Artigo de método

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

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DOI:

10.3791/67305

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22 de novembro de 2024

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Resumo

A inflamação da córnea, especialmente a inflamação grave da córnea, desempenha um papel significativo no desenvolvimento da disfunção das células-tronco límbicas da córnea. A construção de modelos animais apropriados pode nos ajudar a focar nos efeitos da inflamação grave nas células-tronco límbicas da córnea. Um removedor de ferrugem de 2 mm foi usado para remover o epitélio central da córnea de ratos Sprague Dawley (SD) para criar uma lesão. Em seguida, o estroma central da córnea foi suturado com pontos de náilon para induzir inflamação persistente. Dessa forma, foi construído um modelo de inflamação da córnea com abrasão do epitélio central da córnea e sutura do estroma central, que induziu inflamação corneana grave. Foram observadas as alterações na inflamação da córnea e na condição das células-tronco límbicas em 1, 3 e 7 dias após a modelagem. No3º dia após a modelagem, o limbo corneano dos ratos estava severamente edemaciado, com evidente neovascularização e hiperplasia local, sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas. No7º dia, o edema da córnea piorou gradativamente e a neovascularização continuou a aumentar. Por meio da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e coloração por imunofluorescência, descobrimos que os fatores inflamatórios epiteliais da córnea foram significativamente regulados positivamente, a diferenciação epitelial da córnea foi anormal, as células-tronco epiteliais da córnea foram significativamente reduzidas e a proliferação celular e a estaminalidade também diminuíram. Portanto, este modelo demonstra que a inflamação grave pode induzir danos às células-tronco límbicas sem danificar diretamente as células-tronco límbicas. O modelo é benéfico para observar os efeitos da inflamação grave nos mecanismos biológicos das células-tronco e fornece uma plataforma ideal para estudar os mecanismos da disfunção das células-tronco epiteliais da córnea induzida pela inflamação.

Introdução

A disfunção das células-tronco límbicas (LSCD) é caracterizada por defeitos epiteliais persistentes, vascularização da córnea, inflamação crônica, cicatrização e conjuntivalização da córnea 1,2. Pode surgir da depleção ou disfunção das células-tronco límbicas após doenças graves da superfície ocular, como queimaduras químicas, queimaduras térmicas, síndrome de Stevens-Johnson e lesão iatrogênica causada por cirurgias oculares 2,3,4. Os mecanismos patogênicos do LSCD envolvem principalmente alterações nas células-tronco e distúrbios no microambiente das células-tronco 5,6, o que afeta a homeostase do epitélio da córnea 2,7. Existem dois tipos principais de mudanças de destino nas células-tronco límbicas no LSCD: 1) O potencial de diferenciação direcional das células-tronco epiteliais da córnea torna-se anormal, levando à sua diferenciação em células epiteliais da pele. Isso é evidenciado por uma diminuição na expressão do fator de transcrição específico das células epiteliais da córnea Pax6 e das queratinas específicas da córnea Krt12 e Krt3, juntamente com um aumento significativo na expressão dos marcadores de metaplasia epitelial escamosa relacionados à pele Krt10, Krt1 e Sprr1b8; 2) A lesão da superfície ocular destrói diretamente as células-tronco límbicas da córnea, resultando em necrose ou apoptose e, posteriormente, causando proliferação do tecido conjuntival que cobre a córnea9. Foi relatado que, durante o desenvolvimento do LSCD, as células inflamatórias, como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas, aumentam significativamente no microambiente de células-tronco epiteliais da córnea. Da mesma forma, citocinas como interferon-gama (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e proteínas inflamatórias de macrófagos (MIP)-1α/β também apresentam elevações significativas10.

Vários modelos de LSCD foram estabelecidos, incluindo aqueles induzidos por suturas, lesões químicas e manchas de cloreto de benzalcônio11. Cada um desses modelos tem suas vantagens e desvantagens. Lesões químicas podem danificar toda a superfície ocular e destruir diretamente as células-tronco límbicas12. O cloreto de benzalcônio funciona de forma semelhante às lesões químicas, mas tem um efeito relativamente lento13. O modelo de sutura da córnea pode induzir uma resposta inflamatória estável e de longo prazo, mas a reação inflamatória é relativamente leve e não pode causar LSCD.

Para investigar o papel e os mecanismos da inflamação no desenvolvimento do LSCD da córnea, foi estabelecido um modelo animal que combina curetagem do epitélio central da córnea com suturas da córnea. Este modelo induz inflamação persistente do epitélio da córnea sem danificar diretamente as células-tronco límbicas.

Protocolo

Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes da ARVO para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Guizhou (Aprovação nº 2305192). Os ratos foram alojados no Centro Animal da Universidade Médica de Guizhou, aderindo aos regulamentos relevantes de manejo animal.

1. Seleção de animais

  1. Use ratos Sprague-Dawley (SD) fêmeas com idade entre 7 e 8 semanas. Certifique-se de que não haja lesões na superfície ocular sob o exame com lâmpada de fenda.
  2. Esterilize os instrumentos usando um esterilizador rápido. Os instrumentos necessários incluem removedor de anel de ferrugem da córnea, marcador de amostragem de pele de tamanho de 2 mm, porta-agulhas, facas de camada de placa, tesoura cirúrgica oftálmica e fórceps.
  3. Anestesiar ratos com tribromoetanol a 1,25% por injeção intraperitoneal na dose de 0,3 mL por 100 g de peso corporal. Avalie a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé. Instilar uma gota de colírio de tropicamida para dilatação da pupila. Aplique colírio de cloridrato de bupivacaína no olho. Use pomada lubrificante ocular no olho contralateral para manter a umidade.
  4. Desinfete a pele e o cabelo ao redor dos olhos com iodóforo.
  5. Estabeleça o modelo de inflamação.
    1. Coloque o rato em decúbito lateral. Exponha o globo ocular sob um microscópio cirúrgico.
    2. A córnea central foi marcada usando um marcador de amostragem de pele de tamanho de 2 mm, e o epitélio corneano central marcado foi raspado usando um removedor de anel de ferrugem da córnea.
    3. Colocar três suturas corneanas de 120° com fio de náilon 10-0, porta-agulha e tesoura cirúrgica oftálmica e pinça a cerca de 3 mm do limbo, não penetrar na córnea14,15.
  6. Aplique pomada ocular Ofloxacina no final do procedimento para prevenir infecções.
  7. Observe e fotografe a córnea no1º, 3º e7º dia de pós-operatório usando uma lente ampliada de 10x com lâmpada de fenda. Registre os sintomas como cicatrização epitelial da córnea, hiperemia conjuntival, edema da córnea, hiperemia límbica e neovascularização da córnea.

2. Cálculo do índice inflamatório

  1. Calcule o índice inflamatório da superfície ocular após estabelecer o modelo animal.
    1. Pontue a congestão do corpo ciliar da seguinte forma: sem congestão (0 pontos); a presença de congestão inferior a 1 mm (1 ponto); hiperemia entre 1 mm e 2 mm (2 pontos); hiperemia entre 1 mm e 2 mm (3 pontos).
    2. Pontue o edema central da córnea da seguinte forma: sem edema (0 pontos); edema com visibilidade clara da íris (1 ponto); edema com visibilidade incerta da íris (2 pontos); edema com a íris não visível (3 pontos).
    3. Pontue o edema de córnea paracentral da seguinte forma: sem edema (0 pontos); edema com visibilidade clara da íris (1 ponto); edema com visibilidade incerta da íris (2 pontos); edema com a íris não visível (3 pontos).
    4. Calcule o índice de inflamação somando todas as pontuações e dividindo-o por 9.

3. Avaliação da neovascularização da córnea

  1. Observe a neovascularização da córnea com uma lâmpada de fenda.
    1. Analise e processe imagens usando o software de processamento de imagem de lâmpada de fenda16.
    2. Registre o crescimento da neovascularização da córnea em cada ponto de observação, medindo a neovascularização da córnea mais longa em direção à córnea central com curvatura mínima.
    3. Classifique-os da seguinte forma: Grau 0: Avascular; Grau 1: Micro (<1 mm); Grau 2: Leve (1 mm a 1,5 mm); Grau 3: Moderado (>1,5 mm a 2 mm); Grau 4: Grave (>2 mm).

4. Analisando a biologia do modelo

  1. Prepare amostras de olhos congelados.
    1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4-5% e sacrificá-lo por luxação cervical.
    2. Na posição de decúbito lateral, levante o globo ocular do rato para fora com uma micropinça e corte a conjuntiva aberta ao longo da cúpula do olho superior e inferior com uma tesoura para os olhos.
    3. Corte o nervo óptico, prestando atenção em manter a integridade do epitélio da córnea.
    4. Seque as manchas de sangue e água na superfície do globo ocular com papel de filtro e coloque-as na caixa de incorporação com meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT).
    5. Remova as bolhas da caixa de embutir com uma pipeta de 200 μL, congele-a com nitrogênio líquido e guarde as amostras embutidas no refrigerador de temperatura ultrabaixa.
  2. Prepare seções congeladas dos globos oculares.
    1. Antes de preparar a secção congelada, pré-arrefecer o criostato a cerca de -28 °C e o suporte da amostra a -26 °C.
    2. Retire as amostras congeladas do congelador frio e coloque-as no criótomo durante cerca de 1 h.
    3. Pré-resfrie a amostra congelada em um criótomo por 10 min. Marque a amostra com um lápis, fixe-a na almofada da amostra com OCT e fixe-a na grelha de corte após o resfriamento.
    4. Ajuste a posição e a direção da amostra congelada e fixe-a. Primeiro, corte cortes de 20 μm até que a córnea central seja vista. Em seguida, obter cortes de 6 μm por corte contínuo e coletar os cortes nas lâminas de adesão pré-preparadas.
    5. Marque o nome, material, tempo de corte, nome e número do tecido na lâmina. Coloque-o em temperatura ambiente (RT) por cerca de 30 min.
    6. Depois de secar as seções, coloque-as em uma caixa e guarde-as na geladeira de temperatura ultrabaixa para reserva.
  3. Realize a coloração de hematoxilina e eosina.
    1. Retire as secções congeladas pré-preparadas do frigorífico de temperatura ultrabaixa e coloque-as na hotte à temperatura alta para secar.
    2. Fixe as seções usando paraformaldeído a 4% por 15 min em RT. Enxágue as amostras com 1x PBS por 5 min.
    3. Coloque as seções de amostra contendo lâminas em um suporte de lâminas e mergulhe-as no cilindro de corante com solução de corante de hematoxilina em RT por 5 min.
    4. Enxágue lentamente a amostra contendo lâminas com água da torneira para lavar o corante flutuante, coloque-as no tanque de corante com álcool de ácido clorídrico a 0,1% e remova-as rapidamente após 1-2 s.
    5. Enxágue lentamente a amostra com água da torneira por 15 min.
    6. Remova a amostra da água e mergulhe as lâminas no tanque de corante de eosina; deixe no RT por 3 min.
    7. Enxágue lentamente a amostra com água da torneira, lave o excesso de corante e execute a desidratação com álcool gradiente usando álcool 75%, álcool 80%, álcool 95%, álcool 100% (um) e álcool 100% (dois). Aplique as seções em cada concentração por 2 min.
    8. Tornar as amostras transparentes durante 2 min em xileno (1) e xileno (2), respectivamente.
    9. Seque a amostra na hotte, sele as secções com um agente de vedação e tenha cuidado para não produzir bolhas.
    10. Coloque as lâminas em uma caixa de lâminas no RT. Imagem das seções usando um microscópio.
  4. Realize a coloração por imunofluorescência.
    1. Retirar as secções congeladas e colocá-las numa caixa à RT na hotte para secar.
    2. Marque o nome do anticorpo a ser corado no branco da lâmina de vidro da amostra congelada.
    3. Fixe os espécimes com paraformaldeído a 4% em RT por 15 min. Uma pequena quantidade de água da torneira foi adicionada à caixa para evitar que a amostra seque.
    4. Remova o fixador de paraformaldeído e lave a amostra três vezes com 1x tampão PBS. Tenha cuidado para não lavar a amostra.
    5. Seque o líquido ao redor da seção de tecido, cubra a amostra com solução de membrana celular (0,2% TritonX-100) e incube em RT por 20 min.
    6. Remova a solução de membrana celular e lave as seções três vezes por 5 min cada com 1x tampão PBS.
    7. Seque as seções de tecido, cubra a amostra com solução de bloqueio de imunofluorescência (2% BSA) e incube em RT por 1 h.
    8. Prepare o anticorpo primário e o diluente (1% BSA) durante a incubação de acordo com as instruções do fabricante.
    9. Remova o fluido de bloqueio e seque a amostra com uma bomba de sucção. Adicione o anticorpo primário preparado, tampe a caixa e incube-o em uma geladeira a 4 ° C durante a noite (incube por cerca de 12-16 h) longe da luz.
    10. Descarte o anticorpo primário e lave a amostra quatro vezes por 10 minutos cada em PBS.
    11. Durante a etapa de limpeza, prepare a diluição do anticorpo secundário de acordo com as instruções do fabricante.
    12. Remova o PBS, seque a amostra e adicione o anticorpo secundário preparado à amostra. Cobrir o provete e incubar em RT durante 1 h de distância da luz.
    13. Remova o anticorpo secundário, lave a amostra 4 vezes com 1x tampão PBS por 10 min cada e cubra toda a lâmina com 1x tampão PBS.
    14. Remova o PBS, seque a amostra e sele as seções com um meio de montagem contendo DAPI, garantindo que não haja bolhas de ar. Embrulhe as lâminas em papel alumínio e mantenha-as a 4 °C longe da luz.
    15. Tire fotos com um sistema de microscópio confocal a laser ou com um sistema de câmera de microscópio de fluorescência vertical (velocidade de digitalização: 4 μs/pixel, resolução de digitalização: 1024 x 1024).
  5. Preparação de suspensão unicelular do epitélio da córnea de rato
    1. Após a eutanásia, retirar os globos oculares com uma pinça embebida em álcool 75% e colocá-los na solução salina balanceada 1x Hanks (HBSS) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de penicilina-estreptomicina preparada previamente.
    2. Limpe os globos oculares e use 1x HBBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina duas vezes por 5 minutos cada.
    3. Remova a conjuntiva ao longo da margem escleral; deixar a margem escleral em cerca de 1 mm. Novamente, lave o tecido da córnea duas vezes com 1x HBBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina.
    4. Transfira o tecido limpo da córnea para um meio epidérmico hormonal suplementado (SHEM) contendo 2U / mL de Dispase II. Feche a vedação e coloque-a a 4°C por 14-16 h.
    5. Tenha uma pinça, uma pinça desdentada, um dispositivo de recuperação de íris e um esterilizador cirúrgico prontos.
    6. Sob um microscópio cirúrgico, separe suavemente o epitélio da córnea ao longo da borda da córnea.
    7. Lave o epitélio da córnea com 1x HBSS contendo 10% de penicilina-estreptomicina por 5 min.
    8. Transfira o tecido epitelial da córnea para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 200 mL de tripsina e incube em uma incubadora de CO2, 37 ° C a 5%. A cada 5 minutos, agite o tubo de centrífuga três vezes para digerir a folha epitelial da córnea em uma suspensão de célula única.
    9. Adicione uma quantidade igual de meio SHEM para interromper a ação da solução de digestão de tripsina e coloque-o em RT.
  6. Cultura de clones de células epiteliais da córnea
    1. Prepare as células trofoblásticas.
      1. Quando a densidade de crescimento das células de camundongo NIH 3T3 atingir 80-90%, descarte o meio de cultura celular. Adicione 10 mg / mL de meio de cultura de mitomicina NIH 3T3 pré-preparado e incube a 37 ° C por 2,5 h.
      2. Remova o meio, enxágue as células com 1x HBSS, substitua por um novo meio celular NIH 3T3 e continue a incubação em uma incubadora de CO2 (5% CO2, 37 ° C).
    2. Preparar a suspensão de células epiteliais da córnea e contar as células de acordo com a proporção necessária.
    3. Ao preparar a suspensão de células epiteliais da córnea, processe as células NIH 3T3 tratadas com mitomicina.
      1. Descarte o sobrenadante, enxágue as células com 1x HBSS, adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA e incube em RT por 2-3 min.
      2. Adicione uma quantidade igual de meio epitelial hormonal suplementar (meio SHEM: DMEM/F12, fator de crescimento epidérmico de camundongo 10 ng/mL [EGF], 10 μg/mL de insulina-transferrina-selênio [ITS], 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 0,5% de dimetilsulfóxido [DMSO], 0,5 mg/mL de hidrocortisona), pipete suavemente para fazer uma suspensão celular e conte as células.
    4. Use uma placa de 12 poços e adicione 0,5 mL de meio SHEM a cada poço.
    5. Misture as células epiteliais da córnea com células NIH 3T3 a uma densidade de 500 células epiteliais da córnea / cm2 e 5 x 105 células NIH 3T3 / cm2. Adicione 1 mL de meio SHEM a cada poço.
    6. Adicione 1 mL da mistura de células a cada poço e pipete suavemente para distribuir as células uniformemente.
    7. Incubar em incubadora (5% CO2, 37 °C), trocando o meio a cada 2-3 dias. Cultura por 12-14 dias.
  7. Coloração violeta de cristal
    1. Após aproximadamente 12 dias, quando os clones epiteliais da córnea estão prestes a se fundir, remova o meio de cultura e adicione 1 mL de solução de paraformaldeído a 4% em cada poço, cobrindo completamente as células. Fixe as células por 15 min em RT.
    2. Remova o paraformaldeído a 4% e lave os poços três vezes com 1x PBS por 5 min cada.
    3. Remova 1x tampão PBS e adicione solução de corante violeta a 0,4% a cada poço. Manchar por 30 min no RT.
    4. Remova ou recicle a solução de corante violeta cristal e lave-a três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
    5. Seque os poços ao ar em RT até que estejam completamente secos.
    6. Use um sistema de fotografia de microscópio vertical regular (velocidade de varredura: 4 μs/pixel, resolução de varredura: 1024 x 1024).
  8. Extração de mRNA da córnea
    1. Reúna tesouras oftálmicas, tesouras de córnea, pinças dentadas, raspador epitelial elétrico da córnea, Trizol, tubos de centrífuga de 1,5 mL sem RNase e uma caixa de gelo.
    2. Aquisição epitelial
      1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4-5% e sacrificá-lo após luxação cervical. Coloque o animal em posição lateral. Apare os bigodes do rato com uma tesoura para os olhos para evitar bloquear a visão.
      2. Coloque o rato sob um microscópio cirúrgico e ajuste-o a uma altura apropriada para focar no globo ocular. Use uma pinça dentada para empurrar e expor suavemente o globo ocular. Levante a conjuntiva do rato e use um raspador epitelial da córnea elétrico limpo para raspar a área central de 2 mm do epitélio da córnea.
      3. Colete o epitélio da córnea raspado com pinças dentadas limpas e borrifadas com álcool. Coloque o tecido coletado em um tubo de centrífuga contendo 1 mL de Trizol.
      4. Trabalhe o mais rápido possível para enxaguar o tecido coletado em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo água duplamente deionizada. Absorva o excesso de água com papel de filtro. Pulverize com álcool 75% e prossiga para a próxima etapa.
      5. Levante a conjuntiva do rato novamente usando uma pinça dentada. Use uma tesoura de córnea com o lado côncavo para cima para cortar a conjuntiva ao longo do limbo, deixando cerca de 0,5 mm de conjuntiva branca.
      6. Raspe o epitélio da córnea dentro de uma faixa de 2 mm no limbo da córnea usando o raspador elétrico. Colete o tecido conforme descrito anteriormente. Colete o epitélio central da córnea de três globos oculares e o epitélio límbico de três globos oculares.
      7. Coloque os tecidos coletados em tubos separados de 1 mL de reagente de extração de RNA Trizol. Realize toda a operação no gelo para preservar a integridade do RNA. Prossiga com as próximas etapas imediatamente ou armazene as amostras em um freezer de temperatura ultrabaixa a -80 °C para uso posterior.
    3. Descongele a amostra no gelo, use um homogeneizador de tecido ultrassônico para lisar as células. Defina a potência do homogeneizador ultrassônico para 25%, o tempo para 2 s por rajada, o tempo de intervalo para 5 s e o tempo total para 2 min. Deixe repousar no gelo por 10 min.
    4. Adicionar clorofórmio (1/5 do volume total, cerca de 200 μl) a cada amostra, misturar bem invertendo durante 30 segundos e centrifugar a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C.
    5. Precipitação de RNA
      1. Após a centrifugação, o líquido dentro do tubo da centrífuga é dividido em três partes. A camada superior clara é o RNA, a camada branca turva do meio é o DNA e as proteínas e a camada inferior é o Trizol. Pipetar cuidadosamente cerca de 500 μL da camada transparente superior para um novo tubo de centrifugação de 1,5 ml, com cuidado para não aspirar o precipitado branco na camada intermédia. Se aspirado inadvertidamente, repita a centrifugação para coletar a camada transparente novamente.
      2. Adicione uma quantidade igual de isopropanol pré-resfriado ao tubo de centrífuga contendo a camada transparente, aproximadamente 500 μL, inverta o tubo várias vezes para misturar bem e, em seguida, coloque-o imediatamente em um freezer de temperatura ultrabaixa a -80 °C por 20-30 min. Esta etapa visa acelerar a precipitação de RNA.
    6. Retirar a amostra e centrifugar imediatamente a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Uma pequena quantidade de precipitado branco e escamoso é vista na parte inferior do tubo da centrífuga; descarte o sobrenadante.
    7. Adicione etanol 70% pré-preparado e resfriado com gelo a cada tubo. Centrifugar imediatamente a 4 °C numa centrifugadora refrigerada a 400 x g durante cerca de 10 min; Repita as etapas acima uma vez para lavar bem o precipitado. Nesta etapa, pré-esterilize a hotte com luz UV por 15 min.
    8. Depois de remover os tubos da centrífuga e descartar o sobrenadante, centrifugue novamente a 4 °C a aproximadamente 250 x g por 2 min. Use uma ponta de pipeta de 200 μL para aspirar cuidadosamente o excesso de álcool do lado oposto ao precipitado, secando o mais completamente possível. Coloque em uma hotte pré-esterilizada por UV para secar, seque o precipitado ao ar por cerca de 15 min.
    9. Prepare a solução adicionando 1 mL de inibidor de RNase a 40 mL de água de dietilpirocarbonato (DEPC). Adicione uma quantidade adequada de mistura de água / inibidor de RNase DEPC, cerca de 20-30 μL, para dissolver a amostra. Se houver muito precipitado, adicione 30-50 μL. Proceda imediatamente com a PCR de transcrição reversa.
  9. PCR de transcrição reversa
    1. Certifique-se de que estes itens estejam presentes: máquina de PCR, tubos de centrífuga de 1.5 mL sem RNase, tubos de PCR de 0.2 mL, banho de gelo ou caixa de gelo, pipeta e pontas sem RNase.
    2. Medir a concentração de RNA utilizando o espectrofotómetro de microvolume. Para cada amostra, certifique-se de que 1 μg de RNA seja adicionado ao sistema de reação.
    3. O sistema de transcrição reversa tem um volume total de 20 μL. Calcule a quantidade total de reagentes necessários com base no número de amostras. Misture de acordo com a proporção especificada nas instruções.
    4. Prepare o sistema de reação no gelo, vórtice-o e centrifugue-o brevemente. Incubar a 42 °C durante 15 min e a 90 °C durante 30 s.
    5. Use o cDNA obtido do processo de transcrição reversa diretamente para análise de PCR quantitativa em tempo real ou armazene em uma geladeira a -80 °C.
  10. Reação de PCR quantitativa em tempo real
    1. Use um kit de reagentes de PCR quantitativo em tempo real17 com um sistema de reação de 10 μL. Use as sequências de primer mostradas na Tabela 1.
    2. Adicione o sistema de reação descrito acima em uma placa de 96 poços ou em um tubo de oito tiras especificamente para RT-PCR. Certifique-se de que as amostras estejam bem misturadas. Verifique se há bolhas nos tubos antes de colocá-los na máquina de PCR.
    3. Amplificar o gene utilizando o ciclo de PCR (95 °C durante 5 min), 40 ciclos (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s) e completar os dados para calcular o valor de 2-ΔΔ Ct. Processe, analise e plote os dados usando o software de análise de dados apropriado.

Resultados

Conforme mostrado na Figura 1A, por meio da observação com uma lâmpada de fenda, verificamos que a cicatrização do epitélio da córnea estava prejudicada. Em circunstâncias normais, o epitélio central da córnea cicatrizaria completamente dentro de 24-48 horas após a remoção, mas na excisão do epitélio central da córnea combinada com um modelo de sutura, novos vasos sanguíneos continuaram a existir. No terceiro dia após o estabelecimento do modelo, foram observados edema límbico corneano significativo e neovascularização, com sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas da córnea aparecendo localmente. Com o tempo, no7º dia, a cura ainda não estava completa. O índice de inflamação da córnea foi avaliado por meio de congestão ciliar, edema paracentral da córnea e edema central da córnea. O edema da córnea piorou gradualmente e a inflamação da córnea (Figura 1A) continuou a piorar. Além disso, a neovascularização da córnea é um indicador de inflamação. Com a progressão da inflamação, a neovascularização da córnea (Figura 1B) e o índice de inflamação (Figura 1C) apresentaram aumento contínuo.

Realizamos crioembedding nos tecidos oculares 7 dias após a criação do modelo. A coloração de hematoxilina e eosina (Figura 2A) mostrou espessamento do epitélio no limbo e córnea central, com o arranjo epitelial perdendo sua morfologia normal, indicando hiperplasia atípica. O estroma corneano apresentava-se edemaciado, com infiltração significativa de células inflamatórias. Usando a coloração de imunofluorescência PMN e ED1 (Figura 2B), foi observado um aumento acentuado na infiltração de neutrófilos e macrófagos. O estudo avaliou fatores inflamatórios usando IL-1β (Figura 2C) e MIP-1α (Figura 2D), descobrindo que a IL-1β atingiu o pico no dia 3 e diminuiu gradualmente a partir de então, enquanto a MIP-1α aumentou continuamente ao longo do tempo.

A inflamação crônica geralmente leva a uma série de deficiências de células-tronco límbicas, como regulação negativa de Pax6, expressão reduzida de Krt12 e metaplasia escamosa do epitélio da córnea. Para verificar se o modelo desenvolvido neste estudo poderia induzir essas alterações no fenótipo epitelial da córnea, foi realizada a coloração por imunofluorescência para Krt12 (Figura 3A) e Pax6 (Figura 3B) no epitélio da córnea. A expressão de Krt12 diminuiu com a inflamação prolongada, com apenas células positivas para Krt12 observadas no dia 7, e a expressão de Pax6 foi significativamente reduzida no epitélio da córnea. No nível de mRNA, os níveis de expressão dos marcadores epiteliais normais da córnea Krt12 ( Figura 3C ) e Pax6 ( Figura 3D ) foram significativamente reduzidos no dia 7. No entanto, os níveis de expressão dos marcadores de metaplasia escamosa Krt10 ( Figura 3E ) e Sprr1b ( Figura 3F ) foram significativamente aumentados no dia 7.

Usamos o marcador de proliferação Ki67 para corar o epitélio da córnea, e os resultados mostraram uma diminuição significativa no número de células epiteliais da córnea positivas para Ki67 no dia 7 (Figura 4A). O status das células-tronco epiteliais da córnea foi avaliado usando o marcador específico de células-tronco límbicas da córnea ABCG2 (Figura 4B) e o marcador de células progenitoras epiteliais P63 (Figura 4C). Os níveis de ABCG2 e P63 foram significativamente menores do que os do grupo normal. Além disso, empregamos o padrão-ouro para células-tronco, o método de cultura clonal, para avaliar as alterações nas células-tronco límbicas da córnea durante esse processo. Observamos que a taxa de formação clonal de células-tronco límbicas da córnea (Figura 4D) diminuiu no dia 3 e diminuiu significativamente no dia 7, com a área média dos clones se tornando menor e apenas alguns holoclones visíveis no dia 7. A eficiência de formação de colônias (CFE) foi obtida pela contagem dos clones celulares visíveis no campo microscópico da placa de cultura. O CFE (Figura 4E) indicou uma redução gradual no número de células-tronco límbicas da córnea sob condições inflamatórias. Isso sugere que a inflamação grave neste modelo leva ao esgotamento das células-tronco epiteliais límbicas da córnea, e esse processo não induz uma transformação fenotípica das células-tronco límbicas da córnea, mas apresenta problemas de diferenciação ou auto-renovação.

O modelo de inflamação usado neste estudo resultou em alterações corneanas características do LSCD, incluindo infiltração extensa de células inflamatórias na córnea, displasia do epitélio da córnea e expressão interrompida ou reduzida de Pax6 e Krt12 no fenótipo epitelial normal da córnea. Além disso, houve um aumento significativo na expressão de mRNA de Krt10. Em resumo, este modelo experimental é adequado para estudar a diferenciação anormal de células-tronco epiteliais da córnea induzida por inflamação.

figure-results-1
Figura 1: Estabelecimento do modelo de inflamação. Para estudar os efeitos da inflamação grave nas células-tronco epiteliais da córnea, foi estabelecido um modelo de inflamação grave. (A) Após a indução do modelo, a córnea foi observada usando fotografia com lâmpada de fenda. Três dias após a modelagem, o limbo corneano do rato estava severamente edemaciado, com neovascularização óbvia e hiperplasia localizada, que são sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas da córnea. No sétimo dia, o edema da córnea piorou gradualmente e a neovascularização continuou a crescer. Com a progressão da inflamação, (B) neovascularização da córnea e (C) índice de inflamação apresentaram aumento contínuo. *p < 0,05, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: A resposta inflamatória após a modelagem. A resposta inflamatória induzida pelo modelo na córnea foi avaliada. (A) A coloração de hematoxilina e eosina do globo ocular mostrou que, durante o processo inflamatório, tanto o epitélio límbico quanto o central da córnea espessaram, e o arranjo epitelial da córnea perdeu sua morfologia normal, exibindo sinais de hiperplasia atípica. (B) O marcador de macrófagos ED1 (verde) e o marcador de neutrófilos PMN (vermelho) foram significativamente aumentados. A RT-qPCR mostrou uma elevação significativa dos fatores inflamatórios epiteliais da córnea (C) IL-1β e (D) MIP-1α. Azul representa coloração nuclear com DAPI, barra de escala = 50 μm; p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Alterações fenotípicas das células sob condições inflamatórias. Imunomarcação para (A, vermelho) KRT12 no epitélio límbico e (B) PAX6. (C) Os níveis de expressão de mRNA de KRT12 mostram uma redução significativa à medida que a inflamação progride. (D) A expressão do mRNA de PAX6 revela uma distribuição anormal e uma diminuição acentuada do epitélio límbico sob condições inflamatórias. Por outro lado, a expressão de mRNA de (E) Krt10 e o marcador epitelial da córnea anormalmente diferenciado (F) Sprr1b aumentam significativamente durante a inflamação. Azul representa coloração nuclear com DAPI, barra de escala = 50 μm; **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Alterações das células-tronco límbicas sob um estado inflamatório. Imagens de imunofluorescência de (A, vermelho) Ki67 ilustram alterações nas células em proliferação após a indução da inflamação. A expressão de mRNA do marcador de células-tronco (B) ABCG2 é significativamente reduzida. O marcador de células progenitoras (C) p63 também é expresso. (D) Imagens de coloração violeta cristalina e (E) CFE mostram uma diminuição no número de células-tronco límbicas em condições inflamatórias. Azul indica núcleos corados com DAPI; a barra de escala é de 50 μm; *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do primerSequência de primer
TNF-aEncaminhar5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'
Inverter5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'
IL-1βEncaminhar5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'
Inverter5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'
Pax6Encaminhar5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'
Inverter5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'
Trt 12Encaminhar5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'
Inverter5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'
Krt10Encaminhar5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'
Inverter5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'
Sprr1bEncaminhar5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'
Inverter5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'
ActinaEncaminhar5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'
Inverter5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'

Tabela 1: Sequência dos primers usados para RT-PCR quantitativo.

Discussão

A inflamação desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da deficiência de células-tronco límbicas18, mas seus mecanismos e efeitos específicos requerem mais exploração. Para resolver esse problema, induzimos LSCD raspando o epitélio central da córnea e suturando o estroma central da córnea para causar inflamação grave da córnea. Observamos a evolução da inflamação da córnea e o estado das células-tronco límbicas nos dias 1, 3 e 7 pós-modelagem. No terceiro dia pós-modelagem, foram observados edema significativo do limbo do rato, neovascularização acentuada e aumento da proliferação tecidual local, características típicas da deficiência de células-tronco límbicas. No dia 7, o edema da córnea se intensificou ainda mais e o número de novos vasos sanguíneos continuou a aumentar. Por meio de técnicas de coloração por RT-qPCR e imunofluorescência, observamos que no dia 7 pós-modelagem, os níveis de expressão do marcador de macrófagos ED1, marcador de neutrófilos PMN e fatores inflamatórios epiteliais centrais da córnea MIP-1α e IL-1β estavam significativamente elevados. Durante a progressão da inflamação, a imagem de imunocoloração e os níveis de expressão de mRNA relacionados do fator de transcrição específico das células epiteliais da córnea Pax6 e da queratina específica da córnea Krt12 foram significativamente reduzidos. A expressão de mRNA do marcador de metaplasia epitelial escamosa relacionada à pele Krt10 e do marcador epitelial da córnea Sprr1b aumentou durante a progressão da inflamação, indicando diferenciação anormal. A expressão de mRNA do marcador de células-tronco ABCG2 diminuiu significativamente. O marcador de células precursoras p63 também foi expresso. Imagens de coloração violeta de cristal e CFE mostraram que, sob condições inflamatórias, o número de células-tronco límbicas diminuiu. Uma análise abrangente indicou que, sete dias após a modelagem, os fatores inflamatórios no epitélio da córnea aumentaram significativamente, a diferenciação do epitélio da córnea foi anormal, o número de células-tronco epiteliais da córnea diminuiu significativamente e a capacidade de proliferação celular e as características das células-tronco diminuíram.

Este modelo induz a inflamação da córnea sem danificar diretamente as células-tronco epiteliais límbicas, promovendo assim a pesquisa sobre os efeitos e mecanismos da inflamação da córnea nas células-tronco epiteliais límbicas. Nos tecidos epiteliais, incluindo o epitélio da córnea, a reprogramação das células-tronco se manifesta como transdiferenciação epitelial. Esse processo está intimamente relacionado à inflamação e é caracterizado pela diferenciação anormal induzida por várias citocinas, fatores de crescimento e outros fatores solúveis no microambiente 19,20,21,22. Em um estado inflamatório, especialmente em estados inflamatórios persistentes de longo prazo, como a síndrome do olho seco e outras doenças da superfície ocular 23,24,26, o epitélio da córnea pode ser reprogramado em epitélio cutâneo, uma condição conhecida como metaplasia escamosa. Essa transição envolve o enfraquecimento ou perda dos marcadores epiteliais específicos da córnea Krt12, que são substituídos pelos marcadores específicos da pele Krt10 e Sprr1b27,28. O modelo descrito neste protocolo exibe fenômenos semelhantes. Inicialmente, as células-tronco límbicas são ativadas e, em seguida, sob inflamação sustentada, ocorre a metaplasia escamosa epitelial da córnea. Observamos células epiteliais escamosas típicas no epitélio da córnea, caracterizadas pela redução da expressão de Krt12 e Pax6 e aumento da expressão de Krt10 e Sprr1b (marcadores de metaplasia escamosa). A inflamação precoce aumentou a proliferação do epitélio da córnea, enquanto os estágios posteriores viram um declínio na proliferação. Consistente com o que encontramos em nossos estudos sobre LSCD causada pela síndrome de Stevens-Johnson ou aniridia congênita, os marcadores de células-tronco límbicas ABCG2 e o padrão-ouro para avaliação de células-tronco, a eficiência de formação de colônias, foram significativamente reduzidos. No entanto, as células clonais mantiveram a capacidade de se diferenciar em células epiteliais maduras da córnea. Em estudos anteriores, a metaplasia escamosa do epitélio da córnea foi observada em culturas de interface ar-líquido, mas as células-tronco epiteliais da córnea ainda exibiam o potencial de se diferenciar em um fenótipo epitelial da córnea normal e aumentar a capacidade proliferativa. Isso é muito semelhante à nossa pesquisa atual29.

Portanto, o modelo de pesquisa desenvolvido neste protocolo confirma que a inflamação grave pode levar a danos às células-tronco límbicas sem danificar diretamente o nicho das células-tronco límbicas. Essa descoberta é muito benéfica para observar os efeitos da inflamação grave nos mecanismos biológicos das células-tronco límbicas e fornece uma plataforma experimental ideal para estudar os mecanismos do LSCD causado pela inflamação da córnea.

No entanto, este modelo tem suas limitações. Ratos anestesiados são submetidos à raspagem mecânica do epitélio corneano seguida de sutura corneana, ambos procedimentos invasivos com alto risco de infecção intra e pós-operatória30. Além disso, a espessura da córnea do rato a torna propensa a perfurações durante a sutura, exigindo alta proficiência do operador.

Portanto, devemos prestar atenção aos seguintes pontos durante o procedimento: (i) limpeza e desinfecção: Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da cirurgia. O colírio antibiótico deve ser administrado no dia anterior e no dia do procedimento para reduzir o risco de infecção. Como a sutura da córnea é um corpo estranho que pode causar inflamação e infecção, deve-se seguir uma técnica asséptica rigorosa e o colírio antibiótico deve ser continuado por três dias no pós-operatório. (ii) Manuseio da córnea do rato: A córnea do rato é relativamente fina e propensa a perfurações durante a sutura. Use uma pinça dentada para segurar a conjuntiva no lado oposto do local da sutura para estabilizar o globo ocular e facilitar a operação. Coloque a sutura a aproximadamente 1,5-2 mm do limbo da córnea, onde a córnea é mais espessa e menos propensa a perfurações, evitando danos às células-tronco límbicas. (iii) Remoção do epitélio da córnea: A trefina da córnea e o raspador epitelial da córnea podem remover rapidamente o epitélio da córnea e são fáceis de operar, mas são bastante afiados e podem danificar o estroma ou causar perfuração. Controle a intensidade da força durante a remoção para evitar perfuração. Para garantir a uniformidade na área de remoção, use um marcador circular para marcar a área antes de remover o epitélio da córnea.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado em parte pelos Projetos Provinciais de Ciência e Tecnologia de Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fundo Científico da Província de Fujian para Jovens Acadêmicos Distintos (2023J06053 [para S.O]); a Fundação de Ciências Naturais da China (No.82101084 [para S.O.] e o Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, 202306310049 [para Y.W.]).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linha de sutura 10-0Alcon, Inc., EUA8065698001
trefina corneana de 2 mmSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, cabeças de pistola de pipeta de 1 mL, placas de cultura de placas de cultura de células, tubos de centrífugaGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/ -80 ° Frigorífico CQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
Uma seringa de 10 mL  Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Aderir ao slideShiTai Company188105
álcool amilenoXangai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CitoquertinaAbcam, Reino Unidoab76318
Anticorpo anti-queratina 12 EPR17882Abcam, Reino Unidoab185627
Anticorpo anti-PAX6Abcam, Reino Unidoab195045
Lâminas anti-decapagem, lamínulasJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japãohttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Incubadora de forno de CO2, triturador ultrassônico, centrífugaThermo Fisher Technologies Inc., EUAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Microscópio confocalShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
pinça epitelial da córneaSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., EUAH-1000
DEPC água  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
creme para os olhos Dicuro (creme para os olhos com ofloxacina)Santian Pharmaceutical Corporation, Japãohttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, meio de cultura, anticorpo duplo e PBSThermo Fisher Scientific, Inc., EUAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Reino Unido 
Balança eletrônicaShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Invólucro da membranaParafilm, Inc., EUAhttps://www.sigmaaldrich.cn
A tira de teste de sódio fluoresceína foi usada em oftalmologiaTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Sistema micrográfico de contraste de fase invertido fluorescenteTE-2000U, Nikon, Japãohttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Centrífuga de mesa congeladaEppendorf, Alemanhahttps://www.eppendorf.sh.cn 
Moldura de folha de vidroXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 com agente selante DAPIXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., ChinaKit
HEAuragene, ChinaKit http://jushengwu.com/a048/ de solução de
hematoxilina-eosinaAURAGEN, Estados UnidosP032IH
Balança eletrônica de alta e baixa precisãoSdolis, Alemanhahttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 anticorpoAbcam, Reino Unidoab16667
nitrogênio líquidoXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
de multiformaldeídoSigm, Américahttps://www.sigmaaldrich.cn
Centrífuga de temperatura normal 46Eppendorf, Alemanhahttps://www.thermofisher.cn
OCTXangai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Sistema micrográfico biológico comumEclipse 50i, Nikon, Japãohttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, e o aparelho do reatorBiometra Thermocycler, Alemanhahttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipetas de várias especificaçõesEppendorf Company, Alemanhahttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers para Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Colírio de cloridrato de promeaína 0,5%Alcon, Inc., EUAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, Estados Unidos20R-PR020
PCR quantitativo de fluorescência em tempo real AppliedBiosystems,  Estados Unidoshttps://www.thermofisher.cn
Kit de transcrição reversaTAKARA, Japãohttps://www.takarabiomed.com.cn/
Lâmpada de fendaTOPCON, Japãohttps://topconchina.cn/
Pinça lisaSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Caixa de amostrasLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Bancada SupercleanNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Cingapurahttps://www.hi-p.com/
pinça dentadaSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Colírio de toppicamida (Medol)Alcon, Inc., EUAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace proteína de ácido nucleico testador de concentraçãoThermo Fisher Technologies Inc., EUAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen Os Estados Unidoshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, com um microscópio cirúrgicoCarl ZEIS, Alemanhahttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
MCA341GA de coloração https://www.bosonbio.com.cn/ corante de Pó

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Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea
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