Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

Summary

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é usada para identificar desregulação nos metabólitos em pacientes com várias doenças. Essa técnica permite a quantificação dos metabólitos perturbados, desvendando os insights fisiopatológicos. Aqui, descrevemos o procedimento passo a passo da abordagem baseada em RMN para a caracterização metabólica dos pacientes.

Abstract

A metabolômica está emergindo como uma abordagem significativa para refletir a resposta do indivíduo às condições fisiopatológicas. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) evoluiu como uma ferramenta para identificar desregulações metabólicas em pacientes gravemente enfermos que sofrem de condições como síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), pancreatite aguda grave (SAP), lesão renal aguda (LRA) e sepse. Os dados espectrais da amostra de soro do grupo de estudo e controle são registrados usando um espectrômetro de RMN de 800 MHz e processados usando ferramentas de processamento e análise de RMN. Além disso, uma análise estatística rigorosa, como testes univariados e multivariados, é realizada para identificar metabólitos significativos, que são então identificados e quantificados com precisão usando o software de quantificação de metabólitos de RMN. Além disso, a análise de vias destaca os ciclos bioquímicos perturbados que resultam na gravidade da doença. Por meio dessa abordagem abrangente, os pesquisadores pretendem obter insights mais profundos sobre as alterações metabólicas associadas a essas doenças críticas, potencialmente abrindo caminho para uma melhor compreensão da doença e melhores estratégias de diagnóstico e tratamento.

Introduction

Apesar dos esforços contínuos para fornecer diagnóstico eficiente de doenças em todo o mundo, a terapia direcionada ainda não atingiu seu verdadeiro potencial. Várias abordagens, como transcriptômica, proteômica, etc., resultaram na identificação de vários biomarcadores, mas estes não tiveram utilidade clínica suficiente devido à falta de sensibilidade e especificidade ^1,2. A terapia direcionada é um grande desafio em algumas doenças multifatoriais, levando a uma maior mortalidade. Há necessidade de uma melhor compreensão do mecanismo subjacente e da fisiopatologia de doenças complexas existentes com ampla heterogeneidade. Assim, a este respeito, a evolução da metabolômica revolucionou o desenvolvimento terapêutico, o que eventualmente pode ajudar a adaptar os regimes de tratamento para várias doenças críticas, como síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), sepse e pancreatite aguda grave (SAP).

A metabolômica é uma abordagem abrangente que visa identificar e quantificar moléculas de pequeno peso molecular (metabólitos como aminoácidos, lipídios, peptídeos, ácidos orgânicos e vitaminas) em vários biofluidos, células ou extratos de tecidos. Esses metabólitos, que normalmente pesam menos de 1500 Da, desempenham papéis ativos nos processos bioquímicos, refletindo um esboço progressivo do estado biológico do organismo. Eles incluem substratos para os principais processos enzimáticos, intermediários em vias biológicas e subprodutos do metabolismo celular. Consequentemente, a metabolômica captura uma impressão digital detalhada das influências dietéticas, interações medicamentosas e estados de doença. As alterações metabólicas são indicadores altamente sensíveis do metabolismo e das vias biológicas, permitindo correlações com expressões fenotípicas e anormalidades fisiopatológicas resultantes ^3,4. As variações iniciais nos metabólitos podem servir como indicadores precoces da gravidade da doença, enquanto as mudanças temporais podem ajudar no monitoramento da eficácia do tratamento, progressão da doença e resultados clínicos ^5,6,7. A metabolômica, portanto, aprimora os ensaios clínicos e várias outras abordagens ômicas, redefinindo doenças por meio de desfechos clínicos, fisiológicos e bioquímicos 8,9,10,11,12,13. As capacidades analíticas da metabolômica são empregadas para monitorar e determinar a suscetibilidade à doença por meio de concentrações alteradas de metabólitos^14,15.

Nesse contexto, tanto a espectrometria de massa (MS) quanto a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) surgiram como as principais plataformas analíticas para o perfil de metabólitos em amostras biológicas. Esses métodos são usados para identificação e quantificação direcionada e não direcionada de metabólitos 16,17,18. Cada plataforma tem suas vantagens e limitações, mas a natureza não destrutiva da RMN a torna preferível em vários estudos in vivo e para a caracterização da estrutura de compostos desconhecidos, particularmente nos estágios iniciais da pesquisa metabolômica. O fracionamento, a derivatização e a ionização da amostra necessários antes da MS podem introduzir vieses e muitas vezes resultar em perda de amostra, afetando as características dinâmicas que a espectroscopia de RMN pode capturar com o mínimo ou nenhuma preparação da amostra. A principal limitação da RMN é sua menor sensibilidade em comparação com a EM, que oferece um limite inferior de detecção, dificultando a detecção de metabólitos menos abundantes¹⁹. No entanto, avanços como ímãs supercondutores de alta resolução, sondas de RMN resfriadas criogenicamente e técnicas que aumentam a sensibilidade mitigaram essa limitação 20,21,22. Como uma abordagem complementar à genômica e proteômica, o perfil metabólico usando espectroscopia de RMN está ganhando força como uma técnica preferida 23,24,25. A preparação mínima de amostras, reprodutibilidade e repetibilidade da RMN a tornam uma ferramenta valiosa para capturar as características dinâmicas inerentes aos metabólitos, apesar de seus desafios de sensibilidade²⁶.

Vários grupos de pesquisa realizaram metabolômica com sucesso, identificando o perfil metabólico desregulado de pacientes para várias doenças²⁷, como SDRA 28,29,30,31,32,33, pneumonia ³⁴, sepse⁷, cálculos biliares³⁵ e pancreatite³⁶. Estudos metabolômicos baseados em RMN de pacientes críticos têm sido fundamentais para rastrear a progressão da síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) para a síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (MODS), que é uma das principais causas de mortalidade e morbidade em unidades de terapia intensiva (UTI)³⁷. Em um estudo de Stringer e col., amostras de plasma foram usadas para examinar alterações metabólicas em pacientes com lesão pulmonar aguda (LPA) induzida por sepse em comparação com pacientes controles³⁸. Os principais metabólitos encontrados elevados neste estudo piloto refletiram as vias metabólicas envolvidas e sua associação com os escores clínicos. Esta pesquisa foi estendida à metabolômica sérica para diferenciar a sepse dos estágios iniciais dos mecanismos de lesão pulmonar na SDRA³². Além disso, outro estudo em SDRA identificou biomarcadores séricos potentes que diferenciam distintamente entre lesão pulmonar aguda/SDRA e controles saudáveis, oferecendo informações sobre alterações metabólicas sistêmicas correspondentes ao início agudo da lesão pulmonar^39,40.

A espectroscopia de RMN é uma técnica analítica automatizada e de alto rendimento que fornece informações robustas e imparciais sobre a impressão digital metabólica, revelando a fisiopatologia subjacente³⁸. A aplicação clínica e a interpretação biológica dos dados de RMN dependem da obtenção de espectros de alta qualidade que contenham informações ricas. Portanto, é crucial garantir a coleta, o processamento e a análise de dados precisos, uniformes e bem formulados. Portanto, o objetivo deste estudo é alavancar as etapas essenciais da metabolômica baseada em RMN para a identificação e quantificação de metabólitos. Este estudo destaca as principais etapas do protocolo necessário para o estudo metabolômico clínico (Figura 1), como a seleção de amostras apropriadas, coleta e armazenamento, processamento e preparação de amostras, aquisição e análise de dados, identificação e quantificação do metabólito de interesse e, eventualmente, interpretação dos resultados em um contexto clínico para obter insights relevantes. Cada uma dessas etapas é essencial para alavancar a espectroscopia de RMN em metabolômica para descobrir insights biológicos e clínicos significativos.

Protocol

A aprovação ética (código IEC: 2022-71-PhD-126) foi obtida do IEC do Instituto de Pós-Graduação em Ciências Médicas Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Foram obtidos consentimentos por escrito e informados dos pacientes ou de seus familiares para a realização do estudo e publicação dos dados para fins de pesquisa. Além disso, a pesquisa foi conduzida seguindo as diretrizes institucionais.

1. Desenho do estudo e liberação ética

1. Determine o tamanho da amostra para cada grupo. Revise cuidadosamente e estabeleça os critérios de seleção para os participantes. Além disso, se o desenho do estudo exigir a inclusão de amostras humanas ou animais, obtenha autorização ética do comitê de ética institucional (IEC) apropriado antes de iniciar a coleta da amostra.
2. Selecione pacientes com SDRA categorizados como leves, moderados e graves, com base nos critérios diagnósticos da definição de Berlim 2012 com base na pressão parcial de oxigênio no sangue arterial (PaO2) para a fração inspirada de oxigênio (FiO2) (P/F). Os pacientes com SDRA com uma faixa de P/F de 300-200 são considerados leves, 200-100 como moderados e abaixo de 100 como graves³⁸. Aqui, nos concentramos em dois grupos: pacientes com SDRA leve e moderada (ver Tabela 1).
   NOTA: O estudo envolve o uso de soro obtido de amostras de sangue para realizar metabolômica baseada em RMN. Neste estudo, os participantes incluídos para referência tinham idade média de 42 anos (± 10,9 anos), com distribuição por sexo de 2 homens e 6 mulheres.

Categoria	Relação P/F
Moderada	300-200
Moderado	200-100
Grave	100-0

Tabela 1: Categorização dos pacientes com SDRA.

2. Seleção, coleta e processamento de amostras

1. Realize o isolamento do soro seguindo as etapas descritas abaixo.
   1. Para experimentar, colete 2 mL de amostras de sangue das artérias usando uma agulha estéril em um frasco simples (sem aditivos) e estéril. Deixe a amostra coagular por 30 min em temperatura ambiente. Para este estudo, foram selecionados 4 pacientes com diagnóstico de SDRA leve e 4 pacientes com SDRA moderada.
   2. Centrifugue a amostra a 3100 x g por 15 min para separar o soro²⁵. Transfira o soro para tubos de microcentrífuga estéreis, fazendo alíquotas de menor volume (ou seja, 400-500 μL), rotule-as adequadamente (nome do paciente, número CR, ponto do dia, etc.) e armazene-as a -80 ° C para análise futura.
      NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser pausado e retomado em um momento conveniente.
2. Processe a amostra de soro antes dos experimentos de RMN usando as etapas a seguir.
   1. Descongele a amostra antes de realizar os experimentos de RMN. Misture 250 μL de alíquota do soro com 250 μL de solução tampão fosfato salino (contendo 100% D₂O, 0,9% NaCl, 50 mM tampão fosfato de sódio, pH 7,4) para minimizar a variação do pH.
   2. Vortex a mistura por alguns segundos (~ 15 s) para garantir que esteja homogeneamente misturada. Por fim, transferir a amostra preparada para um tubo de RMN limpo com inserto coaxial contendo propionato de trimetilsilil (TSP) na concentração de 0,05 mM, que serve como padrão externo para calibração e quantificação⁴¹.
      NOTA: Para referência, é utilizado um composto inerte e não reativo que não interage com os analitos. Outros compostos de referência comumente usados incluem tetrametilsilano (TMS) e trimetilsililpropanossulfonato de sódio (DSS).

3. Experimentação de RMN

NOTA: O foco está na identificação de pequenas moléculas nas amostras de soro, portanto, usamos a sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que suprime os sinais das macromoléculas. Todas as amostras de soro neste estudo foram registradas usando um espectrômetro de RMN de 800 MHz equipado com uma cabeça de sonda inversa de banda larga TCI de ressonância tripla de 5 mm resfriada criogenicamente e gradiente z blindado.

1. Coloque a amostra no ímã. Escreva o comando wrpa (mencione o número do experimento) e pressione enter para configurar um experimento de prótons com o programa de pulso cpmg. Mencione o nome do paciente e outros detalhes necessários clicando na opção Título.
2. Bloqueie o campo magnético escrevendo o comando Bloquear, pressione enter e selecione a opção 90% H₂O e 10% D₂O mais. Ajuste e combine a sonda manualmente por ATMM para otimizar a eficiência dos pulsos de radiofrequência e maximizar a sensibilidade. Execute o calço de gradiente 1D clicando em topshim.
3. Defina os seguintes parâmetros de aquisição, incluindo um atraso de relaxamento de 5 s, uma largura de varredura espectral de 12 partes por milhão (ppm) e um tempo de eco de 300 μs. Todos esses parâmetros podem ser facilmente modificados selecionando a opção Parâmetros de aquisição no painel superior.
4. Aplique o alargamento de linha de 0,3 Hz usando uma função de janela exponencial, coletando dados em 64.000 pontos em 128 varreduras. Esses parâmetros podem ser modificados da mesma forma selecionando a opção Parâmetros de aquisição no painel superior. Ao clicar em Parâmetros de aquisição, uma lista de especificações aparecerá, e os atributos mencionados, juntamente com outros parâmetros, podem ser modificados durante a otimização.
5. Adquira os espectros de RMN usando ferramentas de processamento e análise de RMN. Assim que os espectros finais forem obtidos, escreva o comando apk e absn e pressione enter para realizar a correção de fase e a correção da linha de base, respectivamente. Clique na opção Calibrar eixo presente no painel superior e, em seguida, calibre o pico do TSP para 0 ppm automática ou manualmente.
6. Transfira os dados adquiridos do sistema para a estação de trabalho, onde são feitos processamento e análise adicionais.
   NOTA: A fase experimental está concluída e pode ser pausada. O pré-processamento, análise e interpretação de dados podem ser realizados convenientemente.

4. Pré-processamento de dados

1. Realize o pré-processamento de dados usando ferramentas de processamento e análise de RMN e software de quantificação de metabólitos de RMN.
   1. Às vezes, apenas a correção automática não é suficiente e, nesse caso, a correção manual também é necessária. Para realizar a correção de fase manualmente, clique na opção Processar na barra de menu superior das ferramentas de processamento e análise de RMN. Em seguida, clique em Ajustar fase, arraste o mouse e observe até que os espectros sejam corrigidos de fase. Feito isso, clique na opção Salvar e Devolver (presente em forma de ícone) disponível na mesma barra de menu.
   2. Para realizar a correção manual da linha de base (método Whittaker), abra o arquivo espectral no módulo processador do software de quantificação de metabólitos de RMN. Selecione a opção Correção de linha de base. Em seguida, selecione a opção Método Whittaker. Agora coloque os pontos na base dos picos em todo o espectro (0,0 a 10 ppm geralmente no caso do soro ou de acordo com a disponibilidade do metabólito nos espectros) para ajustar a base. Depois que todos os arquivos espectrais tiverem sido corrigidos na linha de base, salve-os em uma única pasta. O processamento posterior, usando o processador ou o módulo profiler do software de quantificação de metabólitos de RMN, pode ser realizado usando o mesmo arquivo salvo no formato específico.
   3. Execute o binning usando o módulo profiler do mesmo software. Selecione a opção Ferramentas, Processo em lote e, em seguida, Agrupamento espectral.
2. Para gerar a planilha de compartimentalização final a ser usada para análise estatística, selecione a pasta que contém todos os arquivos espectrais corrigidos da linha de base após clicar em Compartimentalização espectral.
3. Divida os espectros em um número definido de caixas de tamanhos iguais com uma largura espectral definida, variando de 0,01 a 0,04 ppm (pode ser otimizado de acordo com o estudo). Esse processo simplifica e organiza os dados espectrais, facilitando uma análise mais consistente. Especifique o tamanho do bucket junto com os valores de ppm inicial e final e designe a pasta onde as planilhas de compartimentalização de saída serão salvas.
4. Exclua as regiões de deslocamento químico correspondentes à água e ao solvente TSP (4,8-5,2 e 0,0-0,7 ppm) para evitar interferência espectral 42,43,44.
5. Esta planilha contém os nomes de amostra em uma linha e os diferentes valores de compartimento, juntamente com ppm nas outras linhas. Antes de usar esta planilha para análise estatística, modifique-a organizando as amostras em grupos para análise e salvando-as apenas no formato delimitado por vírgulas (CSV).
   NOTA: Por exemplo, ao comparar o grupo leve com o grupo moderado de pacientes com SDRA, organizamos os dados com rótulos leves e moderados, adicionamos um número de série e salvamos o arquivo no formato CSV.

5. Análise estatística

NOTA: A planilha de compartimentalização obtida na etapa anterior serve como arquivo de entrada para análise estatística. Neste estudo, foi utilizado o módulo de análise estatística (um fator) do software de análise estatística metabolômica.

1. Antes da análise estatística, execute a etapa de normalização usando soma, log e Pareto, mas pode variar em diferentes estudos⁴⁵.
2. Realizar análises univariadas e multivariadas para distinguir os diferentes grupos e determinar a precisão dos metabólitos identificados.
   1. Realize análise de componentes principais (PCA), análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) para observar a discriminação entre os grupos que produzem pontuações de importância variável de projeção (VIP) para cada metabólito responsável pela diferença no perfil metabólico.
   2. Realizar métodos univariados, como o teste t de Student e ANOVA, para identificar os metabólitos significativos com base nos critérios de ter um valor de p menor que 0,05. Ambos os testes produzem gráficos de bigode de caixa mostrando a diferença na concentração relativa dos metabólitos.
   3. Realize a análise de biomarcadores, que produz uma área sob o gráfico da curva característica de operação do receptor (AUROC). O valor da AUC (área sob a curva) > 0,8 é considerado significativo⁴⁶.
   4. Selecione a lista final de metabólitos significativos usando os critérios pontuação VIP>1, valor de p corrigido por Bonferroni<0,05⁴⁴ e AUC > 0,8⁴⁶.
3. Identifique os metabólitos conforme descrito abaixo.
   1. O binning fornece metabólitos significativos na forma de valores de ppm em vez de nomes. Identifique os metabólitos correspondentes a valores específicos de ppm usando bancos de dados como o Banco de Ressonância Magnética Biológica (BMRB)⁴⁷e o Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB).
   2. Além desses, use a literatura publicada anteriormente^42,44 para identificação e validação.
   3. Use o módulo profiler do software de quantificação de metabólitos de RMN para confirmar os metabólitos identificados com seus valores de ppm.

6. Quantificação de metabólitos usando software de quantificação de metabólitos de RMN

NOTA: O módulo profiler do software é amplamente utilizado para quantificar os metabólitos identificados.

1. Antes de iniciar a quantificação, calibre o composto de referência selecionado para o estudo (tsp usado neste estudo) usando o módulo do processador. Clique na opção Calibrar CSI (indicador de forma química). Mencione a concentração do composto de referência (0,05 mM para este estudo). Em seguida, arraste o pico do software para o pico de referência espectral e ajuste sua altura e largura corretamente. Assim que os picos de referência espectral se ajustarem ao pico do software, clique em Aceitar.
2. Abra os espectros desejados no módulo profiler e selecione a biblioteca de compostos apropriada para estudo.
3. Na parte inferior da tela, uma lista de metabólitos é exibida. Selecione o metabólito de interesse nesta lista. Uma vez selecionado, o possível ppm do metabólito escolhido aparecerá no canto superior do espectro.
4. Selecione o valor de Ppm no canto superior e amplie os espectros para a escala específica de ppm do metabólito.
5. Neste ponto, dois picos aparecerão na tela: um representando os dados gravados e o outro, exibido como uma linha pontilhada, representando o pico do software. Alinhe os dois picos. Arraste o pico do software e ajuste sua altura e posição para corresponder ao pico presente na amostra.
6. Uma vez devidamente alinhada, a concentração do metabolito pode ser obtida a partir do valor apresentado na rubrica concentração em mM para esse metabolito (figura 1).
7. Siga o mesmo procedimento para todos os metabólitos e amostras e exporte os valores quantificados em uma planilha. Para gerar o arquivo de saída, clique na opção Operações em lote no menu Ferramentas . Especifique a pasta desejada para salvar o arquivo de saída.

7. Análise de vias

NOTA: Os metabólitos significativos identificados após a análise são utilizados para determinar as principais vias que influenciam diretamente o resultado em grupos de doenças. O módulo de análise de vias do software de análise estatística metabolômica e o banco de dados KEGG são geralmente empregados para esse fim.

1. Insira a lista obtida de metabólitos significativos no módulo. Uma lista contendo os nomes dos caminhos é gerada.
2. Selecione as vias finais com base em um critério de ter um fator de impacto maior que 0,1. Valores de impacto significativos indicam vias relacionadas à doença³⁰.
3. Analise minuciosamente as vias resultantes para elucidar a desregulação associada à gravidade da doença. Um dos deméritos desse método é sua ineficiência em identificar as vias desreguladas quando os metabólitos significativos são menores que 3.
4. Para lidar com o mesmo, o metabólito identificado e sua correlação com a gravidade da doença também podem ser determinados usando a literatura publicada anteriormente. Faça uma pesquisa bibliográfica completa e observe se o metabólito identificado também está seguindo a mesma tendência de acordo com seu interesse.

Figura 1: Etapas fundamentais na metabolômica baseada em RMN. A figura apresenta as principais etapas da metabolômica baseada em RMN: coleta e preparação de amostras, realização de espectroscopia de RMN, pré-processamento de dados, realização de análises estatísticas, identificação e quantificação de metabólitos e interpretação do significado biológico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Para realizar um estudo metabolômico, é essencial determinar o tamanho da amostra e os grupos específicos que serão analisados. A seleção de um tamanho amostral adequado é essencial para a obtenção de resultados significativos que se correlacionem com precisão com a gravidade da doença⁴⁸. No entanto, neste trabalho em particular, usamos um pequeno tamanho de amostra para demonstrar as etapas envolvidas na identificação e quantificação de metabólitos usando metabolômica baseada em RMN, que se destinava principalmente à referência. Neste estudo, examinamos as diferenças metabólicas entre pacientes nos estágios leve e moderado da SDRA no dia 1 de sua internação na UTI, incluindo um total de 8 indivíduos. Seguindo o protocolo, espectros de RMN de todas as amostras foram adquiridos e processados e, eventualmente, uma planilha foi criada com os resultados do binning.

Em seguida, realizamos uma análise estatística rigorosa, onde as planilhas de binning foram usadas como arquivos de entrada, normalizando os dados usando soma, log e Pareto. Realizamos ACP (Figura 2A) e OPLS-DA (Figura 2B), onde a primeira apresentou agrupamento, mas a segunda revelou clara discriminação entre os grupos e destacou diferenças metabólicas. A análise estatística do teste de permutação (20x) produziu valores de R2Y=0,99 e Q2=0,47. Posteriormente, realizamos um teste t de Student (Figura 2C) e análise de biomarcadores (Figura 2D) para identificar metabólitos desregulados. Seguindo os critérios descritos na seção do protocolo, filtramos os resultados para os metabólitos significativos (Tabela 2).

Figura 2: Análise multivariada e univariada. (A) Análise de componentes principais (PCA) e (B) Análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) de pacientes com SDRA leve (representada pela cor vermelha) e pacientes com SDRA moderada (representada pela cor verde). (C) Os gráficos de caixa com bigode destacam as diferenças na concentração relativa de metabólitos entre pacientes com SDRA leve e moderada detectadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons em amostras de soro. O eixo x representa os grupos de estudo, e o eixo y mostra a concentração relativa quando pacientes com SDRA leve (representada pela cor vermelha) e pacientes com SDRA moderada (representada pela cor verde) foram comparados no dia 1 de admissão na UTI. (D) O gráfico de área sob a curva (AUC) de metabólitos significativos prevendo a gravidade obtida após a realização da análise de biomarcadores comparando pacientes com SDRA leve e moderada no dia 1 da internação na UTI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

S.No.	Nome	Localização espectral (ppm)	Valor de p	VIP	Valor AUC
1	Lactato	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucina	1.42	0.03	2.01	0.875

Tabela 2: Lista de metabólitos significativos obtidos após a comparação de pacientes com SDRA leve e moderada no dia 1 de internação na UTI.

Como os resultados foram obtidos em valores de ppm, atribuímos metabólitos usando literatura anterior e os validamos por meio do profiler. Após a atribuição, lactato e isoleucina foram obtidos como metabólitos significativos, que também foram relatados em alguns estudos anteriores de SDRA^30,40. Garantimos a seleção de picos bem resolvidos e não sobrepostos. Após a identificação, filtrou-se a lista dos metabólitos significativos utilizando os critérios citados no protocolo. Em seguida, quantificamos os metabólitos de interesse usando o módulo profiler, abrindo os espectros, procurando o metabólito de interesse e ajustando o pico do software ao pico obtido nos espectros. Isso forneceu os valores quantificados dos metabólitos em mM. Uma planilha contendo nomes de amostras, nomes de metabólitos e concentrações foi gerada para referência. Após a quantificação com o software, a validação por meio de outras abordagens, como a proteômica, pode ser realizada.

Além disso, os metabólitos identificados são analisados minuciosamente para determinar sua correlação com a gravidade da doença e identificar as vias bioquímicas nas quais esses metabólitos estão ativamente envolvidos. Como apenas dois metabólitos significativos foram identificados após o uso dos critérios mencionados na seção de material e método, a análise da via usando o software não foi possível. Portanto, uma pesquisa bibliográfica completa foi feita para destacar os ciclos metabólicos perturbados. Os dois metabólitos identificados neste estudo se correlacionaram com sucesso com a gravidade da SDRA. O aumento do lactato denotou inflamação pulmonar e respiração anaeróbia, enquanto o aumento da isoleucina indicou catabolismo proteico associado a lesão pulmonar, infecção e metabolismo energético⁴⁰. Compreender essas vias metabólicas serve a um duplo propósito. Em primeiro lugar, revela a complexidade da doença, fornecendo insights sobre seus mecanismos biológicos. Em segundo lugar, auxilia nos avanços terapêuticos, orientando os médicos na adaptação dos tratamentos para os pacientes, melhorando os resultados clínicos.

Discussion

A metabolômica identifica e quantifica com eficiência os metabólitos, visando os ciclos metabólicos que se tornam perturbados durante a doença. A qualidade dos resultados depende da execução meticulosa de cada etapa da abordagem metabolômica. Cada estágio, desde a seleção e coleta da amostra até a identificação da via, é fundamental para identificar com precisão os principais fatores que contribuem para a doença. Antes de realizar a metabolômica, uma revisão completa da literatura é essencial, e atenção cuidadosa deve ser dada em todas as etapas.

Ao projetar um estudo metabolômico, a seleção de uma amostra é crucial para extrair informações significativas e garantir a preparação ideal da amostra, seja para impressões digitais metabólicas direcionadas ou não direcionadas da condição clínica em consideração. O processamento inicial adequado da amostra é crucial, e os protocolos devem ser seguidos de forma consistente para todas as amostras ao longo do estudo⁴⁹. É necessário cuidado extra ao trabalhar com amostras clínicas. Amostras comumente usadas para metabolômica baseada em RMN incluem biofluidos, extratos celulares e extratos de tecidos^50,51. O líquido cefalorraquidiano (LCR) e a urina geralmente requerem pré-tratamento mínimo e são frequentemente estudados em contextos como doenças relacionadas aos rins, doenças neurodegenerativas e toxicidade medicamentosa. O sangue total, o plasma e o soro fornecem informações abrangentes para um amplo espectro de doenças críticas e são preferidos devido à facilidade de coleta. Uma ampla gama de outros biofluidos, como fluido seminal, saliva, bile, fluido de diálise, líquido amniótico, condensado de ar exalado, aspirados pulmonares, líquido sinovial e mini lavado broncoalveolar (mBALF), tem sido amplamente utilizado por sua especificidade e precisão usando RMN 52,53,54. Cada biofluido apresenta suas vantagens e desafios em relação à coleta, disponibilidade e conteúdo informativo, dependendo do estudo ou desenho experimental⁵⁵. Nós nos concentramos em amostras de soro de pacientes com SDRA para este estudo, pois as amostras de sangue normalmente oferecem informações em nível de corpo inteiro e não são significativamente influenciadas por variações diárias extremas. Por outro lado, as amostras de urina estão sujeitas a várias flutuações e podem ser afetadas por dieta, estilo de vida, medicamentos e fatores ambientais²⁷. O armazenamento adequado da amostra também é importante para evitar atividade enzimática ou degradação microbiana. As amostras são normalmente criopreservadas a -80 °C com ciclos mínimos de congelamento e descongelamento para evitar a quebra metabólica e manter a estabilidade da amostra. A amostra pode ser armazenada a -80 °C por longos períodos, permitindo que a experimentação de RMN seja conduzida convenientemente. No entanto, planejar e realizar o experimento o mais rápido possível é aconselhável para obter os melhores resultados.

Neste estudo, empregamos um espectrômetro de RMN de 800 MHz para aquisição de dados, que fornece dados espectrais de alta resolução. Para este experimento, aderimos aos mesmos parâmetros de aquisição mencionados acima. No entanto, é importante observar que os mesmos parâmetros de aquisição descritos neste protocolo podem ser aplicados usando espectrômetros de RMN operando em outras intensidades de campo magnético. O número de varreduras pode ser aumentado ao operar em um campo magnético mais baixo para melhorar a resolução. Embora intensidades de campo mais altas possam oferecer resolução aprimorada, os aspectos centrais do processo de aquisição, como sequências de pulso, atrasos de relaxamento e controle de temperatura, permanecem consistentes em diferentes instrumentos, garantindo a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados.

Seguir um procedimento padronizado é essencial para manter a reprodutibilidade e a imparcialidade, pois os desvios podem dificultar a análise e avaliação subsequente dos dados. Cada etapa da experimentação de RMN deve ser realizada meticulosamente, pois a qualidade dos espectros depende delas. Atenção especial deve ser dada ao calço, pois define a forma do pico, e os parâmetros de aquisição devem ser otimizados de acordo com a amostra e o desenho do estudo. Para amostras com baixa concentração metabólica na amostra, o número de varreduras pode ser aumentado. A aquisição de dados em RMN envolve a otimização padrão de experimentos 1D e 2D adaptados à escolha da amostra e às informações específicas necessárias. Vários experimentos de RMN foram otimizados para obter espectros de alta qualidade de biofluidos, minimizando o impacto de macromoléculas indesejadas. A sequência de pulso CPMG⁵⁶ é preferida para amostras como soro, plasma ou líquido cefalorraquidiano. Essa técnica suprime os sinais amplos de macromoléculas, como lipídios e proteínas, que têm longos tempos de relaxamento transversal e podem obscurecer as ressonâncias de metabólitos de baixo peso molecular.

O pré-processamento de dados engloba os métodos intermediários usados para garantir uma análise uniforme e homogênea dos dados e sua interpretação. Esse processo inclui evitar sinais indesejáveis ou regiões espectrais propensas a inconsistências e corrigir mudanças de pico. Em biofluidos, excluir regiões indesejadas geralmente significa remover sinais, como os da água, que dominam a faixa de 4,6 ppm a 5 ppm. As mudanças de pico, causadas por variações no pH, temperatura, concentração de sal, fatores de diluição e composição iônica, podem ser minimizadas usando tampões em pH homeostático. Além disso, o uso de compostos de referência padrão, alinhamento de pico e binning pode ajudar a reduzir os deslocamentos de pico. O alinhamento de pico é crucial para correlacionar padrões em diferentes espectros adquiridos sob condições idênticas.

O processamento de espectros deve ser feito corretamente para garantir um binning preciso posteriormente na análise. Todos os espectros devem ser calibrados e alinhados uniformemente, e as correções de base e fase podem ser realizadas manual ou automaticamente. A correção adequada de fase e base, bem como a calibração, são críticas. A realização da correção basal é essencial para evitar distorções que possam afetar a identificação e quantificação dos metabólitos⁵⁷. A correção de fase é necessária para garantir que nenhum pico distorcido ou invertido possa afetar a interpretação dos resultados. Decida cuidadosamente os critérios para selecionar metabólitos significativos e filtre os resultados de acordo. Como o binning fornece resultados na forma de valores de ppm, identifique com precisão o nome do metabólito usando várias fontes mencionadas no protocolo. Se vários metabólitos estiverem presentes nos mesmos valores de ppm, identifique-os por meio da forma de pico.

Antes de realizar a análise estatística, a normalização é feita para reduzir as variações no conjunto de dados, induzidas ou não, devido a diferenças de magnitude e flutuações nas concentrações de metabólitos. Esse processo envolve vários métodos de centralização, dimensionamento e transformação, escolhidos com base na distribuição e variabilidade dos dados. O objetivo é minimizar o viés sistemático indesejado, preservando os fatores biológicos de interesse. Métodos multivariados, incluindo PCA, PLS-DA e OPLS-DA, são usados para estabelecer metabólitos diferenciais com valores VIP maiores que 1. A previsibilidade do modelo e a validação cruzada são determinadas usando os valores R2 (qualidade do ajuste) e Q2 (qualidade da previsão), enquanto as estatísticas do teste de permutação validam o modelo. Um mapa de calor baseado em correlação de Pearson avalia a robustez do modelo enumerando metabólitos regulados positivamente e negativamente em subfenótipos e os endótipos resultantes.

Métodos univariados, como o teste t de Student e ANOVA, como correção de Bonferroni ou minimização de FDR (taxa de descoberta falsa) e Benjamini-Hochberg, são usados para reduzir a probabilidade de falsos positivos. Esses métodos fornecem uma medida aproximada de características potencialmente importantes, independentemente de sua correlação dentro ou entre moléculas e outros fatores de confusão. Metabólitos significativos são identificados com base em um valor de p menor que 0,05, que são então usados para fundamentar endótipos metabólicos em subgrupos de resultados⁴⁵.

Gráficos de bigodes individuais e AUROC são empregados para avaliar a especificidade e a sensibilidade dos endótipos em subgrupos de desfechos. A pontuação clínica é combinada com o modelo no AUROC para validar a precisão do modelo. O valor da AUC > 0,8 é considerado significativo⁴⁶. Vários outros testes estão disponíveis online para testar a precisão da discriminação e eficácia dos metabólitos identificados. Alguns deles são classificação aleatória de florestas, mapa de calor, correlação, ^etc.45.

Várias abordagens são utilizadas para quantificar metabólitos significativos, incluindo o pico de integração, que pode ser um desafio para iniciantes devido à sua natureza avançada. Identifique picos característicos para metabólitos referindo-se a mudanças químicas individuais para identificação precisa. Determine a área desses picos característicos em relação à área do pico de referência, TSP. Para calcular a concentração absoluta de um metabolito (Cm), utilizar a seguinte equação:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Onde Cr é a concentração do composto de referência (TSP) na solução, Im e Ir são as áreas de pico integradas (podem ser obtidas usando a ferramenta de processamento e análise de RMN) do metabólito e da referência (TSP), respectivamente, e nm e nr são o número de prótons que representam o metabólito e os picos de referência, respectivamente²⁴.

Como alternativa, o software automatizado de quantificação de metabólitos de RMN é usado para obter concentrações de metabólitos para espectros únicos ou múltiplos com base na concentração do padrão de referência, TSP. A quantificação usando software simplifica o processo e reduz a probabilidade de erros em comparação com outros métodos. Embora este trabalho de pesquisa destaque o uso de software para quantificação de metabólitos, pode haver problemas se o metabólito de interesse não estiver presente na biblioteca de software. Além disso, o software é pago, portanto, apenas pesquisadores com licença autorizada podem usá-lo.

A metabolômica provou ser fundamental para desvendar as complexidades de várias doenças, identificando ciclos metabólicos desregulados que contribuem para a gravidade da doença. No entanto, traduzir esses achados para a prática clínica tem sido um desafio. A comunidade médica agora está enfatizando uma abordagem de medicina personalizada para melhorar os resultados da doença. Embora a identificação de metabólitos desregulados fosse anteriormente suficiente, os esforços atuais se concentram na quantificação precisa para definir faixas específicas da doença. Essas informações são inestimáveis para os médicos na personalização de estratégias de tratamento. Os avanços nas técnicas de quantificação facilitaram os esforços de pesquisa, com vários grupos de pesquisa em todo o mundo empregando com sucesso essas abordagens usando software especializado.

Esse progresso ressalta o potencial da metabolômica para impactar significativamente a medicina personalizada e melhorar os resultados clínicos. Além disso, a integração de dados metabolômicos com outros dados ômicos, como genômica e proteômica, promete fornecer uma compreensão mais abrangente dos mecanismos da doença e refinar ainda mais as intervenções terapêuticas. À medida que a tecnologia continua a evoluir, espera-se que a precisão e a utilidade da metabolômica em ambientes clínicos aumentem, abrindo caminho para soluções de saúde mais eficazes e personalizadas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canadá		Software de quantificação de metabólitos de RMN
Inserção coaxial	Sigma aldrich	Z278513
Óxido de deuterim	Sigma aldrich	151882
Eppendorf	tubes Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Software de análise estatística de metabolômica
Tubo de RMN	Wilmad	Z412007	Pipeta de 5mm de diâmetro
	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μ l
Frascos de coleta de amostra Frascos	resfriamento criogênico Tarsons	523194
Azida de sódio	Sigma aldrich	S2002
Cristal de cloreto de sódio	Sigma aldrich	S9625
Fosfato de sódio dibásico	Sigma aldrich	567550
Fosfato de sódio monobásico	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Ferramenta de processamento e análise de RMN	Bruker
Sal Sigma	aldrich	269913