Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

Resumo

Este protocolo fornece uma diretriz abrangente para a configuração e monitoramento quantitativo de co-culturas, incluindo cianobactérias secretoras de açúcar fotoautotróficas e leveduras heterotróficas.

Resumo

Com a crescente demanda por biotecnologias sustentáveis, consórcios mistos contendo um micróbio fototrófico e espécies parceiras heterotróficas estão sendo explorados como um método para a bioprodução solar. Uma abordagem envolve o uso de cianobactérias fixadoras de CO₂ que secretam carbono orgânico para apoiar o metabolismo de um heterotrófico co-cultivado, que por sua vez transforma o carbono em bens ou serviços de maior valor. Neste protocolo, é fornecida uma descrição técnica para auxiliar o experimentalista no estabelecimento de uma co-cultura combinando uma cepa de cianobactéria secretora de sacarose com um (s) parceiro (s) fúngico(s), representado por espécies de leveduras modelo. O protocolo descreve os principais pré-requisitos para o estabelecimento da co-cultura: Definir a composição do meio, monitorar as características de crescimento de parceiros individuais e a análise de culturas mistas com várias espécies combinadas no mesmo vaso de crescimento. Técnicas laboratoriais básicas para monitoramento de cocultura, incluindo microscopia, contador de células e citometria de fluxo de célula única, são resumidas e exemplos de software não proprietário a serem usados para análise de dados de arquivos padrão de citometria de fluxo bruto (FCS) de acordo com os princípios FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) são fornecidos. Finalmente, comentários sobre os gargalos e armadilhas frequentemente encontrados ao tentar estabelecer uma co-cultura com cianobactérias secretoras de açúcar e um novo parceiro heterotrófico estão incluídos. Este protocolo fornece um recurso para pesquisadores que tentam estabelecer um novo par de micróbios co-cultivados que inclui uma cianobactéria e um micróbio heterotrófico.

Introdução

Com a rápida expansão das ferramentas genômicas e tecnologias de DNA nos últimos anos, os esforços de bioengenharia são cada vez mais capazes de considerar comunidades mistas de micróbios como viáveis para estratégias de bioprodução, em vez de se concentrar apenas em culturas axênicas. Os consórcios microbianos possuem múltiplas vantagens potenciais em relação às culturas de uma única espécie, incluindo especialização e divisão do trabalho, adaptabilidade e robustez e eficiência na utilização do substrato¹. No entanto, a engenharia previsível de consórcios multiespécies é complicada por incertezas causadas por comportamentos de ordem superior que emergem das interações entre espécies². A sinalização entre espécies e a troca de metabólitos estão no cerne do princípio da divisão do trabalho, mas também levam a sinergias e antagonismos inesperados entre os participantes dos consórcios³. É necessário um desenvolvimento considerável no campo para que todo o potencial dos consórcios microbianos mistos possa ser realizado, incluindo o uso de plataformas flexíveis de cocultura de 2 e 3 parceiros, que podem ser usadas para caracterizar e entender melhor a interatividade microbiana de "baixo para cima".

Alguns tipos dominantes de plataformas de co-cultura estão atualmente em uso no campo, incluindo parceiros auxotróficos complementares e micróbios que secretam metabólitos que geralmente são benéficos para uma ampla gama de espécies microbianas. Na última categoria, as cianobactérias foram projetadas para se tornarem produtoras primárias aprimoradas por meio da introdução de vias que levam à secreção de carboidratos facilmente metabolizados e agora foram exploradas em uma variedade de consórcios racionalmente projetados. Resumidamente, em tais comunidades microbianas projetadas, o parceiro cianobacteriano é capaz de utilizar luz e CO₂ como insumos primários e, por meio do processo de fotossíntese oxigenada, essas cepas podem secretar açúcares de carbono central como um bem público. Uma classe de tais cepas de cianobactérias projetadas são aquelas que foram projetadas para secretar o dissacarídeo^{sacarose 4}. Essas cepas provavelmente tiveram seu sucesso porque a sacarose é um metabólito próximo ao metabolismo central do carbono para muitas espécies e também é freqüentemente hiperacumulado como um chamado "soluto compatível" para se adaptar a uma variedade de estresses abióticos ambientais⁵. Um número mínimo de intervenções genéticas pode levar à secreção eficiente de sacarose em uma variedade de organismos modelo de cianobactérias⁴.

As cianobactérias secretoras de sacarose são uma plataforma útil para a investigação de consórcios microbianos racionalmente projetados, porque uma ampla gama de espécies heterotróficas pode metabolizar a sacarose como sua fonte dominante de carbono e energia. De fato, utilizando alguns modelos de cianobactérias com capacidade secretora de sacarose, muitos laboratórios projetaram racionalmente co-culturas e consórcios de espécies mistas que contêm um ou mais micróbios heterotróficos e que, em última análise, são apoiados pelas entradas primárias de luz e CO₂ sem suplementação de matérias-primas de carbono orgânico⁴. As cepas heterotróficas podem simplesmente subsistir dos carboidratos derivados de cianobactérias ou podem ser utilizadas para converter a matéria-prima de sacarose em bioprodutos de maior valor (por exemplo, combustíveis, polímeros, pigmentos, etc.). Além de ser uma estratégia potencial para a bioprodução sustentável, essas coculturas simplistas também podem ser úteis como uma plataforma para a investigação de interações emergentes entre espécies microbianas não relacionadas.

Este artigo em vídeo enfoca metodologias e pré-requisitos para a utilização de cianobactérias produtoras de açúcar como uma plataforma flexível para o projeto de consórcios microbianos simples que podem ser estáveis suplementando apenas insumos de carbono leve e inorgânico. Embora a configuração e o monitoramento de culturas contendo microrganismos estabelecidos sejam simples e possam ser facilmente alcançados usando densidade óptica (OD) ou metodologia de retroespalhamento, isso não é viável quando dois ou mais organismos são combinados em um recipiente. A principal razão é que esses métodos não distinguem entre os diferentes microrganismos, portanto, eles apenas fornecem uma imagem geral da cultura e não resolvem o crescimento dos organismos individuais. Além disso, as cianobactérias têm um amplo espectro de absorção na faixa de 400-750 nm, portanto, medir o OD₆₀₀ de um heterotrófico levaria a resultados falsos devido à ficocianina (que absorve em 620 nm). Portanto, são fornecidos protocolos específicos para a configuração de comunidades mistas cianobactérias-heterotróficas dentro do laboratório, bem como protocolos genéricos úteis para a análise do desempenho desses consórcios ao longo do tempo. Embora os protocolos se concentrem em um emparelhamento específico de um modelo, espécies de cianobactérias secretoras de sacarose com um ou mais micróbios heterotróficos modelo, a intenção deste trabalho é fornecer um recurso para pesquisadores que desejam projetar novos pares de espécies e acelerar a fase de otimização para o estabelecimento de tais culturas. Portanto, além dos protocolos específicos da espécie, estão incluídas informações e estratégias que podem ser usadas para adaptar e generalizar esses protocolos para comunidades personalizadas, conforme definido pelas necessidades do leitor.

Devido à flexibilidade da plataforma de co-cultura aqui descrita, são descritos protocolos para várias espécies heterotróficas diferentes que foram relatadas anteriormente em co-cultivo com cianobactérias secretoras de açúcar. Por exemplo, o protocolo passo a passo para uma co-cultura de Synechococcus elongatus PCC 7942 com a levedura comum de laboratório Saccharomyces cerevisiae é fornecido. No entanto, o artigo também inclui protocolos apropriados para testar o desempenho de coculturas contendo outras espécies modelo, incluindo a forma de levedura de Ustilago maydis.

O artigo se concentra em um conjunto central de protocolos necessários para estabelecer uma co-cultura de cianobactérias/heterotróficas e realizar a caracterização básica do desempenho desses consórcios mistos ao longo do tempo. Especificamente, são enfatizados métodos de citometria de fluxo de célula única e contagem de partículas adequados para obter um censo preciso de diferentes espécies, bem como abordagens de microscopia para avaliar a morfologia celular. Esses protocolos destinam-se a servir de base para a adaptação às necessidades e equipamentos disponíveis. É importante ressaltar que são fornecidas notas técnicas e outras considerações importantes para estabelecer e monitorar coculturas dentro do laboratório. Finalmente, exemplos de alternativas não proprietárias para análises de dados de arquivos FCS⁶ brutos usando pacotes Python são incluídos. Em resumo, o objetivo é tornar as técnicas de co-cultura baseadas em cianobactérias mais acessíveis a um público científico mais amplo.

Protocolo

NOTA: Este protocolo contém instruções detalhadas sobre como configurar e quantificar co-culturas de S. elongatus secretor de açúcar e espécies de leveduras modelo heterotróficas. Em geral, o protocolo é aplicável a qualquer espécie de levedura passível de manipulação genética.

1. Estabelecimento de co-culturas combinando cianobactérias fototróficas e leveduras heterotróficas

1. Preparações para o co-cultivo: Meios e pré-cultivo
   NOTA: Prepare todos os meios e soluções de estoque usando água filtrada ultrapura. Todos os copos (copos de medição, cilindros graduados, garrafas de armazenamento e frascos de cultivo) devem ser limpos e autoclavados. Os meios estéreis podem ser armazenados à temperatura ambiente (RT). Um dispositivo compatível com os requisitos do cultivo fotoautotrófico precisa estar disponível.
   1. Prepare o meio de cocultura pelo menos 3-4 dias antes do início pretendido da cocultura. A maioria das receitas de meios de co-cultura são variações do meio comum BG-11⁷ utilizado para o cultivo rotineiro de muitas espécies modelo de cianobactérias. Este protocolo usa o meio CoYBG-11 relatado anteriormente como exemplo (⁸; Veja a Tabela 1). Autoclave (121 °C, 20 min) ou esterilize com filtro (tamanho de poro de 0,22 μm) o meio preparado, conforme apropriado.
      NOTA: Consulte a seção Discussão para obter sugestões sobre como adaptar um meio apropriado para outros pares de espécies.
   2. Prepare reagentes moleculares: Para indução da expressão de cscB e exportação de sacarose ^9,10,11, prepare um estoque 1 M de isopropil-β-tiogalactosídeo (IPTG).
      NOTA: O uso de antibióticos durante a co-cultura é abaixo do ideal, mas se todas as cepas tiverem de resistência, eles podem ser usados. Nesse caso, prepare estoques de antibióticos de acordo com as necessidades das cepas empregadas.
   3. Prepare uma pré-cultura de cianobactérias: Pelo menos 3 dias antes do início da co-cultura, transfira as células de uma pré-cultura da cepa secretora de açúcar de cianobactérias que cresce em meio BG-11 para um frasco fresco defletor contendo meio CoY^BG-11 (Tabela 1).
      NOTA: Várias espécies e cepas de cianobactérias foram modificadas para secretar açúcares. Para uma revisão abrangente das cepas disponíveis no momento da redação deste artigo, consulte⁴. Esta referência também lista espécies heterotróficas (ver 1.1.4) para as quais a co-cultura de cianobactérias foi relatada anteriormente.
      1. Meça o OD₇₅₀ da pré-cultura. Calcule o volume necessário da pré-cultura para atingir um OD_{alvo 750} de 0,3 (C₁) usando a equação V₁ = C₂ x V₂ / C₁ onde C₂ = OD alvo, V₂ = volume alvo e V₁ = volume necessário de pré-cultura. Por exemplo, ao inocular uma cultura de 30 mL (V₂), a quantidade x de cultura líquida a ser usada é V₁ (mL) = (0,3 x 30) / (OD₇₅₀ medido).
         NOTA: A densidade óptica é uma aproximação da densidade celular e depende das condições de crescimento e da morfologia celular; Portanto, é necessário que os pesquisadores usem métodos para correlacionar a densidade óptica com o número absoluto de células (ver seções 2.1, 2.2 e 2.3) para uma avaliação adequada do desempenho da cocultura. Para cianobactérias, comprimentos de onda de luz dentro do espectro fotossinteticamente ativo (ou seja, 400-700 nm) não devem ser usados para determinar a densidade óptica porque são absorvidos pela clorofila e outros pigmentos; portanto, comprimentos de onda vermelhos distantes são usados rotineiramente (por exemplo, 750 nm).
      2. Incubar a cultura diluída numa fotoincubadora adequada. Incubação típica
         as condições para as cianobactérias modelo são as seguintes: 30 °C, 150 rpm (projeção de 25 mm), 2% de espaço livre de CO₂ , ~ 200 μmol de fótons ^m-2 · ^s-1 Iluminação LED, 75% de umidade.
         NOTA: A suplementação com CO₂ é altamente recomendada para otimizar a quantidade de sacarose liberada.
      3. Repita este processo de diluição todos os dias por pelo menos 3 dias antes de estabelecer a co-cultura, de modo a garantir que as cianobactérias estejam em crescimento exponencial. Isso ajudará a melhorar a consistência no desempenho da co-cultura entre experimentos de dias diferentes.
   4. Pelo menos 2 dias antes do início da co-cultura, prepare uma pré-cultura heterótropa. Como observado, várias espécies e subcepas de leveduras foram cultivadas anteriormente em co-cultura com cianobactérias ^8,12,13.
      1. Transfira as células em uma diluição de 1:100 (250 μL) de uma cultura líquida das espécies heterotróficas crescendo em um caldo de cultivo rico (ver Tabela 1) para 50 mL de meio CoY^BG-11 suplementado com 20 g / L de sacarose em um balão defletor de 250 mL.
      2. Incubar durante a noite na mesma temperatura que as condições de cultivo usadas para o parceiro cianobacteriano.
   5. Verificar a OD₆₀₀ pelo menos 24 h antes do momento previsto para a inoculação da co-cultura para garantir que a estirpe heterotrófica cresceu o suficiente para as necessidades experimentais (ver 1.2): diluir em meio fresco para manter o crescimento exponencial, se necessário.
2. Co-cultura, inoculação e manutenção
   NOTA: Consulte a seção Discussão para considerações sobre a taxa de inoculação entre os microrganismos fototróficos e heterotróficos.
   1. Para a inoculação da co-cultura, enriqueça ambas as pré-culturas por centrifugação.
      1. Calcular o volume da suspensão celular concentrada para atingir a densidade inicial desejada para ambas as espécies utilizando a equação padrão C₁ x V₁ = C₂ x V₂ , em que C₁ = DO de cultura enriquecida. Por exemplo, para fazer uma cultura de 25 mL de S. elongatus com um OD_{inicial 750} de 0,5 (de uma cultura axênica de 1,5 OD) e S. cerevisiae com um OD_{inicial 600} de 0,05 (de uma cultura axênica de 0,7 OD), com base na equação acima, são necessários 8,33 mL de cultura inicial de S. elongatus , 1,79 mL de cultura heterófica enriquecida, e 14,88 mL de meio CoY^BG-11 .
      2. Centrifugue as culturas usando 13.000 x g por 10 min em RT. Em condições estéreis, decantar e rejeitar o sobrenadante.
         NOTA: Menos força centrífuga relativa (RCF; xg) pode ser usada para pellet S. cerevisiae , pois são células maiores (2x-3x vezes) em comparação com S. elongatus, mas tome cuidado para que o sobrenadante fique transparente. Para a coleta da biomassa cianobacteriana, menos de 13.000 x g também podem ser usados, mas exigiria um tempo maior para centrifugação (por exemplo, 4.000 x g podem ser usados por 20 min).
      3. Ressuspenda o pellet de cianobactérias em 25 mL de meio estéril CoY^BG-11 . Use as mesmas condições de centrifugação de antes, depois, descarte e decanta o sobrenadante.
      4. Repita este processo duas vezes para S. elongatus e mais 4 vezes para S. cerevisiae.
         NOTA: É importante lavar os pellets de cianobactérias e o heterótrofo (S. cerevisiae) para remover os componentes residuais do meio. Como S. cerevisiae vinha crescendo na presença de sacarose anteriormente, o aumento da quantidade de etapas de lavagem garantirá que o possível açúcar residual seja removido.
      5. Uma vez verificada a DO, combinar os volumes de S. elongatus e S. cerevisiae num balão defletor de 250 ml em condições estéreis e adicionar CoY^BG-11 a um volume final de 50 ml. Diluir do estoque de 1 M de IPTG previamente preparado até uma concentração final de 1 mM (isso é para induzir as cianobactérias a exportar sacarose para o meio). Para uma cultura de 50 mL, use 50 μL do estoque IPTG de 1 M.
         NOTA: Frascos defletores geralmente são melhores porque fornecem melhor aeração e mistura para cianobactérias.
      6. Colocar o balão do passo anterior a 200 μmol de fotões ·^m-2·^s-1 de iluminação LED complementada com 2% de CO₂ a 30 °C com agitação orbital a 150 rpm (projeção de 25 mm) e 75% de humidade.
         NOTA: As condições mencionadas acima podem variar e precisam ser otimizadas com base no resultado experimental.
      7. Monitorizar o crescimento da cultura através de amostragem estéril (1 ml) de 12 em 12 h ou de 24 em 24 h (ver secção 2). Opcionalmente, use as amostras para realizar microscopia de células vivas padrão e determinar unidades formadoras de colônias (UFC¹⁴) de células de levedura em um meio adequado para rastrear a morfologia e a aptidão celular e monitorar a quantidade de células heterotróficas vivas, bem como a contaminação.
         NOTA: As UFCs não são recomendadas como método para monitorar a densidade celular precisa das espécies de cianobactérias, que podem sofrer estresse significativo na transição do cultivo em meio líquido para sólido. Portanto, placas de ágar com um meio rico apropriado para o crescimento das espécies parceiras de levedura, como a peptona dextrose do extrato de levedura (YEPD)¹⁵, devem ser escolhidas.

Composto químico	BG-11 (concentração mg/L)	CoY BG-11 (concentração mg/L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Ácido cítrico	6	6
Citrato férrico de amônio	6	6
EDTA (sal dissódico)	1	1
Na2CO3	20	20
Composição de metais residuais
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(NO3)2 · 6H2O	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2O	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
Adicional
HEPPSO	7160	7160
Base de nitrogênio de levedura (YNB), sem aminoácidos, sem sulfato de amônio	–	3608, 120013
Agente de titulação de pH 8,3	KOH	KOH
KPO3	–	118
Sacarose (apenas para heterótrofos)	–	13690

Tabela 1: Composição do meio de BG-11 e CoY^BG-11. Dadas as concentrações de levedura-nitrogênio, as concentrações de base em CoY^BG-11 são derivadas de recursos publicados ^8,12,13.

2. Ferramentas e metodologia para monitorar o crescimento de coculturas

NOTA: Este protocolo é uma diretriz para análise e monitoramento de cocultura, desde técnicas simples, mas intensas em trabalho, como microscopia e câmaras de contagem, até aplicações de alto rendimento, como contadores de partículas e citometria de fluxo de célula única. Além da co-cultura propriamente dita, é aconselhável incluir culturas axênicas de microrganismos individuais para permitir uma análise abrangente. Como ponto de partida geral para análise, determine o OD das culturas. Nesta seção, são detalhadas diferentes metodologias que podem ser usadas para converter medidas relativas de densidade celular (ou seja, DO) em valores absolutos de número de células por volume. A medição OD₇₅₀ é frequentemente usada para determinar a densidade celular de culturas de cianobactérias (devido à absorção de comprimentos de onda de 400-700 nm), enquanto a OD₆₀₀ é usada para organismos heterotróficos. Ambas as medições fornecem valores guia aproximados com unidades arbitrárias. Observe que os valores podem diferir fortemente entre os instrumentos.

1. Quantificação microscópica com câmaras de contagem
   NOTA: As câmaras de contagem (ou seja, Neubauer (melhorado)/hemocitômetros) são um meio simples e barato de determinar a composição de coculturas compostas de células que podem ser facilmente distinguidas morfologicamente, i.e., por suas formas celulares (Figura 1A). Consiste em uma lâmina de microscópio de vidro grosso e uma tampa de vidro. Se a lamínula estiver posicionada corretamente na parte superior da corrediça, ela cria duas câmaras de volume de precisão com grades gravadas (Figura 1B-D). Ao contar uma área definida de uma grade, a concentração de células de uma suspensão pode ser calculada. As câmaras de contagem estão disponíveis em diferentes profundidades. Dependendo da espessura da célula, uma profundidade de câmara adequada deve ser escolhida. Para células fúngicas, como U. maydis ou S. cerevisiae, Uma profundidade de 0,1 mm funciona bem. Essa profundidade da câmara é muito grande para células menores, como cianobactérias, e as células estão flutuando na câmara. Uma câmara com profundidade de 0,02 mm é adequada tanto para cianobactérias quanto para coculturas de cianobactérias e fungos.
   1. Certifique-se de que a câmara de contagem e a lamínula estejam livres de poeira e células.
      NOTA: Recomenda-se a limpeza com etanol a 70% (v/v) e lenços de papel sem fiapos diretamente antes do uso.
   2. Para posicionar a lamínula corretamente, deslize-a nas duas barras de suporte com um pouco de pressão, mas tenha cuidado para evitar quebras.
      NOTA: Uma lamínula específica e espessa é necessária para esta aplicação (consulte o manual da câmara). Como a tampa de vidro às vezes quebra durante a montagem, é bom ter substituições à mão.
   3. Quando a lamínula estiver posicionada corretamente, observe os chamados anéis de Newton (Figura 1B) entre as duas superfícies de vidro, e que a lamínula não escorregue mais.
      NOTA: Uma respiração suave na lamínula antes da montagem geralmente melhora o resultado.
   4. Misture bem a suspensão celular e aplique alguns microlitros (~ 2-10 μL dependendo da profundidade da câmara) da suspensão celular na borda da câmara e deixe-a encher completamente por força capilar. Use uma diluição apropriada da suspensão celular para permitir uma contagem confiável, por exemplo, resultando em 20 a 200 células por quadrado grande (Figura 1D, retângulo vermelho).
   5. Use uma objetiva apropriada (por exemplo, 10x) de um microscópio de luz (campo claro ou modo de contraste de fase) e concentre-se nas linhas da grade da câmara de contagem. A orientação é fornecida pela grade. Comece a contar as células nos quadrados adequados para o tamanho de célula dado.
      NOTA: Use uma ajuda técnica, como um contador portátil ou um aplicativo de smartphone apropriado para contagem (por exemplo, "contador de coisas" geral ou aplicativos especializados de hemocitômetros que fornecem recursos extremamente úteis). Defina uma regra para contar células localizadas nas bordas da grade para evitar contagens duplas. Por exemplo, as células localizadas nas bordas superior e esquerda de cada quadrado podem ser contadas, excluindo as bordas direita e inferior. Existem regras alternativas¹⁶. Se um microscópio de fluorescência for usado, as células também podem ser distinguidas com base em seus marcadores de autofluorescência ou fluorescência.
   6. Depois de contar, por exemplo, todos os quatro quadrados grandes nos cantos, determine o valor médio para cada tipo de célula. Com esses valores médios, a área do quadrado utilizado e a profundidade da câmara dada (consulte as informações dos fabricantes), calcule as concentrações celulares (ver Resultados Representativos).
      NOTA: Dependendo do tamanho da célula, diferentes quadrados podem ser usados para contagem. Para células de levedura e cianobactérias, os quatro grandes quadrados nos cantos estão funcionando bem (Figura 1D, retângulo vermelho).
   7. Após o uso, limpe a câmara considerando os requisitos das amostras (por exemplo, inativar organismos geneticamente modificados adequadamente).
2. Quantificação usando contadores de partículas
   NOTA: Dependendo das características das células em uma co-cultura, um contador de partículas pode ser aplicado para determinar o número de células dos parceiros. Para a aplicabilidade deste método, as células precisam diferir fortemente em seu tamanho; por exemplo, a discriminação de células bacterianas e de levedura pode ser alcançada. As culturas axênicas dos microrganismos individuais do consórcio precisam ser incluídas para permitir a interpretação dos resultados. As coculturas que abrigam células com tamanhos semelhantes ou mais de 2 parceiros devem ser analisadas com a metodologia descrita nas seções 2.1 ou 2.3.
   1. Preparações
      1. Ajuste a DO da cultura para 0,1 e dilua a amostra 1.000 vezes com um tampão de medição isotônico (consulte o manual do dispositivo) em um volume total de 10 mL. Preparar triplicados técnicos de todas as amostras.
      2. Selecione um tamanho de poro adequado do capilar para o experimento.
         NOTA: O tamanho dos poros deve estar dentro da faixa das células menores na co-cultura, mas também deve incluir as células maiores. Não fique muito pequeno porque o poro pode entupir devido à agregação celular, que pode ocorrer devido à divisão celular. Os tamanhos de poros disponíveis diferem. Um capilar de 45 μm, por exemplo, começa a detectar células com um diâmetro de 0,7 μm. (U. maydis e S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
   2. Quantificação de células em um contador de partículas
      1. Inicie o dispositivo. Eventualmente, realize um autoteste para controle de qualidade (consulte o manual do dispositivo específico).
      2. Coloque as amostras nos copos de amostra, feche a tampa e misture a amostra inclinando levemente o copo.
         NOTA: Tente evitar formação de espuma e bolhas. Sempre use um copo para cada medição. Os copos podem ser limpos e reutilizados várias vezes. Descarte os copos se houver algum resíduo que não possa ser removido. Se a amostra permanecer no copo por períodos mais longos, misture-a novamente antes de medir.
      3. Registre em uma faixa de 0-30 μm devido aos agregados celulares serem potencialmente maiores do que as células individuais.
         NOTA: Primeiro, use cada uma das culturas axênicas dos parceiros de co-cultura para ter uma ideia do tamanho das células e determinar se elas podem ser distinguidas por seu tamanho.
      4. Após a avaliação, determine a composição da co-cultura da mesma maneira.
3. Quantificação de consórcio usando citometria de fluxo de célula única
   NOTA: A citometria de fluxo de célula única é um método de alto rendimento que pode ser empregado para determinar o número de células de parceiros individuais na cocultura, uma vez que os parceiros podem ser discriminados por tamanho/suas propriedades de espalhamento de luz e/ou fluorescência. É importante ressaltar que, para o estabelecimento do método, as culturas axênicas dos parceiros de co-cultura são necessárias para analisar suas propriedades no citômetro e ajustar os portões populacionais de acordo. Para cepas que transportam um repórter fluorescente, cepas sem o repórter fluorescente são necessárias como controles negativos. Uma familiaridade básica com as aplicações do citômetro facilitará a implementação bem-sucedida do protocolo abaixo^{17,18,19,20,21}. Neste exemplo, uma mistura artificial de 3 microrganismos é analisada (ver Resultados representativos): Synechocystis (expressando um fluoróforo repórter citosólico, mVenus) e as duas leveduras S. cerevisiae e U. maydis. Para uma discriminação precisa de S. cerevisiae e U. maydis, foram introduzidos marcadores de fluorescência sob a forma de proteína fluorescente verde citoplasmática (GFP) (U. maydis eGFP) e proteína fluorescente vermelha (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) usando técnicas básicas de clonagem molecular. Se possível, cepas com integração genômica de repórteres devem ser preferidas para evitar a necessidade de pressões de seleção contínuas.
   1. Preparação da amostra
      1. Medir a DO das culturas numa determinada fase de crescimento a analisar.
      2. Ajustar o diâmetro externo das amostras para uma gama adequada à medição. Use um OD₇₅₀ aproximado de 0,05-0,5 para as cianobactérias e um OD₆₀₀ de 0,2-1,5 para a levedura usando meio de cultura fresco (volume final: pelo menos 500 μL). Para co-culturas, apontar para um OD₇₅₀ entre ~ 0,1 e 0,5 e registrar o fator de diluição. Para o cálculo, aplique a fórmula fornecida na etapa 1.1.3.1. Isso garantirá que a contagem de células permaneça em uma faixa de 1.000 a 10.000 células/s a uma taxa de fluxo de 10 μL/min (equivalente a 6.000 a 60.000 células/μL).
         NOTA: Para diluição, pode-se usar meio ou tampão sem autofluorescência e partículas (por exemplo, BG-11). Tenha cuidado com meios que contenham ingredientes complexos, como extrato de levedura, que podem aparecer como partículas na medição.
      3. Transfira 300 μL de cada suspensão de célula de amostra para um poço individual em uma placa de 96 poços (poço redondo padrão, fundo transparente e plano).
         NOTA: Como alternativa, transfira 0.5-2 mL para um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) se o modo de amostragem semiautomático for usado em vez do modo de leitura de placas.
   2. Medição de citometria
      1. Inicie o citômetro e execute o programa de inicialização e controle de qualidade (CQ) de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Carregue (carregador de placas ou amostragem semiautomática) e execute as amostras. Comece com as amostras de controle usando as culturas axênicas de cada parceiro de cocultura para identificar cada espécie com base em suas propriedades antes de separá-las em uma amostra de cocultura.
      3. Gráficos de pontos abertos e/ou histogramas para os canais de fluorescência e dispersão (por exemplo, dispersão direta [FSC] ou dispersão lateral [SSC] altura [-H] ou área [-A]) relevantes para as amostras.
      4. Procure a(s) população(ões) de células necessária(s) e ajuste o limite para excluir o ruído técnico e as pequenas partículas do meio.
         NOTA: Recomenda-se pesquisar a população de células em um gráfico de pontos FSC-H sobre largura FSC ou FSC-H sobre SSC-H e ajustar a escala de linear para logarítmica para células pequenas como bactérias (normalmente 1-3 μm). Defina o limite no canal FSC-H ou SSC-H. Para células com menos de 1 μm de diâmetro, use o SSC violeta (VSSC) no laser violeta a 405 nm para uma melhor resolução.
      5. Ajuste o ganho de cada canal de interesse manualmente para um intervalo de 25 a 2.500. Ajuste os ganhos de forma que o controle negativo (por exemplo, sem o marcador fluorescente) esteja em uma faixa de 1 x 10^2-1 x 10³ e o controle positivo (por exemplo, com o marcador fluorescente) esteja em uma faixa de 1 x 10^5-1 x 10⁶ para obter a melhor separação e permanecer dentro da faixa de 1 x 10^1-1 x 10⁷.
         NOTA: Os ganhos padrão do QC também podem ser mantidos como uma boa referência.
      6. Para determinar a concentração de células na amostra, registre um volume de amostra definido usando a função de registro (por exemplo, 10 μL a uma taxa de fluxo de 10 μL / min). Posteriormente, divida as contagens de células individuais medidas para este volume pelo volume registrado para obter uma contagem de células por μL para cada população.
         NOTA: Tenha em mente o fator de diluição inicial ao calcular a concentração de células na cultura/amostra.
   3. Bloqueio/seleção de populações de células
      NOTA: Independentemente do dispositivo usado para executar as medições, a análise e o gating podem ser realizados no software operacional do citômetro ou no software de análise comercial, conforme exemplificado abaixo²². Além disso, a análise de dados de citometria de fluxo usando software não proprietário pode ser feita de forma eficiente com várias ferramentas de código aberto, como FlowCytometryTools²³ ou FlowKit, utilizando FlowUtils²⁴ pacotes em Python. No espírito da ciência aberta, este protocolo compartilha um JupyterNotebook exemplar mostrando o uso desses pacotes para exploração de dados básicos. Obviamente, softwares alternativos podem ser igualmente adequados para realizar bioinformática por citometria de fluxo²⁵.
      1. Selecione certas populações de células desenhando portas ao redor delas em um gráfico de pontos ou definindo segmentos divisores ou de linha em torno de picos em um histograma (Figura 4).
         NOTA: A função de portão automático do programa pode ser usada como referência.
      2. Separe os sinais para organismos fototróficos e heterotróficos com base na autofluorescência do organismo fototrófico (causada principalmente pela clorofila) na região vermelha do espectro. Exemplo: Use o histograma do canal APC-H (excitação (ex.) a 638 nm, emissão (em.) a 660/10 nm) e defina um divisor vertical entre o pico direito (fototrófico = população positiva de autofluorescência de clorofila) e pico esquerdo (
         NOTA: Os marcadores fluorescentes também podem ser usados para distinguir dois (ou mais) parceiros fototróficos dentro da mesma cultura (por exemplo, mVenus para Synechocystis).
      3. Separe os dois organismos heterotróficos com base em seus marcadores fluorescentes ou propriedades de espalhamento (FSC, SSC, se possível).
         NOTA: A separação baseada nas propriedades de dispersão só é aplicável se as células tiverem, por exemplo, tamanho ou morfologia celular diferente que resulte em mudanças visíveis no espalhamento (por exemplo, Synechocystis: células esféricas com ~ 1,5-3 μm de diâmetro vs. U. maydis células alongadas com um comprimento de 10 μm e cerca de 1-2 μm de diâmetro²⁶).
      4. Exemplo: Use o histograma do canal FITC-H (ex.: 488 nm, em.: 525/40 nm) exibindo apenas a população "heterotrófica" para distinguir entre as células heterotróficas contendo GFP (por exemplo, U. maydis eGFP) e aquelas sem GFP (por exemplo, S. cerevisiae RFP/mKate2) (Figura 4B). Alternativamente, use o histograma do canal PC5.5-H (ex.: 561 nm, em.: 710/50 nm) exibindo apenas a população "heterotrófica" para distinguir entre as células heterotróficas contendo RFP (por exemplo, S. cerevisiae RFP / mKate2) e aquelas sem RFP (por exemplo, U. maydis GFP) (Figura 4C).
         NOTA: Lembre-se de que dois (ou mais) tipos diferentes de células podem "ficar" juntos durante a medição. Esses "dupletos" ou "múltiplos" podem ser facilmente detectados em gráficos de pontos de ambos os marcadores fluorescentes (por exemplo, APC-H sobre FITC-H para identificar dupletos de fototrófico e parceiro heterotrófico marcado com GFP).
      5. Para análise básica de dados em Python, siga as instruções neste Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         NOTA: Este notebook suporta três etapas de análise de dados. i) Importar dados: Importação de arquivos FCS. ii) Realizar controle de qualidade: Verifique a integridade dos dados e o número de eventos. iii) Visualize dados: Use gráficos como histogramas, gráficos de dispersão e gráficos de densidade para visualizar os dados. Além disso, o procedimento de como realizar o gating para isolar populações de interesse reproduzindo a Figura 4 é exibido.
         Para facilitar a análise de co-culturas em projetos de longo prazo, recomenda-se que o pesquisador use os métodos acima para contar o número de células e criar curvas padrão para comparar os valores de OD com as contagens absolutas de células. A densidade óptica é uma medida relativa que pode variar com base na espécie, cepa, condições de crescimento e espectrômetro. Portanto, a geração de curvas padrão "internas" é necessária para a conversão precisa dos valores de OD em números de células.

Figura 1: Quantificação microscópica de células morfologicamente distinguíveis. (A) Uma câmara de contagem de Neubauer. (B) Os anéis de Newton indicam o posicionamento correto da lamínula especial. (C) Representação esquemática da arquitetura da câmara com a cavidade central de volume definido para contagem de células. (D) A grade da câmara de contagem de Neubauer representada consiste em nove grandes quadrados com um tamanho de 1 mm² (vermelho). Os quatro grandes quadrados nos cantos são divididos em 16 quadrados (azul). O grande quadrado central é dividido em 25 quadrados de grupo com um tamanho de 0,04 mm² (laranja). Cada quadrado de grupo consiste em 16 quadrados menores (verde). O número foi gerado com base em informações dos fabricantes disponíveis publicamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Estabelecimento de co-culturas de S. elongatus fototróficas e leveduras heterotróficas
Anteriormente, relatamos resultados detalhados do co-cultivo de Synechococcus elongatus PCC 7942 com uma variedade de subcepas de S. cerevisiae. Para uma descrição abrangente dos resultados da co-cultura com este par de cianobactérias / leveduras, consulte⁸. Por uma questão de brevidade e precisão, esses resultados não são reproduzidos aqui. Resumidamente, os resultados anteriores indicam uma série de considerações que são importantes para o estabelecimento de co-culturas de cianobactéria-levedura a longo prazo. A principal preocupação é que a capacidade da levedura de sobreviver em condições em que as cianobactérias fornecem as únicas formas de carbono fixo depende fortemente da eficiência com que a cepa de levedura pode utilizar a sacarose. As cepas de S. cerevisiae que evoluíram ou foram projetadas para metabolizar a sacarose de forma mais eficiente^27,28 tiveram maior probabilidade de sobreviver à transição para o modo de crescimento de co-cultura, alcançaram densidades celulares mais altas e exibiram maior robustez em experimentos de co-cultura de cianobactérias de longo prazo (dias a semanas)⁸. A fase inicial de inoculação de uma co-cultura foi especialmente importante para a viabilidade da levedura, provavelmente devido a tensões de diluição da cultura, troca de composição do meio e/ou retirada de uma fonte de carbono mais concentrada. Portanto, os esforços para facilitar a transição de um meio de crescimento mais rico para uma disponibilidade mínima de carbono no início da cocultura podem melhorar o desempenho e a consistência experimental (ver etapa 1.2.1.1). Além disso, S. cerevisiae exibiu respostas ao estresse consistentes com hiperóxia quando inoculado em culturas densas de S. elongatus, consistentes com a formação de O₂ como subproduto primário da fotossíntese oxigenada. Portanto, os esforços para evitar o crescimento excessivo do parceiro de cianobactérias e / ou ciclos de luz alternados "dia / noite" podem estender substancialmente a viabilidade de S. cerevisiae em co-culturas de longo prazo. Consulte a seção Discussão para obter um resumo adicional dos fenômenos comuns em coculturas em relação às amostras de controle axênico.

Monitoramento do crescimento de co-culturas usando diferentes metodologias
Na seção seguinte, é descrita a quantificação exemplar de um consórcio tripartido artificialmente misturado de Synechocystis e as duas leveduras S. cerevisiae e U. maydis usando três métodos diferentes. Para a mistura, OD₇₅₀ (para cianobactérias) e OD₆₀₀ (para os heterótrofos) de culturas individuais foram determinados e ajustados para OD 0,1. Culturas únicas foram misturadas em uma proporção de 1:1:1 usando densidade óptica (que é distinta da contagem de células, veja acima). Para facilitar a discriminação das leveduras no citômetro, cepas repórteres de S. cerevisiae geneticamente modificadas FY1679-O1B²⁹ produzindo constitutivamente mKate2 citoplasmático (genótipo: URA3Δ / pTDH3 :: mKate2; cepa: S. cerevisiae mKate2³⁰) e U. maydis cepa AB33³¹ produzindo constitutivamente eGFP (genótipo: pep4Δ / pRpl40 :: egfp; cepa: U. maydis eGFP³²) foram utilizados. É importante notar que a cepa de cianobactérias foi equipada com um plasmídeo replicativo promovendo a expressão constitutiva e forte da versão da proteína fluorescente amarela mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, cepa Synechocystis mVenus, semelhante a³³) e, além disso, exibe a forte autofluorescência típica devido à presença da maquinaria fotossintética.

Quantificação microscópica usando câmaras de contagem: Todos os tipos de células na mistura artificial usada de três microrganismos podem ser facilmente discriminados microscopicamente (Figura 2A): Synechocystis e S. cerevisiae são representados por células esféricas que, no entanto, diferem muito em seu diâmetro (Synechocystis: aprox. diâmetro de 1,5-3 μm, S. cerevisiae: aprox. diâmetro de 3-6 μm), enquanto as células de U. maydis têm uma morfologia alongada em forma de charuto e um comprimento de pelo menos 10 μm (Figura 2A). Essas características morfológicas claras permitem a quantificação exata de cada parceiro na mistura. Como exemplo ilustrativo, 37, 18, 36 e 21 células de S. cerevisiae são contadas nos quatro grandes quadrados, respectivamente (Figura 2B). O valor médio é de 28 células. Como um grande quadrado do hemocitômetro utilizado tem uma área de 1 mm² e a profundidade da câmara foi de 0,02 mm, isso resulta em 28 células por 0,02 μL. Isso corresponde a 1.400 células/μL, o que equivale a 1,4 x 10⁶ células/mL. Os outros tipos de células foram contados e as concentrações foram determinadas de acordo (Figura 2C, Tabela 2).

Figura 2: Quantificação microscópica de um consórcio tripartido composto por Synechocystis e as leveduras S. cerevisiae e U. maydis. (A) Imagem de contraste diferencial microscópico (DIC) de uma mistura artificialmente combinada dos microrganismos indicados. Todas as espécies podem ser facilmente distinguidas por sua morfologia. Barra de escala: 10 μm. (B) Resultados de contagem exemplares para uma mistura montada artificialmente das cepas indicadas com base em culturas axênicas com um OD de 0,1. Os quatro grandes quadrados nas bordas da grade foram analisados (marca vermelha na Figura 1D). (C) O valor médio das diferentes células contadas nos quatro quadrados foi usado para calcular a concentração de células na suspensão usando a seguinte equação: Valor médio/(profundidade da câmara [0,02 mm] x tamanho do quadrado contado [1 mm²] x 1.000). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quantificação usando contadores de partículas: Os contadores de partículas determinam o número de partículas em uma suspensão, dependendo de seu tamanho. No conjunto de dados de exemplo, foi usado um contador de partículas com um capilar de 45 μm. Como as células de S. cerevisiae e U. maydis apresentam dimensões semelhantes, elas não podem ser distinguidas no contador de partículas, enquanto as células menores de Synechocystis podem ser claramente separadas. A análise de culturas individuais, portanto, mostra picos em posições idênticas referentes a 3 a 6 μm para as duas leveduras (Figura 3A). Durante a medição, é aplicada uma pressão negativa, o que faz com que as células entrem no capilar. Isso altera brevemente a resistência elétrica para que o dispositivo possa determinar o tamanho da partícula com base na alteração. Na cultura mista, dois picos distintos podem ser detectados, um associado às células cianobacterianas menores e o outro representando uma fração conjunta das duas espécies de leveduras (Figura 3B). É importante ressaltar que, além dos picos refletindo as células vivas, picos adicionais foram detectados em cerca de 1 μm (Figura 3), correspondendo a detritos celulares e partículas menores. Sinais que apareceriam em diâmetros maiores do que o esperado podem ser causados por agregações celulares. É importante notar que a forma dos picos reflete a homogeneidade das células: um pico acentuado mostra células muito homogêneas, o que é improvável para uma co-cultura. Em uma co-cultura, espera-se ver um pico muito amplo ou mesmo dois picos se os parceiros da co-cultura forem claramente diferentes em tamanho. Para as culturas axênicas de fungos heterotróficos, o pico pode ser um pico médio largo.

Figura 3: Quantificação de um consórcio tripartido composto por Synechocystis mVenus e as leveduras S. cerevisiae mKate2 e U. maydis eGFP usando um contador de partículas. (A) Saída visual das análises de culturas axênicas das três cepas, conforme indicado nos gráficos (contador de células com capilar de 45 μm). (B) Arquivo de saída visual exemplar para a análise do consórcio tripartido artificial usando condições idênticas. O contador de partículas não suporta a discriminação das duas espécies de leveduras, ambas representadas pelo segundo pico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quantificação por citometria de célula única: Usando o citômetro de fluxo de célula única, as diferentes populações de células podem ser facilmente distinguidas com base em suas propriedades de (auto) fluorescência e dispersão de luz. As células fototróficas (Synechocystis) podem ser diferenciadas das células heterotróficas (U. maydis e S. cerevisiae) com base na autofluorescência vermelha dos pigmentos fotossintéticos que é medida no canal APC-H (Figura 4A). Com base nessa separação inicial de células fototróficas e heterotróficas, as duas populações heterotróficas podem ser distinguidas com base em seus marcadores fluorescentes eGFP no canal FITC-H e mKate2 no canal PC5.5 ( Figura 4B , C ). Em um gráfico de pontos mostrando as propriedades de espalhamento de todas as três populações (FSC-H e FSC-Width), as populações também podem ser distinguidas com apenas algumas pequenas sobreposições das populações (Figura 4D).

Com este método, 10 μL das amostras diluídas foram analisadas com uma taxa de fluxo de 10 μL/min, permitindo uma quantificação de aproximadamente 70.000 células em 1 min. Aproximadamente 60% dessas células poderiam ser atribuídas a Synechocystis (4,23 x 10⁶ células/mL), enquanto os 40% restantes estavam igualmente distribuídos entre U. maydis (1,35 x 10⁶ células/mL) e S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ células/mL, Figura 4E, Tabela 2).

Figura 4: Quantificação de um consórcio tripartido composto pela cianobactéria Synechocystis mVenus e as leveduras U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 usando citometria de fluxo de célula única. Gráficos de exemplo obtidos após a medição de uma cultura mista de Synechocystis mVenus (verde escuro), U. maydis eGFP (verde claro) e S. cerevisiae mKate2 (vermelho) na proporção de 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ em um citômetro (A) mostrando um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal APC-H (ex.: 638 nm, em.: 660/10 nm) de todas as células usadas para diferenciar células fototróficas e heterotróficas com base em sua autofluorescência. (B) Um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal FITC-H (ex.: 488 nm, em.: 525/40 nm) de todas as células heterotróficas usadas para diferenciar células U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 com base em suas propriedades de fluorescência verde. (C) Um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal PC5.5-H (ex.: 561 nm, em.: 710/50 nm) de todas as células heterotróficas usadas para diferenciar células U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 com base em suas propriedades de fluorescência vermelha. (D) Um gráfico de pontos dos sinais de espalhamento na largura do FSC sobre o canal FSC-H usado para identificar as populações de células sem propriedades de fluorescência. (E) As estatísticas da população, incluindo as contagens de eventos, porcentagens e médias aritméticas e desvios padrão (DP) dos canais de fluorescência relevantes. A quantidade total de células, juntamente com seu tamanho e fluorescência, foi determinada em um volume de 10 μL com uma taxa de fluxo de 10 μL / min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para visualizar comparativamente a saída dos diferentes métodos de quantificação, os números de células determinados são apresentados nas duas tabelas a seguir (Tabela 2 e Tabela 3). As concentrações finais de células determinadas usando os três métodos descritos anteriormente estão em uma faixa semelhante para todos os métodos. O citômetro fornece o maior tamanho de amostra, seguido pelo contador de partículas e pela quantificação microscópica, com uma diminuição de aproximadamente uma ordem de grandeza entre os métodos.

Co-cultura 1:1:1		Fotômetro	Citômetro		Contador de partículas		Câmara de contagem de microscopia
Organismo		OD750/600	contagem de células	células/mL	contagem de células	células/mL	contagem de células	células/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1.36 x 106	1,546*	2,58 x 106*	112	1,40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1.35 x 106			89	1.11 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVênus		0.0333	42,330	4.23 x 106	3,094	5.16 x 106	271	3.39 x 106

Tabela 2: Comparação dos diferentes métodos de quantificação: Cultura artificial mista. Observe que U. maydis e S. cerevisiae não podem ser distinguidos usando um contador de partículas (*).

Cultura única		Fotômetro	Citômetro		Contador de partículas		Câmara de contagem de microscopia
Organismo		OD750/600	contagem de células	células/mL	contagem de células	células/mL	contagem de células	células/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3.89 x 106	1,928	3.21 x 106	403	4.03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3.69 x 106	2,465	4.11 x 106	307	3.07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVênus		0.1	127,864	1.28 x 107	8,186	1.36 x 107	428	1.07 x 107

Tabela 3: Comparação dos diferentes métodos de quantificação: Calibração com culturas únicas/axênicas.

Discussão

O manuseio de microrganismos em culturas axênicas únicas em um contexto de laboratório foi estabelecido há décadas para muitos modelos microbianos. No entanto, embora a forma de vida predominante na natureza sejam as comunidades microbianas, a combinação de dois ou mais parceiros em um único vaso de cultivo é menos estabelecida e os desafios são apresentados por lacunas no conhecimento e na metodologia existentes. Também é mais difícil prever o comportamento das células em uma comunidade, pois surgem interações emergentes e troca de metabólitos entre as células, influenciando fortemente o destino da co-cultura^34,35. Portanto, o estabelecimento da co-cultura não é trivial, inclusive no nível de definição do meio de crescimento, a identificação de condições comuns de crescimento, a troca entre espécies de metabólitos/sinais vestigiais e a composição de co-cultura resultante ao longo do tempo. O progresso dos últimos anos na montagem de cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar com parceiros heterotróficos agora permite deduzir as primeiras regras e metodologia que podem fornecer uma diretriz útil para o projeto de novos pares de co-cultivo. Com base nesse conhecimento, na primeira parte deste protocolo é fornecida uma diretriz passo a passo para a montagem de co-culturas contendo uma cianobactéria de secreção de sacarose e uma ou mais leveduras.

Uma consideração crítica ao tentar estabelecer uma co-cultura entre micróbios não relacionados é a composição de um meio de crescimento comum que satisfaça todos os requisitos de nutrientes para as duas ou mais espécies. Devido a limitações de espaço, não é viável fornecer um protocolo totalmente detalhado para esse processo aqui, que também pode exigir um alto grau de personalização em alguns casos, mas, em vez disso, o seguinte descreve considerações importantes a serem lembradas. Uma abordagem inicial direta envolve a comparação do meio de crescimento típico de cianobactérias (por exemplo, BG11; ver Tabela 1) com qualquer meio mínimo estabelecido composto para as espécies heterotróficas de interesse. Suplementar o meio cianobacteriano padrão com quaisquer componentes ausentes contidos no meio mínimo heterotrófico é um bom ponto de partida para o teste inicial ^8,36. Lembre-se de que, como os meios mínimos são frequentemente suplementados com uma fonte significativa de carbono orgânico para o crescimento heterotrófico (por exemplo, 1% -4% de glicose), eles geralmente são projetados para suportar uma densidade celular heterotrófica mais alta do que a provável de ser alcançada em experimentos iniciais de co-cultura. Da mesma forma, alguns componentes comuns do meio também podem atuar como uma fonte de carbono orgânico independentemente do fotossintato fornecido pelo parceiro cianobacteriano (por exemplo, citrato), o que pode complicar a análise posterior de co-culturas de cianobactérias / heterótrofos. Portanto, pode não ser necessário complementar o meio mínimo de cianobactérias com a concentração total de elementos ausentes ao projetar um meio de co-cultura. Por exemplo, muitos organismos variam em sua eficiência de uso de diferentes formas de nitrogênio ambiental (por exemplo, N₂, nitrato, nitrito, uréia) e podem ser completamente incapazes de utilizar algumas das fontes de nitrogênio mais oxidadas. Da mesma forma, muitos micróbios podem exigir suplementação de vitaminas essenciais (por exemplo, vitamina B₁₂), cofatores ou aminoácidos essenciais porque não possuem vias biossintéticas completas para a síntese direta desses compostos. Por essas razões, pode ser mais prático começar simplesmente "fundindo" o meio mínimo estabelecido do parceiro cianobacteriano (por exemplo, BG11) com um meio mínimo bem definido do heterotrófico (por exemplo, sintético definido [SD]). Ciclos posteriores de remoção/redução reiterada de componentes supérfluos podem ser usados para otimizar o meio e reduzir a abundância de quaisquer compostos que possam ser inibidores do crescimento de um dos parceiros. Um ponto de partida útil é tamponar o meio em um pH neutro ou ligeiramente básico, pois essas tendem a ser condições favorecidas pela maioria das espécies modelo de cianobactérias.

Neste ponto, muitas vezes é útil realizar testes preliminares do crescimento do heterotrófico suportado no novo meio de co-cultura quando um excesso de sacarose é fornecido. É claro que, ao selecionar um potencial heterótrofo, é importante escolher um que seja capaz de catabolizar a(s) fonte(s) primária(s) de carbono orgânico que será fornecida pelo parceiro cianobacteriano. É útil notar aqui que a sacarose, como o carboidrato dominante fornecido em muitas culturas cianobacterianas / heterotróficas projetadas⁴, não é um carboidrato tão universalmente utilizado por micróbios heterotróficos quanto a glicose: transportadores de sacarose dedicados devem ser codificados pelas espécies heterotróficas ou invertases extracelulares podem ser necessárias para converter sacarose em frutose e glicose que são frequentemente reconhecidas por transportadores de maior afinidade⁸. Uma observação importante comumente relatada por vários laboratórios que pesquisam comunidades microbianas mistas é que sinergias e antagonismos de ordem superior emergem entre os parceiros fototróficos e heterotróficos ^4,8,13. Por exemplo, outros metabólitos secretados naturalmente (por exemplo, ácidos orgânicos, formas reduzidas de nitrogênio) ou cofatores (por exemplo, sideróforos) podem permitir taxas de crescimento mais altas de um ou ambos os parceiros quando cultivados no mesmo meio em relação aos controles axênicos. Por outro lado, subprodutos metabólicos potencialmente prejudiciais, como a hiperoxigenação do meio por divisão fotossintética da água, foram relatados como causadores de inibição do crescimento entre espécies para um ou ambos os parceiros⁸. Portanto, os controles axênicos podem fornecer uma referência útil, mas o desempenho da co-cultura pode variar das expectativas devido a essas propriedades emergentes.

Dependendo do parceiro heterotrófico e das capacidades de S. elongatus para excretar sacarose (com base no nível de indução, concentração de IPTG usada), diferentes proporções de ambos os organismos devem ser testadas. O sucesso das culturas depende principalmente da capacidade de S. elongatus de manter o crescimento do parceiro heterotrófico (ou seja, pode produzir fonte de carbono suficiente). Embora o crescimento excessivo da cepa heterotrófica seja tipicamente limitado pela falta de carbono orgânico fornecido na composição do meio de cocultura, as cianobactérias podem superar a heterotrófica, o que pode levar a interações inibitórias emergentes (por exemplo, condições hiperóxicas ^8,13). Ao tentar determinar inicialmente as proporções apropriadas de densidade celular para a cianobactéria: levedura, uma boa regra aproximada é que o parceiro cianobacteriano pode suportar um volume celular igual das células heterotróficas que o acompanham. Como as leveduras eucarióticas tendem a ter volumes celulares consideravelmente maiores do que as cianobactérias secretoras de sacarose modelo, isso provavelmente pode significar que a densidade de células cianobacterianas será consideravelmente maior (por exemplo, 50-100 vezes para S. cerevisiae) em estado estacionário. Portanto, um bom ponto de partida ao estabelecer uma nova co-cultura com as condições específicas do laboratório e da espécie do pesquisador seria calcular o volume celular médio da cianobactéria e da levedura (com base nos valores publicados; por exemplo, ver B10NUMB3R5³⁷) para estimar a proporção volumétrica. Os frascos iniciais podem ser semeados com essa proporção de células. Para explorar o espaço da solução, o pesquisador pode querer manter a concentração de cianobactérias constante (por exemplo, OD₇₅₀ = 0,3) enquanto varia a concentração de células de levedura para cima ou para baixo em aproximadamente uma ordem de magnitude em incrementos com base no rendimento permitido pelo espaço de cultivo fototrófico disponível do pesquisador. É claro que essa "regra prática" volumétrica depende da taxa na qual o parceiro fototrófico é capaz de secretar fotossintatos orgânicos (por exemplo, sacarose) que podem ser utilizados pelo parceiro heterotrófico. Uma vez estabelecidas as condições de co-cultivo, o monitoramento cuidadoso do desempenho de crescimento de ambos os parceiros ao longo do tempo fornecerá dados valiosos sobre as proporções ideais de espécies, especialmente se as co-culturas iniciais puderem ser mantidas por dias a semanas, permitindo assim que o pesquisador identifique a proporção em estado estacionário alcançada perto do final de uma co-cultura. Essas informações podem ser utilizadas ao selecionar a densidade de inoculação inicial para cada espécie parceira em experimentos subsequentes para ajudar a cultura a atingir mais rapidamente a proporção ideal de espécies autodeterminada.

Na segunda parte do protocolo, são fornecidas instruções detalhadas para análise de cocultura. Uma quantificação confiável das co-culturas é a chave para sua implementação bem-sucedida: o crescimento (ou pelo menos a atividade metabólica) do parceiro fototrópico secretor de carbono é essencial para sustentar os heterótrofos. Embora a proporção de cianobactérias: heterótrofos usada para inocular a cultura nem sempre seja crítica para otimizar, uma vez que as co-culturas de longo prazo tendem a convergir para proporções estáveis, pode ser importante integrar métodos para verificar o crescimento desenfreado de qualquer um dos parceiros por meio da diluição da cultura ou encapsulamento de uma ou mais espécies^{36 , 38 , 39 , 40}. Como mencionado acima, os subprodutos do parceiro cianobacteriano podem ser inibitórios para o heterótrofo em altas concentrações (por exemplo, O₂), e alguns produtos do metabolismo heterotrófico também podem ser prejudiciais à saúde das cianobactérias. A maioria das coculturas publicadas utiliza heterótrofos que têm uma taxa de crescimento mais rápida do que a maioria das espécies de cianobactérias modelo; Portanto, a taxa de crescimento heterotrófica tende a ser limitada pelo fornecimento de carbono orgânico produzido pela cianobactéria. No entanto, a determinação da dinâmica de abundância das espécies ao longo do tempo é um valor crítico para elucidar falhas na estabilidade e otimizar co-culturas robustas em cultivo de longo prazo.

São fornecidos protocolos para quantificação usando câmaras de contagem, contadores de partículas e citometria de fluxo de célula única. Todas as técnicas são ferramentas valiosas para a caracterização de co-culturas, porém, com diferentes pré-requisitos, vantagens e limitações. As câmaras de contagem são amplamente aplicáveis para quantificação de cocultura, desde que todos os parceiros na cultura possam ser distinguidos visualmente por suas formas celulares ou outras propriedades. A grande vantagem é o baixo preço deste dispositivo, de modo que é basicamente alcançável para todos os laboratórios. Além de informações sobre a composição da co-cultura e a proporção dos diferentes parceiros, uma impressão da morfologia e aptidão da célula pode ser obtida ao lado, e potenciais contaminantes podem ser detectados. No entanto, a aplicação da câmara de contagem também é muito demorada, vem com uma alta carga de trabalho e só pode suportar um baixo rendimento.

Tanto os contadores de partículas quanto a citometria de fluxo de célula única fornecem os enormes benefícios de um alto rendimento e manuseio conveniente e com economia de tempo. Enquanto o contador de células depende de diferenças claras nos tamanhos das células dos parceiros na cocultura, a citometria de célula única também pode discriminar os rótulos de fluorescência, resultando na capacidade de quantificar coculturas com mais de dois membros do mesmo tamanho ou mesmo dois mutantes diferentes do mesmo organismo com base em diferentes marcadores fluorescentes. No exemplo fornecido de uma montagem artificial de Synechocystis com S. cerevisiae e U. maydis, os repórteres de fluorescência intracelular mKate2 e eGFP foram usados para discriminar as duas leveduras. Os mesmos repórteres fluorescentes também podem ser usados para distinguir duas cepas geneticamente modificadas do mesmo organismo (por exemplo, S. cerevisiae) que não podem ser separadas com base apenas em suas propriedades de dispersão de luz. Estratégias semelhantes foram implementadas para rastrear consórcios bacterianos sintéticos⁴¹. Dependendo do tipo de célula, do número de parceiros em um consórcio e de sua faixa potencial de autofluorescência (s), a seleção de marcadores fluorescentes precisa de atenção extra para evitar a sobreposição de qualidades espectrais, principalmente devido às propriedades autofluorescentes das cianobactérias. ⁴²

Defendemos aqui como aderir aos princípios orientadores do FAIR em termos de armazenamento, gerenciamento e compartilhamento de dados científicos. FAIR é um acrônimo que significa Findable, Accessible, Interoperable, and Reusable⁴³. À medida que esses princípios ganham maior aceitação, eles prometem transformar o cenário da pesquisa biológica, promovendo uma abordagem mais aberta, colaborativa e eficiente para o gerenciamento e uso de dados. Embora os componentes críticos de acessibilidade possam ser garantidos pelo depósito de dados no Contexto de Pesquisa Anotado (ARC)⁴⁴, é importante permitir a reprodução das etapas de processamento de dados com software de acesso aberto. Os arquivos FCS brutos armazenam dados e metadados (informações sobre lasers e detectores, incluindo comprimentos de onda, filtros, etc.) sobre experimentos de citometria de fluxo⁴⁵. Eles podem ser carregados e lidos fora de um software proprietário que permite uma análise de dados sofisticada, por exemplo, vários pacotes estão disponíveis para trabalhar com dados brutos dentro do ambiente Python. O pacote desenvolvido demonstra como carregar, ler e visualizar arquivos .fcs brutos contendo dados de citometria fora do software proprietário usando um dos muitos pacotes disponíveis no Python²³. O uso de software aberto, como descrito acima, elimina a necessidade de taxas de licenciamento caras associadas ao software proprietário, fornece controle total sobre o processamento de dados (por exemplo, transformação, compensação, gating) e, adicionalmente, permite a integração de várias ferramentas em um só lugar.

Um benefício extra valioso da utilização da citometria de célula única em conjunto com um classificador de células é a oportunidade de também coletar células de um tipo distinto por FACS. Isso pode ser extremamente valioso para a aplicação de qualquer tecnologia -ômica para obter informações detalhadas sobre a interação das espécies dentro da co-cultura, como RNASeq ou metabolômica. A clara desvantagem desses dispositivos são seus preços altos, portanto, a acessibilidade e a disponibilidade de tais máquinas podem ser uma limitação aparente em alguns laboratórios.

Curiosamente, uma comparação direta dos métodos apresentados para quantificação dos três parceiros em um consórcio revelou uma concordância muito boa entre as diferentes técnicas, indicando que a mistura que foi montada com base em medições de OD é quantificada de forma confiável por todos os métodos descritos. Curiosamente, o número total de cianobactérias foi cerca de 3-4 vezes maior do que o número das duas espécies de leveduras, um fenômeno provavelmente devido ao seu menor tamanho celular. Esta observação está de acordo com o conhecimento comum de que os ODs não fornecem informações sobre o número real de células sem calibração⁴⁶. As leveduras, no entanto, apresentaram contagens em nível comparável (Tabela 2 e Tabela 3). Além disso, a comparação com a quantificação das culturas individuais demonstra que todos os três métodos são ferramentas confiáveis para discriminar os tipos de células, com exceção do contador de partículas que não separou as duas espécies de leveduras.

Em essência, as aplicações de citometria de célula única são claramente a ferramenta mais poderosa para monitorar a composição de co-culturas, permitindo a contagem de 1.000 a 10.000 células por segundo. Isso é especialmente verdadeiro se o número de parceiros aumentar para mais de dois ou se os parceiros forem semelhantes em forma e/ou diâmetro. Notavelmente, existem muitas alternativas que permitem o monitoramento de co-culturas. O crescimento de micróbios marcados com fluorescência em co-culturas pode, por exemplo, ser rastreado continuamente por fluorimetria ou microbiorreatores⁴⁷. No entanto, estes são frequentemente limitados a uma co-cultura de dois parceiros e requerem um planejamento experimental cuidadoso, por exemplo, na escolha de marcadores de fluorescência. O sequenciamento de amplicon (sequenciamento de rRNA 16S) e outras técnicas de sequenciamento de próxima geração em combinação com bioinformática sofisticada é outra opção para a caracterização de comunidades sintéticas 48,49,50. Essas técnicas são adequadas para abordagens de alto rendimento e podem abordar interações estabelecidas em cultivos de longo prazo, questões evolutivas ou rastreamento de mutações com vários parceiros microbianos.

Em conjunto, as coculturas microbianas simplistas que são racionalmente projetadas fornecem uma poderosa abordagem "de baixo para cima" para interrogar a dinâmica interespécies que pode ser mais difícil de abordar dentro de comunidades multiespécies que dominam o mundo natural 51,52,53. Aqui, é fornecido um protocolo simplificado que pode ser prontamente adaptado pela comunidade científica para o estabelecimento e análise de novos pares de cianobactérias e parceiros heterotróficos. É evidente que muita pesquisa é necessária para capitalizar os potenciais insights fundamentais que podem ser obtidos de co-culturas microbianas artificiais, bem como para determinar se consórcios microbianos projetados sinteticamente podem corresponder ao potencial frequentemente atribuído a eles na literatura para aplicações biotecnológicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetiva Ph1 10x	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
Filtro passa-banda 525/40 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	Filtro FITC (em laser de 488 nm)
Filtro passa-banda de 660/10 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	Canal APC (em laser de 638 nm)
Filtro passa-banda de 710/50 nm	Beckman Coulter, Inc.	B71092	Canal PC5.5 (em laser de 561 nm)
Accuvettes para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Copos de amostra com tampas
Tubo de abertura 30 μ M para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760
Autoclave	Lab Associates	EQM-ARBP	para esterilização de material
Frascos defletores ROTILABO®, Gargalo reto, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 componentes	diferentes fornecedores		ver Tabela 1
Filtro estéril de topo de garrafa	Sigmaaldrich	Z222593	a meios estéreis se você não quiser usar autoclave
Capilar 45 µ m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Contador de Células Modelo TTC	Schaerfe Systems
CASY copos	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Solução
de limpeza CASYton	Solução Omni Life Science	OLS 5651808	Solução isotônica
Tubos de centrífuga (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	para fornecer culturas axênicas e co-culturas de cianobactérias
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Solução de limpeza profunda
Vidro de cobertura 20 &vezes; 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Vidro de cobertura para câmara de contagem
Cuvettes	Sarstedt	67.742
Cianobactérias BG-11 Solução de água doce	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Software de aplicação de citômetro
CytoFLEX Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	Citômetro de fluido de bomba
CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
DxH Cleaner para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Solução de limpeza
Centrífuga tubular Eppendorf (pequena)	Labstac	CEN16-15	para centrifugar menos de 2mL de cultura
Etanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
Tubos FACS	Beckman Coulter, Inc.	2523749	tubos para o modo semiautomático
FlowClean Cleaning Agent, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Solução de limpeza diária
Cilindros graduados	Sigmaaldrich	Z131121	para preparação de meios
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron photoincubator	Infors AG		luz LED branca
IPTG	Merck KGaA	I6758	Prepare alíquotas, armazene a -20° C, descongele e mantenha no gelo
Isoton II para Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Solução isotônica
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Software de análise de dados de citometria
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Tecidos sem fiapos
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Copos de medição	VWR	213-3747
Placa de teste micro, 96 poços, tampa de encaixe, fundo plano, PS, transparente	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Base do microscópio	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Cabeça de microsope	Carl Zeiss AG	47 30 14
Sistema de purificação de água Milli-Q	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e contador de partículas	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternativa ao contador de células CASY
Neubauer melhorado, profundidade 0,02 mm	Assistente Alemanha		Câmara de contagem
Neubauer melhorada, profundidade 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Câmara de contagem
pronta a usar diariamente QC Fluorospheres	Beckman Coulter, Inc.	C65719	Referência para
garrafas QC SCHOTT	Dutscher	90347	para armazenamento
Specord® 200 Plus Espectrofotômetro	Analítico Jena GmbH		OD600 / 750
Sacarose	Merck KGaA	84100
Centrífuga de mesa (grande)	Labstac	CEN18-06R	coletar cultura biomassa
Levedura Base de nitrogênio, sem aminoácidos, sem sulfato de amônio	Thermo Fisher Scientific Inc.