Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Muhammad Abid Sheikh; Farah Helena Afandi; Grazia Iannello; Barbara Corneo; Bright Starling Emerald; Suraiya Anjum Ansari

doi:10.3791/67296

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Artigo de método

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

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DOI:

10.3791/67296

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1 de novembro de 2024

Muhammad Abid Sheikh¹ , Farah Helena Afandi¹ , Grazia Iannello² , Barbara Corneo² , Bright Starling Emerald³^,⁴^,⁵ , Suraiya Anjum Ansari¹^,⁴^,⁵

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ²Columbia Stem Cell Initiative, Stem Cell Core, Columbia University Irving Medical Center, ³Department of Anatomy, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁴Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁵ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (PMRI-AD), United Arab Emirates University

Neste artigo

Resumo

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Resumo

O sistema CRISPR-Cas9 para edição de genoma revolucionou os estudos de função gênica em células de mamíferos, incluindo células-tronco. No entanto, a aplicação prática dessa técnica, particularmente em células-tronco pluripotentes, apresenta alguns desafios, como ser demorada e trabalhosa e ter baixa eficiência de edição. Aqui, descrevemos a geração de um nocaute genético mediado por CRISPR em uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas (hESC) expressando sgRNAs estáveis para o gene L2HGDH, usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente e estável. Os sgRNAs direcionados ao éxon 1 do gene L2HGDH foram sintetizados quimicamente e clonados no vetor lentiCRISPR v2-puro, que combina a expressão constitutiva de sgRNAs com Cas9 em um sistema de vetor único altamente eficiente para obter títulos lentivirais mais altos para infecção por hESC e seleção estável usando puromicina. As células selecionadas por puromicina foram expandidas e clones de célula única foram obtidos usando o método de diluição limitada. Os clones únicos foram expandidos e vários clones knockout homozigotos para o gene L2HGDH foram obtidos, conforme confirmado por uma redução de 100% na expressão de L2HGDH usando análise de Western blot. Além disso, usando MSBSP-PCR, o local da mutação CRISPR foi mapeado a montante da sequência de reconhecimento PAM de Cas9 nos clones homozigotos selecionados. O sequenciamento de Sanger foi realizado para analisar as inserções/deleções exatas e a caracterização funcional dos clones foi realizada. Este método produziu uma porcentagem significativamente maior de deleções homozigóticas em comparação com os métodos de entrega de genes não virais relatados anteriormente. Embora este relatório se concentre no gene L2HGDH, essa abordagem robusta e econômica pode ser usada para criar nocautes homozigotos para outros genes em células-tronco pluripotentes para estudos de função gênica.

Introdução

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são células-tronco com potencial para se diferenciar em todos os tipos de células do corpo. Essas células servem como ferramentas valiosas para estudar o desenvolvimento humano, bem como para entender os mecanismos subjacentes de várias doenças, oferecendo assim uma tremenda promessa para a medicina regenerativa, modelagem de doenças e descoberta de medicamentos. Tais estudos envolvem a investigação de como genes específicos contribuem para o desenvolvimento, funcionamento e regulação dos organismos ^1,2....