Medição de quatro subtipos de células NK uterinas usando coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada em mulheres com falha repetida de implantação

Resumo

Este estudo apresenta um método pioneiro para quantificar subconjuntos de células assassinas naturais uterinas durante a janela de implantação usando técnicas avançadas de coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada.

Resumo

A imuno-histoquímica (IHQ) desempenha um papel crucial na pesquisa biológica e no diagnóstico clínico, servindo como o método mais comumente usado para identificar e visualizar antígenos teciduais. No entanto, os métodos tradicionais de coloração IHC têm limitações na distinção de vários subtipos de células imunes. Esse desafio levou os cientistas a explorar novas tecnologias e metodologias para identificação e diferenciação precisas de subtipos de células imunes. Nos últimos anos, a IHQ multiplex surgiu como uma solução, permitindo a detecção simultânea de múltiplos antígenos e sua visualização dentro da mesma amostra de tecido. As células uterinas natural killer (uNK) desempenham um papel fundamental nos processos iniciais da gravidez, incluindo decidualização, remodelação das artérias espirais uterinas e implantação de embriões. Diferentes subtipos de células uNK exibem funções diferentes, permitindo-lhes coordenar vários eventos biológicos para o desenvolvimento embrionário e a gravidez bem-sucedidos. Portanto, pesquisas aprofundadas sobre os subtipos de células uNK são essenciais para elucidar os mecanismos de regulação imunológica durante a gravidez. Tais estudos fornecem informações valiosas e novas abordagens para abordar condições relacionadas, como infertilidade e insuficiência reprodutiva recorrente. Este artigo apresenta um protocolo detalhado de coloração IHC multiplex para estudar a densidade de quatro subtipos de células uNK em amostras endometriais durante a janela de implantação (WOI). O protocolo inclui preparação de amostras, otimização de marcadores de subtipo, imagens microscópicas e análises de dados. Este protocolo de coloração IHC multiplex oferece alta especificidade e sensibilidade, permitindo a detecção simultânea de diferentes subtipos de células uNK, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para explorar os meandros e mecanismos de regulação imunológica durante a gravidez.

Introdução

O primeiro nascido vivo documentado após fertilização in vitro e transferência de embriões (FIV-ET) foi relatado em 1978. Nos últimos 40 anos, tem havido uma alta demanda pela assistência de FIV-TE entre casais inférteis¹. Em 2021, 238,126 pacientes iniciaram um total de 413,776 ciclos de fertilização in vitro nos Estados Unidos. Isso marca um aumento de 25% nos ciclos em relação aos 2 anos anteriores e um aumento de 135% em relação a 2012². Esse aumento é atribuído principalmente ao aumento da prevalência de infertilidade e ao atraso no planejamento da gravidez. Os avanços nas técnicas de cultura de embriões e protocolos de superovulação levaram a um aumento da taxa de nascidos vivos por ciclo de TE, atingindo 30%-50% em mulheres com menos de 40 anos e menos de 30% em mulheres com mais de 40 anos². No entanto, apesar desses avanços, mais da metade dos embriões transferidos ainda não conseguem se implantar. A falha de implantação repetida (RIF), normalmente definida como falha após três ou mais tentativas consecutivas de transferência de embriões de alta qualidade, afeta 15% das mulheres que se submetem à fertilização in vitro-ET³. Casais com RIF são extremamente vulneráveis e mais propensos a se submeter a procedimentos caros e desnecessários que podem expô-los a riscos indevidos⁴. Portanto, compreender as causas do RIF e melhorar a implantação do embrião é crucial para aumentar o sucesso da FIV-ET, principalmente para mulheres com RIF. A preparação do endométrio é fundamental para a implantação bem-sucedida do embrião. Esse processo é caracterizado por um acúmulo significativo de células natural killer uterinas (uNK), que passam de constituir 30% do total de linfócitos no endométrio durante a fase secretora média para 70%-80% na decídua durante o início da gravidez⁵. Notavelmente, as células uNK diferem das células NK periféricas, que são linfócitos citotóxicos críticos para o sistema imunológico inato por causar a morte das células infectadas por lise ou apoptose. Embora as funções exatas das células uNK ainda não sejam totalmente compreendidas, várias linhas de evidência sugerem que elas estão envolvidas na remodelação da angiogênese, invasão do trofoblasto e desenvolvimento fetal⁶. A associação entre a porcentagem de células uNK sobre células estromais e RIF atraiu extensa atração nos últimos 20 anos. Uma meta-análise recente, que incluiu 8 estudos envolvendo 604 mulheres, demonstrou que a densidade de células CD56+uNK durante a fase lútea média é significativamente aumentada em mulheres com RIF em comparação com controles férteis⁷. No entanto, é importante notar que as características das células uNK durante a fase lútea média diferem significativamente daquelas das células NK deciduais (dNK). Embora as células uNK possam se diferenciar em vários subconjuntos de células dNK após a gravidez, a medição das células uNK sozinhas não representa com precisão as células dNK⁸. As células uNK sofrem diferenciação dinâmica e desempenham diferentes papéis no ciclo menstrual e nos processos de decidualização, tornando-as mais complexas do que podem ser identificadas apenas pelo CD56. Vários marcadores são necessários para obter uma compreensão abrangente do comportamento das células uNK durante a preparação endometrial. Nosso estudo recente empregou sequenciamento de RNA de célula única para identificar a diversidade de células uNK ao longo dos ciclos menstruais. Os resultados, validados por citometria de fluxo, mostraram a presença de quatro subtipos distintos de células uNK, cada um exibindo mudanças dinâmicas durante o ciclo menstrual⁹. A análise de enriquecimento genético e o enriquecimento funcional de ontologia gênica indicam que esses subconjuntos de uNK cumprem diferentes funções em vários estágios da menstruação. No entanto, a citometria de fluxo não é universalmente acessível em laboratórios clínicos, e o processamento imediato de tecido endometrial fresco para digestão enzimática torna impossível repetir etapas experimentais após erros.

O objetivo deste estudo foi, portanto, investigar a medição dessas quatro subpopulações de células NK usando um ensaio de coloração multiplex, que fornece uma abordagem diagnóstica mais prática. Em várias colorações, diferentes anticorpos específicos contra cada alvo estão ligados a diferentes marcadores de fluoróforos que emitem diferentes comprimentos de onda de luz quando excitados por um comprimento de onda específico de luz. Comparado ao método tradicional de coloração IHC, este método pode comparar quantitativamente a abundância relativa e a distribuição de vários alvos em uma amostra e fornecer informações sobre a interação e co-localização de diferentes alvos, permitindo-nos identificar diferentes subtipos de células uNK. Essa abordagem não apenas aprofundará nossa compreensão da relação entre as células uNK e o RIF, mas também fornecerá informações para investigar outras subpopulações de células imunes em doenças relacionadas ao endométrio.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Cluster Leste da Universidade Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios (CREC ref no.: 2022.581). As mulheres com RIF foram recrutadas no Centro de Tecnologia de Reprodução Assistida, Hospital Príncipe de Gales, Universidade Chinesa de Hong Kong. O RIF foi definido como a falha em alcançar uma gravidez clínica após a transferência de pelo menos 4 embriões de boa qualidade em um mínimo de 3 ciclos frescos ou congelados em uma mulher com menos de 40 anos¹⁰. O consentimento informado foi obtido das participantes antes da coleta das biópsias endometriais.

1. Aquisição e processamento de amostras endometriais

1. Momento da coleta de amostras endometriais
   1. Colete amostras endometriais seguindo um protocolo rigoroso para garantir a consistência entre os participantes do estudo. Para pacientes com ciclos naturais, realizar urinálise a partir do^9º dia do ciclo menstrual e realizar biópsia endometrial no^7º dia após o pico de LH (LH+7)¹¹ . Para pacientes submetidos a ciclos de terapia de reposição hormonal (TRH), administre 6 mg de valerato de estradiol por via oral diariamente a partir do dia 2 do ciclo menstrual.
   2. Avalie a espessura endometrial por ultrassonografia no dia 13 do ciclo menstrual. Quando a espessura endometrial atingir ou exceder 8 mm, administrar progesterona por via transvaginal e realizar biópsia endometrial 5 dias após a administração de progesterona¹².
2. Coleta e fixação de amostras endometriais: introduzir um amostrador de pipeta na cavidade uterina, avançando-o para a região fúndica; Aplique a sucção puxando para baixo o êmbolo interno, raspando simultaneamente a superfície endometrial por meio de movimentos rotacionais e verticais dentro da cavidade uterina. Enxágue as amostras coletadas com solução salina normal para eliminar as secreções cervicais e uterinas. Meça amostras e avalie o tamanho. Para amostras de 3 mm x 15-25 mm, mergulhe-as imediatamente em 10 mL de formalina tamponada a 10% neutra e fixe-as em temperatura ambiente por 24-48 h.
3. Desidratação: Após a conclusão da fixação, submeta as amostras a uma sequência de desidratação projetada para substituir a água por etanol. Para fazer isso, mergulhe os tecidos em banhos de etanol 70%, 80%, 90% e 100% para garantir a desidratação completa. Após o banho final de etanol, limpar as amostras em xileno para remover qualquer álcool residual e prepará-las para a infiltração de parafina.
4. Incorporação: Depois de colocar o tecido plano na parte inferior do molde, derreta a parafina e adicione-a cuidadosamente às amostras para garantir que o tecido endometrial esteja completamente encapsulado na matriz de parafina. Depois de encher os moldes com cera de parafina, resfrie-os em uma mesa de freezer para promover a solidificação da cera de parafina. Assim que os blocos de parafina endurecerem, armazene em temperatura ambiente até que seja necessário processamento adicional.
   NOTA: Os moldes utilizados foram escolhidos especificamente para acomodar o tamanho das amostras endometriais obtidas para permitir que o tecido endometrial fique plano no fundo sem dobrar, garantindo assim uma orientação ideal para o seccionamento subsequente e sem criar excessos desnecessários.
5. Seccionamento: Para preparar o seccionamento, refrigere os blocos de parafina a 4 °C por 2 h. Cortar as amostras em secções de 4 μm utilizando um micrótomo, seguido de achatar as fatias na superfície da água destilada aquecida a 42 °C e montá-las em lâminas de vidro colantes. Coloque as fatias em um secador de lâminas durante a noite e guarde em temperatura ambiente antes do uso.

2. Otimização de condições imuno-histoquímicas multiplex

1. Validação IHC: Para a validação dos parâmetros de coloração IHC, adote uma abordagem sistemática para ajustar as condições de recuperação de antígenos, concentração de anticorpos e tempos de incubação.
   1. Dentro dos intervalos de diluição recomendados pelo fabricante, testar 2-3 concentrações para cada anticorpo. Otimize a recuperação de antígenos comparando tampões em pH 6 e pH 9 e avalie os protocolos de incubação em temperatura ambiente por 1,5 h e durante a noite a 4 °C.
   2. Avalie cada condição meticulosamente, concentrando-se na intensidade da coloração, especificidade e ruído de fundo. Selecione a combinação ideal que produz a coloração mais clara e específica com ligação não específica mínima. Essa validação rigorosa garantiu a mais alta precisão e reprodutibilidade no protocolo IHQ.
2. Coloração monoplex de amplificação de sinal de tiramida (TSA): Depois de determinar os parâmetros de coloração ideais para anticorpos individuais, otimize o emparelhamento de anticorpos com diferentes corantes TSA. Combine o marcador com maior expressão com um corante com um nível de intensidade de fluorescência mais baixo ou vice-versa. Durante esta fase, faça ajustes na concentração de anticorpos e no tempo de incubação de acordo com a intensidade do sinal de fluorescência observada. Se for observada coloração significativa ou inespecífica, troque o corante pareado¹³.
3. Coloração multiplex TSA: Para o protocolo de imuno-histoquímica multiplex (m-IHC), a ordem sequencial de coloração foi cuidadosamente definida de acordo com os princípios estabelecidos. Para garantir que o processo de multiplexação reflita a sensibilidade e a especificidade da coloração de marcador único, priorize os anticorpos com níveis de expressão mais baixos no início da sequência de coloração. Coloque os anticorpos que requerem reparo de base para recuperação de antígeno no final da sequência de coloração, pois o reparo de base é robusto em comparação com os métodos à base de ácido, que podem, em alguns casos, amplificar artefatos de coloração não específicos.
4. Usando os resultados das etapas 2.1 e 2.2, decida sobre os anticorpos a serem usados e em que estágio, com base em seus requisitos de recuperação de antígenos e densidades de expressão. Por exemplo, o anticorpo CXCR4, que requer um reparo de base para recuperação de antígeno, foi colocado nos estágios finais de coloração. Por outro lado, o anticorpo CD49a, que é caracterizado por uma menor densidade de expressão, recebeu a primeira posição na sequência de coloração. Maximize as chances de detecção bem-sucedida e minimize quaisquer efeitos de mascaramento que possam ocorrer nos estágios posteriores do procedimento de multiplexação.
5. Para os anticorpos restantes, teste diferentes combinações durante a fase de otimização para determinar a sequência mais eficaz que equilibra sensibilidade e especificidade. Os resultados dessas análises comparativas orientarão a composição final do painel multiplex, conforme detalhado na Tabela 1, garantindo que o painel selecionado forneça o desempenho ideal e minimize o fundo.

3. Processo m-IHC

1. Desparafinação, hidratação e fixação: Assar as seções de tecido a 60 °C por 2 h, seguida de imersão sequencial em xileno I (10 min), xileno II (10 min), etanol 100% (5 min), etanol 95% (5 min), etanol 80% (5 min), etanol 75% (5 min), ddH₂O (2 min por 3x), formalina tamponada neutra a 10% (pelo menos 20 min), e ddH₂O (2 min para 3x).
2. Recuperação de antígeno: Adicione 200 mL do respectivo tampão AR6 ou AR9, conforme listado na Tabela 1 para cada anticorpo, a um de recuperação de antígeno resistente ao calor. Coloque as seções no tampão de recuperação de antígeno apropriado e aqueça no micro-ondas em alta potência por cerca de 2 min até ferver. Em seguida, cubra o frouxamente, aqueça em baixa potência por 15 min e resfrie até a temperatura ambiente. Enxágue as seções com ddH₂O e PBST.
3. Desenho de barreira hidrofóbica: Depois de remover o excesso de solução com papel absorvente, desenhe um círculo completo ao redor do tecido usando uma caneta de barreira hidrofóbica.
4. Inativação da atividade enzimática endógena: Trate as seções com peróxido de hidrogênio a 3% e incube por 8 min em temperatura ambiente. Lave com PBST 3x por 2 min cada.
5. Bloqueio de locais não específicos: Após a secagem com papel absorvente, aplique uma solução de bloqueio (1x Diluente/Bloco de Anticorpos) e incube por 10 min em temperatura ambiente.
6. Incubação com anticorpo primário: Após a remoção da solução de bloqueio, aplique 150 μL do primeiro anticorpo primário, CD49a, em cada lâmina a uma diluição de 1:1000 em 1x diluente de anticorpo. Incube conforme otimizado anteriormente na seção 2. Após a incubação, lave as lâminas com PBST 3x por 2 min cada. Para os anticorpos restantes, consulte a Tabela 1 para proporções de diluição específicas.
7. Incubação com anticorpo secundário: Antes de aplicar o anticorpo secundário, use papel absorvente para remover o excesso de umidade para evitar a diluição do reagente. Adicione 4-5 gotas (aproximadamente 150 μL) do anticorpo secundário 1x Anti-Ms + Rb HRP em cada lâmina, seguido por uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Realize três lavagens com PBST por 2 min cada pós-incubação.
   NOTA: Observe que o anticorpo secundário 1x Anti-Ms + Rb HRP é específico para anticorpos primários de coelho e camundongo.
8. Amplificação de sinal com corante TSA: Depois de enxugar o excesso de umidade, dilua o corante TSA 1:100 no diluente de amplificação. Adicione 150 μL desta solução diluída de corante TSA a cada lâmina. Incube por 10 min em temperatura ambiente. Lave com PBST 3x por 2 min cada.
9. Repita as etapas 3.2 e 3.5-3.8 para o procedimento TSA usando o anticorpo e o corante correspondentes.
10. Núcleos de coloração: Após a coloração do último anticorpo, elimine os fluoróforos não ligados por seções de micro-ondas em 200 mL de tampão AR6 dentro de um resistente ao calor, fervendo por 2 min e, em seguida, aquecendo em baixa potência por 15 min. Resfrie as amostras à temperatura ambiente e enxágue com ddH₂O e PBST. Adicione 150 μL de solução de trabalho DAPI diluída em PBST (1:10) gota a gota, incube por 10 min em temperatura ambiente e enxágue 2x com ddH₂O.
11. Montagem: Uma vez que as seções estejam totalmente secas ao ar em uma área escura por aproximadamente 30 min, aplique uma única gota (cerca de 30 μL) do montante fluorescente anti-têmpera e coloque lamínulas.
    NOTA: Proteja todas as operações da luz após a primeira aplicação do corante TSA. A observação imediata e a captura de imagens foram essenciais após a conclusão da coloração para evitar a extinção da fluorescência.

4. Aquisição e análise de imagens

1. Tempo de exposição: Capture imagens usando um gerador de imagens que herda os comprimentos de onda de excitação e emissão correspondentes aos fluoróforos. Ao definir os tempos de exposição, verifique os slides com uma ampla variedade de expressões de marcador para garantir a precisão. Para cada combinação de marcador/filtro, concentre-se manualmente em diferentes áreas do slide. Use o recurso Exposição automática para definir o tempo de exposição.
2. Selecione os filtros de acordo com os corantes TSA e examine várias lâminas para determinar os tempos de exposição ideais por canal. Aplique essas configurações de forma consistente a todas as aquisições subsequentes para manter a comparabilidade durante a imagem.
3. Seleção de áreas de captura: Para garantir amostragem imparcial em seções de tecido e inclusão consistente do epitélio luminal em cada campo analisado, selecione aleatoriamente a área inicial para aquisição da imagem, com o critério crítico sendo a presença da borda epitelial luminal.
4. Após a captura desse campo inicial, selecione sistematicamente as áreas subsequentes movendo um campo para a esquerda ou direita do ponto inicial (omitindo um campo entre cada imagem capturada), mantendo a borda epitelial luminal dentro do quadro. Repita esse processo para capturar pelo menos cinco áreas diferentes, cada uma contendo pelo menos uma parte do epitélio luminal, para manter uma profundidade consistente de análise ao longo de¹⁴. Essa abordagem teve como objetivo incluir um mínimo de aproximadamente 10.000 células estromais em todos os campos capturados para garantir uma coleta de dados abrangente e representativa.
5. Análise de imagem
   1. Preparação de imagem: Para importar e analisar imagens multiespectrais, primeiro navegue até Arquivo > Abrir imagem na interface do software para carregar os arquivos e o slide de autofluorescência (AF). Depois de carregar as imagens, prossiga para desfazer a mistura dos fluoróforos clicando no botão Selecionar fluors e selecionando a biblioteca espectral apropriada. Depois que todos os fluoróforos forem selecionados, clique em OK para confirmar a seleção. Para isolar o espectro AF, use a ferramenta conta-gotas AF para amostrar uma área representativa de tecido da imagem AF, tomando cuidado para excluir quaisquer pixels que não sejam de tecido. Após a amostragem, clique em Preparar imagem ou Preparar tudo no canto inferior esquerdo da interface¹⁵.
   2. Segmentação de tecido: inicie o processo de segmentação delineando manualmente uma linha de base de 3 a 5 regiões por tipo de tecido na imagem, incluindo áreas epiteliais contendo células epiteliais, áreas estromais contendo células estromais e áreas em branco sem conteúdo celular. Se os resultados iniciais da segmentação não forem satisfatórios, anote manualmente regiões adicionais para melhorar o conjunto de dados de treinamento, aumentando assim a precisão e a confiabilidade das análises subsequentes. Esse ajuste dinâmico de regiões e parâmetros garante que o software possa identificar automaticamente estruturas semelhantes nas imagens atuais e em outras imagens importadas com maior precisão.
      NOTA: A anotação inicial serve como um conjunto de dados de treinamento para o software aprender as características de cada componente do tecido. Os recursos de segmentação do software são então refinados iterativamente com base na complexidade e variabilidade do tecido.
   3. Segmentação de células: clique em Segmentar células para iniciar a segmentação de células. Na Configuração de segmentação celular, selecione Núcleos e membrana. Escolha DAPI para identificar núcleos celulares e ajuste a configuração de intensidade para detectar todos os núcleos celulares sem ruído de fundo. Selecione os sinais CD16, CD49a e CD56 para encontrar a membrana e use esse sinal para auxiliar na divisão nuclear. Use o recurso de divisão de componentes nucleares para distinguir núcleos localizados próximos.
      NOTA: O DAPI destaca o interior das células. O recurso de divisão de componentes nucleares ajuda a distinguir os núcleos das células quando eles estão próximos ou parecem mesclados. Esta etapa é importante para obter contagens de células confiáveis e manter a integridade da análise.
   4. Fenotipagem celular: Adote quatro marcadores de superfície celular diferentes, incluindo CD56, CD49a, CXCR4 e CD16 para diferenciar diferentes subtipos de células NK. No Esquema de Fenotipagem, rotule esses quatro marcadores como os fenótipos a serem prosseguidos. Na seção Associar Visualização, atribua cores específicas a cada um dos fenótipos para identificação. Usando o botão Adicionar, categorize as células como expressando positiva ou negativamente os marcadores; por exemplo, no fenótipo CD56, as células podem ser rotuladas como CD56+ ou CD56-. Rotule manualmente pelo menos cinco células para cada fenótipo durante o processo de treinamento. Execute a rotulagem manual adicional se o treinamento inicial não produzir resultados efetivos.
   5. Depois que a configuração de fenotipagem celular for definida, cada célula na imagem indicará se os quatro marcadores de superfície são expressos positiva ou negativamente. Exporte os dados resultantes para uma planilha para análise posterior.
   6. Processamento de dados: Importe os dados obtidos de todas as imagens para uma planilha para processamento. Calcule as porcentagens de todos os subtipos de células uNK em relação ao número total de células na imagem. A contagem final de células representa a contagem média em várias imagens, fornecendo uma visão geral abrangente da população de vários subtipos de células uNK dentro da amostra.

Resultados

Para manter a consistência no momento da coleta de amostras endometriais para mulheres submetidas ao ciclo natural, um teste de urina foi realizado para detectar com precisão o aumento do hormônio luteinizante (LH), com biópsias endometriais realizadas 7 dias após o pico de LH. Para mulheres submetidas a ciclos de TRH, as amostras foram agendadas precisamente 5 dias após o início da suplementação de progesterona. Para quantificar diferentes subtipos de células NK no endométrio, a coloração m-IHC foi empregada. Um esboço esquemático do procedimento experimental é representado na Figura 1.

A otimização do procedimento experimental é fundamental para alcançar resultados de coloração m-IHC de alta qualidade para garantir precisão e consistência nos resultados do experimento. Inicialmente, a IHQ foi empregada para determinar a concentração adequada de anticorpos, com a seleção das soluções de recuperação de antígenos AR6 ou AR9. Para anticorpos como CD56, CD16 e CD49, recomenda-se uma solução de recuperação de antígeno com pH 6, enquanto para o anticorpo CXCR4, resultados de coloração superiores foram alcançados usando uma solução de reparo de antígeno com pH 9 em comparação com um tampão de pH 6. Uma vez que os parâmetros, incluindo taxa de diluição de anticorpos, tempo de incubação e condições de recuperação de antígenos, tenham sido determinados, o corante TSA mais adequado pode ser selecionado com base na afinidade do anticorpo. Um corante com brilho de fluorescência fraco deve ser selecionado para complementar a alta afinidade do anticorpo. Os dados de referência sobre a intensidade do sinal dos corantes TSA podem ser encontrados na Tabela 2. Após a conclusão do ensaio monoplex TSA, a ordem do multiplex TSA pode ser determinada. Dado que os quatro anticorpos são projetados para identificar diferentes subtipos de células uNK, a co-localização entre os anticorpos é inevitável. Para minimizar a sobreposição espectral e evitar interferência entre as frações fluorescentes, a seguinte estratégia foi empregada: selecionar frações fluorescentes com comprimentos de onda o mais distantes possível, comparar a posição e o número de sinais positivos do multiplex TSA com os do monoplex TSA para garantir sua identidade (Figura 2) e garantir um fundo claro (Figura 3)¹⁶.

Após a otimização e conclusão dos procedimentos de coloração m-IHC, a estação de trabalho de imagem foi empregada para aquisição de imagens e o software de análise de imagens foi aplicado para análise aprofundada das imagens (Figura 4). Para a classificação das células uNK, foram utilizados métodos tradicionais e inovadores. A classificação tradicional divide as células NK em duas categorias, CD56 + CD16- e CD56 + CD16 + ¹⁷, com base no nível de expressão de CD16. Com base nessa base, procuramos delinear ainda mais a heterogeneidade das células NK usando uma nova estratégia de classificação. Usando sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) de nossa pesquisa anterior, isolamos células NK individuais por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e realizamos sequenciamento de RNA para capturar os perfis transcriptômicos de cada célula. Nossa análise revelou quatro subtipos distintos de células NK: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) e NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Esses subtipos foram caracterizados pela expressão diferencial de CD49a e CXCR4, com CD56 servindo como um marcador universal para todas as células NK. O CD49a foi detectado especificamente nos subtipos NK1 e NK2, enquanto o CXCR4 estava presente nos subtipos NK2 e NK4. Para validar essa classificação, realizamos análise de citometria de fluxo para garantir a precisão do nosso método de subtipagem (Figura 5)⁹. A proporção de cada subtipo de célula uNK é apresentada como uma porcentagem em relação ao número total de células estromais.

Figura 1: Diagrama do fluxo de trabalho da análise de células NK endometriais. As principais etapas incluem a aquisição e coleta do endométrio, otimização do painel m-IHC, coloração m-IHC do endométrio e aquisição e análise da imagem. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas para quantificação de biomarcadores via DAB, TSA monoplex e TSA multiplex coloração. Imagens representativas para cada um dos anticorpos corados por DAB (painéis esquerdos), TSA monoplex IHC (painéis intermediários) e TSA multiplex IHC (painéis direitos) demonstraram desvio mínimo durante o desenvolvimento de m-IHC. As imagens IHC simuladas pela TSA abaixo imitam muito bem as imagens de campo claro correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados experimentais após a coloração m-IHC do endométrio. (A) Uma imagem não misturada foi adquirida usando o imager com aumento de 200x. (B) Ampliação adicional desta imagem não misturada. (C-F) As imagens foram observadas nos canais TSA dye 570 (CD16), TSA dye 650 (CD56), TSA dye 620 (CXCR4) e TSA dye 520 (CD49a) após a desmistura usando o software de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Analise as imagens coradas com m-IHC. As imagens foram analisadas usando as funções de segmentação de tecido (A) do software de imagem, (B) segmentação celular e (C) função de fenótipo celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise de subtipo de células NK endometriais. (A) As células NK endometriais convencionais podem ser classificadas em células CD56 + CD16-NK e células CD56 + CD16 + NK com base na expressão de CD16. (B) O método inovador de análise de subtipo classificou as células NK endometriais em quatro categorias: NK1 (CD56 + CD49a + CXCR4-), NK2 (CD56 + CD49a + CXCR4 +), NK3 (CD56 + CD49a-CXCR4-) e NK4 (CD56 + CD49a-CXCR4 +). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ciclo de coloração	Marcador	Clone	Companhia	Produto	Diluição de anticorpos	Buffer AR	Fluoróforo
1	CD49a	CL7207	Novus Biológicos	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	abcam	AB183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	R&D	MAB172	1:100	AR9	TSA 620

Tabela 1: Lista das concentrações dos anticorpos e corante TSA usados no m-IHC.

Fluoróforo	Mantra
Corante TSA 520	Alto
Corante TSA 540	Média
Corante TSA 570	Média
Corante TSA 620	Média
Corante TSA 650	Alto
Corante TSA 690	Baixo

Tabela 2: Corantes TSA e intensidade de fluorescência correspondente.

Discussão

A implantação do embrião envolve uma interação complexa entre o embrião e o endométrio. O estado imunológico da homeostase endometrial desempenha um papel fundamental na determinação da receptividade endometrial. Durante a WOI, a população predominante de leucócitos no endométrio são as células NK. Aproximadamente 90% das células uNK exibem alta expressão de CD56, mas não possuem CD16. No entanto, um subconjunto menor de células uNK se assemelha às células NK do sangue periférico, exibindo baixa expressão de CD56, mas expressão positiva de CD16¹⁸. Esses dois subtipos de células uNK demonstram funções distintas. O subtipo CD56+CD16- contribui principalmente para a produção de citocinas, remodelação vascular e interações com células trofoblásticas, que são cruciais para estabelecer e manter a gravidez. Em contraste, o subtipo CD56+CD16+ exibe maior citotoxicidade. Usando sequenciamento de RNA de célula única, nosso estudo recente categorizou ainda mais as células uNK em quatro subconjuntos, subagrupando ainda mais as células NK reguladoras CD56 + CD16 em três subpopulações com base em seus fenótipos e funções específicas⁹. A subpopulação NK1, caracterizada por CD56+CD49a+CXCR4-, está envolvida na remodelação tecidual. O subconjunto NK2, identificado por CD56+CD49a+CXCR4+, regula a resposta imune. O subconjunto NK3, marcado por CD56+CD49a-CXCR4-, interage com trofoblastos. O subconjunto NK4, exibindo CD56+CD49a-CXCR4+, compartilha semelhanças com células NK CD56+CD16+, exibindo funções citotóxicas⁹. No presente estudo, pela primeira vez, estabelecemos com sucesso um protocolo para identificar esses quatro subconjuntos distintos de células NK utilizando a coloração m-IHC.

A coloração convencional de IHQ e a citometria de fluxo são os métodos mais comumente usados para identificar células imunes, cada um com seus próprios pontos fortes e limitações¹⁹. Embora a IHQ convencional seja amplamente utilizada em ambientes clínicos devido à sua fácil acessibilidade, ela enfrenta desafios na detecção simultânea de vários antígenos e na quantificação de sinais positivos. Isso representa um obstáculo significativo na caracterização precisa dos fenótipos de células imunes, que muitas vezes exigem o uso de vários marcadores para medição precisa. Por outro lado, a citometria de fluxo é capaz de detectar simultaneamente vários marcadores celulares, mas requer um grande volume de amostras frescas e não fornece informações espaciais sobre a localização da célula dentro do tecido. Notavelmente, as células imunes endometriais não estão uniformemente dispersas por todo o tecido endometrial; por exemplo, as células uNK são mais densamente agregadas perto da camada basal do endométrio em comparação com áreas próximas à cavidade luminal²⁰. Essas limitações da IHQ convencional e da citometria de fluxo podem ser abordadas por meio de m-IHC e da plataforma de análise de imagem conjugada com algoritmos de aprendizado de máquina para obter segmentação de tecidos, segmentação celular e identificação de células positivas. Essa abordagem aumenta a eficiência analisando dezenas de milhares de células em minutos, minimiza o viés do observador identificando automaticamente células positivas e permite uma análise mais precisa usando vários marcadores. Além disso, elimina a necessidade de amostras frescas e permite experimentos em lote ou análises repetidas quando necessário.

A realização de uma avaliação abrangente dos fenótipos de células uNK usando a técnica m-IHC pode fornecer uma compreensão mais profunda da correlação entre as células uNK e a implantação do embrião, bem como suas alterações em mulheres com RIF. Além das células uNK, outras células imunes endometriais também contribuem para a homeostase imunológica local. Por exemplo, os linfócitos T reguladores (células Treg) mantêm a tolerância imunológica liberando fatores inibitórios, como IL-10 e TGF-β, que suprimem a atividade das células Th1 e Th2²¹. A diferenciação de macrófagos M2, regulada por esteróides e citocinas Th2, contribui para o estado imunotolerante por regular positivamente a atividade da arginase e inibir a produção de óxido nítrico²². Além disso, as células dendríticas (DCs) se diferenciam em células tolerogênicas maduras dentro do útero, liberando fatores como sFLT1 e TGF-β1 que regulam a neogênese vascular e inibem a função das células T CD8+, mantendo assim a homeostase imunológica e apoiando o desenvolvimento embrionário¹⁸. Semelhante às células uNK, essas células imunes também são heterogêneas e um único marcador não pode identificar com precisão seus fenótipos. A aplicação de m-IHC para avaliar subconjuntos de células uNK ilustra o potencial para identificar subconjuntos dessas células imunes endometriais.

Além do endométrio, esse método pode ser aplicado a vários tecidos para identificar fenótipos de células imunes. Ao aplicá-lo em outros tecidos, apenas pequenos ajustes são necessários para garantir uma coloração ideal. Além disso, se os pesquisadores pretendem substituir certos marcadores, o painel original pode ser modificado para atender aos requisitos experimentais específicos. A versatilidade e flexibilidade deste painel o tornam uma ferramenta adaptável para estudar diferentes tecidos ou diferentes subconjuntos de células.

Essa tecnologia não apenas facilita a compreensão das mudanças detalhadas nas células imunes endometriais para dissecar o mecanismo subjacente da não receptividade endometrial, mas também oferece potencial para o desenvolvimento de testes diagnósticos. A relativa facilidade de obtenção e preservação de blocos e seções de parafina abriu caminho para o uso generalizado dessa técnica. Com painéis de coloração padronizados, os hospitais podem aproveitar a tecnologia de coloração automatizada em conjunto com algoritmos de software sofisticados para aumentar significativamente a eficiência de seus procedimentos de análise. As vantagens da tecnologia m-IHC a tornam uma opção viável para práticas clínicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Anticorpos primários
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Anticorpos primários
CD16	abcam	ab183354	Anticorpos primários
CXCR4	R& D	MAB172	Diluente
de amplificação de	Akoya Biosciences	FP1498 série	Tampão de diluição de fluoróforo
Diluentes de anticorpos	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluir o anticorpo
Solução tamponada com citrato, pH 6,0 / 9,0 (10x)	Akoya Biosciences	A6001 / A9001	Solução de recuperação de antígeno
inForm software avançado de análise de imagem	Software Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder 2.2.6	Software de análise de dados
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Microondas de imagem espectral
	Inversor Akoya Biosciences		Decapagem de microondas
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Reagentes fluorescentes adequados à base de tiramida
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Reagentes fluorescentes adequados à base de tiramida
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Reagentes fluorescentes adequados à base de tiramida
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Reagentes fluorescentes adequados à base de tiramida
Lâminas revestidas com poli-L-lisina	Fisher Technologies	120-550-15	Lâminas para uso histológico de rotina
secundários	espectro PolyHRP	Perkin Elmer	ARH1001EA
Invitrogen™   Fluoromount-G™ Meio de montagem	ThemoFisher Science	495802	Instalação
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Coloração de ácido nucleico