmão artificial em banho-maria a 37 °C durante a recirculação.
  3. Em seguida, realize autópsia pulmonar e estudos de desafio de incrustação de proteínas, conforme descrito acima.
    NOTA: A análise de variância de uma via foi usada para determinar se havia diferenças estatisticamente significativas entre as médias dos grupos independentes, e a HSD de Tukey foi usada para determinar quais grupos específicos diferiam.

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Resultados

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Apresenta-se um protocolo para enxertia de polímero zwitteriônico de circuito pulmonar artificial por priming, desmontagem do dispositivo para coleta de amostras de fibras revestidas e avaliação anti-incrustante de fibras seccionadas. Na Figura 1, a modificação da superfície da abordagem do circuito pulmonar artificial é ilustrada. Os pulmões foram expostos ao plasma UVO para a interação do singleto radical de oxigênio com as fibras, que foi seguida por etapas de revestimento zwitteriônico d...

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Discussão

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As fibras de polipropileno (PP) revestidas com PDMS no pulmão artificial demonstraram uma relação entre a exposição ao ozônio e a estrutura da fibra, estabelecendo um limite de sensibilização para o plasma de ozônio ultravioleta. Esse limite orienta os tempos de exposição necessários para gerar radicais de superfície para enxertia de materiais de revestimento, especificamente polidopamina e metacrilato de polissulfobetaina. Quando as fibras foram expostas ao plasma de ozônio ultravioleta...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes. O Dr. Keith Cook e o Dr. David Skoog detêm participação acionária na ART LLC.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado em parte por meio de um contrato de serviços sob o NIH 1R01HL140231-01A1.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BéqueresThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065Usado em experimentos
Centrífuga Beckman Coulter Allegra X-30RBeckman Coulterhttps://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30Para centrifugações
Capuz de segurança Biochemguard BSL2Biochemguardhttps://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdfUsado para fonte de luz UV no revestimento de enxerto
Soro de albumina bovina (BSA)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468Materiais de ensaio de fibrinogênio
Plasma sanguíneo masculino agrupado citratoZenBiohttps://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.phpUsado para experimentos
Tampão citrato-fosfatoSigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=citrate-phosphate%20buffer&type=productFibrinogênio materiais de ensaio
Cloridrato de dopaminaSigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255Para revestimento
Cloridrato de dopaminaSigma-AldrichN/AMateriais de ensaio de fibrinogênio
Imunoglobulina G de cabra conjugada com fluoresceína (IGG)Sigma Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303fPara medições de intensidade de luz de fluorescência
Anticorpo anti-fibrinogênio conjugado com peroxidase de rábanoSigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&type=productFibrinogen materiais
de ensaio Placa quenteThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.htmlUsado em experimentos
Pó de fibrinogênio humanoSigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=human%20fibrinogen&type=productMateriais de ensaio de fibrinogênio
Jelight UVO-Cleaner modelo 144AXJelighthttps://www.jelight.com/uvo-cleaner/Usado para tratamento de plasma de materiais de dispositivos médicos
Kit de ensaio LDHABCAMhttps://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526Para ensaio LDH
O-fenilenodiamina (OPD)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029Materiais de ensaio de fibrinogênio
Fibras de polipropileno revestidas com PDMSART LLCN/AParte de materiais de pulmão artificial
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417Materiais de ensaio de fibrinogênio
Leitor de placas (BioTek)BioTekhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assaysPara leitura Fluorescência Intensidade da luz
Polidimetilsiloxano (PDMS)ART LLCN / AParte de materiais pulmonares artificiais
Periodato de sódio (NaIO4)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285Para de revestimento
Stockert Shiley bomba de rolos multifluxoSorin BiomedicalN/APara experimentos de fluxo
Metacrilato de sulfobetaine (SBMA)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma)Para revestimento
solução salina tamponada com TRIS (pH 8,5)Sigma-Aldrichhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793Preparado em laboratório de TRIS sachês
Tubulação TygonART LLCN/AParte de materiais pulmonares artificiais
de

Referências

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