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Artigo de método

Enriquecimento de proteínas subcelulares em Leptospira usando uma abordagem de fracionamento baseada em Triton X-114

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DOI:

10.3791/67298

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8 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

Neste artigo

Resumo

Embora os procariontes não tenham um sistema organelar, existem regiões subcelulares com proteínas localizadas. A análise quantitativa e qualitativa das enzimas e proteínas nas regiões subcelulares é importante para o desenvolvimento de alvos de fármacos e vacinas. Aqui, ilustramos o fracionamento subcelular de proteínas Leptospiras usando Triton X-114 e sua análise.

Resumo

Os procariontes não possuem organelas subcelulares precisas, mas exibem regiões distintas, como citoplasma, membrana interna, periplasma e membrana externa, onde a maioria das funções bioquímicas e fisiológicas são organizadas. Assim, a compreensão das características funcionais das proteínas requer a elucidação de sua localização subcelular. No entanto, a extração de proteínas subcelulares de bactérias gram-negativas apresenta desafios devido à sua complexa bicamada fosfolipídica. Embora o Triton X-114 tenha se mostrado promissor na extração de proteínas de membrana externa (OMP), um protocolo conciso permanece indefinido. Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho passo a passo para extrair proteínas subcelulares usando a espiroqueta Leptospira como modelo. Esta técnica, com fracionamento subcelular e separação de fases, produz frações distintas para proteínas citoplasmáticas, externas e internas da membrana. O detergente Triton X-114 é adequado para separação de fases devido à sua temperatura ideal do ponto de turvação (~22 °C) e baixa concentração micelar crítica (CMC), permitindo a extração e purificação eficientes de proteínas nativas com desnaturação mínima. Notavelmente, a análise revela a eficiência na discriminação de proteínas das membranas interna e externa distintas do citoplasma.

Introdução

As análises proteômicas subcelulares (SCP) desempenham um papel fundamental na elucidação da patogênese bacteriana, analisando o proteoma dentro de compartimentos subcelulares específicos de células bacterianas. Essa abordagem proteômica subcelular caracteriza proteínas bacterianas em compartimentos distintos, reduzindo a complexidade ao excluir proteínas altamente abundantes e fornecendo informações sobre sua organização e abundância proporcional 1,2. Por exemplo, empregando técnicas de fracionamento subcelular e LC-MS / MS, um estudo sobre Shewanella oneidensis revelou uma parte substancial de seu proteoma, fornecendo detalhes cruciais sobre a arquitetura do compartimento da abundância de células e proteínas. Este estudo serve como uma estrutura fundamental para investigações subsequentes sobre a organização subcelular dentro de bactérias gram-negativas3. No domínio da patogênese bacteriana, delinear o proteoma bacteriano durante a infecção in vivo é imperativo para compreender os mecanismos que impulsionam a patogenicidade4. Investigar o proteoma de Salmonella intracelular dentro de células epiteliais em vários estágios de infecção tem sido fundamental para desvendar as estratégias adaptativas empregadas por patógenos bacterianos em seu meio intracelular 4,5. As estratégias SCP fornecem informações abrangentes sobre a dinâmica celular, avaliando a abundância e a translocação de proteínas em vários compartimentos celulares. Esse método facilita a identificação extensiva de proteínas de diversos compartimentos bacterianos, aprimorando a análise minuciosa dos proteomas bacterianos 6,7.

A distribuição subcelular das proteínas não apenas determina sua atividade funcional, mas também aumenta sua diversidade funcional8. Por exemplo, as enzimas exibem mecanismos regulatórios e níveis de atividade variados, dependendo de sua localização subcelular. As transglutaminases (TGases), por exemplo, exibem papéis ou mecanismos regulatórios distintos em diferentes compartimentos subcelulares nos tubos polínicos: as TGases citoplasmáticas incorporam aminas primárias em proteínas citosólicas (por exemplo, actina e tubulina) de maneira dependente de Ca(2+), interagindo com o citoesqueleto; as TGases de membrana estão associadas a Golgi e membranas plasmáticas, sugerindo um papel na entrega exocitótica; e TGases associadas à parede celular regulam o crescimento apical colocalizando-se com marcadores da parede celular. Essas distinções funcionais são mediadas por papéis específicos do compartimento9. Além disso, o reparo de proteínas oxidadas no envelope bacteriano ressalta o papel crítico dos sistemas enzimáticos dentro de compartimentos celulares específicos expostos a espécies reativas de oxigênio10. Considere-se a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), cuja localização subcelular é modulada por modificações lipídicas, influenciando sua interação com diversas membranas celulares11. A compartimentalização enzimática mantém ambientes distintos propícios a interações entre enzimas e substratos, facilitando assim processos metabólicos específicos do compartimento12.

Bactérias e outros procariontes não têm organelas subcelulares claras; Existem regiões distintas, incluindo citoplasma, membrana interna, periplasma e membrana externa. A maioria das funções bioquímicas e fisiológicas do organismo está organizada em vários compartimentos subcellar13. Assim, a localização subcelular de proteínas é importante para predizer suas características funcionais. No entanto, a extração de proteínas subcelulares de bactérias gram-negativas apresenta desafios devido à sua complexa bicamada fosfolipídica de membrana dupla. Os métodos convencionais de extração, empregando detergentes como o dodecil sulfato de sódio (SDS) e aditivos como a ureia, muitas vezes comprometem a integridade da proteína da membrana, impactando as análises a jusante14,15. Além disso, a composição lipídica desempenha um papel significativo na formação das alterações conformacionais das proteínas de membrana. O sucesso da solubilização depende de fatores como a relação detergente-lipídio-proteína, pois o processo envolve a inserção do detergente na bicamada lipídica seguida de solubilização da proteína16. A escolha do detergente é fundamental para a solubilização eficaz das proteínas da membrana, considerando fatores como temperatura do ponto de turvação e tempo de incubação17. O ambiente lipídico pode influenciar as alterações conformacionais das proteínas da membrana18,19.

Os detergentes são essenciais para extrair proteínas de membrana de membranas biológicas e garantir sua solubilidade em soluções aquosas, um pré-requisito para a purificação subsequente de proteínas. No entanto, a purificação de proteínas de membrana costuma ser um desafio porque elas são removidas de seu ambiente de membrana lipídica nativa e colocadas em um tampão detergente, que replica apenas parcialmente as propriedades físicas e químicas da membrana20. Após a extração, as proteínas de membrana são normalmente purificadas em processos subsequentes usando diálise, precipitação de proteínas e alguns métodos de cromatografia como proteínas solúveis20,21. A separação de fases oferece uma alternativa poderosa ou complemento aos protocolos de purificação baseados em cromatografia e pode ser aplicada diretamente a proteínas solubilizadas. Basicamente, a separação de fases permite que as proteínas integrais da membrana se dividam em fase enriquecida em detergente e proteínas citosólicas na fase aquosa empobrecida em detergente20,22. Vários detergentes foram descritos como sendo usados na solubilização de proteínas de membrana em estudos anteriores20. Estes incluem a família Triton (Triton X-100 & Triton X-114), família Tween (Tween-20, & -80), detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes monoéter de polioxietilenoglicol, etc., mas eles têm prós e contras em termos de estrutura e função das proteínas20. As propriedades físico-químicas desses detergentes influenciam muito a partição de fases e a solubilização de proteínas de membrana20. Os detergentes são moléculas anfipáticas com um grupo polar e uma cadeia de hidrocarbonetos hidrofóbica. Em baixas concentrações, eles existem como monômeros na água. Acima da concentração crítica de micelas (CMC), formam micelas cujo tamanho depende do tipo de detergente, com o número de agregação indicando o número de moléculas por micela (também chamado de peso molecular da micela). Outro fator importante é o "ponto de turvação", que pode ser alcançado alterando a temperatura de uma solução aquosa de detergente micelar que se torna turva e, eventualmente, forma duas fases distintas. Esse processo é conhecido como separação de fases ou extração de ponto de nuvem. Um CMC alto pode produzir mais proteínas de membrana correspondentes a altas concentrações de detergente com ligação mais fraca, que podem ser dialisadas contra um tampão com uma concentração de detergente definida20. No entanto, atingir um alto CMC na maioria dos detergentes requer uma alta temperatura do ponto de turvação, o que pode afetar a estrutura e a função da proteína extraída e afetar os processos a jusante. Mesmo a alta concentração de detergente nesta fase pode ser prejudicial à proteína e criar problemas no manuseio de líquidos para pipetar o volume preciso devido à alta viscosidade. Por exemplo, o tritão X-100 tem um alto rendimento de proteínas de membrana na micela detergente acima da temperatura do ponto de turvação de 64-65 °C. Para manter a temperatura de trabalho, 9% -23% (NH4)2ENTÃO4 ou 16% -25% de adição de NaCl pode ser reduzida à temperatura ambiente (TR), resultando em uma alta concentração de detergente, o que provavelmente afeta a estabilidade da proteína. Da mesma forma, a extração baseada em interpolação usa uma alta temperatura de ponto de turvação (76 ° C para interpolação 20 e 93 ° C para interpolação 80). O detergente aniônico SDS é freqüentemente usado em aplicações de proteínas, mas geralmente desnatura proteínas20. Os pesquisadores, com o objetivo de extrair eficientemente as proteínas da membrana, identificaram o Triton X-114 como um detergente clássico devido à sua temperatura ideal do ponto de turvação de aproximadamente 22 ° C, ideal para estudos de proteínas de membrana. Introduzido pela primeira vez por Bordier em 1981, o Triton X-114 tem sido amplamente utilizado para extração e purificação de proteínas de membrana em diversas fontes, incluindo tecidos animais e vegetais, bem como microorganismos20,22. O baixo CMC do Triton X-114 impede sua remoção por diálise; no entanto, sua natureza suave minimiza a desnaturação das proteínas da membrana na fase enriquecida com detergente. Além disso, o Triton X-114 forma micelas menores (n = 7-8) em comparação com o Triton X-10020. O protocolo de estudo de James G. Pryde empregou Triton X-114 para extração de proteínas de membrana de células de mamíferos cultivadas. Usando uma temperatura de ponto de turvação acima de 20 ° C (incubação a 30 ° C por 3 min), as proteínas integrais da membrana particionaram na fase enriquecida com detergente, enquanto as proteínas periféricas e citosólicas foram recuperadas da fase aquosa empobrecida em detergente22. Além disso, David A. Haake et al. usaram Triton X-114 para extrair proteínas da membrana externa (OMPs) de Leptospira interrogans, com e sem CaCl2 como aditivo23,24. Estudos posteriores confirmaram que o Triton X-114 extrai efetivamente OMPs de compartimentos subcelulares sem aditivos como glicerol ou CaCl225,26. No entanto, a inclusão de sais pode aumentar a concentração de detergente, o que pode afetar estudos de proteoma em larga escala usando espectrometria de massa de alto rendimento20. Em nosso trabalho sobre análise de proteoma subcelular, empregamos Triton X-114 acoplado à espectrometria de massa em tandem, alcançando um enriquecimento significativo em todos os compartimentos subcelulares, incluindo proteínas citoplasmáticas, de membrana interna e de membrana externa25,26. O objetivo principal do presente protocolo é enriquecer eficientemente os compartimentos subcelulares de uma célula bacteriana gram-negativa típica, minimizando os problemas nos processos a jusante. Além disso, o protocolo foi projetado para ser econômico e eficiente em termos de tempo. Aqui, elaboramos o protocolo otimizado desenvolvido em laboratório para isolamento de proteínas subcelulares e discutimos cada gargalo encontrado durante o processo de extração.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo utiliza Leptospira interrogans para o experimento de extração de proteínas subcelulares. Embora este protocolo possa ser adaptado para uso com outras bactérias gram-negativas, a otimização pode ser necessária dependendo dos objetivos específicos da pesquisa. A Tabela de Materiais e a Tabela 1 fornecem a lista de produtos químicos e equipamentos, juntamente com as composições de tampões e soluções reagentes, respectivamente, enquanto a Tabela 2 descreve as instalações laboratoriais.

1. Cepa de Leptospira e condições de cultura

  1. Obter o sorogrupo L. interrogans Icterohaemorrhagiae sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130.
    NOTA: Esta cepa foi obtida do Conselho Indiano de Pesquisa Médica - Centro Regional de Pesquisa Médica em Port Blair, Índia, um centro colaborador da OMS especializado em diagnóstico, referência, pesquisa e treinamento de leptospirose.
  2. Cultive Leptospira (inóculo contendo ~ 1 × 106 células / mL) em 50 mL de meio Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1%.
  3. Incubar a 30 °C até que a cultura atinja a fase de crescimento logarítmico médio (3,5 × 108 células/ml). Testar alíquotas do meio cultivado em placas de ágar nutriente para garantir que o meio permanece não contaminado.
    NOTA: Utilize microscopia de campo escuro e uma câmara de contagem Petroff-Hausser para contar as células. Para mais informações, consulte o artigo27.º publicado anteriormente.

2. Colheita de células

  1. Após um período de incubação de 7 dias, transfira três réplicas biológicas da cultura de L. interrogans para tubos de centrífuga em volumes iguais (25 mL cada).
    NOTA: A cultura de Leptospira foi manuseada dentro de uma capela de fluxo de ar laminar em uma instalação de laboratório BSL-2 durante a transferência.
  2. Centrifugue todos os tubos a 2500 × g por 45 min a 4 °C. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante para um copo contendo desinfectante e descartá-lo. Use o pellet celular para a próxima etapa.
  3. Lave os grânulos celulares três vezes com solução salina tamponada com fosfato (1 mL de cada vez) suplementada com 5 mM de MgCl2, centrifugando a 10.000 × g por 10 min a 4 ° C após cada lavagem.
    NOTA: Esta etapa removerá o BSA indesejado presente no meio EMJH da superfície do pellet celular.

3. Extração de proteínas subcelulares

  1. Extração Triton X-114
    1. Trate o pellet de células Leptospira , obtido após a colheita, com um tampão de extração contendo 10 mM de Tris-Cl (pH 8), 1% de Triton X-114 e 150 mM de NaCl a uma taxa de 1 mL por pellet colhido (Tabela 1) (Opcional - um coquetel de inibidores de protease pode adicionar de acordo com o propósito experimental).
      NOTA: O procedimento envolve simplesmente expor as bactérias a uma solução detergente, adicionando o tampão de extração para extrair as proteínas da membrana.
    2. Misturar suavemente o tampão de extracção com o pellet utilizando uma micropipeta a uma temperatura inferior a 25 °C até que a solução fique visualmente turva.
    3. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C.
    4. Misturar novamente o extracto resultante com uma micropipeta e centrifugar a 15 000 × g durante 30 min a 4 °C.
    5. Transvase o sobrenadante para outro frasco e retenha o sedimento celular para processos de extração subsequentes.
      NOTA: Este sobrenadante contém uma mistura de proteínas hidrofílicas e hidrofóbicas abundantemente do citoplasma e da membrana externa e é usado para separação de fases.
    6. Adicione 50 μL de tampão contendo 10 mM de Tris-Cl (pH 8), 8 M de ureia, um coquetel de inibidores de protease e 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) ao pellet celular.
    7. Vortex a mistura continuamente por 5 min após adicionar o tampão de extração e, em seguida, incube a 4 ° C por mais 5 min.
    8. Centrifugar novamente a mistura a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C e designar o sobrenadante resultante como a fracção de sedimentos (P).
      NOTA: A fração de pellets foi encontrada para conter uma alta abundância de proteínas da membrana interna em Leptospira25,26.
  2. Partição de fase
    1. Ajustar a concentração de Triton X-114 do sobrenadante obtido a partir da extracção para 2%. Por exemplo, se o volume do sobrenadante for de 900 μL, adicione 9 μL de detergente Triton X-114 para atingir a concentração desejada.
    2. Incubar a mistura a 37 °C durante 1 h e, em seguida, centrifugar a 2000 × g durante 5 min a 30 °C. Essa centrifugação de baixa velocidade pode acelerar a separação de fases.
    3. Deixe a mistura se separar em duas fases distintas: aquosa e detergente. Garanta a centrifugação adequada em baixa velocidade para obter uma separação visível. Se necessário, deixe-o descansar por 1 min antes do isolamento. Se a separação não ocorrer, repita a etapa 3.2.2 conforme necessário.
      NOTA: A separação de fases pode ser observada visualmente, por medições de turbidez usando um espectrofotômetro ou por meio de dispersão de luz estática. Para aumentar a precisão do ensaio de ponto de turvação, adicione um corante hidrofóbico (5-hexadecanoil-aminoeosina) com uma concentração de 500 nM à solução e analise-o com espectroscopia ultravioleta-visível (UV-VIS).
    4. Isole a fase aquosa superior perfurando a interface com uma seringa estéril e transferindo-a para um frasco separado. Isole a fase detergente inferior usando uma micropipeta e armazene-a em um frasco separado.
      NOTA: Manuseie o frasco contendo ambas as fases com cuidado durante o processo de separação. Antes de perfurar o frasco para injetáveis com uma seringa, abra a tampa para evitar a quebra da agulha ou dificuldade em extrair a fase aquosa superior. O uso de uma seringa garante uma medição de volume mais precisa de cada fase após a separação e minimiza a contaminação cruzada de proteínas entre as fases.
    5. Rotular as fases como aquosas (A) e detergentes (D) e armazená-las a -20 °C para uso futuro.

4. Estimativa de proteínas

  1. Avalie as concentrações de proteína de cada fração Triton X-114 (aquosa, detergente e pellet) usando o ensaio bicinchonínico28 ou qualquer outro método adequado.

5. Eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE)

NOTA: As proteínas de cada fração (aquosa, detergente, pellet) devem ser tratadas com beta-mercaptoetanol para reduzi-las e, em seguida, separadas usando 10% de SDS-PAGE (três réplicas biológicas). A receita para o SDS-PAGE de 10% pode ser encontrada na Tabela 1. Para o direcionamento de amostras de proteínas, qualquer análise de atividade enzimática precisa ser feita em uma forma nativa que pode ser resolvida em PAGE nativo.

  1. Ressuspenda a amostra de proteína em acetona gelada usando quatro vezes o volume da amostra. Incubar a mistura a -20 °C durante um mínimo de 2 h e, em seguida, centrifugar a 14.000 × g durante 10 min. Além disso, ressuspenda a fração de pellets em acetona gelada a 80% e incube por 5 min a 4 °C. Centrifugue a 14.000 × g por 10 min para remover o excesso de cristais de sal de ureia.
  2. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e coloque o pellet de proteína em um banho seco até que toda a acetona residual evapore dos frascos.
  3. Incubar as amostras de proteínas em tampão de amostra de 20 μL contendo beta-mercaptoetanol e, em seguida, aquecê-las a 95 °C durante 10 minutos em banho-maria ou banho seco.
    NOTA: Aqui, as amostras de proteína representam a fração aquosa (A) contendo proteínas citoplasmáticas, a fração detergente (D) contendo proteínas da membrana externa e a fração do pellet (P) contendo proteínas da membrana interna.
  4. Carregue as amostras contendo A, D e P em cada poço do gel SDS-PAGE a 10% junto com um marcador de proteína pré-preparado (M) e proteína total (T).
    NOTA: A proteína total pode ser preparada reunindo todas as três frações em um único frasco usando 20 μL de tampão de amostra.
  5. Use 1x tampão de eletrodo no aparelho de eletroforese (Tabela 1). Defina os parâmetros de funcionamento do gel para 6 mA para o gel de empilhamento e 12 mA para o gel de resolução. Execute a eletroforese em RT.
  6. Pinte o gel com Coomassie Brilliant Blue G ou outras manchas de proteína disponíveis no laboratório.

6. Immunoblotting

  1. Após a separação do gel, incubar o gel não corado em tampão de transferência (25 mM de base Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol) durante 5 min.
  2. Incube papéis mata-borrão de tamanho apropriado em tampão de transferência de immunoblot por 5 min e, em seguida, monte-os como a camada inferior do sanduíche.
  3. Utilize membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou membranas de nitrocelulose para transferir proteínas dos géis não corados. Comece imergindo a membrana de PVDF em metanol absoluto por 30 s, seguido por uma imersão de 5 minutos no tampão de transferência de immunoblot. Em seguida, integre-o ao sanduíche de mata-borrão.
  4. Agora, coloque o gel não corado que foi removido do tampão de transferência e use-o no sanduíche de transferência de transferência.
  5. Por fim, cubra o sanduíche colocando-o em outro mata-borrão em cima dele, solte as bolhas de ar presas com um rolo de borrão e execute a transferência usando um método de transferência semi-seco.
    NOTA: Outras abordagens, incluindo transferência seca e úmida, podem ser usadas dependendo das instalações do laboratório.
  6. Mergulhe a membrana em um tampão de bloqueio (8% de leite desnatado em TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) por 2 h, seguido de incubação noturna a 4 ° C com anti-soros monoespecíficos * direcionados à lipoproteína Leptospira LipL41 (1: 5000) ou proteína central de filamento flagelar de 35 kDa (FlaB) (1: 4000) (* anticorpo personalizado). Enxágue a membrana três vezes com TBS-T, permitindo que cada enxágue prossiga por 5 min.
    NOTA: Use qualquer anticorpo de interesse. O fator de diluição dos anticorpos pode variar.
  7. Incubar a membrana com um anticorpo secundário anti-coelho de ratinho conjugado com IgG peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:20000) durante 2 h à RT.
  8. Exponha a membrana ao reagente de eletroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas de proteínas.
  9. Coloque a membrana sob filme de raios-X sensível ao azul dentro de uma sala escura.
    NOTA: Quaisquer outros métodos de desenvolvimento também podem ser utilizados.

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Resultados

Neste experimento, empregamos a espiroqueta Leptospira como organismo modelo para extrair compartimentos subcelulares. Empregamos uma metodologia estratégica ancorada no ponto de turvação e na concentração micelial crítica (CMC), aproveitando a eficácia do Triton X-114, um detergente não iônico (Figura 1). Antes de prosseguir, a estimativa de proteínas foi conduzida para avaliar a concentração em cada fração para uma única réplica biológica. Observou-se uma razão de concentração de ...

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Discussão

As técnicas de fracionamento subcelular desempenham um papel fundamental no isolamento de constituintes celulares discretos para análise subsequente. O Triton X-114, um detergente não iônico, é comumente usado nessas técnicas devido à sua capacidade de particionar amostras em fases distintas, permitindo a separação de vários componentes celulares32. O Triton X-114 tem sido particularmente útil na extração de proteínas de membrana (na forma nativa) de uma variedade...

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Divulgações

Os autores declararam que não têm interesses financeiros conflitantes.

Agradecimentos

Os autores expressam sua sincera gratidão ao Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Nova Delhi, Índia, pelo apoio financeiro fornecido por meio do Grant No. Leptos / 22/2013-ECD-I-2012-2400 e o Departamento de Ciência e Tecnologia, Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Nova Delhi, Índia, por seu apoio financeiro por meio do Grant No. SR/SO/HS/0108/2012 para M.G.M. Além disso, os autores estendem seus agradecimentos ao Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Nova Delhi, Índia, por conceder uma Bolsa de Pesquisa Sênior por meio da Concessão No. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 para HP e AS, respectivamente, e Departamento de Ciência e Tecnologia, Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Nova Delhi, Índia, Grant No. PDF/2017/000343 para S.A.D.C.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acético  Sigma  695092
Acetona    Sigma  32201
Acrilamida    Sigma  A-3553
Persulfato de amônio    Sigma  A-3678
Equilíbrio  SHIMADUZ  Z741079
Bis Acrilamida    Sigma  M7279
Soro bovino albumina fração V (BSA)  Sigma  A-8022
Azul de Bromofenol    Sigma  B-8026
Tubo de centrífuga (50 mL)Tarsons500020
Frasco cônico com tampa (150 mL)Tarsons431030
Centrífuga de resfriamento  Eppendorf  5355316200
Coomassie azul brilhante    Sigma1.12553
Microscópio de campo escuro  ZEISS  GmbH37081
Toalhetes de tarefas delicadasCiência Kimtech34155
Banho seco  Eppendorf  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) médio, Difco  Difco  279410
Bandejas de gel: As bandejas de gel devem ser pelo menos 2cm mais largas em dimensões e ter superfície lisa e plana com tampa.   Hoefer  Não aplicável
Bico de Vidro (150 mL)Tarsons421030
Glicina G8790    Sigma  G-8898
Papel de filtro de mata-borrão ImmobilonMilliporeIBFP0813C
Configuração semi-seca de imunotransferência  ATTA  AE-6675
Incubadora - Para incubar as bandejas de gel por 18 horas a 37 ° C.  EYELA  SLI-700
Fluxo de ar laminar  Não aplicável  Não aplicável
Luminol  Sigma  09253
Cloreto de magnésio M8266  Sigma  M8266
Agitador magnético  TARSONS  6040
Metanol    Sigma  17995-7
Pontas de Micropipeta (10 µ L– 10 mL)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Micropipetas  Eppendorf  EP2231300010
Microtubos (1,5 mL Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini rotação  Genaxy  GEN-MINI-6K
Leitor multimodoBMG LABTECH  S/N 413-3877
Leite desnatado bovinoSigma-AldrichM7409
Ácido P-cumárico    Sigma  C9008
Solução salina tamponada com fosfato    SigmaPág. 4417 
Geladeira  LG  GC-B217BLJ2
Rocker - Agitador oscilante ou rotativo com baixa velocidade para coloração do gel.  TARSONS  4080
SDS-PAGE SETUP- Aparelho de eletroforese  Hoefer, Inc.  SE300-10A-1.0  Modelo de Hoefer ' miniVE' que pode moldar gel de 10 cm x 8 cm de espessura de 1 mm. 
Cloreto de sódio      Sigma  5886
Dodecil sulfato de sódio (SDS)    Sigma  L-4396
TEMED    Sigma  T-9281
Tritão X-114    Sigma648468
Trizma Base (TRIS) T6066    Sigma  T6066
Vórtice  TARSONS  3020

Referências

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  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
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Fracionamento SubcelularExtra o com Triton X 114Prote nas de LeptospiraProte nas da Membrana ExternaProte nas da Membrana InternaSepara o de FasesLocaliza o ProteicaSDS PAGEImmunoblottingEspectrometria de Massa
Enriquecimento de proteínas subcelulares em Leptospira usando uma abordagem de fracionamento baseada em Triton X-114
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