Um modelo cirúrgico exclusivo para enxertar tecido adiposo marrom na superfície do coração em camundongos foi desenvolvido. Este modelo pode melhorar a compreensão dos efeitos do tecido adiposo epicárdico (EAT) nas doenças cardíacas e o papel cardioprotetor do escurecimento do EAT.
Artigo de método
Um modelo cirúrgico para enxerto de tecido adiposo marrom na superfície do coração em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um modelo de camundongo para investigar os efeitos parácrinos do escurecimento do tecido adiposo epicárdico (EAT) nas artérias coronárias e no miocárdio deve ser desenvolvido. Devido à sua localização anatômica especial e conexão direta com a superfície do coração, o TAE é considerado não apenas um órgão de armazenamento de energia, mas também um regulador parácrino essencial envolvido em múltiplas doenças cardiovasculares. Vários estudos indicaram que o escurecimento do EAT possui potencial terapêutico promissor para doenças cardiovasculares por meio da transição de fenótipos anti-inflamatórios, liberação de fatores cardioprotetores e vesículas extracelulares, entre outros mecanismos. A deficiência congênita de EAT em modelos de roedores limita a pesquisa experimental sobre sua função em doenças cardiovasculares. Estudos anteriores utilizaram o transplante de tecido adiposo para investigar a interferência endócrina e parácrina entre o tecido adiposo e outros órgãos. Isso destaca a necessidade de desenvolver um modelo cirúrgico para transplantar tecido adiposo marrom (BAT) na superfície do coração de camundongos para estudar seus efeitos parácrinos em doenças cardiovasculares e explorar os potenciais benefícios protetores do escurecimento do EAT. Aqui, este estudo estabelece um procedimento cirúrgico único para enxertar tecido adiposo marrom na superfície do coração em camundongos e avalia a sobrevida do enxerto e a viabilidade do receptor quatro semanas após a operação. Este modelo pode ser aplicado em experimentos futuros para investigar o escurecimento do EAT.
Introdução
O tecido adiposo epicárdico (TAE) é um depósito de gordura heterogêneo e multifuncional localizado na superfície do coração, ligando-se diretamente ao miocárdio e circundando as principais artérias coronárias sem tecido conjuntivo entre elas1. Devido à sua proximidade anatômica com o miocárdio e as artérias coronárias, o TAE pode secretar ativamente biofatores abundantes e diversos de maneira parácrino-dependente para regular doenças cardiovasculares, como fibrilação atrial, aterosclerose e insuficiência cardíaca 2,3,4. O TAE pode ser um fator de risco para doenças cardiovasculares, e acredita-se que o TAE possa se tornar um novo alvo terapêutico para medicamentos cardiometabólicos5.
Ao contrário dos humanos, no entanto, quase não há EAT perceptível na superfície do coração do camundongo. De fato, a maioria dos experimentos com EAT foi conduzida in vitro devido à falta de um modelo animal experimental para observar a função do EAT in vivo6. Assim, os cientistas só podem purificar e analisar os secretomas do EAT in vitro, e não existe um modelo experimental aplicável para observar completamente as funções reais do EAT in vivo. O estabelecimento de um modelo de camundongo com EAT será, portanto, benéfico para elucidar como o EAT exerce seus efeitos únicos no miocárdio proximal e nas artérias coronárias.
O tecido adiposo marrom (BAT) possui capacidade termogênica inerente e melhora o metabolismo da glicose7. Recentemente, os pesquisadores descobriram que o BAT pode funcionar como um tecido cardioprotetor para doenças cardíacas. Pequenas vesículas extracelulares secretadas pelo BAT estão envolvidas na cardioproteção induzida pelo exercício, fornecendo miRNAs cardioprotetores ao coração8. O BAT pode liberar 12,13-diHOME e NOS1 para melhorar a função cardíaca por meio da regulação do ciclo de cálcio9. O FGF21 derivado do tecido adiposo marrom atenua a remodelação cardíaca hipertensiva ativando o receptor A2A10. Além disso, o BAT pode liberar BMP3b, o que diminui o dano miocárdico na lesão de isquemia-reperfusão (I/R)11.
Esses estudos indicam que o BAT desempenha um papel cardioprotetor nas doenças cardiovasculares por meio de mecanismos endócrinos. Também há evidências sugerindo que modelos de transplante de BAT bem-sucedidos, nos quais o BAT de um camundongo normal é transplantado para a região interescapular de um camundongo com dieta rica em gordura, foram observados para aumentar o metabolismo da glicose e a sensibilidade à insulina, reduzir a massa gorda e melhorar a adiposidade no camundongo receptor. O transplante de BAT pode exercer seus efeitos benéficos por meio de vários mecanismos, incluindo a liberação endócrina de citocinas associadas ao BAT, ativação do sistema nervoso simpático, aumento da captação de triglicerídeos por BAT e melhora da tolerância à glicose e resistência à insulina em camundongos obesos12,13. O transplante de BAT pode, portanto, servir como uma potencial abordagem terapêutica para doenças cardíacas.
No entanto, devido a diferenças entre espécies, os camundongos não têm EAT no coração, tornando os efeitos parácrinos do BAT no coração pouco claros. Além disso, ainda não se sabe se o transplante in situ de BAT na superfície do coração oferece benefícios superiores em comparação com outras estratégias.
Para avaliar a função do BAT no coração e elucidar seus efeitos parácrinos em cardiomiócitos e artérias coronárias, nossa equipe tem como objetivo descrever um procedimento passo a passo para estabelecer um modelo microcirúrgico para enxerto de BAT in situ no coração de camundongos. Ao contrário do transplante subcutâneo, que só pode simular as influências endócrinas do BAT, essa abordagem permite o estudo de interações parácrinas diretas. Indicadores observacionais pós-operatórios de rotina serão empregados para confirmar a colonização e sobrevivência bem-sucedidas dos enxertos de BAT por meio do estabelecimento de um suprimento sanguíneo da superfície do coração do camundongo.
Protocolo
Os protocolos experimentais para obtenção de tecido adiposo foram revisados e aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade Central do Sul. O protocolo de uso de animais listado abaixo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Aprovação nº 20230188) no Segundo Hospital Xiangya, Universidade Central Sul, China, sob o Protocolo nº 2024054. Todos os experimentos foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes de segurança animal e cuidados humanitários. Camundongos machos C57 / BL6 de três a oito semanas de idade, pesando 12-25 g, foram usados para este estudo. Os animais receptores receberam anestesia preventiva com buprenorfina a 0,1 mg/kg por via subcutânea 1 h antes da cirurgia. Nos animais receptores, a buprenorfina foi readministrada na mesma dose após o transplante e readministrada conforme necessário nas primeiras 48 horas após a cirurgia. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de tecido adiposo marrom (BAT) do doador
- Anestesie o camundongo doador de 3 a 8 semanas de idade, colocando-o em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 2% misturado com 0,5-1,0 L / min de 100% O2. Para verificar a profundidade adequada da anestesia, aplique pressão no leito ungueal do camundongo ou realize um teste de reflexo de pinça do dedo do pé.
- Coloque o mouse de bruços em uma almofada de aquecimento e prenda seus membros com fita adesiva.
- Identifique a fossa escapular movendo-se aproximadamente 1 cm para baixo ao longo da linha média da pele do pescoço para localizar uma depressão.
- Raspe o cabelo neste local e desinfete a pele com iodopovidona três vezes.
- Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1 cm para expor o tecido adiposo dentro da fossa escapular. Separe cuidadosamente o tecido adiposo branco superficial e a camada muscular para expor o MTD subjacente, que aparece vermelho-acastanhado de um lado. Colete 30 mg de BAT para transplante.
- Lave o BAT para remover sangue e detritos usando uma solução salina estéril.
- Utilizar uma tesoura oftálmica para cortar o BAT em pedaços pequenos (5 × 5 mm, aproximadamente 20 mg) e mantê-los num meio completo para cultura de tecidos a 37 °C enquanto prepara o ratinho receptor.
2. Preparação para o transplante
- Esterilize os instrumentos microcirúrgicos usando um esterilizador de autoclave e use luvas estéreis.
NOTA: Os seguintes instrumentos cirúrgicos são necessários: tesoura romba, microtesoura, microfórceps, pinça curva grossa (×2), pinça angular fina de 45° (×2), tesoura de mola angular, afastador torácico, suturas absorvíveis 2-0, suturas de prolene 7/0 e porta-agulha. - Desinfete o campo de operação com álcool isopropílico 75%.
- Mantenha a temperatura corporal normal e uma frequência cardíaca estável durante a cirurgia usando uma almofada de aquecimento ajustada para 37 °C ± 1 °C.
- Prepare aplicadores de algodão para uso em caso de sangramento.
3. Preparação e intubação do camundongo
- Remova o pelo do decote até o nível do meio do peito do mouse receptor usando creme depilatório.
- Anestesiar o camundongo colocando-o em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 2% misturado com 0,5-1,0 L/min de 100% de O2. Uma vez adequadamente sedado, manter a anestesia com isoflurano a 1,7% misturado com 0,7 L/min de 100% O2.
- Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento e prenda seus membros com fita adesiva.
- Desinfete o campo cirúrgico com solução complexa de iodo, seguida de álcool 70%. Repita esse processo três vezes.
- Cubra o camundongo com uma cortina estéril, expondo apenas o campo cirúrgico para evitar contaminação.
- Use um novo conjunto de luvas estéreis para cada mouse individual.
- Coloque um elástico sobre os dentes da frente para esticar o pescoço. Usando uma pinça curva em uma mão, manipule suavemente a língua para o lado enquanto usa a outra mão para inserir um tubo endotraqueal PE-90. Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja nivelada com o tubo para posicionamento adequado.
- Confirme se o tubo está inserido na traqueia e não no esôfago. Faça uma incisão longitudinal (~6-7 mm) na pele cervical para expor a traqueia, se necessário, para verificação.
- Conecte o tubo endotraqueal a um ventilador de roedores com ciclo de volume, definindo os parâmetros para 140 respirações/min e um volume corrente de 0.2 mL. Prenda o tubo com fita adesiva.
NOTA: Indicadores de ventilação mecânica bem-sucedida - Os movimentos torácicos do mouse devem ser regulares e sincronizados com a frequência respiratória do ventilador.
4. EAT enxerto
- Realize uma incisão esternal na linha média a partir da incisura supraesternal. Faça uma incisão de 1 cm ao longo da linha média do esterno (uma linha branca na parede torácica anterior do camundongo) para expor a parede anterior do coração. Retraia o esterno usando um afastador de tórax sob um microscópio cirúrgico. Evite ferir os pulmões e a artéria torácica interna durante o procedimento.
- Use uma pinça angular de 45° de ponta fina para separar e extirpar suavemente a mucosa epicárdica ao redor do coração.
- Abra o pericárdio na parede anterior do ventrículo esquerdo. Coloque um pequeno pedaço limpo de BAT rico em vasos sanguíneos na superfície do coração. Use uma sutura de prolene 7/0 com dois nós cirúrgicos para prender o BAT à superfície do ventrículo esquerdo mecanicamente. Evite perfurar a parede do coração.
- Remova o afastador torácico e aperte a saída do ventilador por 2 s para inflar novamente os pulmões.
- Use uma sutura absorvível 2-0 com um padrão de sutura interrompido para fechar a caixa torácica.
- Use uma sutura absorvível 2-0 com um padrão de sutura contínuo para fechar a camada da pele.
5. Cuidados pós-operatórios
- Administre 0,3 mL de solução salina normal por via intraperitoneal após a operação para reposição de fluidos.
- Administre buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor na incisão e enrofloxacina (5 mg/kg) para prevenir infecções.
- Coloque o mouse sob uma lâmpada de calor até que ele acorde da anestesia e retorne à decúbito esternal, permitindo movimentos livres. Em seguida, transfira o mouse para uma gaiola separada com comida e água. Forneça uma fonte de alimento de gelatina no chão da gaiola para facilitar o acesso devido ao movimento restritivo menor temporário do tórax.
- Observe o camundongo receptor por 1 h no pós-operatório antes de devolvê-lo à instalação da gaiola. Inspecione o mouse três vezes ao dia durante as primeiras 24 horas para monitorar a atividade e a ingestão nutricional. Monitore os sinais de dor e angústia nas primeiras 72 horas. Verifique a condição do animal diariamente e pese-o semanalmente.
- Consulte um membro da equipe veterinária se algum camundongo apresentar sinais de dor, angústia ou diminuição da ingestão de ração.
NOTA: Considere a eutanásia precoce, se necessário. A técnica de eutanásia envolve overdose de CO2 por 7 min, seguida de luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Necrose, absorção ou rejeição do autoenxerto BAT é definida como um desfecho específico que leva à eutanásia.
Resultados
Com base em observações de resultados pré-operatórios, perioperatórios e pós-operatórios, este modelo de camundongo para enxerto de tecido adiposo marrom (BAT) na superfície do coração foi estabelecido com sucesso. O BAT foi coletado da região escapular do camundongo doador, com cada enxerto de BAT pesando aproximadamente 0,1 g.
A coloração com hematoxilina-eosina confirmou a composição e a estrutura do enxerto como BAT. Em baixa ampliação, um grande número de adipócitos marrons foi observado formando estruturas lobulares dentro do tecido conjuntivo frouxo, que era rico em capilares. O citoplasma dos adipócitos marrons continha numerosos pequenos vacúolos, e seus núcleos eram redondos e localizados centralmente. Em alta ampliação, os adipócitos marrons exibiram semelhanças morfológicas com os adipócitos brancos, mas eram menores em diâmetro. Os núcleos dos adipócitos marrons eram redondos ou ovais e localizados central ou excentricamente dentro da célula. O citoplasma era eosinofílico e continha múltiplas gotículas lipídicas de tamanhos variados, que estavam distribuídas por todo o citoplasma. Capilares e nervos também foram visíveis entre os adipócitos marrons. O tecido adiposo transplantado foi posteriormente confirmado como tecido adiposo marrom por meio de coloração imuno-histoquímica para expressão de UCP1 (Figura 1). O enxerto de TAB foi fixado com sucesso na parede anterior do ventrículo esquerdo (Figura 2).
Quatro semanas após o transplante de BAT, não houve mudanças significativas na dieta, atividade ou peso corporal no camundongo receptor. A incisão torácica cicatrizou bem e estava totalmente coberta de pêlos normais. O camundongo receptor foi sacrificado (seguindo as diretrizes éticas) e o coração, juntamente com o enxerto de BAT epicárdico, foi removido para exame histológico. A coloração com hematoxilina-eosina demonstrou que o enxerto de BAT permaneceu viável, exibindo características histológicas típicas do BAT e estabelecendo microcirculação com o miocárdio adjacente. Não houve sinais de infiltração celular inflamatória significativa ou liquefação de gordura. A coloração tricrômica de Masson revelou a formação de tecido conjuntivo fibroso ao redor das suturas usadas para fixar o tecido transplantado dentro do miocárdio. Tecido conjuntivo fibroso foi observado ao redor e dentro do enxerto, mas não houve compartimentalização aparente ou ruptura estrutural do tecido adiposo. A coloração imuno-histoquímica para CD31 e UCP1 indicou ainda a formação de neomicrovasos dentro do BAT transplantado e confirmou a sobrevivência de uma porção dos adipócitos marrons dentro do enxerto (Figura 3).
Figura 1: Isolamento e identificação de tecido adiposo marrom de camundongos doadores. (A,B) Tecido adiposo marrom (BAT) (indicado por setas brancas) coletado de um camundongo doador para transplante. (C) Coloração imuno-histoquímica representativa da expressão de UCP1 em tecido adiposo marrom (barra de escala = 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estabelecimento do modelo animal. Esta figura ilustra o procedimento para estabelecer o modelo animal. Uma toracotomia mediana é realizada para expor a parede anterior do coração usando um espalhador esternal. O enxerto de tecido adiposo marrom (BAT) é fixado na superfície do coração. A incisão é então fechada com suturas intermitentes para as camadas muscular e cutânea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação do enxerto de tecido adiposo marrom no coração de camundongo quatro semanas após o transplante. (A) Cicatriz da incisão torácica anterior mediana (seta branca). (B, C) Enxerto de tecido adiposo marrom (BAT) fixado no ápice do coração (seta branca). (D) Imagens representativas de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) do aloenxerto BAT e miocárdio quatro semanas após o transplante (barra de escala = 100 μm). O triângulo preto sólido indica o miocárdio, * indica o enxerto BAT e as setas pretas indicam capilares. (E) Imagens de coloração tricrômica do representante Masson do aloenxerto BAT e miocárdio quatro semanas após o transplante (barra de escala = 200 μm). (F) Coloração imuno-histoquímica da expressão de CD31 no aloenxerto BAT e miocárdio quatro semanas após o transplante. Setas pretas indicam expressão positiva de CD31 no aloenxerto (barra de escala = 100 μm). (G) Coloração imuno-histoquímica da expressão de UCP1 no aloenxerto BAT e miocárdio quatro semanas após o transplante (barra de escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Neste estudo, um modelo cirúrgico para transplante de tecido adiposo marrom (BAT) para a superfície do miocárdio foi estabelecido com sucesso. O tecido adiposo epicárdico (TAE) é um depósito de gordura único que se conecta diretamente ao miocárdio e às artérias coronárias, compartilhando uma microcirculação comum e facilitando a diafonia entre eles. Estudos anteriores indicaram que o TAE está associado a várias doenças cardíacas, incluindo doença arterial coronariana, fibrilação atrial e hipertrofia miocárdica. No entanto, embora esses estudos tenham demonstrado que o volume do TAE se correlaciona com a extensão e a gravidade da doença cardíaca, os mecanismos pelos quais o TAE influencia a patologia cardíaca ainda precisam ser elucidados 1,2,3,4,5,14,15,16.
Por outro lado, acredita-se que o BAT desempenhe um papel natural na proteção dos mamíferos da hipotermia. Seu citoplasma contém várias gotículas lipídicas pequenas e multiloculares e é enriquecido com mitocôndrias. O BAT é um tecido adiposo termogênico que regula o gasto energético e mantém a homeostase da glicose e lipídios, tornando-se um potencial alvo terapêutico para doenças metabólicas e cardiovasculares 17,18,19. Alguns estudos clínicos indicaram que o volume do BAT está negativamente correlacionado com doenças cardiovasculares. Indivíduos com maior volume de BAT apresentam menores prevalências de diabetes tipo 2, doença arterial coronariana, dislipidemia, insuficiência cardíaca congestiva, doença cerebrovascular e hipertensão 7,20,21.
Um estudo anterior demonstrou que pequenas vesículas extracelulares (sEVs) derivadas de MTD são captadas por cardiomiócitos, suprimindo a ativação da via MAPK relacionada à isquemia/reperfusão miocárdica (IM/R)8. Outro estudo descobriu que o BAT libera sEVs contendo microRNAs cardioprotetores, que contribuem para a cardioproteção relacionada ao exercício22. Essas descobertas ilustram os mecanismos subjacentes à diafonia BAT-cardiomiócitos e destacam os sEVs BAT e seu conteúdo de microRNA como potenciais candidatos à cardioproteção induzida pelo exercício. Além disso, a neuregulina 4 derivada do BAT (Nrg4) demonstrou mitigar a inflamação endotelial e a aterosclerose em camundongos machos23, demonstrando ainda mais as funções endócrinas protetoras do BAT na saúde cardiovascular.
Além disso, análises transcricionais revelaram que o TAE humano expressa altamente marcadores de BAT, como UCP-1, PRDM16 e PGC-1α, em níveis mais elevados do que os encontrados em outros depósitos de gordura 5,6,24,25. Isso sugere que o EAT pode funcionar parcialmente como BAT. Esses achados apóiam a hipótese de que o escurecimento do TAE poderia proteger o miocárdio e as artérias coronárias da hipotermia e servir como mecanismo de defesa contra isquemia ou hipóxia. Coletivamente, esses estudos indicam que o BAT libera múltiplos fatores bioativos e exerce efeitos benéficos e protetores sobre o sistema cardiovascular6.
Em estudos anteriores, modelos de transplante de BAT foram aplicados a vários modelos de doenças para elucidar o impacto do BAT na ocorrência e progressão da doença. Estes incluem estudos sobre a influência do transplante de BAT na síndrome dos ovários policísticos (SOP)26, seu papel regulador no envelhecimento ovariano27 e seus efeitos no metabolismo de corpointeiro28,29. No entanto, os efeitos fisiopatológicos do transplante de BAT no coração ainda não foram investigados.
Como um órgão capaz de secretar inúmeras moléculas de sinalização, o BAT influencia principalmente a fisiopatologia cardiovascular em um organismo normal por meio de vias endócrinas, entregando essas moléculas ao coração ou aos vasos sanguíneos11. No entanto, ainda não está claro se o BAT pode regular diretamente a fisiopatologia cardíaca por meio de vias parácrinas. O estabelecimento de um modelo adequado e confiável para o transplante de BAT na superfície cardíaca facilitaria a investigação de interações diretas entre o BAT e o coração.
Dado que o BAT está anatomicamente localizado na região interescapular de camundongos, sua interferência com outros órgãos depende principalmente da circulação sistêmica via sinalização endócrina. Além disso, alguns estudos sugeriram que o tecido adiposo epicárdico (TAE) tem o potencial de sofrer uma transição de escurecimento. Várias intervenções dietéticas, ambientais e farmacológicas mostraram-se promissoras na indução do escurecimento do TAE em pacientes obesos e/ou com doença arterial coronariana (DAC). Essa transição pode ajudar a mitigar o microambiente hipóxico e inflamatório que agrava o dano vascular e acelera a aterosclerose coronariana 4,24,30. No entanto, mais pesquisas são necessárias para identificar os fatores e vias específicos envolvidos no escurecimento do EAT. Além disso, modelos animais experimentais são necessários para explorar a relação entre o fenótipo EAT e os resultados cardiovasculares associados ao seu perfil inflamatório desequilibrado.
Uma das principais limitações no estudo do EAT é que os roedores quase não têm EAT perceptível. Em humanos, estudar o TAE in natura também é desafiador devido à dificuldade de obtenção de amostras, pois isso requer toracotomia. Estudos anteriores utilizaram um modelo no qual o tecido adiposo derivado de camundongos com dieta hiperlipídica foi transplantado para a cavidade abdominal de camundongos com infarto do miocárdio para demonstrar que o tecido adiposo diabético pode agravar a lesão de isquemia-reperfusão31. A aplicação de modelos de transplante de tecido adiposo permite explorar os efeitos do BAT no coração via sinalização parácrina.
O objetivo principal do desenvolvimento deste modelo é investigar os potenciais efeitos terapêuticos do BAT como um órgão parácrino semelhante ao EAT para o miocárdio e as artérias coronárias. No futuro, este modelo poderá ser utilizado para estudar os efeitos cardioprotetores do BAT na inibição da progressão da placa aterosclerótica, melhorando a lesão isquêmica miocárdica e aliviando a fibrilação atrial. Além disso, pode fornecer evidências circunstanciais que apóiam os benefícios da promoção do escurecimento do EAT.
Em 2013, uma equipe de pesquisa da Harvard Medical School transplantou o BAT para a cavidade visceral de camundongos receptores, conectando o tecido à almofada de gordura do epidídimo para avaliar melhorias na homeostase metabólica por meio do aumento da massa do BAT32. Em um estudo anterior da década de 1960, os pesquisadores isolaram o BAT da região interescapular do doador e o transplantaram sob a cápsula renal do receptor por um período de 1-2 semanas. Além disso, em outro estudo, o BAT foi transplantado para a câmara ocular anterior de hamsters, e a análise histológica foi usada para avaliar se o BAT transplantado sobreviveu12. No entanto, a viabilidade e a sobrevida do transplante de BAT na região epicárdica de roedores permanecem desconhecidas.
A cirurgia epicárdica em camundongos é agora um procedimento de rotina para induzir modelos de infarto do miocárdio. Curiosamente, uma equipe de pesquisa entregou com sucesso agentes farmacológicos dentro do espaço/fluido pericárdico em um modelo suíno, que foi utilizado para investigar fibrilação atrial, períodos refratários relativos e cardiomiopatia isquêmica. Com base nesses estudos, é necessário desenvolver um modelo de roedor para transplante de BAT epicárdico por meio de procedimentos cirúrgicos.
Com base nos resultados experimentais, dois pedaços de BAT foram separados do espaço interescapular do camundongo doador. O BAT foi coberto por tecido adiposo subcutâneo (SAT) e exibiu uma cor mais escura que o SAT, com um rico suprimento sanguíneo. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) do BAT revelou que os adipócitos marrons continham gotículas lipídicas multiloculares menores e eram altamente vascularizados, com hemácias presentes na luz capilar. Cada segmento de MTD recolhido pesava cerca de 30-40 mg. No entanto, o enxerto BAT transplantado foi limitado a cerca de 20 mg, pois o aumento adicional do enxerto levou à mortalidade do camundongo dentro de 1-2 dias após a cirurgia. Uma possível causa desse desfecho é o espaço restrito entre a cavidade torácica e a parede anterior do coração. Um enxerto relativamente grande pode exercer pressão excessiva, resultando potencialmente em tamponamento cardíaco.
A anestesia foi mantida por intubação traqueal e a profundidade da anestesia foi monitorada pela observação da amplitude e ritmo das flutuações torácicas no camundongo. Uma toracotomia mediana foi selecionada para expor a parede anterior do coração, facilitando o transplante de BAT. Como o TAE está diretamente conectado ao miocárdio e às artérias coronárias sem que o tecido conjuntivo as separe, o protocolo envolveu a abertura do pericárdio, a inserção do TAB na superfície do coração e, em seguida, a sutura do pericárdio.
Quatro semanas após o transplante, os camundongos receptores foram eutanasiados (seguindo as diretrizes éticas) e as cavidades torácicas foram abertas para avaliar a integração e a sobrevida do BAT. Esses achados confirmam que o aloenxerto BAT sobreviveu com sucesso.
Em conclusão, um modelo cirúrgico para enxerto de BAT na superfície do coração em camundongos foi desenvolvido com sucesso. Este modelo pode melhorar a compreensão dos efeitos do EAT nas doenças cardíacas e o potencial cardioprotetor do escurecimento do EAT.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 81870623, 81770881, 81900286, 82100494, 82100944 e 82070910), Plano Chave de P&D da Província de Hunan (2020SK2078) e Fundação de Ciências Naturais da Província de Hunan (2022JJ70055, 2021JJ40842 e 2022JJ40721)
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% penicilina/estreptomicina | Gibco, Invitrogen, Nova York, EUA | 03-031-1BCS | Preservação de tecido para enxerto |
| 10% Soro fetal bovino (FBS) | Bovogen, Nova Zelândia, Austrália | 1907B | Preservação de tecido para enxerto |
| 2-0 Suturas absorvíveis | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Company | 17Y1204J | Fechamento de pele |
| Camundongos C57BL/6J machos de 6 a 8 semanas de idade | SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Hunan, China) | ||
| 7/0 Suturas de prolene | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Company | R731 | Fixação do tecido adiposo marrom no coração |
| Solução de coloração vermelha de alizarina | Servicebio, Wuhan, China | CR2203058 | Coloração vermelha de alizarina para enxerto |
| Tesoura de mola angular | Instrumento cirúrgico Jinzhong Empresa | Y3C040 | Dissecção e separação |
| de tecidos sem corte tesoura | Instrumento cirúrgico Jinzhong Empresa | J22010 | Dissecção e separação de tecidos |
| Afastador de tórax | TIGERGENE Company | TG-CK-07PK | Retrátil e fixação de tórax |
| Curso de pinças curvas | Instrumento cirúrgico Jinzhong Empresa | JD1060 | Dissecção e separação de tecidos |
| DMEM: F12 (1:1) médio | Gibco, Invitrogen, Nova York, EUA | C11330500BT | Preservação de tecido para enxerto |
| Fine 45° pinça angular | Jinzhong instrumento cirúrgico Empresa | Y4E040 | Dissecção e separação de tecidos |
| Isoflurano | Shenzhen RuiWoDe Life Technology Co., LTD | R510-22 | Anestesia a gás de camundongo |
| Micro-pinça | Jinzhong instrumento cirúrgico Empresa | JD1050 | Dissecção e separação |
| de tecidos Micro-tesoura | Jinzhong instrumento cirúrgico Empresa | Y00030 | Dissecção e separação de tecidos |
| Porta-agulhas | Instrumento cirúrgico Jinzhong Empresa | Y3G150 | Agulha de retenção para fechamento |
| Tesoura oftálmica | Instrumento cirúrgico Jinzhong Empresa | Y3C060 | Dissecção e separação de tecidos |
| Microscópio cirúrgico | Murzider Company | MSD203 | Para transplante cirúrgico de enxerto de tecido adiposo marrom |
| Ciclo de volume ventilador para roedores | Nanjing KEWBASIS Biotechnology Co.LTD | KW-MZJ-Z | Anestesia a gás do rato |
Referências
- Iacobellis, G. Epicardial adipose tissue in contemporary cardiology. Nat Rev Cardiol. 19 (9), 593-606 (2022).
- Zobel, E. H., et al. Relation of cardiac adipose tissue to coronary calcification and myocardial microvascular function in type 1 and type 2 diabetes. Cardiovasc Diabetol. 19 (1), 16(2020).
- Packer, M. Epicardial adipose tissue may mediate deleterious effects of obesity and inflammation on the myocardium. J Am Coll Cardiol. 71 (20), 2360-2372 (2018).
- Napoli, G., et al. Epicardial and pericoronary adipose tissue, coronary inflammation, and acute coronary syndromes. J Clin Med. 12 (23), jcm12237212(2023).
- Villasante Fricke, A. C., Iacobellis, G. Epicardial adipose tissue: Clinical biomarker of cardio-metabolic risk. Int J Mol Sci. 20 (23), ijms20235989(2019).
- Doukbi, E., et al. Browning epicardial adipose tissue: Friend or foe. Cells. 11 (6), 11060991(2022).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
- Zhao, H., et al. Small extracellular vesicles from brown adipose tissue mediate exercise cardioprotection. Circ Res. 130 (10), 1490-1506 (2022).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Ruan, C. C., et al. A(2A) receptor activation attenuates hypertensive cardiac remodeling via promoting brown adipose tissue-derived FGF21. Cell Metab. 28 (3), 476-489.e5 (2018).
- Martí-Pàmies, Íal, et al. Brown adipose tissue and BMP3b decrease injury in cardiac ischemia-reperfusion. Circ Res. 133 (4), 353-365 (2023).
- White, J. D., Dewal, R. S., Stanford, K. I. The beneficial effects of brown adipose tissue transplantation. Mol Aspects Med. 68, 74-81 (2019).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
- Rosito, G. A., et al. Pericardial fat, visceral abdominal fat, cardiovascular disease risk factors, and vascular calcification in a community-based sample: the Framingham heart study. Circulation. 117 (5), 605-613 (2008).
- Piché, M. E., Poirier, P., Lemieux, I., Després, J. P. Overview of epidemiology and contribution of obesity and body fat distribution to cardiovascular disease: An update. Prog Cardiovasc Dis. 61 (2), 103-113 (2018).
- Shaihov-Teper, O., et al. Extracellular vesicles from epicardial fat facilitate atrial fibrillation. Circulation. 143 (25), 2475-2493 (2021).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), ijms22041530(2021).
- Fernández-Verdejo, R., Marlatt, K. L., Ravussin, E., Galgani, J. E. Contribution of brown adipose tissue to human energy metabolism. Mol Aspects Med. 68, 82-89 (2019).
- Takx, R. A., et al. Supraclavicular brown adipose tissue 18F-FDG uptake and cardiovascular disease. J Nucl Med. 57 (8), 1221-1225 (2016).
- Chen, H. J., Meng, T., Gao, P. J., Ruan, C. C. The role of brown adipose tissue dysfunction in the development of cardiovascular disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 652246(2021).
- Icli, B., Feinberg, M. W. MicroRNAs in dysfunctional adipose tissue: Cardiovascular implications. Cardiovasc Res. 113 (9), 1024-1034 (2017).
- Shi, L., et al. Brown adipose tissue-derived Nrg4 alleviates endothelial inflammation and atherosclerosis in male mice. Nat Metab. 4 (11), 1573-1590 (2022).
- González, N., Moreno-Villegas, Z., González-Bris, A., Egido, J., Lorenzo, Ó Regulation of visceral and epicardial adipose tissue for preventing cardiovascular injuries associated to obesity and diabetes. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 44(2017).
- Rossi, V. A., Gruebler, M., Monzo, L., Galluzzo, A., Beltrami, M. The different pathways of epicardial adipose tissue across the heart failure phenotypes: From pathophysiology to therapeutic target. Int J Mol Sci. 24 (7), ijms24076838(2023).
- Fang, Y. Q., Zhang, H. K., Wei, Q. Q., Li, Y. H. Brown adipose tissue-derived exosomes improve polycystic ovary syndrome in mice via STAT3/GPX4 signaling pathway. Faseb J. 38 (18), e70062(2024).
- Chen, L. J., et al. Single xenotransplant of rat brown adipose tissue prolonged the ovarian lifespan of aging mice by improving follicle survival. Aging Cell. 18 (6), e13024(2019).
- Quan, Y., Lu, F., Zhang, Y. Use of brown adipose tissue transplantation and engineering as a thermogenic therapy in obesity and metabolic disease. Obes Rev. 25 (3), e13677(2024).
- Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis, and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2018).
- Gan, L., et al. Small extracellular microvesicles mediated pathological communications between dysfunctional adipocytes and cardiomyocytes as a novel mechanism exacerbating ischemia/reperfusion injury in diabetic mice. Circulation. 141 (12), 968-983 (2020).
- Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
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