Uma abordagem de triagem de alto rendimento para avaliar a afinidade de ligação de poluentes ambientais a receptores nucleares

Summary

Este protocolo descreve um sistema de triagem de alto rendimento que usa a polarização de fluorescência de uma sonda fluorescente específica ligada a um receptor nuclear como uma leitura para triagem de poluentes ambientais.

Abstract

Níveis crescentes de compostos foram detectados no meio ambiente, causando poluição generalizada e representando riscos à saúde humana. No entanto, apesar de sua alta ocorrência ambiental, há informações muito limitadas sobre seus efeitos toxicológicos. É urgente desenvolver métodos de triagem de alto rendimento (HTS) para orientar estudos toxicológicos. Neste estudo, um ensaio de ligação receptor-ligante usando um sistema HTS foi desenvolvido para determinar a potência de ligação de poluentes ambientais em receptores nucleares. O teste é conduzido usando um leitor de microplacas (ou seja, uma placa de 96 poços contendo vários produtos químicos) medindo a polarização de fluorescência (FP) de uma sonda fluorescente específica. Este ensaio consiste em quatro partes: a construção e transformação de vetores recombinantes, a expressão e purificação da proteína receptora (domínio de ligação ao ligante), ligação receptor-sonda e ligação competitiva de produtos químicos com o receptor. A potência de ligação de dois poluentes ambientais, ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) e fosfato de trifenil (TPHP), com o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) foi determinada para ilustrar o procedimento de ensaio. Por fim, também foram discutidas as vantagens e desvantagens desse método e suas potenciais aplicações.

Introduction

Um grande número de produtos químicos foi amplamente detectado no meio ambiente e no corpo humano, levantando preocupações significativas sobre seu impacto no ambiente ecológico e na saúde humana ^1,2,3. Apesar de sua alta ocorrência ambiental, informações sobre seus efeitos toxicológicos são escassas. Portanto, é urgente desenvolver métodos de triagem de alto rendimento (HTS) para facilitar a avaliação da toxicidade química.

Vários métodos de triagem de alto rendimento (HTS) foram relatados para avaliação de toxicidade química, como os bioensaios HTS usados nos programas Tox21 e ToxCast ^4,5. Esses métodos podem identificar rapidamente potenciais tóxicos e fornecer informações valiosas sobre os mecanismos de toxicidade química. No entanto, esses bioensaios HTS dependem principalmente de sistemas baseados em células, que podem ser complexos e caros. Além disso, métodos de sequenciamento de alto rendimento também foram usados para avaliação de toxicidade química, mas alcançar a avaliação de alto rendimento de produtos químicos continua sendo um desafio⁶. Estudos anteriores desenvolveram ensaios de ligação competitiva receptor-ligante baseados em polarização de fluorescência (FP) para determinar a potência de ligação de vários poluentes ambientais, incluindo substâncias per e polifluoroalquil (PFAS) ^{7 , 8 , 9 ,} bisfenol A (BPA) ^{10 , 11} e material particulado (PM) ¹² , com receptores nucleares como o receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) ^{7 ,} 8,9,10,13, receptor farnesóide X (FXR)^11,12 e receptor tireoidiano (TR)^14,15. Essa abordagem é eficiente, econômica e fornece insights mecanicistas.

Neste estudo, o protocolo para o ensaio de ligação receptor-ligante é descrito com base na detecção da polarização de fluorescência (FP) de uma pequena sonda fluorescente. O princípio do ensaio de ligação receptor-ligante baseado em FP é ilustrado na Figura 1. Quando uma pequena molécula fluorescente é excitada por luz polarizada plana, a luz emitida torna-se altamente despolarizada devido à rápida rotação molecular. No entanto, quando o traçador se liga a um receptor maior, sua rotação é retardada. Um valor de FP alto é detectado quando o traçador está ligado ao receptor grande, enquanto um valor de FP baixo é observado quando o traçador está livre. O receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) foi purificado para a ligação da sonda ao receptor. Rosiglitazona (Rosi), ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) e fosfato de trifenil (TPHP) foram usados para competir pela ligação da sonda com o receptor. Rosi, um agonista específico do PPARγ, foi usado como controle positivo nos ensaios de ligação competitiva do receptor. Além disso, PFOS e TPHP foram previamente identificados como agonistas fracos de PPARγ em estudos anteriores 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Além disso, eles pertencem a diferentes categorias estruturais de compostos conhecidos pela exposição ambiental e são notáveis por suas taxas de detecção relativamente altas em populações humanas. Esses compostos foram usados para validar ainda mais a ampla aplicabilidade do ensaio de ligação competitiva. O procedimento consiste em quatro etapas: construção e transformação de vetores recombinantes, expressão e purificação da proteína receptora (domínio de ligação ao ligante), ligação receptor-sonda e ligação competitiva de produtos químicos com o receptor.

Protocol

Os detalhes dos reagentes e do equipamento estão listados na Tabela de Materiais.

1. Construção e transformação de vetores recombinantes

NOTA: PPARγ é um fator de transcrição dependente de ligante com uma estrutura clássica de receptor nuclear, compreendendo um domínio de ligação ao DNA que regula os genes-alvo e um domínio de ligação ao ligante ativado por ligantes. Após a ativação do ligante, o PPARγ forma um heterodímero com outro receptor nuclear, o receptor retinóide X (RXR), e se liga a elementos de resposta do PPARγ, regulando assim a transcrição de genes-alvo a jusante ^9,16.

1. Projete primers para o PPARγ-LBD (ver Tabela 1) e amplifique o segmento de DNA PPARγ-LBD (ver Tabela 2 e Tabela 3).
2. Linearize o vetor pET28a marcado com His×6 digerindo-o com endonucleases de restrição XhoI e BamHI¹⁸.
3. Clone o segmento de DNA PPARγ-LBD no vetor pET28a marcado com His×6 usando o kit de clonagem disponível comercialmente, resultando no plasmídeo recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Transfectar o plasmídeo de expressão recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His em células BL21 (DE3) de Escherichia coli para expressão proteica¹⁸.
5. Adicionar 5 μL do vetor recombinante às células BL21 (DE3) competentes, incubar no gelo durante 30 min, aplicar um choque térmico a 42 °C durante 45 s e, em seguida, regressar imediatamente ao gelo.
6. Adicione 900 μL de meio LB, agite a 37 °C por 1 h (160-200 rpm) e centrifugue a ~ 3000 x g por 5 min em temperatura ambiente.
7. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento bacteriano em 100 μL de meio LB e espalhar para um meio sólido. Inverter as placas e cultivar a 37 °C durante 12-16 h.
8. Selecione colônias individuais para identificação de sequenciamento e subsequente expressão e purificação de proteínas.

2. Expressão e purificação da proteína receptora

1. Incubar as células BL21 (DE3) transformadas em meio LB de 200 mL suplementado com 100 μg / mL de ampicilina em um agitador orbital (230 rpm) por 1-2 h a 37 ° C.
2. Induza as células quando o OD₆₀₀ atingir 0,4-0,6 unidades de absorbância adicionando 10 μM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e incube a 16 ° C por 16 h.
3. Recolher a suspensão bacteriana e centrifugar a 8000 × g, 4 °C, durante 10 min.
4. Lise as células em 20 mL de tampão de lise solúvel (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0), adicionando 200 μL de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 200 μL de lisozima. Ressuspenda o pellet bacteriano usando uma pipeta de 5 mL e, em seguida, prossiga com a sonicação a 30% da potência por 20 min.
5. Adicione um tampão de lise igual a 5 vezes o volume da coluna para equilibrar a coluna de níquel. Repita este processo duas vezes e reserve.
6. Centrifugar a suspensão bacteriana sonicada a 8000 × g durante 15 min a 4 °C para obter o lisado sobrenadante bacteriano (CL).
7. Carregue o CL na coluna de níquel (para adsorção de proteínas) para obter o fluxo (FT).
8. Lave a coluna com 5 vezes o volume da coluna de tampão de lavagem (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0) para obter o eluído de lavagem (W1-W6).
9. Lavar a coluna com 1 ml de tampão de eluição (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) para eluir a proteína alvo e obter as fracções proteicas (E1-E5).
10. Pegue uma alíquota de 20 μL de cada fração (CL, FT, W1-W6 e E1-E5) e analise usando SDS-PAGE¹⁸ com coloração Coomassie Brilliant Blue. O PPARγ-LBD funciona como uma proteína de 34,9 kDa em um gel desnaturante.

3. Ensaio de ligação ao receptor

NOTA: Neste ensaio, C1-BODIPY-C12 foi usado como uma sonda fluorescente específica do local para estabelecer o sistema de ligação receptor-ligante. C1-BODIPY-C12, um ligante específico para PPARγ, é um análogo fluorescente de ácido graxo com o grupo fluorescente BODIPY incorporado ao ácido graxo na posição C1.

1. Diluir o PPARγ-LBD humano purificado em tampão Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) até um intervalo de concentração de 1 nM a 6400 nM. Além disso, dilua a sonda C1-BODIPY-C12 em tampão Tris-HCl a uma concentração de 50 nM.
2. Misture a solução diluída de PPARγ-LBD (55 μL por poço) e a solução de sonda C1-BODIPY-C12 (55 μL por poço) em uma placa preta de 96 poços. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
3. Meça a polarização de fluorescência (FP) com o leitor de microplacas.
4. Plote os valores de FP em relação à concentração do receptor, ajuste a curva usando a ligação específica com a equação de declive de Hill usando software estatístico e gráfico e calcule o valor de K_d .

4. Ensaio de ligação competitiva

NOTA: Neste ensaio, 800 nM de PPARγ-LBD humano e sonda C1-BODIPY-C12 de 50 nM foram usados para ligação ao receptor. Rosiglitazona (Rosi), fosfato de trifenil (TPHP) e ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) foram usados para competir com a ligação da sonda ao PPARγ.

1. Diluir os três compostos em tampão Tris-HCl dentro de uma faixa de concentração de 0-200 μM.
2. Preparar a solução de ligação receptor-sonda com uma concentração final de 800 nM de PPARγ-LBD humano e 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12.
3. Misture a solução de ligação receptor-sonda (55 μL por poço) e a solução composta (55 μL por poço) em uma placa preta de 96 poços. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
4. Meça a polarização de fluorescência (FP) com o leitor de microplacas.
5. Plote os valores de FP em função da concentração do ligante. Obter a concentração inibitória semimáxima (IC₅₀) de cada ligante da curva de competição usando o modelo sigmoidal processado por um software de gráfico e análise.

Results

Expressão proteica e purificação de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD foi expresso heterologicamente em BL21 (DE3) como uma proteína marcada com histidina. A proteína foi detectada nas frações solúveis, e o PPARγ-LBD purificado apresentou uma única banda no SDS-PAGE com peso molecular aparente de aproximadamente 34,9 kDa (Figura 2), consistente com o peso molecular previsto da proteína.

A ligação da sonda C 1-BODIPY-C₁₂ ao PPARγ-LBD
No ensaio de ligação ao receptor, C1-BODIPY-C12, um ácido graxo marcado com BODIPY que pode se ligar ao PPARγ-LBD, foi usado como uma sonda de fluorescência para estudar a potência de ligação de poluentes ambientais com hPPARγ-LBD. Conforme mostrado na Figura 3A, os valores de polarização de fluorescência (FP) aumentaram de 20 para 250 após a adição de PPARγ-LBD, indicando a ligação de C1-BODIPY-C12 ao receptor. A curva de ligação atingiu saturação a 800 nM PPARγ-LBD, com uma constante de dissociação (K_d) de 253,5 nM ± 10,05 nM. Portanto, 800 nM PPARγ-LBD foi escolhido para os ensaios de ligação competitivos subsequentes.

A ligação competitiva de poluentes ambientais ao PPARγ-LBD
A rosiglitazona (Rosi), um agonista específico do PPARγ, foi usada como controle positivo para deslocar a sonda fluorescente nos ensaios de ligação competitiva do ligante. Conforme mostrado na Figura 3B, Rosi inibiu a ligação da sonda C1-BODIPY-C12 ao PPARγ-LBD de maneira dose-dependente, com um IC₅₀ de 6,89 μM, demonstrando a viabilidade do ensaio. Em seguida, foram determinadas as afinidades de ligação de TPHP e PFOS ao PPARγ-LBD. Conforme mostrado na Figura 3C, D, TPHP e PFOS também inibiram a ligação da sonda C1-BODIPY-C12 ao PPARγ-LBD de maneira dose-dependente, com valores de IC₅₀ de 60,45 μM e 37,27 μM, respectivamente.

Figura 1: Ilustração esquemática dos ensaios de ligação competitiva do receptor baseados em polarização de fluorescência (FP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise SDS-PAGE do PPARγ-LBD purificado. M é o marcador de peso molecular da proteína. Cl é o lisado celular, FT é a fração de fluxo, W1-W6 são as soluções de lavagem, E1 é o eluído e E2-E4 são as proteínas PPARγ-LBD purificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Curva de ligação do receptor baseada em polarização de fluorescência (FP) e curvas de ligação competitivas. (A) Curva de ligação baseada em FP de C 1-BODIPY-C₁₂ para PPARγ-LBD humano. (BD) Curvas de ligação competitiva baseadas em FP de Rosi, TPH e PFOS para PPARγ-LBD humano. As barras de erro denotam o desvio padrão (DP) para três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID	Seq
pET28a-PPARG-P1 humano	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-PPARG-P2 humano	GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
Sequência de nucleotídeos PPARγ-LBD	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGGGG CTCGAGGCCACCCACCC

Tabela 1: A sequência de primer e nucleotídeo do domínio de ligação ao ligante PPARγ.

Nomes de reagentes experimentais	Volume/Dose
pET28a-PPARG-P1 humano	1 μL
pET28a-PPARG-P2 humano	1 μL
2×phanta Max Master Mix	12,5 μL
cDNA	2 μL
ddH2O	8,5 μL

Tabela 2: Sistema de reagentes experimentais de PCR.

Nomes de experimentos	Temperatura	Hora
Pré-desnaturação	95 °C	3 minutos
Desnaturação	95 °C	15 s
Recozimento	65 °C	15 s
Extensão	72 °C	6 min
Loja	12 °C	--

Tabela 3: Programa de reação experimental de PCR.

Discussion

Polarização de fluorescência (FP), ressonância plasmônica de superfície (SPR) e ressonância magnética nuclear (RMN) são técnicas comuns usadas para avaliar interações de ligação direta entre proteínas e compostos^19,20. O PF tem sido amplamente empregado na investigação de interações moleculares para descoberta de medicamentos e triagem química 21,22,23. Em comparação, os ensaios de SPR e RMN são caros e demorados, tornando-os menos adequados para aplicações de triagem de alto rendimento (HTS). Este protocolo descreve um método de análise receptor-ligante baseado em FP com um sistema de detecção de placas multipoços, permitindo o HTS de produtos químicos.

A escolha da sonda apropriada para um ensaio de ligação ao receptor é crucial. A sonda deve consistir em dois componentes: um ligante específico para o receptor nuclear e um grupo fluorescente. Normalmente, essas sondas podem ser obtidas comercialmente, como exemplificado pela sonda C1-BODIPY-C12 usada neste estudo. C1-BODIPY-C12 é um análogo fluorescente de ácido graxo, com o grupo fluorescente BODIPY incorporado na posição C1, e é um ligante específico para PPARγ. Se uma sonda fluorescente disponível comercialmente não for uma opção, ela deve ser sintetizada quimicamente anexando um grupo fluorescente a um ligante específico conhecido.

A estrutura clássica de um receptor nuclear inclui um domínio de ligação ao DNA responsável por regular a expressão do gene alvo e um domínio de ligação ao ligante (LBD), normalmente localizado no terminal C²⁴ do receptor. O sítio de ligação do co-regulador é geralmente encontrado dentro do domínio da função de ativação transcricional do receptor nuclear, onde interage com fatores correguladores nucleares²⁵. Esses co-reguladores podem aumentar ou suprimir a atividade transcricional do receptor, modulando assim a expressão gênica. O LBD, localizado em uma região específica da proteína receptora, regula as mudanças conformacionais do receptor após a ligação do ligante, que por sua vez ativa ou inibe sua atividade transcricional. Uma vez que o LBD é um domínio bem definido crucial para reconhecer e ligar ligantes específicos de pequenas moléculas²⁴, apenas o receptor-LBD foi usado no ensaio de ligação competitiva do receptor neste estudo. Essa abordagem, que envolveu a expressão e purificação do domínio de ligação ao ligante do PPARγ, reduziu os custos do ensaio.

Os reagentes usados neste método, incluindo tampões para purificação de proteínas, sonda C1-BODIPY-C12 e Tris-HCl, estão disponíveis comercialmente e são baratos, o que é uma vantagem significativa para o ensaio. A detecção de polarização de fluorescência (FP) é realizada em uma placa de vários poços (96 poços ou 384 poços), com um tempo de leitura rápido de 3 a 5 minutos por placa, aumentando o rendimento e a eficiência do teste. A abordagem de ligação receptor-ligante é altamente flexível e pode ser facilmente adaptada a vários receptores, desde que as proteínas receptoras estejam disponíveis. Essa adaptabilidade amplia o escopo da pesquisa que pode ser conduzida usando esse método. No geral, a combinação dessas vantagens - facilidade de uso, eficiência de custos, alta capacidade de rendimento, processamento rápido e flexibilidade na adaptação do receptor - torna esse método uma opção promissora para a triagem de poluentes ambientais tóxicos.

Os presentes resultados demonstram que PFOS e TPHP podem se ligar ao PPARγ, o que é consistente com achados anteriores de ensaios de docking molecular e gene repórter ^9,26. Além disso, o método descrito neste manuscrito foi utilizado para avaliar a potência de ligação de vários poluentes ambientais com receptores nucleares. Por exemplo, usando o ensaio de ligação competitiva receptor-ligante baseado em FP, a potência de ligação de 19 substâncias per e polifluoroalquil (PFASs) e 7 compostos de bisfenol A (BPA) ao receptor ativado por proliferador de peroxissomo β/δ (PPARβ/δ)^7,10, 12 PFASs a PPARγ ^9,13, 7 compostos de BPA e 3 componentes de material particulado (PM_2,5) ao receptor farnesóide X (FXR)^{11, 12} e 8 éteres difenílicos polibromados (PBDEs) e 6 bifenilos policlorados (PCBs) para o receptor da tireoide (TR) ^{14 , 15} foram determinados. Essas descobertas destacam o potencial desse método para rastrear as interações de ligação entre poluentes ambientais e receptores nucleares.

Estudos anteriores relataram métodos de ensaio de polarização de fluorescência (FP) para PPARγ que envolvem o uso de filtração em gel para medir a ligação, o que requer pelo menos 1,5 h para detectar a ligação de um único composto²³. Em contraste, este método permite a detecção de afinidades de ligação para pelo menos 12 compostos com PPARγ em 10 min. Além disso, alguns kits de ensaio disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) custam mais de US$ 3000 para um formato de 800 × 20 μL. Esses métodos são notavelmente caros e demorados. Este estudo apresenta melhorias em relação a esses métodos existentes.

Uma limitação potencial desse método é que a sonda de fluorescência deve ser um ligante para o receptor, e as sondas de fluorescência não interagem diretamente com poluentes ambientais. Portanto, é crucial garantir que a sonda e os poluentes ambientais sejam mantidos separados na solução. Além disso, este ensaio reflete uma situação in vitro e não pode capturar totalmente as interações in vivo , pois os receptores são heterodiméricos in vivo²⁷. Consequentemente, embora este método sirva como uma ferramenta de triagem rápida, é necessária uma investigação mais aprofundada da ativação do receptor e dos mecanismos toxicológicos relacionados in vivo .

Outra desvantagem é o fenômeno de "deslocamento para a direita" observado nos ensaios de polarização de fluorescência (FP) ao avaliar a afinidade de ligação, o que pode levar a uma subestimação sistemática das afinidades medidas. Em estudos anteriores, a afinidade de ligação da rosiglitazona com o PPARγ foi avaliada usando o ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET)²⁸, que é um método altamente sensível para medir a afinidade de ligação ligante-receptor. No entanto, o ensaio TR-FRET é relativamente demorado e complicado, exigindo uma incubação de 4 h da solução de reação à temperatura ambiente antes da detecção. Embora o ensaio FP exiba menor sensibilidade em comparação com o ensaio TR-FRET, ele é mais adequado para triagem de alto rendimento de ligantes ambientais que se ligam a receptores nucleares. No entanto, o ensaio FP pode perder alguns ligantes ambientais fracos. Além disso, em estudos anteriores, a afinidade de ligação do PFOS com o PPARγ foi determinada usando diálise de equilíbrio (EqD)²⁹, outro método altamente sensível para medir a afinidade de ligação ligante-receptor. No entanto, o EqD depende de equipamentos analíticos caros (LC-MS/MS), o que limita sua aplicação e impede recursos de triagem de alto rendimento.

Embora este ensaio de polarização de fluorescência (FP) exiba um fenômeno de "deslocamento para a direita", que pode resultar em valores de IC₅₀ calculados geralmente mais altos, ele não afeta a classificação de afinidade relativa ou as previsões subsequentes de avaliação de risco. Além disso, o ensaio FP é econômico, eficiente em termos de tempo e capaz de rastrear uma ampla gama de compostos quanto à sua afinidade com vários receptores nucleares. No geral, a triagem de alto rendimento baseada em PF de ligantes ambientais facilita a rápida identificação de poluentes ambientais tóxicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Sonda	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Liga-se a PPARγ-LBD e emite fluorescência.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Manchar as bandas de proteína.
Prisma GraphPad	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazol	Solarbio, China	I8090	Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo	Solarbio, China	367-93-1	Induza a expressão de PPARγ-LBD
Leitor de microplacas	Biotek, EUA	Synergy H1	Detectando o valor FP
Reagente NaCl	Shanghai	7647-15-5	Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
NaH2PO4 · 2H2O	Reagente de Xangai	13472-35-0	Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Purificação de proteínas.
Origem 8.5	OriginLab, Northampton, MA, EUA
Ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS)	J& K Scientific Ltd, China	1763-23-1	Os poluentes ambientais detectados
Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Inibe a degradação de proteínas.
PPARγ-Kit de Ensaio Concorrente	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Kit de Ensaio de Triagem de Ligante	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazona (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	Os agonistas de PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Expansão da cultura bacteriana e indução da expressão de proteínas
Fosfato de trifenil (TPHP)	Macklin, China	T819317	Os poluentes ambientais detectados
Tris	Solarbio, China	T8230	Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Prepare o meio de caldo de lisogenia (LB).
Limpador ultrassônico	Kimberly, China	LHO-1	Interrompa as bactérias para obter uma lise completa
Ureia	Solarbio, China	U8020	Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Extrato de levedura	OXOID Limited, China	LP0021B	Prepare o meio de caldo de lisogenia (LB).