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Artigo de método

Uma abordagem de triagem de alto rendimento para avaliar a afinidade de ligação de poluentes ambientais a receptores nucleares

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DOI:

10.3791/67327

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20 de setembro de 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um sistema de triagem de alto rendimento que usa a polarização de fluorescência de uma sonda fluorescente específica ligada a um receptor nuclear como uma leitura para triagem de poluentes ambientais.

Resumo

Níveis crescentes de compostos foram detectados no meio ambiente, causando poluição generalizada e representando riscos à saúde humana. No entanto, apesar de sua alta ocorrência ambiental, há informações muito limitadas sobre seus efeitos toxicológicos. É urgente desenvolver métodos de triagem de alto rendimento (HTS) para orientar estudos toxicológicos. Neste estudo, um ensaio de ligação receptor-ligante usando um sistema HTS foi desenvolvido para determinar a potência de ligação de poluentes ambientais em receptores nucleares. O teste é conduzido usando um leitor de microplacas (ou seja, uma placa de 96 poços contendo vários produtos químicos) medindo a polarização de fluorescência (FP) de uma sonda fluorescente específica. Este ensaio consiste em quatro partes: a construção e transformação de vetores recombinantes, a expressão e purificação da proteína receptora (domínio de ligação ao ligante), ligação receptor-sonda e ligação competitiva de produtos químicos com o receptor. A potência de ligação de dois poluentes ambientais, ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) e fosfato de trifenil (TPHP), com o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) foi determinada para ilustrar o procedimento de ensaio. Por fim, também foram discutidas as vantagens e desvantagens desse método e suas potenciais aplicações.

Introdução

Um grande número de produtos químicos foi amplamente detectado no meio ambiente e no corpo humano, levantando preocupações significativas sobre seu impacto no ambiente ecológico e na saúde humana 1,2,3. Apesar de sua alta ocorrência ambiental, informações sobre seus efeitos toxicológicos são escassas. Portanto, é urgente desenvolver métodos de triagem de alto rendimento (HTS) para facilitar a avaliação da toxicidade química.

Vários métodos de triagem de alto rendimento (HTS) foram relatados para avaliação de toxicidade química, como os bioensaios HTS usados nos programas Tox21 e ToxCast 4,5. Esses métodos podem identificar rapidamente potenciais tóxicos e fornecer informações valiosas sobre os mecanismos de toxicidade química. No entanto, esses bioensaios HTS dependem principalmente de sistemas baseados em células, que podem ser complexos e caros. Além disso, métodos de sequenciamento de alto rendimento também foram usados para avaliação de toxicidade química, mas alcançar a avaliação de alto rendimento de produtos químicos continua sendo um desafio6. Estudos anteriores desenvolveram ensaios de ligação competitiva receptor-ligante baseados em polarização de fluorescência (FP) para determinar a potência de ligação de vários poluentes ambientais, incluindo substâncias per e polifluoroalquil (PFAS) 7 , 8 , 9 , bisfenol A (BPA) 10 , 11 e material particulado (PM) 12 , com receptores nucleares como o receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) 7 , 8,9,10,13, receptor farnesóide X (FXR)11,12 e receptor tireoidiano (TR)14,15. Essa abordagem é eficiente, econômica e fornece insights mecanicistas.

Neste estudo, o protocolo para o ensaio de ligação receptor-ligante é descrito com base na detecção da polarização de fluorescência (FP) de uma pequena sonda fluorescente. O princípio do ensaio de ligação receptor-ligante baseado em FP é ilustrado na Figura 1. Quando uma pequena molécula fluorescente é excitada por luz polarizada plana, a luz emitida torna-se altamente despolarizada devido à rápida rotação molecular. No entanto, quando o traçador se liga a um receptor maior, sua rotação é retardada. Um valor de FP alto é detectado quando o traçador está ligado ao receptor grande, enquanto um valor de FP baixo é observado quando o traçador está livre. O receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) foi purificado para a ligação da sonda ao receptor. Rosiglitazona (Rosi), ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) e fosfato de trifenil (TPHP) foram usados para competir pela ligação da sonda com o receptor. Rosi, um agonista específico do PPARγ, foi usado como controle positivo nos ensaios de ligação competitiva do receptor. Além disso, PFOS e TPHP foram previamente identificados como agonistas fracos de PPARγ em estudos anteriores 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Além disso, eles pertencem a diferentes categorias estruturais de compostos conhecidos pela exposição ambiental e são notáveis por suas taxas de detecção relativamente altas em populações humanas. Esses compostos foram usados para validar ainda mais a ampla aplicabilidade do ensaio de ligação competitiva. O procedimento consiste em quatro etapas: construção e transformação de vetores recombinantes, expressão e purificação da proteína receptora (domínio de ligação ao ligante), ligação receptor-sonda e ligação competitiva de produtos químicos com o receptor.

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Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento estão listados na Tabela de Materiais.

1. Construção e transformação de vetores recombinantes

NOTA: PPARγ é um fator de transcrição dependente de ligante com uma estrutura clássica de receptor nuclear, compreendendo um domínio de ligação ao DNA que regula os genes-alvo e um domínio de ligação ao ligante ativado por ligantes. Após a ativação do ligante, o PPARγ forma um heterodímero com outro receptor nuclear, o receptor retinóide X (RXR), e se liga a elementos de resposta do PPARγ, regulando assim a transcrição de genes-alvo a jusante 9,16.

  1. Projete primers para o PPARγ-LBD (ver Tabela 1) e amplifique o segmento de DNA PPARγ-LBD (ver Tabela 2 e Tabela 3).
  2. Linearize o vetor pET28a marcado com His×6 digerindo-o com endonucleases de restrição XhoI e BamHI18.
  3. Clone o segmento de DNA PPARγ-LBD no vetor pET28a marcado com His×6 usando o kit de clonagem disponível comercialmente, resultando no plasmídeo recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. Transfectar o plasmídeo de expressão recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His em células BL21 (DE3) de Escherichia coli para expressão proteica18.
  5. Adicionar 5 μL do vetor recombinante às células BL21 (DE3) competentes, incubar no gelo durante 30 min, aplicar um choque térmico a 42 °C durante 45 s e, em seguida, regressar imediatamente ao gelo.
  6. Adicione 900 μL de meio LB, agite a 37 °C por 1 h (160-200 rpm) e centrifugue a ~ 3000 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  7. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento bacteriano em 100 μL de meio LB e espalhar para um meio sólido. Inverter as placas e cultivar a 37 °C durante 12-16 h.
  8. Selecione colônias individuais para identificação de sequenciamento e subsequente expressão e purificação de proteínas.

2. Expressão e purificação da proteína receptora

  1. Incubar as células BL21 (DE3) transformadas em meio LB de 200 mL suplementado com 100 μg / mL de ampicilina em um agitador orbital (230 rpm) por 1-2 h a 37 ° C.
  2. Induza as células quando o OD600 atingir 0,4-0,6 unidades de absorbância adicionando 10 μM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e incube a 16 ° C por 16 h.
  3. Recolher a suspensão bacteriana e centrifugar a 8000 × g, 4 °C, durante 10 min.
  4. Lise as células em 20 mL de tampão de lise solúvel (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0), adicionando 200 μL de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 200 μL de lisozima. Ressuspenda o pellet bacteriano usando uma pipeta de 5 mL e, em seguida, prossiga com a sonicação a 30% da potência por 20 min.
  5. Adicione um tampão de lise igual a 5 vezes o volume da coluna para equilibrar a coluna de níquel. Repita este processo duas vezes e reserve.
  6. Centrifugar a suspensão bacteriana sonicada a 8000 × g durante 15 min a 4 °C para obter o lisado sobrenadante bacteriano (CL).
  7. Carregue o CL na coluna de níquel (para adsorção de proteínas) para obter o fluxo (FT).
  8. Lave a coluna com 5 vezes o volume da coluna de tampão de lavagem (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0) para obter o eluído de lavagem (W1-W6).
  9. Lavar a coluna com 1 ml de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) para eluir a proteína alvo e obter as fracções proteicas (E1-E5).
  10. Pegue uma alíquota de 20 μL de cada fração (CL, FT, W1-W6 e E1-E5) e analise usando SDS-PAGE18 com coloração Coomassie Brilliant Blue. O PPARγ-LBD funciona como uma proteína de 34,9 kDa em um gel desnaturante.

3. Ensaio de ligação ao receptor

NOTA: Neste ensaio, C1-BODIPY-C12 foi usado como uma sonda fluorescente específica do local para estabelecer o sistema de ligação receptor-ligante. C1-BODIPY-C12, um ligante específico para PPARγ, é um análogo fluorescente de ácido graxo com o grupo fluorescente BODIPY incorporado ao ácido graxo na posição C1.

  1. Diluir o PPARγ-LBD humano purificado em tampão Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) até um intervalo de concentração de 1 nM a 6400 nM. Além disso, dilua a sonda C1-BODIPY-C12 em tampão Tris-HCl a uma concentração de 50 nM.
  2. Misture a solução diluída de PPARγ-LBD (55 μL por poço) e a solução de sonda C1-BODIPY-C12 (55 μL por poço) em uma placa preta de 96 poços. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
  3. Meça a polarização de fluorescência (FP) com o leitor de microplacas.
  4. Plote os valores de FP em relação à concentração do receptor, ajuste a curva usando a ligação específica com a equação de declive de Hill usando software estatístico e gráfico e calcule o valor de Kd .

4. Ensaio de ligação competitiva

NOTA: Neste ensaio, 800 nM de PPARγ-LBD humano e sonda C1-BODIPY-C12 de 50 nM foram usados para ligação ao receptor. Rosiglitazona (Rosi), fosfato de trifenil (TPHP) e ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS) foram usados para competir com a ligação da sonda ao PPARγ.

  1. Diluir os três compostos em tampão Tris-HCl dentro de uma faixa de concentração de 0-200 μM.
  2. Preparar a solução de ligação receptor-sonda com uma concentração final de 800 nM de PPARγ-LBD humano e 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12.
  3. Misture a solução de ligação receptor-sonda (55 μL por poço) e a solução composta (55 μL por poço) em uma placa preta de 96 poços. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
  4. Meça a polarização de fluorescência (FP) com o leitor de microplacas.
  5. Plote os valores de FP em função da concentração do ligante. Obter a concentração inibitória semimáxima (IC50) de cada ligante da curva de competição usando o modelo sigmoidal processado por um software de gráfico e análise.

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Resultados

Expressão proteica e purificação de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD foi expresso heterologicamente em BL21 (DE3) como uma proteína marcada com histidina. A proteína foi detectada nas frações solúveis, e o PPARγ-LBD purificado apresentou uma única banda no SDS-PAGE com peso molecular aparente de aproximadamente 34,9 kDa (Figura 2), consistente com o peso molecular previsto da proteína.

A ligação da sonda C 1-BODIPY-C12 ao PPARγ-LBD

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Discussão

Polarização de fluorescência (FP), ressonância plasmônica de superfície (SPR) e ressonância magnética nuclear (RMN) são técnicas comuns usadas para avaliar interações de ligação direta entre proteínas e compostos19,20. O PF tem sido amplamente empregado na investigação de interações moleculares para descoberta de medicamentos e triagem química 21,22,23.

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 82103875).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C1-BODIPY-C12 SondaThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Liga-se a PPARγ-LBD e emite fluorescência.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Manchar as bandas de proteína.
Prisma GraphPadDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazolSolarbio, ChinaI8090Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeoSolarbio, China367-93-1Induza a expressão de PPARγ-LBD
Leitor de microplacasBiotek, EUASynergy H1 Detectando o valor FP
Reagente NaClShanghai7647-15-5Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
NaH2PO4 · 2H2OReagente de Xangai13472-35-0Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Purificação de proteínas.
Origem 8.5 OriginLab, Northampton, MA, EUA
Ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS)J& K Scientific Ltd, China1763-23-1Os poluentes ambientais detectados
Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)Solarbio, ChinaP0100Inibe a degradação de proteínas.
PPARγ-Kit de Ensaio ConcorrenteThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Kit de Ensaio de Triagem de LiganteCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazona (Rosi)aladdin, China122320-73-4Os agonistas de PPARγ
ShakerZHICHENG, ChinaZWY-211CExpansão da cultura bacteriana e indução da expressão de proteínas
Fosfato de trifenil (TPHP)Macklin, ChinaT819317Os poluentes ambientais detectados
TrisSolarbio, ChinaT8230Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BPrepare o meio de caldo de lisogenia (LB).
Limpador ultrassônicoKimberly, ChinaLHO-1Interrompa as bactérias para obter uma lise completa
UreiaSolarbio, ChinaU8020Prepare tampões para o processo de purificação de proteínas.
Extrato de leveduraOXOID Limited, ChinaLP0021BPrepare o meio de caldo de lisogenia (LB).

Referências

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