Isolamento e registro de patch-clamp de células inteiras da microglia hipocampal de camundongos adultos

Resumo

O presente protocolo descreve como isolar e purificar a micróglia primária do hipocampo de camundongos adultos, seguido de instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras nessas células agudamente isoladas.

Resumo

A microglia são células imunes residentes no cérebro que interagem com os neurônios para manter a homeostase do sistema nervoso central (SNC). Estudos mostram que a superfície microglial expressa canais de potássio que regulam a ativação microglial, enquanto anormalidades nesses canais de potássio podem levar a doenças neurais. Atualmente, os registros de microglia de células inteiras são realizados principalmente em microglia primária cultivada de camundongos fetais ou recém-nascidos devido a dificuldades na realização de avaliações eletrofisiológicas em microglia agudamente isolada. Este estudo apresenta um protocolo fácil de seguir para isolar a micróglia do hipocampo de camundongos adultos e realizar gravações de patch-clamp de células inteiras nas células isoladas. Resumidamente, o cérebro foi removido de um camundongo após a decapitação, o hipocampo foi dissecado bilateralmente e a micróglia foi isolada usando um kit de dissociação cerebral de camundongo adulto. A microglia foi então purificada usando um método de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e semeada em lamínulas. O isolamento microglial bem-sucedido foi confirmado por coloração imunofluorescente com anticorpos anti-CD11 e anti-Iba1. Uma lamínula foi colocada em uma câmara de registro e as correntes de potássio de toda a célula da micróglia agudamente isolada foram registradas em condições de pinça de voltagem.

Introdução

A microglia, que deriva de progenitores mielóides no saco vitelino primitivo, é residente no SNC e compreende cerca de 10% a 15% do total de células nervosas ^1,2. Funcionalmente, além de vigiar o ambiente local, desempenhar funções de defesa imunológica e fornecer nutrição e suporte para os neurônios ^3,4, a microglia também pode entrar em contato direto com os neurônios para regular os receptores de superfície neuronal e a ligação do ligante correspondente e interagir indiretamente com os neurônios por meio da secreção de citocinas⁵. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que a microglia expressa vários tipos de canais de potássio, que contribuem para a manutenção do potencial negativo de membrana⁶ e regulam a ativação microglial. Dado que canais anormais de potássio microglial foram observados em várias doenças cerebrais⁷, é crucial que os pesquisadores identifiquem possíveis medicamentos que tenham como alvo esses canais de potássio e desenvolvam estratégias para regular a função microglial.

Os métodos tradicionais de digestão e purificação da micróglia geralmente usam todo o cérebro, o que ignora a heterogeneidade da micróglia em diferentes áreas do cérebro⁸. A dissociação in vitro e a cultura de longo prazo em meios contendo soro colocam a microglia em um estado ativo⁹, o que pode não refletir com precisão suas características fisiológicas e estado verdadeiro.

Além disso, embora as correntes de potássio retificadoras externas tenham sido registradas na micróglia primária de recém-nascidos cultivados e linhagens celulares¹⁰, os dados de culturas de longo prazo de tecido cerebral fetal ou de camundongo recém-nascido podem diferir daqueles da micróglia madura. O presente protocolo visa isolar agudamente a microglia e realizar imediatamente registros de células inteiras das correntes microgliais de potássio usando tecido cerebral de camundongo adulto.

As propriedades bioquímicas e dos canais de potássio foram examinadas usando um método adequado para o isolamento e purificação da microglia de pequenos tecidos 11,12,13,14,15. Portanto, este protocolo fornece orientação para os pesquisadores elucidarem as propriedades bioquímicas e funcionais da microglia em condições fisiológicas e de doença. Embora este protocolo use o hipocampo e os canais de potássio como exemplos, ele também pode ser aplicado ao estudo de outras áreas cerebrais e propriedades eletrofisiológicas de canais / células.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Ciências da Vida da Universidade Normal do Sul da China, e os padrões apropriados de bem-estar animal foram mantidos (aprovação ética: SCNU-SLS-2023-048). Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas de 3-5 meses de idade foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação das soluções

1. Prepare 50 mL de solução intracelular contendo 160 mM de KF, 10 mM de HEPES, 10 mM de EGTA e 2 mM de MgCl₂. Ajustar o pH a 7,2 com 1 M de solução de KOH e ajustar a pressão osmótica a 300 mOsm com D-sacarose^13,16. Conservar a -20 °C.
2. Prepare 50 mL de tampão de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS.
3. Preparar a poli-L-lisina (PLL) numa diluição de 1:1000 em água.
   NOTA: As lamínulas devem ser revestidas com PLL no dia anterior ao experimento. Incubar as lâminas revestidas a 37 °C durante a noite. Recicle o PLL no segundo dia e seque as tiras revestidas a 37 °C.

2. Preparação de suspensão unicelular a partir de tecido cerebral

1. Anestesiar os camundongos com 2,5% de hidrato de cloral (0,15 mL / 10 g, i.p.) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). O desaparecimento do reflexo da córnea e do reflexo da dor por beliscar os dedos dos pés ou beliscar a pele em camundongos confirma a anestesia profunda. Coloque os animais em decúbito dorsal em uma mesa de dissecação e prenda seus membros.
   1. Exponha o tórax e perfunda o coração¹⁷ com PBS estéril gelado para remover as células sanguíneas circulantes intravasculares. Segure a cabeça e corte a pele ao longo da linha média do cérebro com uma tesoura para expor o crânio.
   2. Corte a parte posterior do crânio bilateralmente e entre as órbitas oculares com uma tesoura pequena. Corte o crânio ao longo da sutura sagital e remova o crânio com uma pinça. Extraia o tecido cerebral rapidamente com uma pinça¹⁷.
2. Coloque o tecido cerebral em placas de cultura de 10 cm contendo PBS gelado. Disseque o córtex cerebral bilateralmente com uma pinça, isole o tecido do hipocampo e corte-o em pedaços menores. Transfira as peças para um tubo de centrífuga de 15 mL.
   NOTA: A dissecção bilateral do córtex cerebral revela o crescente do tecido hipocampal em ambos os hemisférios do cérebro.
3. Ressuspenda os pequenos pedaços de tecido hipocampal em 2 mL de solução salina balanceada de Hank gelada (HBSS) e centrifugue a 300 × g por 3 min (à temperatura ambiente) e, em seguida, descarte o HBSS.
4. Adicione 1950 μL de mistura enzimática 1 ao tubo de centrífuga de 15 mL contendo os pedaços de tecido hipocampal. Agitar continuamente o tubo da centrífuga em banho-maria a 37 °C durante 5 min.
   NOTA: A mistura enzimática 1 é uma combinação de 50 μL de enzima P e 1900 μL de tampão Y, pré-aquecido a 37 ° C (presente como parte do kit disponível comercialmente, consulte a Tabela de Materiais).
5. Remova o tubo da centrífuga do banho-maria. Adicione 30 μL de mistura enzimática 2 recém-preparada ao tubo de centrífuga de 15 mL. Pipetar os fragmentos de tecido para cima e para baixo 20 vezes com uma ponta de pipeta de 1 mL e incubar em banho-maria por 5 min com agitação contínua a 37°C.
   NOTA: A mistura enzimática 2 é uma combinação de 20 μL de tampão Y e 10 μL de enzima A. As duas etapas de digestão acima convertem o tecido cerebral em uma suspensão celular. O tempo total de digestão não deve exceder 15 min.
6. Remova o tubo da centrífuga e pipete a suspensão para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 1 mL até que não haja mais pedaços grandes de tecido.
7. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de triagem celular de 70 μm e recolher o filtrado num tubo de centrifugação limpo de 50 ml.
   NOTA: Esta etapa remove quaisquer pedaços grandes de tecido não digerido.
8. Transferir o filtrado para um novo tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 4 °C, 300 × g durante 10 min. Descarte o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
9. Lave a suspensão celular pipetando para cima e para baixo 20 vezes com 15 mL de HBSS e centrifugue a 4 °C, 300 × g por 10 min. Rejeitar o sobrenadante e
   ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão MACS.
   NOTA: Esta etapa fornece a suspensão de célula única usada em experimentos subsequentes.

3. Separação aguda da microglia

1. Transferir 1 ml da suspensão monocelular para um tubo de microcentrífuga de 2 ml e centrifugar a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Descarte o sobrenadante.
2. Ressuspenda o pellet de célula única em 90 μL de tampão MACS. Adicionar 10 μL de microesferas de CD11b/c e incubar a suspensão a 4 °C durante 15 min num agitador horizontal.
3. Coloque a coluna de classificação no campo magnético de um separador MACS adequado e umedeça a coluna duas vezes com 500 μL de tampão MACS.
4. Lave a suspensão monocelular adicionando 1 ml de tampão MACS diretamente ao tubo e centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 3 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão MACS.
6. Transferir a suspensão de células ressuspensas para a coluna de triagem no campo magnético utilizando uma pipeta de 1 ml. Descarte o fluxo. Lave a coluna três vezes com 500 μL de tampão MACS enquanto ela permanece no campo magnético.
   NOTA: O fluxo contém células não rotuladas. A coluna deve ser lavada sem removê-la do campo magnético.
7. Remova a coluna de classificação do campo magnético. Adicione 1 mL de tampão MACS à coluna e empurre-o lentamente com o pistão. Colete o fluxo.
   NOTA: O fluxo contém as células marcadas (ou seja, a microglia). Para melhorar a pureza da microglia, o processo pode ser repetido com uma nova coluna de classificação (opcional).
8. Semeie as células selecionadas em uma placa de 24 poços contendo uma lamínula revestida com PLL. Adicione 200 μL de meio de cultura e incube por 20 min em uma incubadora a 37 °C com 95% de O₂, 5% de CO₂ e 60% -80% de umidade. Esta etapa permite que a microglia se prenda à lamínula para experimentos subsequentes de patch clamp e imunofluorescência de células inteiras.

4. Imunofluorescência

1. Aspire o meio de cultura dos poços da placa e lave as células três vezes com 0,1 M PBS no agitador.
2. Descarte o PBS e fixe a microglia na lamínula com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente (TR).
3. Remova o fixador e enxágue a lamínula três vezes com 0,1 M PBS.
4. Descarte o PBS e permeabilize as células com 200 μL de tampão de bloqueio contendo 0,2% de Triton X-100 e 5% de BSA em PBS por 1 h em RT no agitador.
5. Incubar a micróglia com tampão de bloqueio mais anticorpos primários anti-Iba1 e anti-CD11b¹⁸ durante a noite a 4 °C.
6. No dia seguinte, remova os anticorpos primários e enxágue a lamínula três vezes com PBS em RT no shaker.
7. Incube a microglia com o tampão de bloqueio contendo anticorpos secundários acoplados a fluoróforo por 2 h em RT. Adicione corante DAPI nos últimos 15 minutos de incubação.
8. Remova os anticorpos secundários e lave a lamínula três vezes com PBS. Monte as lamínulas nas lâminas do microscópio para obter imagens.

5. Registro de patch-clamp de célula inteira de correntes de potássio na microglia

1. Descongele a solução intracelular e mantenha-a no gelo.
2. Puxe pipetas de remendo (eletrodos) de capilares de vidro borossilicato de paredes finas usando um extrator vertical¹⁷.
   NOTA: A resistência do eletrodo deve ser inferior a 10 MΩ.
3. Transfira uma lamínula para a câmara de registro e adicione a solução extracelular contendo 160 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂ e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,2 com solução de NaOH 1 M antes de utilizar^13,16 e ajustar a pressão osmótica para 300 mOsm com D-sacarose.
4. Localize a microglia esférica sob um microscópio aquático usando a objetiva de 40x.
5. Encha o eletrodo com solução intracelular, conecte-o ao estágio principal do amplificador da configuração de eletrofisiologia e aplique pressão positiva. Mude para a objetiva 4x e localize o eletrodo.
   1. Abaixe o eletrodo na solução de banho e ajuste o amplificador para voltage clamp modo para realizar o teste de membrana no modo de banho . Volte para a objetiva de 40x e aproxime a ponta do eletrodo da microglia.
      NOTA: Quando a ponta do eletrodo está muito próxima de uma célula microglial, a resistência deve aumentar ligeiramente.
   2. Aplique uma pequena pressão negativa para segurar a célula. Quando a resistência atingir 100 MΩ, mude do modo de banho para o modo de remendo no teste de membrana. Quando a resistência atingir 300 MΩ, libere a pressão negativa.
   3. Quando a resistência indicar a formação de uma vedação de gigaohm (ou seja, >1 GΩ) entre o eletrodo e a membrana microglial, mude do modo patch para o modo de célula no teste de membrana.
6. Aplique uma pequena quantidade de sucção e inicie um choque elétrico para romper a membrana. O aparecimento de grandes transientes capacitivos indica ruptura bem-sucedida da membrana.
7. Mude para o modo de grampo de tensão e abra o programa de gravação. Registre as correntes de potássio por 200 ms. Para testar potenciais, aplique etapas de tensão em incrementos de 20 mV de -120 mV a +40 mV a 1 Hz.
8. Analise os dados obtidos offline usando o software apropriado.

Resultados

Resumidamente, o processo envolve o isolamento da micróglia hipocampal do cérebro de camundongos adultos, seguido pelo registro de patch-clamp de células inteiras dessas células (Figura 1). O procedimento começa com a dissecação do hipocampo de camundongos adultos C57BL / 6J de 3 a 5 meses de idade. Especificamente, todo o cérebro é removido após a perfusão e colocado em uma placa de cultura contendo PBS gelado (Figura 2A). Para garantir o isolamento agudo das células do hipocampo, o córtex cerebral é removido e o tecido hipocampal em forma de meia-lua é isolado intacto (Figura 2B).

Para uma qualidade celular ideal e subsequentes registros de patch-clamp de células inteiras de alta qualidade, é crucial controlar o tempo de digestão durante a preparação da suspensão de célula única. O estudo agitou manualmente o tecido hipocampal na mistura enzimática e limitou estritamente o período de digestão a não mais que 15 minutos (Figura 3). As células foram então isoladas pelo método MACS, alcançando uma pureza de 86,20% ± 0,68%^19,20. Para confirmar que essas células classificadas eram microglia, marcadores de superfície microglial foram testados por imunofluorescência usando anticorpos anti-Iba1 e anti-CD11b, que são amplamente utilizados para detectar microglia¹⁸. Os resultados indicaram que as células isoladas foram CD11b e Iba1 positivas, confirmando o sucesso do isolamento da microglia (Figura 4).

Finalmente, para avaliar se a micróglia agudamente isolada é de alta qualidade para experimentos de acompanhamento, descrevemos como realizar registros de patch-clamp de células inteiras para avaliar as correntes de potássio microglial. A micróglia registrada teve uma capacitância média de membrana de 10,42 ± 2,05 (Figura 5). Os resultados demonstraram que as correntes microgliais de potássio podem ser registradas, indicando que as microglias agudamente isoladas são adequadas para estudos neurobiológicos.

Figura 1: Visão geral do procedimento experimental. Existem quatro etapas principais: os tecidos cerebrais são cuidadosamente extraídos e o hipocampo é dissecado bilateralmente; os tecidos do hipocampo são digeridos para preparar uma suspensão unicelular usando uma mistura enzimática, conforme detalhado na seção do protocolo; As células-alvo são isoladas por um método de classificação de células ativadas por magnetismo; e as correntes de potássio em células agudamente isoladas são analisadas por registro de patch-clamp de célula inteira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dissecção do hipocampo. (A) Todo o cérebro de um camundongo de 3 a 5 meses de idade. (B) Hipocampo bilateral isolado. Barra de escala: 0,5 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diagrama esquemático mostrando a digestão dos tecidos do hipocampo. Ilustração de etapas experimentais críticas, garantindo que o tecido hipocampal seja digerido em uma suspensão unicelular adicionando misturas enzimáticas a 37 ° C com agitação contínua por até 15 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Identificação da micróglia hipocampal agudamente isolada. Imagens confocais representativas mostrando células CD11b (verde) e Iba1 (vermelhas) positivas purificadas do hipocampo, confirmando que as células isoladas são microglia. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Registro das correntes de potássio microglial de células inteiras. (A) Um eletrodo de registro é posicionado na superfície da microglia hipocampal isolada. Barra de escala: 20 μm. (B) Correntes representativas de potássio da microglia hipocampal agudamente isolada sob condições de grampo de tensão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A micróglia cultivada de camundongos fetais ou recém-nascidos é claramente inadequada para estudar a micróglia adulta. Além disso, dada a heterogeneidade da microglia em diferentes áreas do cérebro²¹, a microglia isolada de todo o cérebro pode não representar com precisão as características da microglia em uma estrutura cerebral específica. Este protocolo fornece um método para isolar a micróglia do hipocampo especificamente para avaliar as propriedades elétricas dessas células. Inclui métodos para registrar as correntes governadas pelos canais microgliais de potássio.

É bem sabido que a digestão do tecido precisa ser estritamente controlada ao preparar suspensões unicelulares para evitar comprometer as propriedades dessas células durante a cultura de células primárias e experimentos subsequentes. Normalmente, uma suspensão unicelular é obtida de todo o cérebro por meio da digestão enzimática pancreática e homogeneização física. No entanto, ao isolar a microglia de uma área específica do cérebro, como o hipocampo, a homogeneização física por si só não produz uma quantidade suficiente de células para experimentos significativos. Além disso, as enzimas pancreáticas têm atividade digestiva vigorosa, o que pode afetar a viabilidade celular.

Para resolver esses problemas, o estudo adotou um procedimento de dissociação relativamente leve e controlou manualmente o tempo de digestão para não mais de 15 minutos usando o kit de dissociação cerebral de camundongos adultos. Essa abordagem mantém a microglia em um estado ativo, o que é crítico para os registros subsequentes de patch-clamp de células inteiras. O procedimento de dissociação leve também oferece vantagens em termos de velocidade e custo-benefício.

Os métodos para a purificação da micróglia primária incluem o método de agitação estratificada (SSM)²², o método de centrifugação por gradiente de densidade (DGCM)²³ e o método de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)^11,24. Entre estes, o SSM é amplamente utilizado para a purificação de neurônios ou células gliais. No entanto, uma das principais limitações do MUS é a sua incapacidade de atingir níveis elevados de pureza²⁵. Da mesma forma, o DGCM também resulta em baixos níveis de pureza. O método FACS requer coloração de células por 15 min a 1 h, seguido de classificação com um classificador de células de alta velocidade, o que pode prejudicar a viabilidade celular. Em contraste, este protocolo utiliza o método MACS, que oferece um tempo de isolamento reduzido e evita o uso repetitivo e demorado de instrumentos e procedimentos de coloração. Como resultado, microglia de alta pureza são obtidas, embora em quantidades potencialmente menores em comparação com alguns métodos alternativos.

Existem limitações para esta técnica. Por exemplo, o método de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) produz relativamente poucas microglias, e a microglia agudamente isolada não pode ser cultivada por longos períodos. No entanto, essa abordagem é valiosa porque permite a investigação das propriedades eletrofisiológicas da microglia que foram recém-preparadas a partir do hipocampo de camundongos adultos, em vez de depender de células que foram cultivadas por um longo tempo.

A técnica de patch-clamp de células inteiras é uma ferramenta crucial e amplamente utilizada para estudar propriedades eletrofisiológicas celulares, particularmente neuronais, em áreas como neurociência, farmacologia e citobiologia²⁶. O registro de patch-clamp de células inteiras tem sido empregado em vários estudos para investigar as propriedades de fatias de cérebro agudamente dissecadas, culturas primárias e linhagens celulares. No entanto, faltavam registros de patch-clamp de células inteiras de micróglia agudamente isolada do cérebro de camundongos adultos até nossas investigações.

Este estudo não apenas fornece um protocolo para isolar a microglia do hipocampo adulta, mas também demonstra o registro bem-sucedido das correntes de potássio nessas microglias isoladas. Notavelmente, é provável que este protocolo se aplique ao estudo da micróglia em estruturas cerebrais diferentes do hipocampo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri de 100 mm	Corning	353003
15 mL Tubos Falcon	BD	352096
Placas de 24 poços	BD	353047
Placa de Petri de 35 mm	Corning
353001-50 mL Tubos Falcon	BD	352070
70 μ Triagem de células m	Miltenyi	130-095-823	Para remover aglomerados de células antes da classificação de células
Kit de dissociação cerebral de camundongo adulto	Miltenyi	130- 107-677
Anticorpo Anti-CD11b	Bio-Rad	MCA74	Cabra Anti-mouse IgG também disponível. Para bloquear imunoglobulinas endógenas.
Anticorpo anti-Iba 1	SYSY	234308	cabra Anti-cobaia IgG) também disponível. Para bloquear imunoglobulinas endógenas.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Amplificador	USA
BSA Albumina Fraction V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 camundongos			Laboratório Médico de Guangdong
CD11 b/c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Hidrato de Cloral	Absin	abs47051394	Amplamente utilizado como anestesia em camundongos
Clampfit 10.6	USA
Microscópio Confocal	Zeiss	LSM 800
Meio de cultura	Fisher Scientific
C11995500BT-DAPI corante	Beyotime	C1002
Extrator de eletrodos	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Agitador horizontal	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Software de análise de imagem	Fiji
Colunas MACS	Miltenyi	130-042-201
Separadores MACS	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldeído	Fisher Scientific	T353-500	Use solução fresca a 4% em 1X PBS, pH 7.2-7.4.
Poli-L-lisina	Beyotime	C0313	Revestimento de lamínula
Triton X-100	Sigma	X100