Method Article

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O peixe-zebra (Danio rerio) tem uma excelente capacidade de regenerar diferentes órgãos e apêndices. A regeneração óssea em peixe-zebra tem sido estudada usando diferentes métodos, como amputação de barbatanas, arrancamento de escamas, trepanação de crânio e abordagens microscópicas. Usando uma configuração de varredura a laser confocal equipada com um laser de dois fótons, um método de ablação a laser foi desenvolvido como um paradigma de lesão para ablação de células formadoras de osso (osteoblastos) no opérculo em desenvolvimento de larvas de peixe-zebra. O método descrito aqui permite a ablação das células de maneira precisa, pois a área, a forma e a profundidade podem ser ajustadas com precisão. Além disso, esse método permite a obtenção de imagens da área antes e logo após a ablação, para que os efeitos de curto prazo da lesão possam ser analisados. Nesta configuração experimental, a resposta imune após a ablação de osteoblastos na área lesada foi estudada. Observou-se um aumento no recrutamento de macrófagos após a ablação, indicando a relevância de sua presença durante a regeneração óssea.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O peixe-zebra regenera diversos órgãos, como retina, cérebro, coração e pâncreas1. Além disso, o peixe-zebra regenera elementos esqueléticos, razão pela qual tem sido usado para estudar a regeneração de barbatanas, escamas e calvárias (calotas cranianas)2. Diferentes paradigmas experimentais têm sido utilizados para estudar a regeneração tecidual e óssea, como ressecção de nadadeiras (amputação), fratura de nadadeiras, trepanação craniana 3,4, crioleferimento 5,6 ou ablação genética 7,8,9. Recentemente, as abordagens de ablação a laser têm sido amplamente utilizadas em peixes-zebra para estudar a resposta de cicatrização e regeneração após lesões 10,11,12,13,14.

A ablação mediada por laser tem sido usada em diferentes áreas da pesquisa biológica, como mecanobiologia, biologia do desenvolvimento, pesquisa de regeneração e cirurgia tumoral 10,11,12,15,16,17,18,19. Existem várias metodologias de ablação a laser, como o uso de lasers YAG (granada de ítrio e alumínio), UV (ultravioleta) ou 2p (dois fótons)20. A ablação a laser permite a remoção de células individuais ou porções maiores de tecidos de maneira muito precisa, possibilitando o estudo de diferentes processos, como a resposta do sistema imunológico à ablação tumoral21 ou durante a regeneração do opérculo do peixe-zebra. Neste último exemplo, a ablação foi confirmada pelo desaparecimento do sinal do fluoróforo nuclear e citoplasmático e coloração de necrose10,22.

É bem conhecido que a resposta imune inata e sua cinética regulada são essenciais para a regeneração tecidual adequada. Neutrófilos e macrófagos são as primeiras células a serem recrutadas para o local da lesão, onde desempenham diferentes papéis, como liberação de citocinas e fatores de crescimento, remoção de detritos celulares e remodelação da matriz extracelular23. Esse recrutamento e subsequente funcionalização de macrófagos também foram observados em barbatanas de peixe-zebra amputadas24 e no opérculo em desenvolvimento, que foi submetido a 'nanodissecção' a laser levando à ablação de osteoblastos10. Neste último experimento, a recuperação do número de osteoblastos, o desenvolvimento normal do opérculo e o recrutamento de células imunes inatas (neutrófilos, macrófagos e células semelhantes a osteoclastos) para a área lesada foram observados após ablação mediada por laser UV e laser de dois fótons10. Experimentos em peixe-zebra nos quais o sistema imunológico foi farmacologicamente suprimido pelo uso de glicocorticóides mostraram um comprometimento da regeneração após imunidade desregulada, apoiando o papel funcional do sistema imunológico no reparo tecidual 3,10,25,26.

Aqui, é descrita uma metodologia de ablação mediada por laser de dois fótons para estudar a biologia da regeneração óssea no desenvolvimento de ossos de peixe-zebra. Em particular, o efeito da abordagem de ablação de osteoblastos no opérculo é mostrado em termos da resposta imune, que é investigada pelo monitoramento do recrutamento de macrófagos para o local da ablação.

Protocol

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O protocolo do estudo recebeu aprovação da Landesdirektion Sachsen, números de licença 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. As linhagens de peixe-zebra utilizadas foram mantidas de acordo com a legislação nacional e sob condições padronizadas, conforme descrito anteriormente27,28. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de materiais e soluções

  1. Mantenha os embriões em 1x meio E3. Prepare o meio 1x E3 diluindo 170 mL de um estoque E3 60x em 10 L de água deionizada e adicionando 2 mL de azul de metileno a 0,1%.
    1. Prepare o estoque de mídia E3 60x misturando 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2·2 H2O, 4,90 g de MgSO4·7 H2O em 1 L de água autoclavada deionizada.
  2. Para a inclusão das larvas, prepare alíquotas de agarose de baixo ponto de fusão (LMA) a 1% com antecedência e mantenha-as em temperatura ambiente.
    1. Para preparar alíquotas, dissolva a ML em 1x meio E3, por exemplo, 500 mg de LMA em 50 mL de 1x E3 em um frasco Erlenmeyer, aqueça a solução no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente e distribua-a em alíquotas de 1 mL em tubos de 1,5 mL.

2. Reprodução de peixe-zebra e coleta de embriões

NOTA: Larvas de peixe-zebra transgênicas duplas relatando a presença de osteoblastos comprometidos [osterix: nGFP = Tg (Ola.Sp7: NLS-GFP) zf132] 29 e macrófagos [mpeg: mCherry = Tg (mpeg: mCherry) gl23] foram usados aqui30 (Figura 1A).

  1. Configure o peixe-zebra parental com os transgenes individuais desejados em gaiolas de acasalamento padrão na noite anterior ao acasalamento.
    NOTA: As gaiolas de acasalamento padrão permitem que os ovos passem para um compartimento inferior, onde o peixe-zebra parental não pode alcançá-los.
    1. Mantenha machos e fêmeas separados até o acasalamento usando uma divisória na gaiola de acasalamento. Remova a divisória na manhã do dia seguinte para iniciar o acasalamento.
  2. Ao meio-dia, o mais tardar, remova o peixe-zebra parental dos tanques de reprodução e colete os embriões, coando a água da gaiola de acasalamento por uma peneira.
    NOTA: Caso a idade exata das larvas seja decisiva, colher embriões em intervalos regulares de aproximadamente 30 min. Companheiros de ninhada devem ser usados em experimentos com diferentes grupos experimentais.
  3. Colocar os embriões numa placa de 100 mm de diâmetro contendo 1 meio E3 e mantê-los numa incubadora a 28 °C31.
  4. Remova os óvulos não fertilizados e os embriões mortos do prato usando uma pipeta de plástico com a ajuda de um estereomicroscópio e troque 1x mídia E3 diariamente.
  5. Antes do experimento, classifique as larvas positivas para os transgenes repórteres usando um estereomicroscópio de fluorescência.

3. Larvas incorporadas em agarose de baixo ponto de fusão

  1. Derreter as alíquotas LMA num termobloco ou em banho-maria a 65 °C. Uma vez derretida a ML, mantenha-a a 42 °C até a incorporação (Figura 1B). Adicione 50 μL de 0,4% de MS-222 à alíquota de 1 mL de LMA derretida para obter uma concentração de 0,02% de MS-222 para anestesia.
  2. Anestesie 4 larvas dpf (dias após a fertilização) (ou larvas mais velhas) em meio MS-222 E3 a 0,02%.
  3. Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de micropoços com fundo de vidro usando uma pipeta de plástico Pasteur de 3 mL e remova o excesso de meio E3 com a mesma pipeta (Figura 1B). Evite secar as larvas.
    NOTA: Mais de uma larva pode ser embutida em um prato simultaneamente; Recomenda-se incorporar 3 a 5 larvas para permitir tempo suficiente para a colocação.
  4. Pegue a agarose LMA derretida do banho-maria / termobloco e adicione uma gota (resfriante) de LMA ao prato, cobrindo o fundo do vidro onde as larvas foram posicionadas. Preste atenção que o LMA não está muito quente, mas ainda líquido.
  5. Em seguida, coloque as larvas na posição lateral desejada antes que a agarose se solidifique. Aqui, certifique-se de uma posição lateral na qual o opérculo esteja o mais próximo possível do fundo de vidro do prato como uma preparação para a configuração do microscópio inverso (Figura 1B).
  6. Deixe a agarose solidificar e, em seguida, adicione o meio E3 (contendo no máximo 0,02% MS-222) ao prato para evitar o ressecamento da agarose (Figura 1B).

figure-protocol-1
Figura 1: Representação esquemática do procedimento de incorporação. (A) Tg(osterix:nGFP) transgênica dupla; mpeg1:mCherry)29,30 larvas de peixe-zebra com osteoblastos operculares marcados em verde e macrófagos marcados em vermelho foram usados. (B) O fluxo de trabalho do procedimento de incorporação, conforme descrito na etapa 3 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Imagem in vivo das larvas e ablação a laser

  1. Para osteoblastos de ablação a laser no opérculo em desenvolvimento de peixe-zebra transgênico Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, use um microscópio de varredura a laser invertido de dois fótons com uma objetiva de água 25x/0,95 ou uma configuração equivalente.
  2. Coloque o prato com as larvas embutidas no estágio microscópico no microscópio invertido e posicione a região desejada para ablação no centro do campo de visão. O opérculo pode ser facilmente identificado com a ajuda do sinal de fluorescência GFP.
  3. Uma vez que o opérculo esteja focado e centralizado no campo de visão do microscópio, escolha as configurações da pilha z (geralmente intervalos z de 1-2 μm são usados) para obter imagens de toda a largura do opérculo. Ao mesmo tempo, escolha a área em um plano z específico a ser ablacionado (geralmente na zona posterior do opérculo). A ablação a laser de dois fótons é exercida apenas neste plano.
    NOTA: Uma resolução mais alta na dimensão z levará a tempos de imagem mais longos, mas permitirá análises volumétricas dos dados adquiridos posteriormente.
  4. Imagem da área de interesse do opérculo antes da ablação. Para a detecção de GFP, use um laser de luz branca a 488 nm e um detector híbrido variando de 495 nm a 550 nm ou equivalente. Visualize os macrófagos usando excitação de 555 nm (laser de luz branca), com uma faixa de detecção mCherry de 595 a 780 nm em um detector híbrido (ou equivalente).
    1. Use o formato de imagem 512 x 512 para uma boa relação qualidade/tempo (outros formatos podem ser usados se desejar uma resolução mais alta ou, alternativamente, uma velocidade mais alta).
      NOTA: Uma incubadora com temperatura controlada instalada no microscópio pode ser usada e ajustada, por exemplo, para 28 °C.
  5. Desenhe uma região circular com um diâmetro de 25 μm (outras formas e tamanhos podem ser selecionados dependendo do experimento) em um plano 2D selecionado, focalizando o opérculo usando a ferramenta ROI.
  6. Para realizar a ablação, aplique a potência de ablação (medida sem objetiva) a 450 mW e exponha a área selecionada ao laser de dois fótons a uma velocidade de varredura de 400 Hz e uma duração total de 10 s. Durante a ablação, a área pode ser visualizada usando um detector híbrido na faixa de 401-443 nm ou equivalente.
  7. Após a ablação, confirme a ablação estruturalmente criando imagens novamente da mesma pilha z com as mesmas configurações usadas antes da ablação. A área de ablação não contém mais células fluorescentes.

5. Recuperação de larvas e imagens para monitorar o recrutamento de células imunes

  1. Se a imagem do recrutamento de células imunes precisar ser realizada com atraso, recupere as larvas da imagem e da anestesia. Remova as larvas cuidadosamente da ML usando uma pinça ou uma agulha de dissecção.
    1. Primeiro, remova uma camada de agarose que cobre as larvas. Em segundo lugar, remova a agarose em contato direto com as larvas. Omita esta etapa se a imagem imediata do recrutamento de células imunes estiver ocorrendo.
  2. Coloque as larvas de volta em um prato com meio E3 puro e verifique sua recuperação. A recuperação é evidente pela natação das larvas.
  3. Aos 4 ou 6 hpl (horas após a lesão), imagine a área do opérculo novamente usando as mesmas configurações no mesmo microscópio para verificar os efeitos da ablação no recrutamento de macrófagos. Para fazer isso, repita a incorporação (etapa 3) e a imagem como realizada anteriormente (etapa 4).
  4. Após a imagem, remova as larvas da ML. O sacrifício das larvas pode ser realizado por incubação em água gelada ou com uma overdose de MS-222 em E3, dependendo dos requisitos legais. As amostras podem então ser usadas para estudos de acompanhamento ou descartadas.

6. Análise de imagem e análise estatística

  1. Processe as imagens usando um software de processamento de imagem, como o Fiji32. Dependendo da resolução z dos dados adquiridos, as análises podem ser realizadas em 2D ou 3D.
  2. Quantifique os macrófagos manualmente, incluindo células claramente separadas, por exemplo, discernindo os principais corpos celulares ou, alternativamente, quantificando as células com um rótulo nuclear ou medindo a área caso as células estejam sobrepostas (próximo passo).
  3. Para quantificação da área, crie uma máscara abrangendo os macrófagos. Para fazer isso, use a ferramenta Ajustar > Limite do > Imagem e crie um ROI (Analisar Ferramentas > > Gerenciador de ROI > Adicionar) em Fiji. Exclua pequenas partículas no fundo para quantificação.
    1. Em seguida, meça a área (Analisar > Medir). Considere se as áreas de fluorescência celular sobreposta precisam ser incluídas na medição.
      NOTA: Aqui, a área de ablação circular foi omitida das medidas de área, uma vez que os macrófagos recrutados não podem ser distinguidos nesta área.
  4. Gere gráficos traçando os resultados da medição usando um software adequado. Para comparar os dados antes e depois da ablação, realize um teste estatístico apropriado (aqui, um teste t unicaudal pareado foi realizado).
    NOTA: As figuras podem ser preparadas usando software de edição de fotos e design gráfico.

Results

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A ablação a laser foi realizada conforme indicado no protocolo acima. O sinal GFP dos osteoblastos na área ablacionada desapareceu instantaneamente após a ablação. Para estudar a resposta da ablação de osteoblastos em termos de resposta imune, foi observada a presença de macrófagos em larvas de 6 dpf antes e em 6 hpl. Antes da ablação, muito poucos macrófagos foram observados na área do opérculo10 (Figura 2). Aos 6 hpl, foi detectado um forte acúmulo de macrófagos na região do opérculo ablacionado e um aumento do número de macrófagos no campo de visão, incluindo o opérculo e a área ao redor do opérculo10 (Figura 2).

figure-results-1
Figura 2: Recrutamento de macrófagos a 6 hpl em larvas de peixe-zebra de 6 dpf. Área do opérculo sem ablação e a 6 hpl. Os osteoblastos operculares são marcados em verde, os macrófagos em magenta e o círculo tracejado indica a área de ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O recrutamento de macrófagos também foi analisado em larvas de 4 dpf com opérculos muito menores em 4 hpl observando resultados semelhantes (Figura 3). A quantificação do número de macrófagos (fora do local de ablação imediata a laser) mostrou um aumento dentro do período de tempo investigado (4,00 ± 2,37 macrófagos antes da ablação versus 7,00 ± 2,76 macrófagos a 4 hpl) (Figura 3B). Da mesma forma, a área de macrófagos (medida em μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 antes da ablação versus 1553 μm2 ± 869,9 μm2 a 4 hpl) aumentou ( Figura 3C ). Como os macrófagos às vezes são difíceis de distinguir, recomenda-se medir a área dos macrófagos em vez do número de macrófagos, como foi feito aqui.

figure-results-2
Figura 3: Recrutamento de macrófagos a 4 hpl em larvas de peixe-zebra de 4 dpf. (A) Área do opérculo sem ablação e a 4 hpl. Os osteoblastos operculares são marcados em verde, os macrófagos em magenta e o círculo tracejado indica a área de ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (B) Quantificação do número de macrófagos na área do opérculo diretamente antes (0 hpl) e após a ablação (4 hpl). (C) Quantificação da área de macrófagos (local de ablação a laser excluído). Testes t unicaudais pareados. Cada ponto representa os dados de uma larva, e a média ± DP é mostrada, n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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A ablação a laser tem sido aplicada em várias disciplinas da pesquisa biológica. Em particular, tem sido útil como método para estudar a regeneração tecidual 10,11,12. Por exemplo, o recrutamento e as alterações fenotípicas das células imunes inatas foram recentemente analisados ao longo do tempo usando ensaios de ablação a laser UV ou laser de dois fótons, juntamente com a recuperação de osteoblastos no local de ablação a laser10. Imagens ao vivo do recrutamento de células imunes foram realizadas até 12 h pós-lesão (hpl); no entanto, períodos de imagem mais longos podem ser previstos com ajustes apropriados na anestesia e aprovação das respectivas autoridades. Em Geurtzen e col., as análises foram realizadas até vários dias após a ablação a laser e ajudaram a definir o meio inflamatório no local da ablação, bem como a estabelecer o papel de suporte dos macrófagos na regeneração óssea10. Muitas outras aplicações, como estudar o papel da liberação de espécies reativas de oxigênio33 após a morte celular no tecido ósseo, são concebíveis.

Uma das vantagens do uso da ablação celular mediada por laser de dois fótons é a possibilidade de combiná-la com imagens confocais. O software usado aqui (consulte Tabela de Materiais) pode ser configurado para um modo (Modo de Dados ao Vivo) no qual a imagem e a ablação ocorrem consecutivamente, acelerando o processo. Outra vantagem da tecnologia é a precisão da ablação. O tamanho e a forma da ablação podem ser facilmente ajustados no software de maneira muito precisa. No cenário experimental aqui apresentado, uma área circular com diâmetro de 25 μm foi escolhida para ablação. No entanto, outros experimentos de ablação em Drosophila empregaram ablações lineares de 25 μm para reduzir a tensão do tecido no epitélio embrionário, cortando as junções celulares vizinhas34. Essa precisão permite a ablação de um número específico e controlado de células, células únicas ou mesmo membranas celulares.

Notavelmente, o tipo de lesão realizada com um laser de dois fótons não se assemelha a lesões e morte celular que ocorrem naturalmente, o que precisa ser lembrado na pesquisa de regeneração, mas também em outras disciplinas. Em particular, as ablações a laser criam lesões muito focadas, destruindo completamente (queimando) as células na região de interesse20 com danos mínimos nos tecidos circundantes, enquanto lesões mecânicas ou outros tipos de lesões tendem a afetar vários tipos e camadas de tecido em uma escala mais ampla. Isso pode levar a múltiplas consequências envolvendo diferentes tipos de morte celular (por exemplo, necrose, apoptose, autofagia)35 e diferentes resultados regenerativos. Além disso, as reações à ablação a laser podem diferir em termos celulares e moleculares. Por exemplo, foi demonstrado que, embora as células ao redor do local da lesão a laser possam perder a integridade da membrana plasmática, elas podem sobreviver ao dano e restaurar a integridade36. A ablação a laser também leva a áreas da matriz extracelular danificadas, que podem resultar de "explosões térmicas" no centro do feixe de laser aplicado e também de forte exposição ao calor nas células diretamente vizinhas10,37. No entanto, as células ao redor dos locais de ablação a laser mostram um número aumentado de corpos apoptóticos, como mostrado para o tecido cardíaco ablacionado a laser38, e uma resposta imune é desencadeada, como mostrado aqui. Além das diferenças descritas, outra limitação dos ensaios de ablação assistida por laser pode ser a profundidade na qual a lesão pode ser realizada e o tamanho limitado das amostras. Estruturas ocultas em espécimes espessos podem não ser adequadamente ablacionadas e a imagem será difícil. Isso, no entanto, dependerá muito do microscópio e do laser usados, bem como da objetiva e da incorporação.

Incorporar as larvas de forma que o opérculo seja colocado próximo ao fundo de vidro do prato é essencial no caso de uma configuração invertida ser usada, como no protocolo apresentado. Além disso, é muito importante testar a temperatura do LMA antes de aplicá-lo para cobrir as larvas (etapa 3.4), pois a agarose quente danificará as larvas. Para evitar isso, retire a alíquota LMA do termobloco mais cedo, por exemplo, enquanto remove a mídia E3 restante do prato com fundo de vidro e teste a temperatura, como na pele do pulso. O LMA deve ser quente, mas não quente.

Uma vez que as larvas estejam cobertas com LMA, é importante colocá-las rapidamente na posição correta antes que a LMA comece a solidificar. A posição lateral é a mais fácil de alcançar; No estudo apresentado, a posição desejada foi lateral com leve inclinação para o lado ventral. Caso a ML solidifique antes que as larvas sejam posicionadas corretamente, é possível remover a ML (como na etapa 5.1) e repetir a incorporação. Da mesma forma, é importante que a área a ser fotografada (e ablação a laser) esteja o mais próximo possível do fundo de vidro do prato para máxima qualidade de imagem e ablação celular, embora isso também dependa da distância de trabalho da objetiva.

É possível incorporar mais de uma larva no mesmo prato para obter imagens. Isso economizará tempo e fará melhor uso do LMA. O número de larvas que podem ser incorporadas dependerá da experiência do experimentador, mas 3-5 larvas são recomendadas.

A ablação a laser também pode ser realizada com configurações microscópicas verticais que empregam lentes de imersão. Nesse caso, é importante incorporar as larvas com uma visão ligeiramente ventral (de cima) para permitir uma boa qualidade de imagem e sucesso na ablação a laser do opérculo. Além disso, apenas uma fina camada de LMA deve cobrir as larvas para permitir uma boa excitação e detecção de sinais fluorescentes.

Neste protocolo, uma configuração de ablação mediada por laser de dois fótons para osteoblastos é descrita como uma metodologia para realizar lesões em ossos em desenvolvimento, especificamente no opérculo. Este método pode ser adaptado para ablação de células em outros ossos do peixe-zebra em desenvolvimento. Além disso, geralmente é uma abordagem útil para estudar a regeneração de tecidos lesados11,12. A facilidade de realizar ablações e cortes de tecidos de diferentes tamanhos e formas permite seu uso em diferentes arranjos experimentais e campos de pesquisa 15,17,18,19,21,34. Ao todo, a ablação mediada por laser de dois fótons é um método muito adaptável - para diferentes tecidos, organismos e até mesmo ambientes in vitro - e representa uma ferramenta importante na pesquisa biológica.

Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) Transregio 67 (projeto 387653785), o DFG SPP 2084 μBone (projeto KN 1102/2-1) para FK. Este trabalho foi apoiado pela Light Microscopy Facility (DFG project 413875620), uma instalação central da Plataforma de Tecnologia CMCB na TU Dresden. Os trabalhos na TU Dresden foram cofinanciados com receitas fiscais baseadas no orçamento acordado pelo Parlamento da Saxónia («Landtag»).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloreto de cálcio di-hidratado, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Placa de Cultura de Células, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Forma da ponta reta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Placa Falcon de 6 poçosCorning353502
Placa de micropoços com fundo de vidroMatTekP35G-1.5-14-CPrato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro de Vidro de 14 mm, Não Revestido
Laser multifotônico Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Baixo ponto de fusão de agarose Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Gaiolasmuitas variedades, por exemplo, Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Cloreto de potássio, KClPanReac AppliChem131494
Cloreto de sódio, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON Leica MicrosystemsEquipado com um laser multifotônico Insight X3 e software Leica Application Suite
Agulha de dissecação de aço inoxidávelBochem12010140 mm
SZX16OlympusEquipado com uma base de iluminação LED SZX2-ILLTQ
Gabinetes termostáticos TS - WTWxilemaTS 608/2-iPara incubação (embrião)
Transferência pipeta, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparente
Zeiss SteREO Discovery.V12 versão 4.7.1.0.ZeissEquipado com câmera Axiocam MRm e software AxioVision
de acoplamento Sistema de microscópio estéreo de

References

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