Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

Resumo

As proteinases são vitais para a patogênese bacteriana, permitindo a invasão e a evasão imunológica. A extração em uma única etapa de proteínas citoplasmáticas e de membrana de bactérias em sua forma ativa é angustiante. Este artigo em vídeo demonstra a extração de proteínas celulares inteiras de Leptospira para análise de zimografia para detectar e caracterizar gelatinases.

Resumo

As proteinases de bactérias patogênicas contribuem para a invasão e patogênese degradando ativamente os componentes da matriz extracelular (MEC) do hospedeiro e as barreiras celulares, modificando a resposta imune do hospedeiro e degradando o sistema de defesa do hospedeiro. Isso torna as proteinases uma das moléculas mais virulentas e sua identificação e caracterização são essenciais para a prevenção e controle de doenças. Muitas bactérias também possuem proteinases ligadas à membrana externa. O isolamento e a caracterização das proteínas da membrana externa em suas formas ativas apresentam desafios significativos devido à sua localização dentro da membrana externa. Neste estudo, demonstramos um método de etapa única para extrair gelatinases citoplasmáticas e associadas à membrana externa de Leptospira e demonstramos sua atividade enzimática usando zimografia. Neste método, usamos desoxicolato de sódio para romper a membrana celular e liberar as proteínas ligadas e o ácido 6-aminocapróico para solubilizar a proteína de membrana liberada em sua forma nativa. Além disso, mostramos uma análise zimográfica das gelatinases leptospiras. Essa abordagem fornece uma estrutura versátil para isolar, purificar e caracterizar metaloproteases, colagenases e gelatinases de vários patógenos bacterianos.

Introdução

A maioria dos patógenos bacterianos deve encontrar a matriz extracelular (MEC) do hospedeiro durante a invasão e disseminação para órgãos-alvo durante a patogênese. O colágeno forma o principal componente na MEC dos tecidos animais¹. As gelatinases são um grupo de proteases que atuam no colágeno e sua forma hidrolisada, a gelatina. A degradação da MEC é executada principalmente por um grupo de proteases, que inclui colagenases e gelatinases ^2,3. Os patógenos bacterianos usam colagenases e gelatinases para remodelar ou quebrar a MEC do hospedeiro para sua conveniência na invasão e patogênese ^4,5. As enzimas degradadoras de ECM bacterianas são candidatas potenciais para vacinas e medicamentos^{direcionados 5}.

As proteases bacterianas são encontradas nas formas secretoras e ligadas à membrana 6,7,8,9. Muitos métodos de extração de enzimas celulares são ineficazes para isolar gelatinases e colagenases bacterianas ligadas à membrana, pois esses procedimentos podem não preservar eficientemente a forma nativa das proteínas ligadas à membrana. Da mesma forma, existem métodos específicos de membrana que extraem apenas proteases e gelatinases ligadas à membrana. Os métodos convencionais de extração de proteínas totais, incluindo proteínas de membrana, geralmente envolvem detergentes e íons caotrópicos, que podem afetar a atividade enzimática. Um procedimento de extração que mantém a atividade enzimática e a solubilidade é essencial para a separação eletroforética e permite o desenvolvimento da zimografia para detectar a atividade da protease.

O desoxicolato de sódio, um detergente iônico que pode lisar as células rompendo a membrana celular, permite a liberação do conteúdo celular e da proteína da membrana. O ácido 6-aminocapróico pode solubilizar a proteína de membrana liberada em sua forma nativa. A solubilização pelo ácido 6-aminocapróico tem a vantagem de não afetar a eletroforese. Aqui, demonstramos a extração de proteinases bacterianas celulares e ligadas à membrana usando desoxicolato de sódio e ácido 6-aminocapróico, estabilizando-as em sua forma solúvel nativa 10,11,12. Esse método solubiliza efetivamente proteínas da célula e da membrana que podem ser usadas diretamente sem interferir na eletroforese^13,14. Várias caracterizações enzimáticas podem ser realizadas alterando os inibidores de protease e íons metálicos usados no tampão de ativação, dependendo da aplicação.

Protocolo

1. Extração de gelatinases bacterianas

NOTA: Consulte a Tabela 1 para a preparação de reagentes e materiais.

1. Cultivar o organismo em meio Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) contendo 10 mg/ml de albumina sérica bovina a 30 °C. Tomar 10 mL de cultura de Leptospira na fase intermediária de crescimento contendo 3,5 × 10⁸ células/mL para as proteinases de extração^13,14. Use a contagem microscópica direta com uma câmara de contagem de Petroff-Hausser sob um microscópio de campo escuro para observar a fase intermediária do crescimento.
2. Colher as células por centrifugação a 6.000 × g durante 10 min e rejeitar o sobrenadante num recipiente para descontaminação por autoclavagem a 121 °C durante 60 min.
3. Transfira o pellet suspendendo-o em 1 mL de tampão de lavagem para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 6.000 × g por 5 min. Repita esta lavagem.
4. Extraia a proteína do pellet adicionando 100 μL de tampão de extração para um pellet de Leptospira de 10 mL de cultura e vórtice por 5 min. Continuar a extracção incubando a 4 °C durante 1 h. Coletar a proteína extraída por centrifugação a 15.000 × g a 4 °C por 10 min e descartar o pellet em um recipiente para descontaminação por autoclavagem a 121 °C por 60 min.
5. Use o extrato de proteína diretamente para zimografia, adicionando um volume igual de 2x tampão de amostra.
6. Use o ensaio de estimativa de Bradford para determinar a concentração de proteína.
7. Se a concentração de proteína for baixa, precipite-a com acetona misturando a proteína com um volume 4x de acetona para precipitação e incube-a durante a noite a -20 ° C. No dia seguinte, centrifugue a amostra a 10.000 × g por 10 min, seque ao ar o pellet resultante e ressuspenda-o em PBS ou dissolva-o no tampão desejado e armazene-o a -20 ° C por até 1 mês. Use liofilização para armazenamento ou transporte de longo prazo.
   NOTA: Devido às proteases ativas no extrato e à ausência de inibidores de protease, as proteínas podem se degradar na amostra.

2. Zimografia de gelatinases

1. Preparação do gel SDS PAGE copolimerizado com gelatina
   1. Gel de resolução
      1. Faça a mistura de gel de resolução adicionando os componentes nas quantidades necessárias para moldar o gel. Para 3,86 mL de água em um béquer de 50 mL, adicione 2,5 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL da solução estoque de gelatina a 10%, 3,34 mL de solução de acrilamida-bis acrilamida (ABA), 0,1 mL de SDS a 10%, 0,006 mL de TEMED e 0,1 mL de persulfato de amônio a 10% e misture bem sem espuma e bolhas. O sistema mencionado (Placas de Vidro Regulares; 18 x 8 cm) requer 10 mL de mistura de gel de resolução.
         NOTA: Se a gelatina for de uma alíquota congelada, descongele-a até derreter para limpar a solução sem grumos. Adicione persulfato de amônio antes da fundição, pois a polimerização começará imediatamente após a adição de persulfato de amônio.
      2. Despeje a mistura de gel de resolução na câmara de fundição até ~ 3-5 mm abaixo da marcação para o fundo dos poços. Evite bolhas de ar.
      3. Despeje lentamente um pouco de água para obter uma camada uniforme de 1 mm na parte superior do gel e remova as bolhas. Deixe o gel endurecer durante 1 h.
         NOTA: A formação de gel pode ser confirmada procurando uma separação de fases entre a camada de água e o gel; O gel não pode ser derramado mesmo que o de gel esteja inclinado.
   2. Gel de empilhamento
      1. Prepare o gel de empilhamento misturando os seguintes componentes. Para 1,84 mL de água em um béquer de 10 mL, adicione 2,5 mL de Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 mL de ABA, 0,03 mL de SDS a 10% e 0,006 mL de TEMED. O sistema de 8 x 10 cm de 1 mm de espessura requer 3 mL de mistura de gel de resolução.
      2. A partir do de gel, transvase a água formada na parte superior do gel inclinando a configuração do gel para um lado e enxugando a água recolhida do canto utilizando uma tira estreita de papel de filtro.
      3. Adicione 0,03 mL de APS a 10% à mistura mencionada na etapa 2.1.2.1 e misture sem formar bolhas.
      4. Despeje o gel de empilhamento no gel de resolução e coloque imediatamente o pente na posição sem formar bolhas de ar sob os dentes do pente, deixando uma espessura de 3-5 mm de gel de empilhamento entre o gel de resolução e a parte inferior dos dentes do pente. Aguarde pelo menos 3 h para polimerização completa e reticulação da gelatina.
      5. Retire o espaçador inferior e fixe o gel no aparelho de eletroforese.
      6. Coloque lentamente o gel no tanque contendo 1x tampão de eletrodo, garantindo que não haja ar preso no fundo do gel.
2. Preparação da amostra
   1. Adicione um volume igual de tampão de amostra ao extrato e incube a 37 °C por 30 min para permitir que o SDS se ligue à proteína. Utilizar uma amostra contendo 2 μl de soro humano com um volume igual de tampão de amostra como controlo positivo.
3. Carregando a amostra
   1. Carregue cuidadosamente a amostra nos poços com uma pipeta de ponta estreita ou uma seringa Hamilton (0,5-1 mL). Adicione gradualmente o tampão de eletrodo para preencher as porções restantes dos poços, a parte superior do gel e o tanque superior da unidade de eletroforese sem perturbar as amostras carregadas.
      NOTA: A seringa Hamilton deve ser bem lavada entre as amostras para evitar contaminação cruzada.
4. Eletroforese em execução
   1. Inicie a eletroforese a 6 mA por gel e execute até que a frente do corante entre no gel de resolução. Em seguida, aumente a corrente para 12 mA por gel e continue até que a frente do corante atinja 1 cm acima do fundo do gel.
      NOTA: O tempo de execução pode mudar dependendo da concentração de ABA usada e do tamanho da proteína alvo.
5. Marcando a orientação das bandas do padrão
   1. Depois de completar a eletroforese, desmonte cuidadosamente as placas de vidro usando uma ferramenta de separação de placas ou espátula de plástico e marque a orientação do carregamento da amostra cortando o canto inferior direito do gel e marque as bandas marcadoras fazendo furos nas proximidades ou escaneando o gel.
6. Renaturação de enzimas resolvidas
   1. Mergulhe o gel em solução de renaturação contendo Triton X-100 em uma bandeja de gel e incube por 30 min em temperatura ambiente sem agitar.
      NOTA: O Triton X-100 renaturaliza as proteínas, pois o gel de zimograma contendo proteínas resolvidas pode ser desnaturado e perder atividade na presença de SDS.
7. Incubação para atividade de protease
   1. Substituir a solução de renaturalização por um tampão de activação que submerja completamente o gel e incubar a 37 °C durante 18 h numa incubadora.
      NOTA: Modifique o tampão de ativação adicionando inibidores ou ativadores de proteinases de interesse para caracterizar a atividade da proteinase conforme necessário.
8. Coloração do zimograma
   1. Após a incubação, remova o tampão de ativação e enxágue o gel brevemente com água por 1 min para remover qualquer Triton X-100 restante e evitar a formação de espuma durante a agitação.
   2. Adicione a solução de coloração à bandeja, garantindo que o gel esteja completamente submerso. Agite o gel suavemente em baixa velocidade para evitar danos. Continue colorindo até que o gel fique completamente azul.
   3. Remova o excesso de manchas da superfície do gel enxaguando-o com água por 1 min. Adicione a solução de descoloração à bandeja e agite suavemente. Substitua a solução de descoloração por uma solução nova várias vezes até obter o contraste de banda desejado contra o fundo azul.
      NOTA: Ao realizar a descoloração, monitore continuamente o gel para garantir que ele não fique completamente descolorado, permitindo a observação e o registro das bandas proteolíticas.
   4. Digitalize o gel em um sistema de documentação de gel ou scanner de documentos e determine a massa molecular das bandas de proteínas comparando-as com os padrões de proteína.

Resultados

O resultado mostra o zimograma da proteína leptospira e gelatinases do soro humano. Os resultados, mostrados na Figura 1, representam proteases como faixas brancas claras contra um fundo azul. As bandas representam áreas onde a gelatina copolimerizada é degradada e, portanto, não corada, enquanto outras áreas de todo o gel são coradas de azul devido à presença de gelatina. Além disso, mostra que, embora a gelatina também seja uma proteína, ela não é eluída na eletroforese devido à copolimeri...

Discussão

Durante a preparação do gel de acrilamida, a gelatina copolimeriza com a matriz polimérica de acrilamida. Consequentemente, a gelatina copolimerizada permanece imobilizada dentro do gel e não migra durante a eletroforese, mesmo sendo uma proteína. Após a eletroforese, as proteínas nativas extraídas usando desoxicolato e tampão de ácido 6-aminocapróico se separam de acordo com sua massa e carga. Após a remoção do SDS, essas proteínas são renaturalizadas na presença do Triton X-100 e recup...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 6-aminocapróico	Merck	A2504
Ácido acético	Sigma	695092
Acetona	Sigma	32201
Acrilamida	Sigma	A-3553
Persulfato de amônio	Sigma	A-3678
Bis Acrilamida	Sigma	M7279
Soro bovino albumina fração V (BSA)	Sigma	A-8022
Azul de Bromofenol	Sigma	B-8026
CaCl2	Merck	C4901
Coomassie azul brilhante	Sigma	1.12553
Desoxicolato	Sigma-Aldrich	D6750
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) médio, Difco	Difco	279410
Gelatina	Merck	G9382
Glicerol	Merck	G5516
Glicina G8790	Sigma	G-8898
Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , mantida no biorrepositório do ICMR-RMRC Portblair	Mantido no biorrepositório do ICMR-RMRC Port Blair		Temperatura ideal de crescimento 30 > C
Cloreto de magnésio M8266	Sigma	M8266
Metanol	Sigma	17995-7
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma	Pág. 4417
Ferramenta de separação de placas	Maravilha Wedgle
Rotor	Termocientífico	FIBERLite F15 8x50 cy
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma	L-4396
TEMED	Sigma	T-9281
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Base Trizma (TRIS)	Sigma	T6066