Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

Allexa D. Burger; Jayna Wong; Endrei Marcantonio; Sladjana Prisic

doi:10.3791/67274

Artigo de método

Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

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DOI:

10.3791/67274

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20 de setembro de 2024

Allexa D. Burger^*¹ , Jayna Wong^*¹ , Endrei Marcantonio¹ , Sladjana Prisic¹

¹School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha a preparação de meios limitados por Zn²⁺, vasos de crescimento e culturas de sementes para produzir ribossomos limitados por Zn²⁺ em micobactérias. Traços de Zn²⁺ levam ao crescimento limitante de Zn²⁺ e descrevemos características morfogênicas usadas como bioindicadores para verificar a limitação de Zn²⁺ in vitro na bactéria modelo, Mycobacterium smegmatis, e no patógeno humano M. tuberculosis.

Resumo

Muitas bactérias constroem ribossomos alternativos em condições de crescimento limitantes de Zn²⁺, substituindo proteínas ribossômicas de ligação a Zn²⁺ por parálogos independentes de Zn²⁺. A definição de um sistema para estudar esses ribossomos alternativos tem se mostrado difícil porque a contaminação por Zn²⁺ em laboratório é comum. Para resolver esse problema, agentes quelantes às vezes são adicionados aos meios de crescimento, mas essa abordagem complica a resposta biológica à limitação gradual do Zn²⁺e está associada à hibernação do ribossomo. Aqui, instruções detalhadas são descritas para preparar meios e culturas de semeadura para crescimento limitado de Zn²⁺ sem adição de quelantes. Seguindo este método, a bactéria modelo, Mycobacterium smegmatis, sofre morfogênese, que depende de ribossomos alternativos. Como a morfogênese é tratável e ocorre apenas em condições limitantes de Zn²⁺, M. smegmatis pode ser usado como um bioindicador para verificar condições de crescimento biologicamente relevantes. Três fenótipos de bioindicadores (densidade celular, comprimento celular e fluorescência da coenzima F₄₂₀) que indicam limitação de Zn²⁺ no tipo selvagem são descritos, e mudanças nesses bioindicadores para um mutante de deleção que não pode construir ribossomos alternativos são descritos. Como a contaminação por traços de Zn²⁺ é difícil de controlar para cada lote de meio, e a quantificação precisa de Zn²⁺ em cada preparação de meio é excessivamente onerosa, seguir esse fenótipo bioindicador é uma maneira acessível de validar a preparação de meios de crescimento limitados por Zn²⁺. Para ajudar a identificar as condições adequadas para o crescimento limitante do Zn²⁺ e a produção alternativa de ribossomos, as mudanças nos fenótipos dos bioindicadores também foram perfiladas para preparações contaminadas com Zn²⁺ ou severamente depletadas de Zn²⁺ de meios limitados por Zn²⁺. Mais detalhes para alcançar o crescimento limitante de Zn²⁺ e a produção alternativa de ribossomos em M. tuberculosis são apresentados, juntamente com o fenótipo bioindicador associado. No geral, as instruções detalhadas e os fenótipos de bioindicadores descritos aqui ajudarão a padronizar a produção de ribossomos alternativos translacionalmente ativos em micobactérias.

Introdução

O íon zinco (Zn²⁺) é um micronutriente essencial e um componente padrão dos meios microbiológicos. No entanto, muitas bactérias sofrem limitação de Zn²⁺ no ambiente, pois as condições limitantes de Zn²⁺ são generalizadas; solo¹, marine² e nichos dentro do hospedeiro³ são frequentemente limitados por Zn²⁺. Como tal, a maioria das bactérias desenvolveu mecanismos para superar a limitação do Zn²⁺ e preservar a função celular⁴. Os sistemas envolvidos na manutenção da homeostase do Zn²⁺ estão sob rígido controle transcricional⁵ e estão envolvidos na eliminação do Zn²⁺ usando sistemas de importação de Zn²⁺ de alta afinidade, mobilizando reservas celulares de Zn²⁺ e substituindo certas proteínas de ligação ao Zn²⁺ por parálogos alternativos independentes de Zn²⁺⁶. Um exemplo deste último são os parálogos de proteína ribossômica (RPs) independentes de Zn²⁺, que são uma característica comum de regulons responsivos a Zn²⁺ em bactérias⁴. Esses RPs independentes de Zn²⁺ altamente divergentes são distinguidos de seus parálogos de ligação de Zn²⁺ pela interrupção do motivo CXXC de ligação de Zn²⁺⁷. Mais da metade dos genomas procarióticos sequenciados contêm pelo menos um par de RPs duplicados onde, em muitos deles, um RP se liga a Zn²⁺, enquanto seu parálogo não⁸. Embora a notação C+/C- (indicando a presença/ausência do motivo de ligação Zn²⁺ rico em cisteína) seja comumente usada em referência a esses pares de RP parálogos⁷, os RPs independentes de Zn²⁺ também foram descritos como versões alternativas (Alt) dos parálogos primários (Prim) de RP de ligação a Zn²⁺, uma vez que os AltRPs servem como RPs alternativos para a biogênese do ribossomo no Zn²⁺-condição limitada em algumas bactérias e é uma palavra-chave com melhor capacidade de pesquisa⁹^,¹⁰^,¹¹.

Como a expressão de AltRP é rigidamente regulada por Zn²⁺, é lógico supor que a expressão de AltRP oferece redundância funcional para proteínas ribossômicas dependentes de Zn²⁺ em face da limitação de Zn²⁺. De fato, essa característica dos AltRPs foi demonstrada para a bactéria modelo do solo Bacillus subtilis, onde o crescimento é resgatado durante a limitação de Zn²⁺ pela liberação da superfície PrimRP L31 e substituição pelo AltRP L31¹²^,¹³. No entanto, alguns AltRPs são parálogos aos PrimRPs principais, por exemplo, S14, o que significa que sua incorporação é necessária durante a biogênese do ribossomo¹²^,¹³. Reconstruir o ribossomo com AltRPs é um programa comprometido e intensivo em energia. Embora esses AltRPs centrais possam servir para liberar Zn²⁺ do ribossomo, também é possível que alguns AltRPs tenham evoluído uma função adicional no ambiente limitado por Zn²⁺. Isso é apoiado pela observação de que os AltRPs são divergentes de seus PrimRPs parálogos; a homologia da sequência dos genes AltRP é frequentemente maior entre homólogos em diferentes espécies do que a sequência do gene PrimRP de ligação a Zn²⁺ dentro da mesma espécie⁷^,¹⁰. Como os genes que codificam AltRPs altamente divergentes estão sob controle transcricional dependente de Zn²⁺, eles são removidos da pressão seletiva exercida sobre os superoperons ribossômicos fortemente regulados e altamente conservados¹⁴. A pressão seletiva dissociada sobre a informação genética que codifica a maquinaria ribossômica e os AltRPs expõe esses RPs a trajetórias evolutivas diferentes das PrimRPs homólogas e pode permitir a evolução específica da linhagem do mesmo AltRP em diferentes bactérias¹⁰^,¹⁵. A existência generalizada de AltRPs em bactérias e a regulação genética dissociada desses RPs únicos levanta uma questão interessante sobre se a incorporação de AltRPs em ribossomos bacterianos confere uma propriedade especial aos ribossomos contendo AltRP (ribossomos Alt).

As micobactérias são um grupo ideal de bactérias para investigar as propriedades mecanicistas dos ribossomos Alt. Primeiro, as micobactérias possuem um operon altRP altamente conservado contendo quatro genes que codificam AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 e L33-2⁸^,⁹. Os AltRPs micobacterianos são significativamente diferentes de seus parálogos PrimRP; em todos os quatro pares PrimRP / AltRP, um determinado gene AltRP é mais semelhante em todas as espécies de micobactérias do que ao gene PrimRP na mesma espécie¹⁰. A evolução específica da linhagem de AltRPs também é aparente dentro de micobactérias, como evidenciado por AltRPs S18-2 e L28-2 em Mycobacterium tuberculosis e M. bovis, que contêm sequências únicas no terminal C que não estão presentes em outras micobactérias¹⁰. Em segundo lugar, este grupo de bactérias altamente relacionadas contém membros não patogênicos e patogênicos que residem em diversos ambientes, desde o solo (por exemplo, M. smegmatis) até uma miríade de hospedeiros: humanos (por exemplo, M. tuberculosis), bovinos (por exemplo, M. bovis), aquáticos (por exemplo, M. marinum) e aviários (por exemplo, M. avium), para citar alguns. A natureza altamente conservada do operon altRP em micobactérias, a evolução específica da linhagem de genes AltRP específicos e os ambientes muito diferentes nos quais os membros desse grupo existem fornecem uma oportunidade única para analisar a evolução conservada e específica da linhagem da função AltRP e propriedades mecanicistas dos ribossomos Alt. Apesar da abundância de AltRPs em genomas procarióticos, o papel de AltRPs e Alt-ribossomos foi investigado em apenas algumas bactérias⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. O estabelecimento de um sistema padronizado com métricas específicas para validar as condições de crescimento limitantes de Zn²⁺ em micobactérias melhoraria os resultados experimentais e avançaria a compreensão dos ribossomos Alt no campo da pesquisa de ribossomos.

Zn²⁺ é um micronutriente; portanto, traços de contaminação do Zn²⁺ em produtos químicos e água contribuem para a biodisponibilidade do Zn²⁺, mesmo quando omitidos da preparação do meio. Os vestígios de Zn²⁺ presentes na água ou produtos químicos podem variar drasticamente entre os laboratórios, afetando assim o resultado do crescimento limitante do Zn²⁺. Quantificar empiricamente o [Zn²⁺] em cada preparação independente de meio é excessivamente oneroso para a maioria dos laboratórios que realizam ensaios de crescimento de rotina, mas um mecanismo para eliminar a possibilidade de contaminação por Zn²⁺ em meios de crescimento seria intrinsecamente valioso. Para este fim, é apresentado aqui um método detalhado para preparar um meio limitado por Zn²⁺ quimicamente definido (ZLM), vasos de crescimento e culturas de sementes para crescimento limitante de Zn²⁺ e produção de ribossomo Alt em M. smegmatis e M. tuberculosis. As principais características morfogênicas (densidade celular medida por OD₆₀₀, comprimento celular e fluorescência da coenzima F₄₂₀) após o crescimento em ZLM são usadas para verificar se a limitação de Zn²⁺ foi alcançada. A coenzima F₄₂₀ é um cofator de deazaflavina que tem papéis importantes no catabolismo e na defesa contra o estresse oxidativo em metanógenos e micobactérias²⁰^,²¹. É importante ressaltar que as micobactérias são autofluorescentes quando excitadas a 420 nm devido à abundância desse cofator²². A ligação molecular entre a fluorescência [Zn²⁺] e F₄₂₀ permanece sem solução, mas seguir a fluorescência F₄₂₀ em culturas é um bioindicador tratável e confiável.

Em M. smegmatis, os fenótipos bioindicadores ocorrem nas bactérias do tipo selvagem, mas um mutante de deleção sem o operon altRP não passa pelo mesmo programa morfogênico e pode ser usado como um bioindicador diferencial¹⁰. Embora M. tuberculosis não siga o mesmo programa morfogênico que M. smegmatis durante a limitação de Zn²⁺, M. tuberculosis tem uma resposta robusta e global ao Zn²⁺ limitação e um fenótipo bioindicador chave seguindo este método²³. Assim, o sistema definido aqui permite que os ribossomos Prim e Alt- sejam gerados sob as mesmas condições de crescimento (ou seja, limitação de Zn²⁺), facilitando a dissecação mecanicista da função do ribossomo Alt e seu papel na formação da fisiologia bacteriana. Este método de crescimento foi usado para resolver a estrutura dos ribossomos Alt ativos e demonstrar sua atividade translacional em M. smegmatis²⁴. Além disso, apoiando que este método de crescimento e fenótipo bioindicador destaca a funcionalidade biológica dos AltRPs durante a limitação do Zn²⁺, a expressão de AltRP é necessária para a morfogênese dependente de Zn²⁺ e tem um efeito profundo no transcriptoma e proteoma de M. smegmatis¹⁰^,²⁵. O mesmo método, com pequenas modificações na quantidade de inóculo e no tempo de incubação, é usado para gerar culturas limitadas a Zn²⁺ de M. tuberculosis⁹^,²³. Aqui, são detalhados protocolos e fenótipos bioindicadores para alcançar o crescimento limitante de Zn²⁺ em M. smegmatis e M. tuberculosis, com foco em M. smegmatis, uma vez que essa bactéria é mais sensível à contaminação por Zn²⁺ no meio e é mais amplamente acessível do que o patógeno de crescimento lento.

Protocolo

OBSERVAÇÃO: As cepas utilizadas neste estudo são M. smegmatis selvagem mc² 155 (doação do Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) e a cepa deletada ΔaltRP (originada no laboratório Prisic¹⁰). Elas podem ser cultivadas em laboratório de Nível 1 de Biossegurança (NB1) ou em laboratório de NB2, dependendo das regulamentações locais de biossegurança e dos recursos disponíveis. Aqui, o protocolo foi escrito para um laboratório de NB2. Se for realizado em um laboratório de NB1, uma técnica asséptica com bico de Bunsen pode substituir a cabine de segurança biológica. Além disso, pesquisadores que desejarem incluir outras cepas ou condições precisarão calcular o volume de meio necessário com base no número total de culturas analisadas. Manipule a M. tuberculosis patogênica H37Rv (Mtb-H37Rv; doação do Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) em laboratório de NB3, utilizando um respirador (por exemplo, PAPR ou N95). Não reutilize frascos ao cultivar micobactérias altamente virulentas, como a Mtb-H37Rv. A M. tuberculosis auxotrófica mc²6206 (Mtb-Aux) é atenuada e pode ser manipulada em laboratório de NB2 (doação do Dr. William R. Jacobs Jr., Albert Einstein College of Medicine).

1. Preparação dos frascos

OBSERVAÇÃO: Condições de crescimento com limitação de Zn²⁺ são obtidas em frascos Erlenmeyer de policarbonato reutilizáveis (autoclaváveis) de 250 mL. Não utilize frascos de vidro para o crescimento com limitação de Zn²⁺, ou investigue e compare rigorosos procedimentos de lavagem ácida com os resultados apresentados neste protocolo¹⁹. Frascos novos são adequados para alcançar condições de crescimento com limitação de Zn²⁺, mas nunca misture frascos novos e usados em um mesmo experimento. Descarte frascos que apresentem sinais de fragilidade (geralmente nas costuras) ou que tenham sido utilizados mais de aproximadamente 20 vezes. Verifique regularmente os filtros das tampas quanto a degradação e descarte-os se estiverem comprometidos. Se presentes, descarte as tampas rosqueáveis que cobrem os filtros na parte superior das tampas. Este método descreve as precauções adotadas para limpar os frascos e prepará-los para reutilização.

Rotule permanentemente os frascos para que o mesmo conjunto seja usado apenas em condições de limitação de Zn²⁺. Rotule outro conjunto de frascos para o crescimento com Zn²⁺ em abundância. O uso de cores diferentes para rotulagem é útil para evitar a mistura dos frascos.
Nunca permita que resíduos de cultura sequem dentro dos frascos. Adicione água aos frascos imediatamente após decantar a cultura (por exemplo, 100 mL). Se a cultura não for colhida ao final do crescimento, esvazie os frascos despejando toda a cultura em um recipiente para descarte de resíduos líquidos com concentração final de 10% de água sanitária, após registrar os fenótipos dos bioindicadores conforme descrito neste protocolo.
Autoclave os frascos no ciclo para líquidos (pelo menos 121 °C a 15 psi) por 20 min, com a água dentro e as tampas colocadas.
Após a autoclavação, lave os frascos com detergente não iônico e de baixa formação de espuma, escovando bem com uma escova macia. Destine uma escova exclusivamente para a lavagem dos frascos usados no crescimento com limitação de Zn²⁺. Certifique-se de que os frascos estejam limpos, sem resíduos ou detritos. Não escove nem use sabão nas tampas; enxágue suavemente com água desionizada.
Enxágue bem os frascos com água da torneira, seguido por três enxágues com água desionizada (tipo II ou III) e pelo menos mais um enxágue com água ultrapura (tipo I) (18,2 MΩ-cm a 25 °C e ≤ 5 ppb de carbono orgânico total).
Coloque os frascos na posição vertical e de cabeça para baixo para que a água não acumule no fundo. Não use estantes de secagem laboratoriais padrão montadas na parede, pois essas mantêm os frascos em um ângulo e permitem a formação de pequenas poças de água. Estantes comuns para utensílios de laboratório são suficientes. Deixe os frascos e as tampas secarem completamente.
Uma vez secos, rosqueie as tampas nos frascos e cubra-as com papel alumínio. Fixe uma tira de fita indicadora de autoclave no papel alumínio para indicar o status estéril e proteger os filtros das tampas contra poeira.
Autoclave os frascos limpos (pelo menos 121 °C a 15 psi) por 20 min, seguido por um ciclo de vácuo pós-autoclavagem para secar a carga (se a autoclave estiver equipada com esse recurso). Armazene os frascos secos e protegidos contra poeira.

2. Preparação do meio limitante em Zn²⁺ (ZLM)

OBSERVAÇÃO: Utilize apenas béqueres de plástico, cilindros graduados e quaisquer outros materiais descartáveis para preparar os meios. Designe um conjunto de vidraria que seja usado exclusivamente para o preparo de meios com limitação de Zn²⁺. Enxágue toda a vidraria cuidadosamente com água ultrapura (tipo I) antes e após o uso. Utilize produtos químicos de alta pureza e compre dos mesmos fornecedores, sempre que possível.

Prepare o meio de Sauton limitado em Zn²⁺, sem sais adicionais de Zn²⁺²⁶, misturando os seguintes produtos químicos com cerca de 950 mL de água ultrapura em um béquer plástico de 1 L com um bastão de agitação:
0,5 g de KH₂PO₄ (0,05%; MM: 136,09)
0,5 g de MgSO₄ x 7H₂O (0,05%; MM: 246,48)
2 g de ácido cítrico anidro (0,2%; MM: 192,12)
4 g de L-asparagina, 99% (0,4%; MM: 132,12)
60 mL de glicerol (6%)
189 µL de solução de citrato férrico de amônio 1 M (0,005%; MM: 265)
1. Adicione o glicerol utilizando uma pipeta serológica plástica descartável de 50 mL. Enxágue bem a pipeta pipetando para cima e para baixo cerca de 10 vezes no meio, até que não reste glicerol residual na pipeta.
  NOTA: O glicerol é altamente viscoso e difícil de medir. Alternativamente, o glicerol também pode ser despejado em um cilindro graduado e enxaguado várias vezes com cerca de 30 mL de água ultrapura, que então são adicionados ao meio. Se adotar essa abordagem, comece com um volume menor (~600 mL) para que o volume final não ultrapasse ~950 mL após a adição do glicerol e das lavagens do cilindro graduado ao meio.
Complete o volume do meio até cerca de 950 mL e misture bem. A L-asparagina leva alguns minutos para se dissolver; aguarde até que não haja mais flocos brancos antes de prosseguir.
NOTA: A solução de citrato férrico de amônio confere ao meio uma coloração amarelo-claro.
Prepare 15 mL de solução fresca de NaOH (~10% p/v) com água ultrapura em um recipiente plástico (por exemplo, tubo cônico de 15 mL).
Enxágue completamente um medidor de pH com água ultrapura antes do uso e imerja apenas a lâmpada do medidor de pH no meio. Mantenha o medidor de pH no meio com agitação suave enquanto ajusta o pH. Utilizando uma pipeta plástica descartável, adicione a solução de NaOH recém-preparada até atingir um pH final de 7,4.
NOTA: O pH inicial do meio é altamente ácido. É necessário um grande volume da solução de NaOH para elevar o pH até a faixa neutra. Adicione inicialmente 4-6 mL da solução de NaOH; quando o pH atingir cerca de 6,5, adicione a solução de NaOH gota a gota. Não ultrapasse o pH-alvo de 7,4. Se isso ocorrer, não tente reajustar com HCl ou outros ácidos – descarte o meio. É recomendável destinar um medidor de pH exclusivamente para a preparação do meio limitado em zinco (ZLM) e não utilizá-lo para medir o pH de outros meios ou tampões que possam contaminar a sonda.
Transfira o meio para um cilindro graduado e complete até o volume final de 1 L com água ultrapura. Esterilize o meio por filtração através de um frasco-filtro descartável de 0,2 µm.
Adicione assépticamente 2,5 mL de solução de Tween-80 a 20%, previamente filtrada e esterilizada (concentração final de 0,05%). Armazene a 4 °C, protegido da luz, por até 6 meses.

Crescimento limitado por Zn²⁺ em M. smegmatis

OBSERVAÇÃO: Devido à variação entre lotes na quantidade de Zn²⁺ presente no ZLM, é imprescindível usar o mesmo lote de meio ou vários meios que tenham sido bem misturados entre si para todas as culturas em um experimento. Além do meio necessário para preparar as culturas, cerca de 100 mL a mais são necessários para lavar e normalizar as culturas semente.

Realize todas as etapas em uma cabine de segurança biológica. Prepare culturas sementes 18 h antes de montar um experimento de crescimento. Não utilize culturas sementes supercrescidas ou com aglomeração. Uma cultura semente por linhagem é suficiente.
1. Adicione assépticamente 5 mL de meio 7H9-ADC (caldo Middlebrook 7H9 com 0,05% de Tween 80 e enriquecimento com 10% de ADC [concentração final: 0,5% de albumina sérica bovina, 0,2% de dextrose, 0,085% de NaCl e opcionalmente 0,0003% de catalase]) a um tubo de biorreator de 50 mL.
2. Adicione assépticamente 10 µL de células de estoque glicerinado descongeladas (preparadas conforme²⁶) diretamente ao meio. Parafuse a tampa do tubo.
3. Posicione firmemente os tubos em um incubador com agitação em um ângulo de aproximadamente 45°, de modo que o líquido alcance cerca da metade do tubo durante a agitação.
4. Incube os tubos a 37 °C com agitação a 120 rpm por aproximadamente 18 h.
Verifique as culturas sementes noturnas para garantir que a cultura esteja uniformemente turva e não apresente aglomeração significativa. A densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) da cultura noturna deve ser idealmente em torno de 0,5-0,8.
Centrifugue as culturas noturnas nos tubos de biorreator, usados para crescimento noturno, a 3.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter o pellet.
Decante ou aspire o sobrenadante e ressuspenda em 5 mL de ZLM. Repita os passos de centrifugação e ressuspensão 2 vezes, totalizando três lavagens.
1. Durante as etapas de centrifugação, encha uma cubeta até transbordar com etanol a 70% para esterilização. Deixe a cubeta cheia repousar na cabine de segurança biológica por 10 min e enxágue bem 3 vezes com ZLM usando uma pipeta.
  NOTA: O processo de normalização celular exige tempo e prática para ser realizado com eficiência. Ao normalizar as células diretamente na cubeta esterilizada com etanol, o processo é grandemente acelerado.
2. Prepare um número suficiente de cubetas para o número de linhagens incluídas no estudo, por exemplo, este protocolo exige duas cubetas esterilizadas, uma para o tipo selvagem e outra para o mutante ΔaltRP.
Após três lavagens com ZLM, ressuspenda cada pellet celular em 2 mL de ZLM.
Use 600 µL de ZLM em uma cubeta para zerar o espectrofotômetro. A cubeta não precisa ser esterilizada. Reserve a cubeta e use-a para zerar o espectrofotômetro antes de normalizar cada cultura (ou seja, cada linhagem).
Trabalhando com uma linhagem por vez, transfira 600 µL de células lavadas do passo 3.5 para uma cubeta esterilizada preparada no passo 3.4.1 e meça a OD₆₀₀ inicial. Se a OD₆₀₀ for superior a 1, prossiga para o passo 3.8. Se a OD₆₀₀ for inferior a 1, siga os subpassos 3.7.1 e 3.7.2.
1. Se a leitura inicial de OD₆₀₀ do passo 3.7 for inferior a 1, recolha toda a cultura dentro da cubeta, devolva-a ao restante das células sementes lavadas no tubo de centrífuga e centrifugue novamente conforme o passo 3.3. Ressuspenda a cultura em um volume menor do que o usado no passo 3.5 (por exemplo, 1 mL) para obter uma densidade celular mais alta e repita o passo 3.7.
2. Se a OD₆₀₀ após o passo 3.7.1 ainda for inferior a 1, a cultura não está suficientemente densa; reinicie o procedimento a partir do passo 3.1. Incube as culturas por mais tempo ou aumente a quantidade de inóculo para preparar as culturas noturnas, de modo que a densidade final da cultura noturna seja em torno de OD₆₀₀ = 0,5-0,8, conforme descrito no passo 3.2.
Calcule o volume de ZLM a ser adicionado aos 600 µL de células lavadas na cubeta para obter uma OD₆₀₀ de 1, utilizando a seguinte equação e a OD₆₀₀ medida no passo 3.7:
Volume de ZLM (μL) = (OD₆₀₀ inicial - 1) × 600 μL
Adicione o volume de ZLM calculado no passo 3.8 à cubeta preparada no passo 3.7, homogeneíze bem pipetando de 5 a 10 vezes e meça novamente a OD₆₀₀.
Ajuste a OD₆₀₀ para dentro de 5% da OD₆₀₀ = 1 seguindo os subpassos listados abaixo. Use duas pipetas, sendo uma (tamanho P1000) dedicada à mistura da cultura, para evitar o uso excessivo de ponteiras em cada ajuste.
1. Se a OD₆₀₀ for superior a 1, adicione ZLM gota a gota (~50 µL de cada vez), homogeneíze bem pipetando para cima e para baixo de 5 a 10 vezes e meça a OD₆₀₀. Repita este processo conforme necessário até que a cultura esteja dentro de 5% da OD₆₀₀ = 1.
2. Se a OD₆₀₀ cair abaixo de 1 durante a normalização, adicione mais células lavadas (~20 µL inicialmente) do passo 3.5, homogeneíze bem pipetando de 5 a 10 vezes e meça a OD₆₀₀. Repita este processo conforme necessário (ou adicione mais ZLM conforme descrito no passo 3.10.1 se a OD₆₀₀ ultrapassar 1) até que a cultura esteja dentro de 5% da OD₆₀₀ = 1.
3. Assegure-se de que o volume na cubeta não exceda ~1,5 mL durante a normalização celular para evitar derramamento no espectrofotômetro. Remova cultura da cubeta ao diluir, se necessário. Também certifique-se de que o volume da cultura na cubeta esteja acima do mínimo necessário para medir com precisão a OD₆₀₀ no espectrofotômetro. A maioria dos espectrofotômetros exige pelo menos 600 µL.
Repita os passos de normalização celular (3.6 - 3.10) para todas as linhagens e condições incluídas no estudo.
Prepare o número total de frascos necessários para um experimento adicionando assépticamente 50 mL de ZLM em frascos Erlenmeyer plásticos de 250 mL preparados conforme descrito no passo 1.
Inocule os frascos adicionando assépticamente 50 µL da cultura normalizada com OD₆₀₀ = 1 diretamente da cubeta, obtendo uma OD₆₀₀ final de 0,001 (diluição 1:1000 do inóculo normalizado).
Para culturas cultivadas sem limitação de Zn²⁺ (ou seja, meio repleto de Zn²⁺, ZRM), adicione 30 µL de ZnSO₄ estéril 10 mM (preparado recentemente a partir de solução estoque estéril 1 M) diretamente aos frascos de cultura, obtendo uma concentração final de 6 µM de ZnSO₄.
Incube os frascos a 37 °C com agitação a 100 rpm por 3 dias até a fase estacionária (Dia 0 é o dia da inoculação).
A cada dia de crescimento, use um leitor de microplacas com monocromador ou com filtros para medir as seguintes métricas de crescimento utilizando 200 µL de cultura em uma microplaca de 96 poços com fundo plano. Realize as leituras da placa imediatamente após a alíquota das células para evitar sedimentação.
NOTA: O pré-aquecimento do leitor de placas não é necessário, pois os valores absolutos de fluorescência são menos informativos do que as razões e os espectros de fluorescência, e o pequeno volume medido equilibra rapidamente à temperatura ambiente durante a preparação da placa. A fluorescência pode ser medida a partir da parte superior ou inferior da placa se houver condensação na tampa, embora os valores de intensidade de fluorescência sejam geralmente menores quando lidos pela parte inferior.
1. Densidade celular (ou seja, OD₆₀₀): Para relatar a OD₆₀₀ obtida de um leitor de microplacas, gere uma curva padrão para converter a leitura do caminho óptico da microplaca com um volume fixo (por exemplo, 200 µL) para o caminho óptico padrão de 1 cm.
2. Fluorescência do cofator F₄₂₀ (ex 420 nm/em 475 nm): Para leitores de microplacas com filtros, use o conjunto de filtros mais próximo (por exemplo, ex 430 nm/em 488 nm) e microplacas pretas de 96 poços.
3. Meça a fluorescência de fundo a 375 nm (ex 375 nm/em 475 nm).
4. Se estiver usando um monocromador, gere um espectro de intensidade de fluorescência de ex 230 - 440 nm em incrementos de 5 nm e emissão fixa em 475 nm.
5. Se estiver usando um monocromador, calcule a porcentagem de intensidade de fluorescência a 375 nm em relação a 420 nm usando a equação:
  F_375/420 (%) = (F₃₇₅/F₄₂₀) x 100

4. Gravação e medição do comprimento celular

No dia 3, visualize e registre o comprimento das células. Limpe uma lâmina de vidro e uma lamínula com um pano sem fiapos. Pipete uma gota de 10 µL de cultura sobre a lâmina e coloque a lamínula diretamente sobre a cultura. Pressione suavemente a lamínula para que a cultura se espalhe e preencha quase toda a área sob a lamínula. Prepare as lâminas e visualize imediatamente para evitar secagem.
NOTA: Se a cultura não se espalhar facilmente, detritos podem estar impedindo um bom contato, e o movimento da água dificultará a captura de células em foco. Prepare uma nova lâmina.
Utilizando um microscópio composto (ou contraste de interferência diferencial, DIC, veja abaixo) com objetiva de imersão em óleo de 100x e ocular de 10x (aumento total de 1000x) e um adaptador para câmera, visualize a lâmina preparada.
NOTA: As células são muito mais fáceis de visualizar com o contraste fornecido pela microscopia de interferência diferencial (DIC)¹⁰. Utilize este tipo de microscópio para imagens de alta qualidade, se possível. Para análises rotineiras e verificação do estado de crescimento limitado por Zn²⁺, um microscópio composto de luz padrão é suficiente.
Tire fotos de áreas da lâmina com múltiplas células que estejam em foco, no mesmo plano (ou seja, todo o comprimento da célula seja visível) e que não estejam se movendo. Registre fotos suficientes em diferentes áreas da lâmina (ou em várias lâminas da mesma cultura) para que pelo menos 100 células sejam medidas.
Utilizando o mesmo microscópio e objetiva, capture uma imagem de uma lâmina de calibração.
No Fiji²⁷, use a ferramenta de linha reta para traçar uma linha ao longo do comprimento da lâmina de calibração. Selecione Analisar > Definir escala e preencha a distância conhecida e a unidade da barra de escala. Selecione Global para aplicar a escala a todas as imagens e medições futuras.
Abra uma foto do microscópio. Use a ferramenta de linha reta para traçar uma linha ao longo do comprimento de uma célula e pressione a tecla M no teclado para medir a célula. Meça pelo menos 100 células de cada cultura.
Copie os dados de comprimento gerados na janela pop-up do Fiji para um software de planilha eletrônica ou salve-os como um arquivo de valores separados por vírgula (.csv) para análise estatística.

5. Modificações para o cultivo de M. tuberculosis (Mtb) limitado em Zn²⁺

OBSERVAÇÃO: Em contraste com Mtb-H37Rv, Mtb-Aux não consegue sintetizar L-leucina e D-pantotenato, e esses suplementos são adicionados ao meio²⁸. A suplementação para Mtb-Aux não afeta a limitação de Zn²⁺, e ambas as cepas exibem fenótipos semelhantes em ZLM²³. Este protocolo é uma modificação de um protocolo previamente publicado²³, sendo a principal diferença o cultivo das culturas por 8 dias em vez de 10 dias, a fim de reduzir a agregação e permitir o enriquecimento de células isoladas, o que é necessário para aplicações posteriores, como infecções de macrófagos. Para outras diferenças menores, consulte a publicação original²³. O método de inoculação difere de M. smegmatis devido ao inóculo muito maior necessário para iniciar o crescimento de M. tuberculosis.

Para o Mtb-Aux, forneça suplementação adicional de 50 µg/mL de L-leucina e 48 µg/mL de D-pantotenato em todos os meios. Esterilize por filtração soluções estoque 1000x de 50 mg/mL de L-leucina e 48 mg/mL de D-pantotenato de cálcio com filtro de 0,2 µm e adicione aos meios esterilizados.
Adicione assépticamente 1 mL de células em estoque glicerinado descongelado a 4 mL de 7H9-ADC em um tubo cônico redondo de 14 mL com tampa de encaixe (para Mtb-Aux) ou em um tubo de biorreator de 50 mL (para Mtb-H37Rv).
Incube a 37 °C sem agitação até que a cultura atinja OD₆₀₀ ~1. Isso levará cerca de 1 semana. Aire a cultura uma vez ao dia abrindo o tubo em uma cabine de segurança biológica e pipetando algumas vezes para misturar a cultura.
Inocule 1 mL da cultura estacionária em 50 mL de 7H9-ADC em um frasco plástico ventilado de 250 mL. Uma cultura de 50 mL em 7H9-ADC é suficiente para triplicatas biológicas por linhagem e condição (ou seja, selvagem em ZLM e ZRM). Tenha cuidado para evitar grandes agregados (ou seja, grandes aglomerados de células) deixando a cultura repousar por 5-10 min antes da inoculação, permitindo que os agregados sedimentem no fundo do tubo, e coletando a cultura do topo.
NOTA: A inoculação com grandes agregados resulta em culturas agregadas, o que afeta a normalização e a reprodutibilidade da cultura.
Incube a 37 °C com agitação a 100 rpm até que a cultura atinja OD₆₀₀ entre 0,5 e 0,8 (fase logarítmica média). Isso levará de 3 a 5 dias.
Transfira a cultura para um tubo cônico de 50 mL e pelletize as células por centrifugação a 3.000 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante aspirando 40 mL com uma pipeta serológica e removendo o sobrenadante restante com uma micropipeta P1000.
NOTA: Esta etapa é crítica para reduzir o arraste de Zn²⁺ proveniente do meio 7H9-ADC.
Resuspenda o pellet em 5 mL de ZLM e complete o volume total da cultura para 50 mL no tubo cônico com ZLM.
Repita a centrifugação a 3.000 x g durante 10 min à temperatura ambiente para pelletizar as células. Descarte o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular até o volume final de 50 mL conforme descrito na etapa 5.7.
Meça a OD₆₀₀ das células semente lavadas e calcule o volume necessário para obter uma OD₆₀₀ inicial de 0,05 (Mtb-H37Rv) ou 0,08 (Mtb-Aux) em 50 mL usando a seguinte equação:

NOTA: O crescimento do Mtb-Aux com uma OD₆₀₀ inicial de 0,05 é inconsistente; portanto, utiliza-se uma OD₆₀₀ mais alta de 0,08 para garantir crescimento consistente.
Aliquote o volume da cultura semente calculado na etapa 5.9 em um novo tubo cônico de 50 mL e complete o volume para 50 mL com ZLM. Decante a cultura lavada e normalizada do tubo cônico para frascos Erlenmeyer plásticos preparados conforme descrito na etapa 1. Repita utilizando o mesmo tubo cônico para todas as réplicas biológicas de cada linhagem e condição.
Para culturas cultivadas sem limitação de Zn²⁺ (ou seja, meios repletos de Zn²⁺, ZRM), adicione 30 µL de ZnSO₄ 10 mM estéril diretamente aos frascos de cultura para uma concentração final de 6 µM de ZnSO₄.
Incube os frascos de cultura a 37 °C com agitação a 100 rpm por 8 dias. Meça a OD₆₀₀ e a fluorescência de F₄₂₀ durante todo o crescimento conforme descrito na etapa 3. Descarte as culturas se estiverem agregadas nos primeiros dias de crescimento (ou seja, a cultura não apresenta turvação e há agregados visíveis ao longo da cultura).
NOTA: Idealmente, as culturas devem ser predominantemente planctônicas (ou seja, livres de grandes agregados visíveis a olho nu) durante os primeiros dias de crescimento. As culturas de Mtb, especialmente as em ZLM, tornam-se progressivamente mais agregadas ao longo do crescimento, e a presença de agregados flutuando na superfície do meio em forma de flocos é esperada na fase logarítmica tardia²³.

Resultados

Fenótipos bioindicadores de M. smegmatis
Tipo selvagem M. smegmatis culturas cultivadas em ZLM que atingem Zn²⁺-limitação de crescimento apresentam três fenótipos bioindicadores principais quando comparados a células cultivadas sob Zn²⁺-condições de repleção: [1] diminuição da DO₆₀₀, [2] células alongadas e [3] diminuição da fluorescência máxima em 420 nm. O mutante que lack AltRPs (ΔaltRP) não possui o mesmo Zn²⁺dependente de morfogênese como o tipo selvagem¹⁰^, e seu fenótipo único em Zn²⁺-mídia limitante pode ser usada como um bioindicador diferencial. Portanto, as três métricas de bioindicadores devem ser inicialmente avaliadas em selvagem cultivado em ZRM e ZLM. Se o Zn esperado²⁺-um fenótipo selvagem limitado é observado, o ΔaltRP a linhagem com deleção deve então ser avaliada. O crescimento em ZLM nem sempre alcança Zn²⁺-condições limitadas, que é exatamente a razão pela qual são necessários bioindicadores. Selvagem único e ΔaltRP fenótipos bioindicadores verificam que o Zn biologicamente relevante²⁺-condições limitantes foram alcançadas. Quando culturas cultivadas em ZLM não atingem Zn²⁺crescimento limitado devido ao Zn²⁺ contaminação no meio ou nos recipientes de cultura (ZLM-C), esses fenótipos bioindicadores serão menos acentuados, conforme mostrado em Figura 1 e Figura 2. Inversamente, se a concentração de Zn²⁺ em ZLM é muito baixo, o crescimento é prejudicado pelo Zn²⁺ esgotamento (ZLM-D), que é evidente pela baixa turbidez da cultura e fenótipos alterados dos bioindicadores, também detalhado em Figura 1 e Figura 2.

A densidade celular é uma métrica robusta de limitação por Zn²⁺. Culturas cultivadas em ZRM atingem consistentemente alta turbidez (acima de OD₆₀₀ de 5) após 72 h, possivelmente agregando-se, e são visivelmente mais amarelas (dados não mostrados) do que culturas cultivadas em ZLM (Figura 1A). A limitação por Zn²⁺ restringe o crescimento (marcado pela diminuição da OD₆₀₀) de todas as linhagens quando comparadas à condição com Zn²⁺ suficiente, e a linhagem ΔaltRP apresenta menor densidade celular do que a selvagem (Figura 1A). O crescimento limitado por Zn²⁺ em ZLM resulta consistentemente em uma OD₆₀₀ acima de 3,5 e abaixo de 5 na linhagem selvagem e abaixo de 3 na linhagem ΔaltRP (Figura 1A). Culturas cultivadas em ZLM que apresentaram contaminação por Zn²⁺ (ZLM-C) atingem uma densidade celular semelhante (OD₆₀₀ acima de 5) à das culturas com Zn²⁺ suficiente cultivadas em ZRM (Figura 1A). Se a [Zn²⁺] em ZLM for muito baixa, as culturas ficarão severamente deficientes em Zn²⁺ (ZLM-D), e o crescimento será prejudicado, como evidenciado pela redução da densidade celular em culturas selvagens (OD₆₀₀ inferior a 3; Figura 1A). A densidade celular da linhagem selvagem (3,5 < OD₆₀₀ < 5) deve ser o primeiro ponto de verificação fenotípico do bioindicador para confirmar condições limitantes de Zn²⁺. Apenas culturas selvagens que atingirem a densidade celular esperada devem ser consideradas, e a análise da linhagem ΔaltRP deve ser realizada somente após a verificação do fenótipo bioindicador limitado por Zn²⁺ na linhagem selvagem.

Culturas selvagens em fase estacionária cultivadas em ZLM limitado para Zn²⁺ são alongadas, com um comprimento celular médio de cerca de 9 µm, enquanto Zn²⁺-culturas completas cultivadas em ZRM são curtas, com um comprimento celular médio de cerca de 3 µm (Figura 1B). Culturas selvagens cultivadas em ZLM com Zn²⁺ contaminação (ZLM-C) não se alongam completamente, mas são ligeiramente mais longas que Zn²⁺-células repletas com um comprimento médio de célula de 5 µm. Bioindicação de Zn²⁺ contaminação em lotes inteiros de ZLM indica possível contaminação durante o preparo, enquanto em culturas individuais (ou seja, frascos) indica contaminação devido à lavagem inadequada dos frascos ou ao preparo da cultura. Culturas selvagens cultivadas em ZLM que estão severamente deficientes em Zn²⁺ (ZLM-D) apresentam alongamento menos acentuado, com um comprimento celular médio de cerca de 7 µm (Figura 1B). O fenótipo alongado do tipo selvagem não é observado no ΔaltRP estirpe, e ΔaltRP células limitadas em Zn²⁺ têm um comprimento celular médio de cerca de 5 µm (Figura 1B). Figura 2 mostra imagens representativas de células cultivadas em diferentes preparações de ZLM ou ZRM (após a etapa 2) e visualizadas com microscópio óptico composto. Após a etapa 4, células de diversos campos em imagens como as mostradas em Figura 2 são usados para calcular o comprimento médio das células das culturas mostradas em Figura 1B. O fenótipo alongado do tipo selvagem é específico para Zn²⁺-condições limitantes; a alongamento celular não é observado quando os cultivos são Zn²⁺-repleto ou gravemente com Zn²⁺-privado de (Figura 1B e Figura 2).

O fenótipo do bioindicador com fluorescência reduzida de F₄₂₀ é melhor observado em varreduras de fluorescência (Figura 1C). A diminuição da fluorescência do cofator F₄₂₀ é quantificada tomando-se a porcentagem da intensidade de fluorescência em 375 nm (fundamental) em relação a 420 nm (autofluorescência do cofator F₄₂₀), conforme descrito na etapa 3.16.5, representada como F_375/420. Para leitores de placas monocromáticos sem capacidade de varredura fluorescente, leituras pontuais em 375 nm e 420 nm (ambas com emissão em 475 nm) são adequadas para calcular F_375/420. Culturas selvagens cultivadas em condições completas em Zn²⁺ (ou seja, em ZRM) apresentam F_375/420 altamente reprodutível em torno de 17% (Figura 1D). A redução na fluorescência de F₄₂₀ em culturas limitadas em Zn²⁺ cultivadas em ZLM é marcada por um aumento no F_375/420 para cerca de 27% (Figura 1D). A fluorescência de F₄₂₀ na cepa ΔaltRP limitada em Zn²⁺ é notavelmente menor do que a do tipo selvagem na mesma condição, e isso é visualmente evidente nas varreduras de fluorescência (Figura 1C). O valor de F_375/420 é mais variável na cepa ΔaltRP limitada em Zn²⁺, com uma faixa de aproximadamente 50% a 80% (Figura 1D). Culturas cultivadas em ZLM, mas que apresentam bioindicação de contaminação por Zn²⁺ (ZLM-C), têm F_375/420 reduzido para cerca de 21%, e culturas que estão esgotadas em Zn²⁺ (ZLM-D) apresentam F_375/420 em torno de 35% (Figura 1D).

Em resumo, três fenótipos bioindicadores devem ser avaliados nas cepas selvagem e ΔaltRP para verificar o estado de limitação de Zn²⁺ em culturas cultivadas em ZLM. Os bioindicadores devem ser os seguintes para um crescimento biologicamente relevante limitado por Zn²⁺: [1] OD₆₀₀ da cepa selvagem entre 3,5 e 5, e da cepa ΔaltRP inferior a 3, [2] as células selvagens com cerca de 10 µm de comprimento, e as células ΔaltRP com metade desse comprimento, e [3] a razão F_375/420 da cepa ΔaltRP elevada, ou seja, acima de 50%.

Fenótipos bioindicadores de M. tuberculosis
Zn²⁺-limitado M. tuberculosis não apresenta o mesmo programa morfogênico que M. smegmatis. Especificamente, não há diferença na DO₆₀₀ entre Zn²⁺-repleto e Zn²⁺-culturas limitadas e Zn²⁺culturas limitadas não demonstram nenhum fenótipo morfológico evidente, ou seja, não se alongam²³Da mesma forma, não há um Zn²⁺fenótipo bioindicador deficiente (ou seja, densidade celular reduzida) em M. tuberculosis como é observado em M. smegmatis. Zn²⁺- culturas limitadas apresentam aglomeração mais aparente em comparação com Zn²⁺- culturas completas, embora ambas as condições apresentem considerável agregação no dia 10 (observado tanto em Mtb-H37Rv quanto em Mtb-Aux). O fenótipo bioindicador chave para Zn²⁺ limitação em M. tuberculosis é o pico reduzido de F₄₂₀ fluorescência, conforme relatado anteriormente²³. Os resultados para culturas cultivadas por 8 dias são apresentados aqui em vez de 10 dias para minimizar a agregação. Diminuição de F₄₂₀ a fluorescência é evidente em Zn²⁺- culturas limitadas com monocromáticas (Figura 3) e leitores de placas baseados em filtros. Para leitores de placas baseados em filtros, utilizando Mtb-H37Rv, Zn²⁺culturas limitadas (ou seja, cultivadas em ZLM) apresentam cerca de 50% dos valores brutos de fluorescência em comparação com Zn²⁺-culturas completas (ou seja, cultivadas em ZRM; dados não mostrados). Utilizando um leitor de placas monocromático, modo de leitura inferior e Mtb-Aux, Zn²⁺-culturas repletas têm F_375/420 cerca de 75%, e Zn²⁺- culturas ZLM contaminadas apresentam valores semelhantes. Diminuição de F₄₂₀ fluorescência em Zn²⁺-culturas limitadas cultivadas em ZLM são refletidas por F_375/420superior a 100%. O Zn²⁺-limitedo ΔaltRP a linhagem apresenta crescimento e F semelhantes₄₂₀ fluorescência observada no Zn²⁺-selvagem limitado (Figura 3) e não é útil como bioindicador em M. tuberculosis como é em M. smegmatis (Figura 1). Portanto, é aconselhável testar os meios que serão utilizados para cultivar M. tuberculosis com o rápido crescimento M. smegmatis

Curvas de crescimento, distribuição de comprimento e análise de fluorescência em estudo bacteriano; gráficos e diagramas de caixa.
Figura 1: Fenótipos bioindicadores de M. smegmatis cultivados sob limitação de Zn²⁺ e o efeito da contaminação por Zn²⁺ e do esgotamento de Zn²⁺ sobre os fenótipos. Exemplos representativos dos fenótipos bioindicadores mostrados em cada painel são provenientes das mesmas culturas após 72 h. Exemplos de resultados de crescimento em condições de contaminação por Zn²⁺ (ZLM-C), limitação de Zn²⁺ (ZLM-L) e esgotamento de Zn²⁺ (ZLM-D) são provenientes de preparações independentes de meio, todas seguindo o mesmo método de preparação descrito aqui (passo 2). Os fenótipos representativos das cepas selvagem e ΔaltRP limitadas em Zn²⁺ são provenientes do mesmo lote de ZLM. Todas as cepas e condições possuem três réplicas biológicas (n=3). (A) Curvas de crescimento mostrando a densidade óptica detectada a 600 nm (OD₆₀₀) e a diminuição da densidade celular com a limitação e o esgotamento de Zn²⁺. As barras de erro representam o desvio padrão entre as réplicas. (B) Comprimentos celulares das cepas selvagem e ΔaltRP, demonstrando o fenótipo alongado da cepa selvagem limitada em Zn²⁺. O diagrama de caixa e bigodes mostra a distância interquartil, os comprimentos celulares mínimo, máximo e mediano em µm. (C) Escaneamentos representativos de fluorescência de culturas mostrando pico de fluorescência F₄₂₀ reduzido com a limitação de Zn²⁺ e fluorescência F₄₂₀ diminuída na cepa ΔaltRP limitada em Zn²⁺. Apenas uma cultura representativa das triplicatas biológicas de cada preparação de meio diferente é mostrada. Os escaneamentos de fluorescência utilizam uma faixa de comprimento de onda de excitação de 230 nm a 440 nm com incrementos de 5 nm e um comprimento de onda de emissão de 475 nm. O painel inserido no canto superior esquerdo é um zoom das cepas selvagem e ΔaltRP limitadas em Zn²⁺, destacando o pico de fluorescência reduzido em 420 nm na cepa ΔaltRP limitada em Zn²⁺. As unidades dos eixos são as mesmas do gráfico principal. Todas as legendas são iguais às de (A). (D) Quantificação da fluorescência reduzida do cofator F₄₂₀, calculada a partir da porcentagem de F_375/420. As porcentagens são calculadas a partir dos valores obtidos nos escaneamentos de fluorescência em (C). O diagrama de caixa e bigodes mostra a distância interquartil, os valores mínimo, máximo e mediano das porcentagens. As abreviações que representam o estado relativo ao Zn²⁺ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn²⁺, C = contaminado com Zn²⁺, L = limitado em Zn²⁺, D = esgotado de Zn²⁺; e outras abreviações são: WT = cepa selvagem, a.u. = unidades arbitrárias. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados da eletroforese de status de Zn²⁺, WT vs ΔaltRP, análise de separação proteica.
Figura 2: Imagens representativas de microscopia de M. smegmatis após 72 h. As imagens são provenientes dos cultivos mostrados na Figura 1. As células foram visualizadas usando um microscópio óptico composto com aumento total de 1000x, utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 100x. As barras de escala correspondem a 10 µm. As abreviações que indicam o status relativo ao Zn²⁺ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn²⁺, C = contaminado com Zn²⁺, L = limitado em Zn²⁺, D = esgotado de Zn²⁺; outras abreviações são: WT = linhagem selvagem. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico do espectro de excitação de fluorescência; comprimento de onda versus fluorescência; análise de estudo proteico.
Figura 3: Perda do fenótipo do bioindicador F₄₂₀ em M. tuberculosis limitado por Zn²⁺, demonstrada por varreduras de fluorescência representativas de Mtb auxotrófico mc²6206 (Mtb-Aux). Exemplos de resultados de crescimento contaminado por Zn²⁺ e limitado por Zn²⁺ são provenientes de preparações independentes de meio. As cepas selvagem limitada por Zn²⁺ e ΔaltRP são provenientes do mesmo lote de ZLM. Todas as cepas e condições possuem três réplicas biológicas (n=3). Apenas uma cultura representativa das réplicas biológicas em cada uma das diferentes preparações de meio e cepas é mostrada no gráfico. As varreduras de fluorescência foram realizadas no modo de leitura inferior após 8 dias de crescimento, utilizando uma faixa de comprimento de onda de excitação de 230 nm a 440 nm com incrementos de 5 nm e um comprimento de onda de emissão de 475 nm. As abreviações que representam o status relativo ao Zn²⁺ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn²⁺, C = contaminado por Zn²⁺, L = limitado por Zn²⁺, D = esgotado de Zn²⁺; e outras abreviações são: WT = cepa selvagem, a.u. = unidades arbitrárias. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Uma grande contribuição para a lacuna de conhecimento sobre os fundamentos mecanicistas dos ribossomos Alt é a dificuldade em alcançar condições limitantes de Zn²⁺ in vitro. A contaminação por traços de Zn²⁺ no ambiente de laboratório é comum; assim, alcançar condições de crescimento limitadas por Zn²⁺ reprodutíveis é um desafio. A contaminação por Zn²⁺ pode se originar de várias fontes, embora a fonte mais significativa e comum de contaminação e variabilidade seja a água ultrapura usada para enxaguar materiais de laboratório e fazer meios. Os sistemas de água ultrapura devem ser mantidos adequadamente e devem ser lavados por 1 minuto antes de enxaguar o material de laboratório ou usar água como meio. Os frascos que não são lavados ou bem enxaguados com água ultrapura podem causar contaminação por Zn²⁺ , e isso será aparente pelo aumento da densidade celular em certos frascos, mas não em outros do mesmo lote de ZLM. Frascos novos podem ser usados para avaliar se a fonte de contaminação por Zn²⁺ é de frascos ou meios reutilizados. A contaminação por Zn²⁺ no ZLM deve ser remediada pelo aumento do enxágue dos itens usados para fazer mídia e um conjunto designado de materiais para a preparação do ZLM. Se nenhuma dessas medidas for bem-sucedida em atingir os fenótipos bioindicadores esperados, o [Zn²⁺] em água ultrapura e ZLM deve ser quantificado para descartar a possibilidade de que a fonte de água esteja contaminada com Zn²⁺. Conforme relatado anteriormente, o [Zn²⁺] de ZLM é de 115 ± 37 nM²³, e concentrações abaixo de 70 nM e acima de 150 nM geralmente levam a fenótipos depletados de Zn²⁺ e contaminados com Zn²⁺, respectivamente. No entanto, uma boa preparação do meio é apenas um fator que afeta o resultado, e Zn²⁺ inadequado ou excessivo pode ocorrer devido à preparação inadequada do inóculo e/ou cultura, ou seja, decantação deficiente do meio repleto de Zn²⁺ durante as etapas de lavagem. Todas as culturas de M. smegmatis incluídas aqui foram preparadas da mesma maneira - os resultados de crescimento contaminados com Zn²⁺ (ZLM-C) e empobrecidos com Zn²⁺ (ZLM-D) são incluídos para destacar a variabilidade que pode ocorrer entre diferentes lotes de meios usando o mesmo sistema de água ultrapura, mesmo quando os experimentos são feitos corretamente.

Para garantir que as células de cultura em ZLM produzam fenótipos bioindicadores limitantes de Zn²⁺ reprodutíveis, é importante rotular exclusivamente os frascos, sempre usá-los para a mesma condição (ou seja, com ZLM ou ZRM), rastrear frascos em vários usos e descartar frascos que estão no final de seu ciclo de vida ou que continuam a produzir fenótipos bioindicadores contaminados com Zn²⁺ com ZLM. A preparação adequada do inóculo é muito importante para alcançar o crescimento limitante do Zn²⁺, pois o transporte de Zn²⁺ de células de sementes inadequadamente lavadas é uma fonte comum de contaminação por Zn²⁺ que pode ser difícil de analisar a partir de ZLM contaminado com Zn²⁺. As culturas de M. smegmatis devem ser analisadas e colhidas após 72 h de crescimento em ZLM (e ZRM cultivado em paralelo). A morfogênese e os fenótipos bioindicadores são pronunciados de 48 a 72 h; portanto, avaliar ou colher culturas para limitação de Zn²⁺ muito cedo (ou muito tarde) pode não produzir o fenótipo bioindicador completo. As culturas que são empobrecidas em Zn²⁺ exibirão comprimentos de células semelhantes às que estão contaminadas com Zn²⁺; assim, F₄₂₀ fluorescência e OD₆₀₀devem ser usados para diferenciar os dois. Da mesma forma, as culturas contaminadas com Zn²⁺ nem sempre crescem melhor do que as bactérias limitadas por Zn²⁺, mas a fluorescência F₄₂₀ e o comprimento celular do tipo selvagem e o mutante ΔaltRP devem revelar se a condição limitada por Zn²⁺ é alcançada.

O mesmo vale para M. tuberculosis, pois a perda do fenótipo do bioindicador F₄₂₀ em culturas limitadas a Zn²⁺ é pronunciada entre 8-10 dias de crescimento em ZLM. Embora M. tuberculosis não exiba um forte fenótipo bioindicador limitado por Zn²⁺ como M. smegmatis, o método de crescimento apresentado aqui tem sido usado para associar a perda do fenótipo do bioindicador F₄₂₀ com o crescimento limitado por Zn²⁺ usando ensaios funcionais e transcriptômica nas cepas virulentas e atenuadas de M. tuberculosis (ref²³e dados não publicados). Portanto, seguir a fluorescência F₄₂₀ é uma maneira acessível de monitorar e verificar condições biológicas limitantes de Zn²⁺ em M. tuberculosis. É importante notar que o mecanismo que leva à redução da fluorescência F₄₂₀ durante as condições limitantes de Zn²⁺ permanece sem solução, assim como a distinção de se a fluorescência reduzida se deve à diminuição da abundância do pool de coenzimas como um todo ou a uma mudança em seu estado redox, uma vez que apenas a forma oxidada emite fluorescência²⁹.

Conforme demonstrado aqui, a preparação de meios limitantes de Zn²⁺ é matizada e existem vários fatores que podem influenciar a concentração efetiva de íons Zn²⁺ no meio, mesmo seguindo o mesmo protocolo e usando os mesmos reagentes. Traços de Zn²⁺ em ZLM permitem crescimento e expressão suficientes do fenótipo limitante de Zn²⁺. Essa diminuição gradual de Zn²⁺ para atingir a limitação é semelhante ao modelo de hipóxia de Wayne, no qual o oxigênio é gradualmente consumido por bactérias cultivadas em um frasco fechado³⁰. Como a hipóxia e os fenótipos limitados por Zn²⁺ dependem do crescimento bacteriano, se não houver oxigênio suficiente, ou neste modelo, Zn²⁺, no inóculo ou meio, as bactérias pararão de crescer antes de serem capazes de se submeter ao programa morfogênico relevante. Portanto, embora a contaminação por Zn²⁺ seja um problema mais óbvio quando se deseja atingir a limitação de Zn²⁺ , a depleção de Zn²⁺ também pode representar um problema devido ao comprometimento do crescimento e ao gatilho dependente de Zn²⁺ perdido durante o crescimento ativo. Além disso, o uso de leitores de placas monocromadores ou baseados em filtro com modos de leitura superior ou inferior para intensidade de fluorescência afeta ligeiramente a porcentagem F_375/420 calculada. Portanto, os valores de cada laboratório podem não ser diretamente comparáveis aos aqui apresentados, mas devem ser semelhantes e seguir as mesmas tendências. Assim, os métodos e procedimentos para fazer ZLM que produza crescimento limitante de Zn²⁺ devem ser otimizados para cada laboratório e sistema de água ultrapura, e os fenótipos bioindicadores apresentados aqui devem ser usados como padrão para definir condições limitantes de Zn²⁺.

Devido à dificuldade em padronizar e reproduzir condições de crescimento limitadas por Zn²⁺, uma abordagem acessível para contornar a contaminação por Zn²⁺ é adicionar um agente quelante ao meio preparado sem adição de Zn²⁺. No entanto, essa abordagem confunde a verdadeira resposta biológica à limitação do Zn²⁺, muitas vezes criando um ambiente carente de Zn²⁺ e outros micronutrientes. Mesmo os agentes quelantes específicos de Zn²⁺ demonstraram regular positivamente a resposta à falta de ferro, além da resposta transcricional dependente de Zn²⁺ em M. tuberculosis²³. Além disso, o uso de agentes quelantes requer titulação e tempo cuidadosos para evitar um ambiente severamente carente de Zn²⁺ que não reflita a resposta biológica durante a mudança de condições limitadas de Zn²⁺ para Zn²⁺ ou o crescimento sustentado em ambientes com disponibilidade limitada de Zn²⁺ livre. Finalmente, a adição de agentes quelantes pode não ser compatível com aplicações a jusante (por exemplo, infecções de macrófagos ou animais). Conclusões fundamentalmente diferentes foram tiradas sobre a forma e função dos ribossomos Alt obtidos com agentes quelantes versus depleção gradual de Zn²⁺ em culturas de crescimento ativo^17,24. Destacados aqui estão diferentes fenótipos resultantes de diferenças relativamente pequenas na pureza da água em diferentes lotes de meios, mesmo quando o procedimento é feito corretamente. O sistema quantificável, reprodutível e biologicamente relevante para a geração de ribossomos Alt apresentado aqui, ou seja, em culturas de tipo selvagem limitadas a Zn²⁺ sem adição de quelantes, oferece um método padronizado que será fundamental para unificar contribuições em todo o campo para uma melhor compreensão da biologia alternativa do ribossomo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Prêmio CAREER da National Science Foundation (NSF) 1844854, pelo Prêmio de Inovação da American Lung Association IA -937538 e pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) NIAID R21 AI109293 para SP O endereço atual da Allexa D. Burger é o Centro de Pesquisa em Biociências do Pacífico, Universidade do Havaí em Mānoa, Honolulu, Havaí, EUA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistemas de filtração a vácuo de 1000 mL, linha padrão	VWR	10040-440
Frascos agitadores Erlenmeyer de 125 mL	Greiner Bio-One	679501
Tubos de cultura de 14 mL, plástico, com tampas de posição dupla	VWR	60818-725
Frascos agitadores Erlenmeyer de 250 mL	Greiner Bio-One	679502
40X-1000X Composto Biológico Binocular de Laboratório Microscópio	Omax	M82EZ
Tubos de Bio-Reação de 50 mL, Estéril	VWR	76211-286
Tubos de Centrífuga de Alto Desempenho de 50 mL com Tampas de Bandeira	VWR	89039-656
Alcojet Detergente em Pó de Baixa Formação de Espuma	Alconox	1404
Citrato de Ferro Amônio (III), marrom	Thermo Scientific	AAA1119930	MW: 265 g/mol, para solução 1M adicione 1,325 g a 5 mL de água ultrapura; armazene protegido da luz a 4 C
Albumina de soro bovino	Thermo Scientific	J10857-A1
D-pantotenato de cálcio	Thermo Scientific	AC243300050
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345-10G
Ácido cítrico anidro, cristalino	Fisher Scientific	BP339-500
Dextrose anidra	Fisher Scientific	D14-500
Difco Middlebrook 7H9 Caldo	BD Diagnostics	271310
Dilufotômetro OD600 para a Determinação da Densidade Celular e Ensaios de Bradford	Implen	OD600-10
GENios FL Leitor de Microplacas	Tecan		Descontinuado
Glicerol	Fisher Scientific	G33-4
Infinite M200 PRO Leitor de Microplacas Multimodo	Tecan	LGE140213-20BL
L-Asparagine	Thermo Scientific	AAB2147336
L-Leucina	Thermo Scientific	A1231122
Macrofire SP CCD câmera	Optrônica		Para uso com microscópio Olympus
Sulfato de magnésio heptahidratado	VWR	97062-134
Sistema de purificação de água Milli-Q Direct 8	Millipore	C85358
Moticam X3	Motic		Descontinuado, substituído pelo Moticam X5 Plus; para uso com microscópio composto
Ácido oleico	Thermo Scientific	031997-14
Microscópio vertical Olympus BX51	Olympus		Descontinuado, substituído por BX53M
Fosfato de potássio, monobásico	Fisher Scientific	BP362-500
Semi-Micro Cubetas de plástico descartáveis de dois lados	VWR	97000-590
Cloreto de sódio, cristal	VWR	VW1494-01
Hidróxido de sódio	Fisher Scientific	S318-500
Tween 80	MP Biomedicals	103170
Sulfeto de zinco heptahidratado, cristalino/	ACS MP Biomedicals	219145290

Referências

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Limita o de Zinco Ribossomos Alternativos Fen tipo Bioindicador Prote nas Ribossomais Morfog nese Celular Fluoresc ncia da Coenzima F420 Medi o do Comprimento Celular Meios Limitados em Zinco Mycobacterium tuberculosis

Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias