Revelando proteoformas de histonas usando eletroforese em gel 2D-TAU

Resumo

Este método descreve uma estratégia simples e rápida para caracterização e investigação de proteoformas de histonas.

Resumo

As histonas sofrem várias modificações pós-traducionais (PTMs), como metilação, acetilação, fosforilação, acilação e ubiquitinação, que controlam a dinâmica dos nucleossomos e determinam o destino celular. O nucleossomo, que é a unidade funcional da cromatina, compreende o DNA, quatro pares de histonas (H3, H4, H2A e H2B) que compõem o núcleo globular e a histona ligante H1, que estabiliza a estrutura da cromatina. As caudas amino (N) terminais das histonas se projetam dos domínios do núcleo globular e sofrem PTMs distintos que influenciam a paisagem da cromatina. Algumas evidências sugerem que a homeostase da histona PTM é crucial para preservar todas as atividades fisiológicas. A desregulação dos PTMs de histonas é a principal causa de proliferação celular anormal, invasão e metástase. Portanto, o desenvolvimento de métodos para caracterizar PTMs de histonas é crucial. Aqui, descrevemos uma técnica eficaz para isolar e analisar isoformas de histonas. O método, baseado na combinação de duas separações ortogonais, permite o enriquecimento das isoformas das histonas e a seguinte identificação por espectrometria de massas. A técnica, originalmente descrita por Shechter et al., combina géis de poliacrilamida de uréia ácida (TAU-GEL), que podem separar proteínas histonas básicas com base no tamanho e na carga, e géis de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE), que podem separar proteínas por peso molecular. O resultado é um mapa bidimensional de isoformas de histonas, adequado para digestão em gel seguida de identificação por espectrometria de massa e análise de western blot. O resultado é um mapa bidimensional de isoformas de histonas, adequado para digestão em gel seguida de identificação por espectrometria de massa e análise de western blot. Esta abordagem proteômica é um método robusto que permite o enriquecimento de uma única isoforma de histona e a caracterização de novos PTMs de histonas.

Introdução

O início, a progressão e a quimiorresistência do câncer estão relacionados a eventos genéticos e epigenéticos, incluindo PTMs de histonas. As histonas sofrem uma variedade de PTMs que regulam a dinâmica da cromatina e ditam o destino celular¹.

O nucleossomo é a unidade funcional da cromatina e é um complexo molecular de DNA e proteínas que permite que o DNA seja empacotado no núcleo. Consiste em quatro pares de histonas (H3, H4, H2A e H2B) que constituem o núcleo do nucleossomo, bem como a histona ligante H1, que ajuda a estabilizar a estrutura da cromatina. As caudas amino (N) terminais das histonas se projetam de seus domínios do núcleo globular e sofrem modificações pós-traducionais específicas que afetam a paisagem da cromatina².

Até agora, pelo menos 23 classes de PTMs de histonas são conhecidas. Esses PTMs são modificações covalentes que consistem principalmente em metilação, acetilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação³. Além disso, uma estreita correlação entre a homeostase do epigenoma e a religação metabólica foi recentemente proposta, o que explica o crescimento exponencial do possível número de PTMs de histonas 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Os PTMs de histonas, depositados, apagados e transduzidos por enzimas modificadoras, são nomeados respectivamente como gravadores, apagadores e leitores. Eles afetam as propriedades físicas e químicas da estrutura da cromatina, impactando o perfil de expressão gênica, incluindo a expressão de genes supressores de tumor e oncogenes 14,15,16.

O número de proteoformas de histonas aumenta quando incorporadas ao nucleossomo como variantes de histonas. Essas variantes são isoformas não alélicas de histonas canônicas e adicionam complexidade ao alterar as propriedades químicas e físicas da cromatina. Em comparação com as histonas canônicas, as variantes de histonas têm domínios funcionais que sofrem modificações pós-traducionais únicas ou interagem com componentes específicos da cromatina, impactando a dinâmica e a estabilidade do nucleossomo¹⁷.

Em células cancerígenas, a desregulação de PTMs e variantes de histonas afeta o perfil de expressão gênica, levando à proliferação celular anormal, invasão, metástase e ativação de vias de resistência a drogas 3,18,19,20. Mutações em histonas ou complexos de remodelação da cromatina podem alterar o fenótipo celular, contribuindo para a transformação neoplásica. O acúmulo de alterações epigenéticas, como a metilação de histonas, é um fator chave na ativação das vias de resistência aos medicamentos 21,22,23. Mutações dentro do complexo SWI / SNF, que consiste em 15 subunidades codificadas por 29 genes, afetam mais de 20% dos cânceres humanos em muitos tipos de tumores. Na última década, estratégias de medicamentos baseados em epigenética (epi-drogas) foram desenvolvidas, e muitos medicamentos direcionados ao câncer com padrões anormais de modificação de histonas foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos ^EUA23.

A análise de proteínas histonas é bastante desafiadora, tornando-se uma área de estudo exigente. Recentemente, os métodos de espectrometria de massa tornaram-se a forma preferida para caracterizar e estudar proteoformas de histonas. No entanto, as condições drásticas de extração, em combinação com a baixa solubilidade de algumas variantes e a alta homologia de sequência, tornam sua análise desafiadora.

Na última década, vários métodos baseados em espectrometria de massa foram desenvolvidos para perfil e investigação de histonas^{24 , 25 , 26 , 27} . Neste estudo, apresentamos um método econômico e confiável para criar um mapa bidimensional de proteoformas de histonas, o que pode aumentar as chances de descobrir novas modificações pós-traducionais.

A eletroforese 2D TAU combina a separação em condições ácidas com SDS PAGE. Na primeira dimensão, a condição ácida do meio dá uma carga líquida positiva às proteínas básicas. Como as histonas são proteínas muito básicas e têm um ponto isoelétrico (pH) mais alto em comparação com o meio, elas se tornam carregadas positivamente e migram sob um campo elétrico. Na segunda dimensão, as histonas são desnaturadas por SDS e separadas com base em seu peso molecular. O mapa 2D resultante pode ser usado como uma ferramenta para enriquecer proteoformas específicas em resolução de ponto único para análise de espectrometria de massa e estudos imunológicos^28,29. Após a eletroforese, os pontos 2D TAU podem ser descoloridos, digeridos com tripsina e analisados por espectrometria de massa. Alternativamente, o mapa TAU 2D pode ser borrado em um filtro de nitrocelulose / PVDF e investigado por imunocoloração²⁷.

Nesse contexto, os métodos podem ser estratégicos para melhorar a identificação e análise de novas modificações pós-traducionais correlacionadas com a religação metabólica^30,31.

Melhoramos ainda mais o método original incorporando uma etapa de sonicação, que é útil para a degradação do DNA e melhora a solubilidade da proteína. Além disso, prolongamos a etapa de incubação para extração de histonas, a fim de obter uma amostra de proteína com alta pureza. Além disso, em nosso protocolo, executamos a primeira dimensão em baixa tensão por mais tempo para obter uma melhor resolução. O gel resultante foi usado para investigar PTMs de histonas canônicas e caracterizar novas modificações, como glicação^10,32.

No geral, desenvolvemos um método para extrair e purificar histonas, seguido pela resolução das proteoformas das histonas usando um mapa bidimensional. O trabalho também inclui um procedimento para digestão em gel para análise de espectrometria de massa e as etapas para análise bidimensional de western blot.

Protocolo

1. Extração de histonas

1. Realize a extração de histonas de pelo menos 1 x 10⁶ células, que são 80% confluentes. Para este experimento, usamos linhagens celulares MCF-10A da ATCC. Após o plaqueamento, lave as células três vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x. Execute todas as etapas no gelo.
2. Prepare um tampão de lise celular contendo 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de KCl e 1,5 mM de MgCl₂. Adicione 1 mM de ditioeritritol e inibidores de protease e fosfatase imediatamente antes de usar.
3. Adicione 800 μL de tampão de lise celular à placa de Petri contendo células, raspe e colete as células em um tubo de 1,5 mL e, em seguida, incube em um rotador a 300 rpm, 4 ° C por 1 h.
4. Centrifugar a 10.000 x g, 4 °C, durante 10 min numa microcentrífuga pré-arrefecida com um rotador para tubos de 1,5 ml.
5. Lave o pellet com 400 μL de tampão de lise celular e centrifugue a 10.000 x g, 4 °C, por 10 min. Descarte o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem 3x.
   NOTA: Use uma microcentrífuga pré-resfriada (4 °C) com um rotador para tubos de 1.5 ml para todas as etapas. Manuseie o pellet com cuidado para evitar perda de material.
6. Ressuspender o sedimento a 640 μL de 0,2 M H₂SO₄ e incubar num rotador a 300 rpm, a 4 °C, durante 16 h.
   CUIDADO: O ácido sulfúrico é um produto químico perigoso; Por favor, use-o sob uma coifa química.
7. Centrifugue a 16.000 x g, 4 °C, por 10 min. Transfira o sobrenadante para um tubo novo e guarde-o até as etapas seguintes. Descarte os detritos nucleares.
8. Precipitar histonas adicionando 212 μL de ácido tricloroacético, gota a gota (a concentração final de TCA é de 33%). Misture a solução invertendo o tubo 10x. Incubar no gelo, no escuro, durante 16 h.
   CUIDADO: O TCA é um produto químico perigoso; Use sob uma capela de exaustão química.
9. Sedimentos girando em uma centrífuga pré-resfriada a 16.000 x g por 10 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante e lave o pellet 3x com 200 μL de acetona fria.
10. Ressuspenda o pellet com acetona fria e, em seguida, sonice a alta potência 2x com 3 ciclos de 30 s ligado/desligado, alternando com uma pausa de 10 minutos no gelo.
    NOTA: O procedimento foi feito usando um ultrassom. Esta etapa é essencial para eliminar o DNA envolto em histonas.
11. Centrifugue a 16.000 x g por 10 min, descarte a acetona e ressuspenda a amostra em 100 μL de água bidestilada Determinar a concentração de proteínas utilizando o método do ensaio de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante³³.
    NOTA: Após a centrifugação, o pellet às vezes aparece branco ou translúcido. Um precipitado branco e opaco pode indicar a presença de contaminantes de sal que podem prejudicar a separação 2D. Nesse caso, repita as etapas de lavagem com acetona até que o pellet fique translúcido.
12. Liofilizar 70 μg de histonas, de acordo com as instruções do fabricante. Defina o liofilizador a 30 °C por 60 min. Verifique o volume do tubo e reitere a etapa a 30 °C até que a amostra esteja completamente liofilizada (geralmente, 90 min são necessários para liofilizar completamente a amostra). Após 60 min, verifique o volume a cada 10 min, pois o processo depende da amostra.
    NOTA: Se a quantidade de proteínas histonas for baixa, comece com 2 x 10⁶ células. Neste caso, use o mesmo volume de reagentes usado para 1 x 10⁶ células. Verifique a pureza de todos os produtos químicos usados durante o procedimento; todos os reagentes devem ser de qualidade HPLC.

2. Mini eletroforese de tritão-ácido-uréia (TAU) em gel 2D

1. Prepare um gel mini-TAU para um mini sistema vertical de eletroforese em gel de poliacrilamida, conforme descrito abaixo.
   1. Prepare o gel de separação: 6 M Ureia, 15% de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 5% de ácido glacial acético, 0,25% de Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Para preparar a solução, dissolva a ureia em acrilamida / bis e 1 mL de água ultrapura com agitação suave à temperatura ambiente; Adicione os outros componentes e ajuste o volume. Para um gel mini-TAU, prepare 10 mL de solução. Encha as placas de gel predefinidas com a solução, evitando a formação de bolhas de ar a apenas 1,5 cm do topo. Cubra a solução com 1 mL de isopropanol para nivelar o gel.
   2. Prepare o gel de empilhamento: 6 M Ureia, 6% de acrilamida/bisacrilamida (29:1), 5% de ácido glacial acético, 0,25% de Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Para preparar a solução, dissolva a ureia em acrilamida/bis e 1 mL de água ultrapura; Adicione os outros componentes e ajuste o volume. Encha as placas de gel com solução de empilhamento, coloque um pente de gel de 10 poços entre as placas e insira-o até que a solução de gel chegue até a metade dos dentes do pente. Deixar o gel polimerizar durante 16 h a 4 °C.
      NOTA: Insira cuidadosamente o pente para garantir a formação regular de poços.
2. Prepare 100 μL de tampão de amostra TAU dissolvendo 6 M de ureia, 5% de ácido glacial acético e água bidestilada Dissolva a amostra liofilizada preparada em 30 μL de tampão de amostra TAU.
3. Encha o mini com tampão de corrida TAU, concentração final de ácido acético a 5%. Enxágue os poços do gel TAU com uma seringa cheia de tampão de corrida e carregue a amostra no poço usando uma micropipeta.
4. Conecte a câmara eletroforética à fonte de alimentação, com o eletrodo positivo (vermelho) colocado na parte inferior. Preste atenção, quando o IP > pH, as proteínas são carregadas positivamente, então a migração é do eletrodo positivo para o negativo. Execute o gel primeiro a 30 V por 70 min, depois na tensão constante de 25 V por 17 h.
   NOTA: Durante este tempo, desligue ocasionalmente a fonte de alimentação e enxágue os poços de gel usando uma seringa descartável. Preste atenção para remover quaisquer bolhas da superfície inferior do gel usando uma seringa para evitar a perda da amostra e a presença de manchas nas proteínas resolvidas.
5. Remova o gel das placas de gel e corte a linha de interesse com um bisturi limpo. Manuseie cuidadosamente o gel para evitar a quebra do gel. Como a linha de interesse é incolor, carregue a amostra no poço número 1 para identificar e cortar exatamente a pista de interesse.
   NOTA: Para verificar a separação no gel mini-TAU, prepare e execute a amostra em duplicata. Um desses géis pode ser corado usando Coomassie Brilliant Blue. O padrão de separação é relatado na Figura 1A.
6. Lave a pista com 15 mL de 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 por 15 min.
7. Prepare 15 mL de tampão de equilíbrio 1 usando 6 M de uréia, 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 30% de glicerol, 20% de SDS e 2% de ditioeritritol. Prepare 15 mL de tampão de equilíbrio 2, usando 6 M de Ureia, 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 30% de glicerol, 20% de SDS e 2% de Iodoacetamida. Prepare o tampão de equilíbrio 1 e 2 imediatamente antes de usar; Armazene o buffer de equilíbrio 2 no escuro.
8. Incubar a pista de gel, sob agitação suave, em 10 mL de tampão de equilíbrio 1 por 15 min, depois decantar. Incubar a pista de gel, sob agitação suave, com 10 mL de tampão de equilíbrio 2 por 15 min no escuro, depois decantar.
9. Prepare um gel de acrilamida SDS 15% de resolução seguindo a Tabela 1. Configure a placa de gel e encha-a com a solução de gel de resolução. Encha a solução até que esteja a 1,5 cm da extremidade da placa de gel longa. Coloque 1 mL de isopropanol na superfície para nivelar o gel e deixá-lo polimerizar.
10. Após a polimerização em gel, decantar o isopropanol e secar o poço com papel de cromatografia de celulose 3MM Chr. Insira a faixa resultante da etapa 8 no poço de gel.
11. Sele a pista para o gel de resolução com uma solução de vedação de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% em 1x tampão Tris / glicina / SDS e 5 μL de azul de bromofenol a 0,003%. Deixe a polimerização em gel de agarose por 30 min.
    NOTA: Evite a formação de bolhas de ar durante a vedação de agarose para evitar manchas de gel.
12. Coloque as placas de gel no e encha com 1x tampão Tris/glicina/SDS. Execute o gel a 120 V até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo. Remova suavemente o gel das placas, descarte o excesso de agarose e core o gel com prata usando um procedimento compatível com espectrometria de massa ou blot para ensaio imunológico.

3. Coloração de prata ³²

1. Prepare os seguintes reagentes - Fixador: 50% de metanol, 5% de ácido acético, 45% de água deionizada; Solução de lavagem: 50% de metanol, 50% de água deionizada; Sensibilizador: 0,02% Na₂S₂O₃ 5H₂O em água deionizada; Reagente de prata: 0,1% de nitrato de prata em água deionizada fria (4 ° C); Desenvolvedor: 0,04% de formalina e 2% de Na₂CO₃, formaldeído (37%) (adicionar imediatamente antes de usar) 0,4 mL de água deionizada e encher até 1000 mL; Reagente de parada: ácido acético a 5%; Solução de armazenamento de gel: ácido acético a 1%.
   NOTA: Como os produtos químicos usados para coloração são perigosos, execute todas as etapas sob uma capela de exaustão química.
2. Siga o procedimento na Tabela 2 com a seguinte consideração. Realize todas as incubações com agitação suave. Prepare o reagente de parada antes de iniciar a etapa de revelação; Isso garantirá o desenvolvimento do gel com a intensidade oportuna. Durante a etapa de desenvolvimento, as manchas aparecerão como sinais amarelos que se tornarão marrons claros no final da incubação. A intensidade dos diferentes pontos dependerá da quantidade de proteoformas de histonas. O gel está pronto para excisão local e digestão em gel (Figura 1B)

4. Digestão em gel

1. Preparar as seguintes soluções: 50 mM de bicarbonato de amónio (NH₄HCO3)/acetonitrilo a 50% (v/v); 10 mM de ditiotreitol (TDT) em 50 mM NH₄HCO₃; 55 mM de iodoacetamida (IAA) em 50 mM NH₄HCO₃; 0,1% de TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitrila de grau HPLC; Tubos de silicone de 1 mL.
   NOTA: Para contornar a contaminação por queratina humana, do cabelo ou da pele, use luvas limpas e trabalhe em uma área limpa.
2. Extirpar os pontos de interesse das histonas do gel corado usando um bisturi limpo e colocá-los em um tubo de silicone fresco (1,5 mL). Tome cuidado para extirpar um único ponto e colocá-lo em um único tubo para evitar a contaminação cruzada da isoforma.
3. Adicione a cada ponto de gel 250 μL de 50 mM NH₄HCO₃/50% de acetonitrila e incube sob agitação suave em um termomisturador à temperatura ambiente. Transvase a solução e repita esta etapa 3x. As peças de gel parecerão transparentes.
4. Desidratar manchas de gel adicionando acetonitrila (200 μL). Nesta fase, as peças de gel assumirão uma cor branca opaca.
5. Transvase a acetonitrila e deixe secar ao ar por 10 min. A peça de gel parecerá seca no tubo. A redução e a alquilação não são essenciais, uma vez que as proteínas histonas foram reduzidas e alquiladas durante a etapa de equilíbrio.
6. Reidrate as manchas de gel em 20 μL de solução de tripsina (HCl 0,1 mM) ou em um volume suficiente para cobrir os pedaços de gel. Colocar os tubos no termomisturador e incubar, sob agitação suave, a 37 °C durante um mínimo de 4 h até 16 h.
7. Transfira o sobrenadante contendo os peptídeos trípticos para um novo tubo. Adicione 50 μL de solução de extração (60% de acetonitrila, 1% de TFA) aos pedaços de gel e sonice 2x em banho-maria ultrassônico por 10 min a 4 °C.
8. Transfira o sobrenadante, contendo peptídeos trípticos adicionais, para o tubo fresco. Use um liofilizador para secar os peptídeos extraídos agrupados. Regular o liofilizador a 30 °C e secar a solução; Um pellet liofilizado aparecerá no tubo.
   NOTA: Esta etapa depende do volume; Geralmente, 1 h é suficiente, mas verifique o volume a cada 10 minutos até que a amostra esteja completamente seca.
9. Adicione 15 μL de TFA a 0,1% a cada tubo e incube suavemente em um termomixer a 25 °C. Transfira o sobrenadante para o frasco para injetáveis para análise de LC-MS/MS.

5. mancha ocidental 2DTAU

1. Prepare o tampão de transferência, 250 mM de base Tris, 92 mM de glicina e 10% de metanol usando água bidestilada
2. Corte a membrana de nitrocelulose e o papel de filtro nas dimensões do gel.
3. Equilibre o gel e mergulhe a membrana, o papel de filtro e os papéis de filtro no tampão de transferência por 15 min. Use membranas de nitrocelulose ou PVDF. Se estiver usando membranas de PVDF (difluoreto de polivinilideno), ative-as embebendo em 100% de MetOH.
4. Prepare o sanduíche de gel no para uma transferência semi-seca da seguinte forma: Eletrodo negativo / Papel de filtro / Gel / Membrana de nitrocelulose / Papel de filtro / Eletrodo positivo. Remova quaisquer bolhas de ar entre o gel e a membrana para garantir bons resultados.
5. Coloque o na unidade semi-seca e deixe o borrão funcionar a 25 V por 30 min. No final, desmonte o sanduíche de blotting e guarde a membrana para o ensaio imunológico. Verifique a eficiência de transferência com a coloração Ponceau. Marque a membrana com um sinal no canto superior direito para preservar a orientação correta do filtro.
6. Incubar com anticorpos primários e secundários, dependendo do experimento (Figura 2).

Resultados

Na Figura 1A, é possível observar como as proteínas histonas migram em um gel 1D. Este é um passo preliminar importante para entender o tempo de execução da primeira dimensão. Uma vez determinado o tempo certo de separação, execute a segunda dimensão. O mapa 2D das proteoformas das histonas mostra um padrão topográfico distinto (Figura 1B). Cada ponto na Figura 1B representa um tipo específico de histona. Observe a região exata do gel onde cada histona proteoforma pode ser encontrada. A identificação por espectrometria de massas para cada proteoforma histona é relatada em Perri et ^al.32. Portanto, cada ponto nesta condição está associado a um tipo específico de histona. A presença de pontos adicionais, ao lado dos canônicos, pode indicar a existência de novas modificações. As imagens de gel podem ser adquiridas usando densitometria e a imagem resultante pode ser analisada usando software de análise de imagem.

A confiabilidade do mapa 2D TAU depende da rotundidade do local. Se a corrida tiver sido realizada corretamente, os pontos aparecerão como sinais distintos e nenhuma faixa horizontal e vertical será visível. Por outro lado, impurezas na amostra, soluções e sobreposição de agarose podem causar estrias e/ou listras no gel. A qualidade do gel terá impacto na digitalização da imagem e na análise quantitativa e qualitativa a seguir. Além disso, pode influenciar o sucesso da análise de Western Blot e das investigações de EM. Para verificar a confiabilidade do método, sondamos a membrana de nitrocelulose de proteoformas histonas resolvidas com o anticorpo primário Acetilada-Lisina (Ac-K2-100) Rabbit mAb³² (Figura 2). Um anticorpo secundário anti-HRP de coelho foi usado para detectar sinais de histonas. Como esperado, usando um densitômetro, é possível quantificar a modificação pós-traducional peculiar em cada variante de histona presente no blot.

Figura 1: 1D e 2D TAUgel. (A) Imagem representativa do padrão topográfico de histonas obtida usando 1D TAUgel. (B) Imagem representativa do padrão topográfico das histonas obtido usando 2D TAUgel. As identificações dos dados são relatadas por Perri et al. ³². Como esperado, cada ponto representa uma histona proteoforme específica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Western blot 2DTAU representativo. Na imagem, é possível observar o nível de acetilação da lisina em cada proteoforma histona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagentes	Concentração: 15%
40% de acrilamida/bis	3.75
1,5 M Tris pH 8,8	2,5 ml
Água MilliQ	3,6 ml
10% SDS	100 μL
10% APS	50 μL
TEMED	5 μL

Tabela 1: Composição da solução de gel de resolução.

Passo	Hora
Fixação de 50% de metanol / 5% de ácido acético	1 h
Lave o etanol 30%	2 x 20 min
Lave a água deionizada	1 x 20 min
Reagente de tiossulfato sensibilizador	1 minuto
Lave a água deionizada	3 x 20 s
Prata Nitrato de prata	30 min
Lave a água deionizada	3 x 1 min
Desenvolvedor de Desenvolvimento	25-30 min Nota: Desenvolver o gel até que as manchas fiquem visíveis (castanho claro)
Solução de parada	1 x 10 min
Lave a água deionizada	2 x 5 min
Lave a água deionizada	1 h

Tabela 2: Método de coloração de prata.

Discussão

Na última década, a terapia do paciente com câncer foi revolucionada pela identificação de várias alterações moleculares que impulsionam o desenvolvimento e a progressão do câncer. O avanço mais significativo na oncologia moderna é o desenvolvimento de terapias baseadas em análises moleculares abrangentes. Os avanços tecnológicos em genômica e proteômica desempenharam um papel crucial no perfil de biomarcadores específicos para detecção precoce, vigilância, prognóstico e monitoramento de medicamentos. A proteômica é definida como a análise do complemento proteico completo de uma célula, tecido ou organismo sob uma condição particular, e também inclui o estudo de interações proteicas, modificações pós-traducionais e localização³⁴. Uma área específica da proteômica é a epiproteômica, que envolve o estudo sistemático das modificações pós-traducionais de histonas. Estes têm sido associados ao desenvolvimento e progressão do câncer³⁵. O artigo descreve um método para identificar isoformas específicas de histonas que contribuem para o fenótipo celular.

A etapa crítica do método é a extração de histonas devido à sua baixa solubilidade e alta basicidade. Suas principais limitações são a complexidade do mapa 2D e o baixo número de variantes, o que pode dificultar a análise MS/MS.

No geral, o principal benefício dessa abordagem é que ela pode ser realizada em qualquer laboratório, e um mini aparelho de gel pode ser adquirido com as devidas precauções. Nesse contexto, estamos confiantes de que esse método pode auxiliar um grande número de cientistas, como aqueles que não podem se beneficiar de uma grande instalação em sua instituição, a identificar novos epimarcadores, visando melhorar o conhecimento sobre o epiproteoma. Além disso, esse método pode ser combinado com espectrometria de massa, que pode ser terceirizada como um serviço, para descobrir novas proteoformas. Também pode ser usado com ensaios imunológicos para confirmar as alterações em uma modificação pós-traducional específica para a qual um anticorpo comercial está disponível.

O método tem sido usado para estudar as mudanças típicas nas modificações de histonas relacionadas ao desenvolvimento do câncer de mama²⁸e para examinar as modificações de H1 em células-tronco embrionárias de camundongos³⁶. Além disso, o método foi empregado com sucesso para medir o nível de carbonilação de histonas³⁷ em fibroblastos de crescimento rápido e para explorar novas modificações de histonas, como glicação de histonas e MARilação de histonas³⁸.

Do nosso ponto de vista, estamos confiantes de que este método pode ser aplicado com sucesso para traçar o perfil de novos PTMs de histonas, particularmente aqueles associados à ativação anormal de vias metabólicas específicas, como acetilação, malonilação, metilação, lipidação, lactilação, butilação e outros. Em última análise, o método também pode servir como uma ferramenta micropreparativa para isolar proteoformas individuais e pode facilitar a análise de PTMs ligados ao metabolismo, melhorando assim nossa compreensão dessa área crucial de pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,4-Ditioeritritol	SIGMA- ALDRICH	D8255;	Reagente para manutenção − Grupos SH no estado reduzido; reduz quantitativamente os dissulfetos.
Tampão Tris-HCL 1,5 M, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Tampão de Gel Resolvente
10x Tris/Glicina/SDS	BIO-RADA	1610772	Use este tampão de corrida 10x Tris/glicina/SDS pré-misturado para separar amostras de proteína por SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) é um álcool secundário. Ele foi testado como um substituto do combustível para uso em várias células de combustível. O pó de CuO dissolvido em 2-propanol tem sido usado para a síntese assistida por ablação a laser de colóides de. A suspensão de 2-propanol com Zn(NO3)2 tem sido empregada para a fabricação de fotoânodo de aço inoxidável revestido de dióxido de titânio (P25-TiO2/SS) revestido com uma camada uniformemente espessa de P25-TiO2.
Solução de Acrilamida 30%/Bis	BIO-RAD	1610158	2,6% Crosslinker. Reagente de pureza de eletroforese
Ácido acético	Glacial Carlo Erba Reagennts	401392	O ácido acético é um importante reagente químico com muitas aplicações industriais.
Acetona	Panreac Applichem	211007.1214	Acetona  é um solvente, conhecido por sua versatilidade em várias aplicações de laboratório, fabricação e limpeza.
Acetonitile	VWR	83640320	para HPLC    Grau LC-MS
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose  é a  heteropolissacarídeo  frequentemente usado em biologia molecular.
Bicarbonato de amônio	SIGMA-ALDRICH	A6141	mínimo 99,0%
Persulfato de amônio	SIGMA-ALDRICH	A3678	Para biologia molecular, para eletroforese, ≥ 98%
Bioruptor mais	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Agente redutor usado para reduzir ligações dissulfeto em proteínas.
Kit de Mancha de Prata Dodeca	BIO-RAD	161-0480	O kit de coloração de prata Dodeca é fácil de usar para a detecção de níveis de proteínas nonagrama em géis de poliacrilamida.
Glicerol	GE - Ciências da Vida em Saúde	171325010L	O glicerol é um composto triol simples, está envolvido para auxiliar na fundição de géis gradientes, estabilizador de proteínas e componente tampão de armazenamento.
Halt Inibidor de Fosfatase	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserva o estado de fosforilação das proteínas durante e após a lise celular ou extração de proteínas teciduais  Coquetel de uso único (100X).
Inibidor de Protease Halt	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) são soluções estoque concentradas prontas para uso de inibidores de protease para adição a amostras para prevenir a degradação proteolítica durante a lise celular e extração de proteínas. Coquetel de uso único (100X).
Ácido clorídrico	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, para biologia molecular
Iodoacetamida	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥ 99% (NMR), cristalino
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Cloreto de potássio, KCl, é  geralmente usado em rotinas de laboratório. Seu uso como tampão de armazenamento para eletrodos de pH e como solução de referência para medições de condutividade está bem estabelecido.
Linha celular MCF10	atcc	CRL-10317	linhagem de células epiteliais que foi isolada em 1984 da glândula mamária de uma mulher branca, de 36 anos, com mamas fibrocísticas. Esta linha celular foi depositada pela Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	O cloreto de magnésio é um sólido cristalino incolor.
N,N,N',N'-Tetrametiletileno-diamina	SIGMA-ALDRICH	T9281	Para Eletroforese, aprox. 99%
Tampão de fosfato salino 1X	Corning	15373631	1 X PBS (solução salina tamponada com fosfato) é  um buffer  solução salina balanceada  Usado para uma variedade de aplicações biológicas e de cultura de células, como lavar células antes da dissociação, transportar células ou tecidos, diluir células para contagem e preparar reagentes.
Hexacianoferrato de potássio	SIGMA-ALDRICH	60299	Aceptor de elétrons, empregado em sistemas envolvendo transporte de elétrons,
Solução SDS 20% (p/v)	BIO-RAD	161-0418	Dodecil sulfato de sódio. Reagente de pureza de eletroforese
Tiossulfato de sódio, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Tiossulfato de sódio, ReagentPlus 99%
Ácido sulfúrico	SIGMA-ALDRICH	339741	Ácido Sulfúrico, Reagente, é  um ácido extremamente corrosivo que vem como um líquido amarelado ligeiramente viscoso. É solúvel em água e é um ácido diprótico. Possui propriedades corrosivas, desidratantes e oxidantes muito fortes, além de ser higroscópica.
Ácido tricloroacético	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	O ácido tricloroacético (TCA) é  Usado como reagente para a precipitação de proteínas1,2 e ácidos nucléicos3.
Ácido trifluoroacético	Riedel-de Haë n	34957	Ácido trifluoroacético
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 é um surfactante de polioxietileno não iônico que é mais frequentemente usado para extrair e solubilizar proteínas.
Tripsina do pâncreas suíno	SIGMA-ALDRICH	T6567	Grau de proteômica, BioReagente, Dimetilado
UREIA	SIGMA-ALDRICH	33247	A ureia é um agente caotrópico e é usada para desnaturação de proteínas. Ele perturba as ligações de hidrogênio na estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas. Também pode perturbar a ligação de hidrogênio presente na estrutura secundária do DNA