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Artigo de método

Planária como modelo animal para convulsão aguda experimental

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DOI:

10.3791/67307

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14 de fevereiro de 2025

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1Department of Biomedical and Translational Sciences, Macon and Joan Brock Virginia Health Sciences Eastern Virginia Medical School, Old Dominion University

Neste artigo

Resumo

As convulsões afetam negativamente várias funções e qualidade de vida. Os vermes Planaria foram expostos a concentrações variadas de quimioconvulsivantes para avaliar seus fenótipos de convulsão e motilidade disruptiva. Este estudo propõe o uso de vermes planárias como modelo para convulsões agudas em humanos e tem importância no desenvolvimento de medicamentos para epilepsia.

Resumo

A epilepsia está entre os distúrbios neurológicos mais prevalentes, caracterizados por convulsões espontâneas recorrentes. As convulsões representam uma manifestação clínica de atividade celular neural descontrolada e excessivamente sincronizada. A extensão dos danos cerebrais causados por convulsões depende de sua duração e intensidade. Lamentavelmente, não há remédio eficaz para a epilepsia. O objetivo desta investigação é avaliar se o verme planária Dugesia dorotocephala pode servir de modelo para auxiliar na identificação e desenvolvimento de tratamentos para epilepsia que possam ter como alvo crises agudas. Atualmente, vários modelos, como modelos marinhos, são usados para avaliar medicamentos anticonvulsivantes (ASM). No entanto, eles são muito caros e há preocupações éticas. Alternativamente, os modelos de invertebrados oferecem uma oportunidade de pesquisa econômica no processo de descoberta de medicamentos para ASM. As planárias pertencem à família dos platelmintos e habitam ambientes marinhos de água doce e terrestres. Dugesia dorotocephala é a espécie dominante de planária aquática em toda a América do Norte. D. dorotocephala apresenta-se como um modelo de invertebrado viável para estudos de epilepsia devido à sua relação custo-efetividade, neurônios semelhantes a vertebrados e comportamentos quantificáveis, ao contrário de outros invertebrados ou animais maiores. Eles têm sido usados em vários estudos de farmacologia e toxicologia ambiental relacionados à idade, memória e regeneração. Neste estudo, as planárias foram expostas a diferentes concentrações de pilocarpina, um quimioconvulsante comum para estudar seu comportamento após a exposição. Após a observação, as planárias foram eutanasiadas e preservadas em formaldeído ou solução de Golgi para avaliação neurohistológica. Seis fenótipos comportamentais distintos foram observados em planárias: oscilações dorsais, oscilações da cabeça, expansão dorsal da cauda, forma de C, movimento da cabeça e movimento da cauda. As frequências de oscilação dorsal foram significativamente aumentadas entre os grupos experimentais em comparação com o controle e exibiram dependência da dose. Além disso, a pilocarpina interrompeu a motilidade da planária. As convulsões induzidas por pilocarpina em planárias podem servir de modelo para avaliar convulsões agudas e medicação anticonvulsivante, essencial no desenvolvimento de intervenções terapêuticas para pacientes humanos que sofrem de epilepsia.

Introdução

A epilepsia, caracterizada por duas ou mais convulsões em 24 horas sem causa aparente, afeta ~ 50 milhões de pessoas em todo o mundo1. Entre eles, 10-15 milhões de indivíduos são relatados como tendo epilepsia resistente a medicamentos2. Portanto, a investigação de medicamentos para epilepsia é crucial. A condição envolve breves episódios de movimento involuntário parcial ou generalizado, variando de olhar fixo a enrijecimento e tremor do corpo, e está ligada a um aumento da atividade elétricano cérebro.

Historicamente, a pesquisa da epilepsia tem se baseado em roedores e outros mamíferos devido às suas semelhanças evolutivas com os humanos. No entanto, esses métodos podem ser demorados e caros, necessitando de uma abordagem alternativa 4,5. Criaturas não mamíferas como moscas-das-frutas, sanguessugas, girinos, peixes-zebra e lombrigas têm sido utilizadas em estudos e têm mostrado resultados promissores6. Além disso, foi demonstrado que a planária poderia fornecer um modelo de estudo genômico comparativo entre genomas de invertebrados e humanos, juntamente com a capacidade de testar medicamentos pró-convulsivantes, anticonvulsivantes (ASM) e padrões comportamentais6. Planaria (Filo Platyhelminthes), conhecida como platelmintos e membros da classe Turbellaria, é conhecida principalmente por suas habilidades regenerativas; no entanto, esta investigação concentra-se em sua resposta a substâncias indutoras de convulsões.

As planárias compartilham mecanismos neurológicos fundamentais com os humanos, como a capacidade de resposta à serotonina e à dopamina, mostrando uma semelhança de 95% com os genes relacionados ao sistema nervoso no cérebro dos mamíferos e possuindo uma estrutura cerebral reconhecível7. Além disso, eles exibem movimentos observáveis em condições de laboratório e são econômicos, eficientes em termos de tempo e éticos em comparação com roedores ou outros mamíferos. Esses comportamentos observáveis, como movimentos em forma de parafuso, C e noz, têm sido extensivamente documentados há décadas e estão associados a substâncias como cocaína, nicotina, dopamina e pilocarpina 7,8,9,10,11,12,13,14. Assim, a planária surge como um modelo viável para a pesquisa de medicamentos para epilepsia em humanos.

Este método tem como objetivo caracterizar neurônios de planárias que foram expostos à pilocarpina usando uma coloração de Golgi. A coloração de Golgi é usada para visualizar neurônios sob microscopia de luz e tem sido usada para investigar se uma mudança na morfologia está relacionada a convulsões 15,16,17. A literatura atual não tem evidências de coloração de Golgi sendo realizada em cérebros de planárias. Embora estudos anteriores tenham documentado efeitos farmacológicos por meio da observação de fenótipos comportamentais, este manuscrito é o primeiro a caracterizar os neurônios de planárias expostos à pilocarpina usando a coloração de Golgi11,18. Essa técnica é valiosa para visualizar e compreender as alterações morfológicas associadas às convulsões. Este estudo observou um aumento significativo na frequência do comportamento de oscilação dorsal oscilante em vermes planários à medida que a concentração de pilocarpina aumentou.

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Protocolo

NOTA: O desenho experimental geral é descrito na Figura 1.

1. Ensaio de fenótipo comportamental

  1. Prepare concentrações de 1 mM e 2 mM de pilocarpina dissolvida em água de nascente, bem como controle apenas com água de nascente.
  2. Pipetar 3 mL de cada solução para uma placa de 4 x 3 poços, com cada fileira representando uma concentração diferente de pilocarpina.
  3. Coloque uma Dugesia dorotocephala criada em laboratório com cerca de 2 semanas de idade em cada um dos 12 poços usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada.
    NOTA: Corte a ponta de forma que a extremidade fique grande o suficiente para caber na planária sem danificá-la.
  4. Registre o comportamento da planária por 1 h usando qualquer câmera que registre bem os comportamentos e seja observável ao olho humano, posicionada sobre a placa de poços 4 x 3 em condições normais de iluminação interna.
  5. Repita as etapas 1.1-1.4 com concentrações de 3 mM, 4 mM e 6 mM de pilocarpina dissolvida em água de nascente.

2. Análise de motilidade

NOTA: Os comportamentos das planárias foram registrados em poços de 2,5 cm de diâmetro. As gravações de vídeo de 1 h de duração foram divididas em partes de 30 minutos e cortadas usando software comercial para analisar planárias individualmente.

  1. Comece um novo experimento usando um software de análise de comportamento automatizado. Abra o sistema de rastreamento de comportamento automatizado aprimorado. Clique em Novo em Novo experimento. Nomeie o experimento.
  2. Configure as configurações experimentais conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Configurações do experimento no prompt do menu. Certifique-se de que as configurações sejam padrão: fonte de vídeo (do arquivo de vídeo), Número de arenas (1), Recursos rastreados (detecção de ponto central), Técnica de detecção de ponto de corpo (baseada em contorno), Opções de análise (nenhuma), Unidades (cm, s, graus).
  3. Defina as configurações da arena conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Configurações da Arena na guia Configurações da Arena no painel de configuração superior esquerdo. Quando solicitado a carregar um vídeo, selecione a filmagem gravada da planaria no local do arquivo armazenado. Depois que o vídeo for selecionado, clique em Grab.
    2. Siga as instruções no painel superior direito da tela. Clique em 1. Desenhe a escala para calibrar. Na imagem de vídeo do poço, arraste uma linha de escala de ponta a ponta do poço de amostra. Insira a distância real do poço (2,5 cm).
    3. Clique em 2. Selecione Forma e Desenhar Arena. Certifique-se de que a Arena 1 esteja selecionada no painel direito. Mova o cursor do mouse para o meio superior da tela e clique no ícone do círculo.
    4. Crie um círculo na imagem de vídeo carregada arrastando de um perímetro da arena para outro. Certifique-se de que a arena esteja na zona laranja. Ajuste a forma para que ela se ajuste à arena. Certifique-se de que o rótulo da Arena 1 esteja dentro dos limites da arena.
    5. Na parte inferior do painel direito, altere a Forma, o Tamanho e a Posição (Largura:2,75, Altura:2,75, X:0, Y:0) para as medidas desejadas.
    6. Clique em 3. Selecione Zonas de forma e desenho (opcional). O Grupo de Zonas 1 no painel direito agora será selecionado. Mova o cursor do mouse para o meio superior da tela e selecione o ícone do círculo. Crie um círculo menor na imagem da arena arrastando-o para dentro.
    7. No painel inferior direito, altere Forma, Tamanho e Posição para as medidas desejadas (Largura: 1,75, Altura: 1,75, X: 0, Y: 0).
    8. Clique no botão Adicionar rótulo de zona na mesma barra de menus do círculo. Clique no centro do círculo menor. Clique com o botão direito do mouse na marca Zona 1 no painel direito para renomear o Centro da Zona.
    9. Clique no botão Adicionar rótulo de zona novamente. Clique no perímetro da arena, fora da zona central. Clique com o botão direito do mouse na Zona 2 no painel direito para renomear o perímetro da zona.
    10. Clique em 4. Valide a configuração para garantir configurações válidas da arena.
  4. Defina as configurações de controle de avaliação conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Configurações de controle de avaliação na guia Configurações de controle de avaliação no painel de configuração superior esquerdo. Seis caixas de componentes aparecerão. Clique em Configurações na quarta caixa rotulada Condição, que inclui Tempo (1) e Tempo infinito (condição nunca atendida).
    2. Clique no Bubble ao lado de After e insira a duração (30 min) na caixa de texto à direita. Haverá também um menu suspenso à direita da caixa de texto de tempo para selecionar entre h, min e s.
      NOTA: As configurações de detecção para imagens gravadas dependerão da qualidade da filmagem. Os métodos a seguir podem ser manipulados para observar os melhores resultados, específicos para filmagens individuais.
  5. Defina as configurações de detecção conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Configurações de detecção na guia Configurações de detecção no painel de configuração superior esquerdo. Clique no botão Selecionar vídeo no painel superior direito. Carregue o vídeo desejado para basear as configurações de detecção.
    2. Clique na guia Avançado no mesmo painel direito. Agora, na guia Método, verifique se ele está definido como Escala de cinza. Altere o intervalo (0 - 100).
    3. Na guia Suavização do painel direito, verifique se a suavização de pixels do vídeo é Nenhuma, a correção de quadros descartados está desativada e a redução de ruído da faixa está desativada.
    4. Na guia Contorno do assunto do painel direito, ajuste a configuração da sequência e altere Erosão, Dilatação e Erosão para 1, 1 e 0, respectivamente.
    5. Na guia Tamanho do assunto, altere Mínimo (0) e Máximo (125000). Clique em Salvar no canto inferior direito.
  6. Configure uma sequência de testes de vídeo para observação, conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Lista de avaliação no painel de configuração superior esquerdo. Carregue a gravação de vídeo de espécimes na sequência desejada clicando nas reticências na coluna Arquivo de vídeo do sistema. Para adicionar mais avaliações, clique em Adicionar avaliações próximo ao canto superior esquerdo do painel Lista de avaliações.
  7. Defina as configurações de aquisição.
    1. Clique em Aquisição na guia Aquisição no canto superior esquerdo. Em Configurações de aquisição no painel direito, clique em Rastrear todos os testes planejados.
    2. Para iniciar a aquisição, clique no botão vermelho no meio inferior da tela ao lado de Pronto para começar. A aquisição de vídeo agora começará e levará um certo tempo, dependendo da quantidade e duração dos testes de vídeo carregados.
  8. Defina as configurações de análise conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Perfil de análise na guia Análise do painel esquerdo. Clique nas variáveis dependentes padrão selecionadas, Velocidade e Distância movida, e exclua-as.
    2. No painel de variáveis dependentes, na guia Local, clique em Na zona. Clique nas caixas Centro e Zona de perímetro para que elas sejam marcadas.
    3. Clique na guia Estatísticas de avaliação na caixa Na zona. Clique para desmarcar Latência para Primeiro. Clique em Adicionar.
    4. Na guia Corpo, clique no botão Rotação. Clique em Sentido horário e deixe o Limite (50,00 graus) e a distância mínima movida (2,00 cm) como padrão. Clique em Adicionar.
    5. Clique no botão Rotação novamente e clique em Sentido anti-horário. Clique em Adicionar.
  9. Analise as trilhas conforme descrito abaixo.
    1. Na guia Resultados, clique em Rastrear visualização. No painel direito, em Filtro, desmarque Último. A barra de controle de reprodução no painel central inferior da tela representará a visualização da trilha de espécimes durante horários específicos de observação.
  10. Analise e exporte resultados. Os resultados podem ser encontrados no restante das guias do painel inferior esquerdo. Para exportar dados, clique em Dados brutos ou Estatísticas em Exportar no painel esquerdo.

3. Eutanásia

  1. Prepare uma solução de eugenol a 22 mM em água de nascente. Colocar planária em placas de Petri com 9 ml de solução de eugenol 22 mM utilizando a pipeta de transferência cortada, mantendo cada concentração separada. Eutanásia por 3 min ou até que todo o movimento tenha cessado.
  2. Coloque a planária em uma placa de Petri fresca cheia de 9 mL de água mineral para enxaguar 1x-2x e coloque na solução de Golgi descrita abaixo (coloração de Golgi) ou paraformaldeído a 4% (coloração de imunofluorescência).

4. Análise histológica

  1. Coloração de Golgi
    1. Depois que as planárias forem sacrificadas, coloque-as em um béquer ou placa de Petri cheia de uma mistura 1:1 das soluções A e B do kit de coloração de Golgi. Substituir as soluções A e B no dia seguinte, colocando a planária num novo copo cheio de uma mistura das soluções A e B.
    2. Deixe a planária descansar por 1 semana nas soluções A e B.
    3. Retirar a planária das soluções A e B e colocá-la na solução C noutro copo. Substitua a solução C no dia seguinte. Deixe a planária descansar por um mínimo de 72 h e até 1 semana na solução C.
    4. Remova a planária da solução C com uma pipeta de transferência e incorpore colocando uma pequena quantidade de composto OCT em um mandril, adicionando a planária e, em seguida, envolvendo a planária com composto OCT. Planária cortada transversalmente em seções de 5 μM com a máquina de criostato a -24° C.
    5. Monte a planária em lâminas revestidas de gelatina usando uma pipeta de transferência e a solução C e deixe secar no escuro em RT por até 3 dias.
    6. Manchar as lâminas usando a solução de coloração (1 parte da solução D, 1 parte da solução E, 2 partes de água de nascente) submergindo as lâminas em copos com as soluções da seguinte forma: Solução de coloração por 10 min, depois em água de nascente 2x por 4 min cada, depois 50% de etanol por 4 min, depois 75% de etanol por 4 min, depois 95% de etanol por 4 min, depois em etanol 100% 4x por 4 min e, finalmente, em xileno 3x por 4 min.
    7. Lâminas de lamínula com meios de montagem histológicos e observe o tecido sob microscopia de campo claro.
  2. Coloração de imunofluorescência
    1. Após a eutanásia das planárias, colocar em paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h. Também pode ser armazenado na geladeira após esta etapa.
    2. Transfira a planária para 20% de sacarose de 4% de PFA e deixe por 1 dia. Remova a planária da sacarose e coloque-a no tampão PBS por 5 min.
    3. Enxágue com 3-4 lavagens de tampão PBS e transfira para 20% de sacarose para armazenamento até que esteja pronto para manchar.
    4. Coloque em soluções de álcool 70%, 95% e 100% por 1 min cada. Coloque em xileno por 1 min.
    5. Coloque 95% e 70% de álcool por 1 min cada. Coloque no tampão PBS 3x por 5 min cada. Colocar numa solução de metanol e peróxido de hidrogénio a 60:40 durante 10-15 min.
    6. Enxágüe em PBS 3x por 5 min cada. Adicionar o volume de paraformaldeído a 4% utilizado anteriormente no ponto 4.2.1 a este tampão PBS.
    7. Enxágüe em PBS 3x por 5 min cada. Bloqueie por 1 h com leite em pó, cobrindo a planária com ele.
    8. Diluir o anticorpo primário (1H6) a 5 μg/ml com PBS e incubar as lâminas durante a noite a 4 °C na solução de anticorpos. No dia seguinte, lave a planária em PBS por 10 min.
    9. Diluir o anticorpo secundário (IgG anti-ratinho de cabra) a 1 μg/ml em PBS e incubar as lâminas durante a noite a RT na solução de anticorpos. No dia seguinte, lave a planária em PBS por 15 min.
      NOTA: Diferentes anticorpos têm diferentes concentrações ideais; Determine isso antes de iniciar o experimento.
    10. Monte a planária inteira na lâmina, cubra com uma lamínula, sele com um meio de montagem aquoso e observe o tecido sob um microscópio fluorescente.

5. Análise de imagem

  1. Abra o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto. Instale o plug-in colour_deconvolution2.jar no aplicativo de software de análise de imagem de código aberto arrastando o plug-in para o aplicativo.
  2. Selecione a imagem a ser analisada e arraste-a para o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto. Vá para a guia Imagem. Clique em cor. Clique em Deconvolução de cores2 v2.1.
  3. Na opção de vetores, clique em H DAB. Na opção de saída, clique em 8bit_Transmittance. Certifique-se de que as LUTs simuladas, Produto vetorial para Cor 3, Mostrar matrizes e Ocultar legenda estejam todos selecionados. Clique em OK.
  4. Selecione a imagem em preto e branco para garantir que o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto possa analisar a imagem com eficiência.
  5. Vá para a guia Imagem. Clique em Ajustar. Clique em Limite. Ajuste o limite para que a coloração DAB ou o primeiro plano seja vermelho com um fundo branco. Certifique-se de que o limite seja o mesmo para cada imagem se várias imagens estiverem sendo quantificadas.
  6. Clique em Analisar. Clique em Definir medidas. Selecione Área, Valor mínimo e máximo de cinza, Limite ao limite, Rótulo de exibição, Mediana e Valor médio de cinza. Clique em OK. Clique em Analisar. Clique em Medir. Obtenha o resultado.
  7. Repita as etapas 1.2 a 1. Até que todas as imagens sejam quantificadas. Clique na imagem de resultados. Clique em Arquivo. Clique em Salvar como. Salve o arquivo como uma planilha e visualize os dados no software da planilha.

6. Análise estatística

  1. Calculamos a média e o erro padrão da média (EPM) para o comportamento da planária por meio da Análise de Variância (ANOVA) e do teste t de Student para significância estatística (p < 0,05).

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Resultados

O seguinte comportamento foi observado pelas planárias expostas a concentrações variadas de pilocarpina:
Oscilações dorsais: uma formação semelhante a uma bolha que viaja da extremidade cranial do corpo da planária até a extremidade caudal.
Oscilações da cabeça: formação semelhante a uma bolha pela cabeça da planária que forma uma aparência semelhante a um girino.
Forma de C: cabeça movendo-se no sentido horário e cauda movendo-se no sentido anti-horário para formar um C.
Mov...

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Discussão

Este estudo demonstrou o comportamento induzido pela pilocarpina em planárias em diferentes concentrações. O comportamento mais pertinente foi a expansão dorsal oscilante, pois esse comportamento não foi documentado em outros estudos sobre o comportamento convulsivo em planárias 9,10,11,12. O mecanismo pelo qual a pilocarpina induz comportamentos semelhantes a ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Queremos agradecer ao EVMS Research Incentive Fund (PI: A.E. Musto) e ao Dr. Jorge Jacot por suas sugestões úteis para otimizar o protocolo de imunofluorescência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga de 1,5 mL Solução
de paraformaldeído a 4%HimediaTCL119
Meio de montagem aquosoClini SciencesNB-47-02240-30ML
Copos (um para cada concentração testada)
Carolina Springwatercarolina132450
Cryostat
primários e secundários diluídos
Etanol (100%)sigma Aldrich
EthosVision XT 16noldus
Fiji Versão 2.9.0
Lâminas revestidas com gelatinasigma Aldrich643203
Golgi Anticorpo 1H6DSHBAB_2619608
Coloração de Golgi kit_Neurociência AssociadoPK 401 / 401A
Peróxido de
Metanol
Mídia de montagemthermo fischer composto OCT
PBS buffersigma AldrichP4417
Leite em pó
Pipetas de transferência de folha
Xileno
Anticorpos Hidrogênio científico de estanho

Referências

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