Artigo de método

Microbiota de jardins de formigas Attine: visualizando uma paisagem microbiana por microscopia eletrônica de varredura

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 de outubro de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

Neste artigo

Resumo

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Propomos um protocolo otimizado de Microscopia Eletrônica de Varredura para visualização de amostras altamente heterogêneas e delicadas contendo biomassa vegetal e fúngica, juntamente com microbiota e biofilme. Este protocolo permite descrever as dimensões espaciais da organização da microbiota.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em ecossistemas de macroescala, como florestas tropicais ou recifes de coral, a localização espacial dos organismos é a base de nossa compreensão da ecologia da comunidade. No mundo microbiano, da mesma forma, os ecossistemas em microescala estão longe de ser uma mistura aleatória e homogênea de organismos e habitats. Acessar a distribuição espacial dos micróbios é fundamental para entender o funcionamento e a ecologia da microbiota, pois as espécies coabitantes são mais propensas a interagir e influenciar a fisiologia umas das outras.

Um ecossistema microbiano entre reinos está no centro das colônias de formigas produtoras de fungos, que cultivam fungos basidiomicetos como recurso nutricional. As formigas Attine procuram diversos substratos (principalmente à base de plantas), metabolizados pelo fungo cultivado enquanto formam uma estrutura esponjosa, um "jardim microbiano" que atua como um intestino externo. O jardim é uma malha entrelaçada de hifas fúngicas que crescem metabolizando o substrato, abrindo nichos para que uma microbiota característica e adaptada se estabeleça. Acredita-se que a microbiota contribua para a degradação do substrato e o crescimento de fungos, embora sua organização espacial ainda não tenha sido determinada.

Aqui, descrevemos como empregamos a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para investigar, com detalhes sem precedentes, a organização espacial da microbiota e do biofilme em diferentes sistemas de fungicultura de formigas produtoras de fungos. A imagem de MEV forneceu uma descrição da estrutura e organização espacial da microbiota. O MEV revelou que a microbiota comumente se reúne em biofilmes, uma estrutura generalizada das paisagens microbianas na fungicultura. Apresentamos os protocolos empregados para fixar, desidratar, secar, revestir por pulverização catódica e criar imagens de uma comunidade tão complexa. Esses protocolos foram otimizados para lidar com amostras delicadas e heterogêneas, compreendendo biomassa vegetal e fúngica, bem como a microbiota e o biofilme.

Introdução

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Os ecossistemas são compostos por organismos interconectados por processos em uma localização geográfica específica (ou seja, o meio ambiente). Os organismos interagem com seu ambiente ao longo do tempo, a partir do qual emergem padrões espaciais complexos e heterogêneos. A padronização espacial determina a diversidade e a estabilidade ecológica e, em última análise, o funcionamento do ecossistema 1,2,3,4. Em ecossistemas de macroescala, como pântanos, savanas, recifes de coral e ecossistemas áridos, os padrões espaciais estão correlacionados com o fluxo e a concentração de recursos. Permitir a otimização de recursos, a heterogeneidade espacial e a padronização resultam em ecossistemas mais resilientes do que os homogêneos2. A localização espacial dos organismos na base da ecologia da comunidade também é traduzida para o mundo microbiano.

Os ecossistemas microbianos, longe de organismos misturados de forma aleatória e homogênea em microhabitats, exibem padrões espaciais que definem grande parte de seu funcionamento 5,6,7. Das colunas de Winogradsky à microbiota associada ao ambiente e ao hospedeiro, esses ecossistemas são organizados de forma heterogênea no espaço, com arranjos espaciais que provocam diferentes respostas fenotípicas. As espécies coabitantes são mais propensas a interagir e influenciar a fisiologia umas das outras. Assim, a organização espacial da comunidade, mais do que sua composição per se, delimita propriedades ecossistêmicas e nichos ecológicos 5,7,8. Ilustrando esses conceitos, as mudanças na padronização espacial parecem correlacionadas à progressão patológica de placas dentárias, cárie, doenças gengivais 9,10, doença inflamatória intestinal11, infecções pulmonares de fibrose cística, infecções crônicas de feridas12,13, câncer colorretal e adenomas14.

No âmbito da biogeografia microbiana (o estudo da distribuição e padronização da biodiversidade no espaço e no tempo em microescala), o conhecimento dos ecossistemas microbianos é amplamente beneficiado pela compreensão de seus padrões espaciais 6,13,15,16,17. Analisamos os padrões espaciais de um ecossistema microbiano construído por insetos, encontrado no centro das carismáticas colônias de formigas attine (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Lá reside um "jardim microbiano", centrado em torno de um fungo basidiomiceto na tribo Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) ou na família Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales) 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . O jardim é uma estrutura esponjosa que emerge de uma malha entrelaçada de hifas que cresce metabolizando o substrato principalmente vegetal incorporado pelas formigas (Figura 1). Estes podem incluir, de acordo com os gêneros atinos: partes secas de plantas, excrementos e carcaças de insetos, folhas recém-cortadas, sementes e partes florais23,24. Análogo a um intestino herbívoro externo, o jardim converte enzimaticamente e quimicamente polímeros recalcitrantes em recursos nutricionais lábeis, fornecendo às formigas aminoácidos essenciais, lipídios e açúcares solúveis 21,25,26,27,28.

Análises ultraestruturais, enzimáticas e transcriptômicas realizadas para jardins dos gêneros de corte de folhas Atta e Acromyrmex sugerem que esses ambientes estruturam um continuum de degradação do substrato e manchas nutricionais 26,29,30,31,32. As partes jovens do jardim tendem a ser mais escuras devido ao substrato recém-incorporado após serem fragmentadas. Esses substratos adicionados recentemente são frequentemente colonizados pelas bordas, que foram cortadas por formigas operárias e inoculadas com aglomerados miceliais. Irradiando das bordas cortadas, as hifas fúngicas se espalham sobre o substrato 29,32,33. A abundância de hifas aumenta à medida que a degradação do substrato progride, resultando em regiões esbranquiçadas e metabolicamente ativas 30,31,32. Regiões mais antigas, com substrato mais degradado e microbiota abundante29,32, tendem a apresentar tons acastanhados e maior umidade. Os trabalhadores removem fragmentos dessa região, separando-os em pilhas de resíduos, onde também retiram substratos que prejudicam o simbionte fúngico 34,35,36. As pilhas de resíduos, embora fisicamente separadas do jardim, são um local de degradação contínua do substrato e ciclagem de nutrientes pela abundante microbiota habitante 29,32,37,38,39.

Uma microbiota composta principalmente por Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas e Serratia, também habita o jardim, aparentemente sendo compartilhada por diversos sistemas de fungicultura attine. Codificando vias metabólicas que poderiam complementar o metabolismo fúngico, a microbiota participa potencialmente das respostas fisiológicas do jardim 40,41,42,43,44. Não apenas os dados metagenômicos indicaram que a microbiota estava lá41,42, mas também a análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) da fungicultura de formigas cortadeiras mostrou principalmente bactérias em forma de bastonete sobre o substrato da planta32. Embora as bactérias (incluindo cepas celulolíticas) tenham sido isoladas de todo o jardim, elas foram visualizadas apenas em partes mais antigas do jardim e em pilhas de resíduos, bem como no pellet inicial carregado pelas rainhas fundadoras 29,32. Também era incerto se a microbiota poderia formar biofilmes in vivo (ou seja, no jardim e nos resíduos), conforme sugerido por sua capacidade metabólica42 e observado in vitro44.

Aqui, empregamos o SEM para compreender melhor a organização espacial da microbiota nas regiões do jardim, detalhando as interações físicas microbiota-substrato e microbiota-hifas. Ao fornecer imagens com maior profundidade focal, o MEV permite observações de estruturas microscópicas tridimensionais em alta resolução, permitindo uma análise completa dos padrões espaciais da microbiota do jardim. Detalhamos as etapas para fixar, desidratar, secar, revestir e criar imagens de amostras fúngicas heterogêneas e delicadas. Ao remover a etapa de pós-fixação com tetróxido de ósmio (OsO4) e reduzir o tempo de desidratação, simplificamos os protocolos 32,33,45 para preparação de amostras de jardim e resíduos para análise de MEV. Este protocolo adaptado preserva os padrões estruturais das hifas, bem como a organização espacial da microbiota e do biofilme, e pode ser aplicado a outros ecossistemas microbianos delicados e biofilmes.

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Figura 1: Jardins microbianos Attine. O jardim é uma estrutura esponjosa resultante de uma malha entrelaçada de hifas que cresce metabolizando o substrato principalmente vegetal incorporado pelas formigas. Também habitando o jardim está a microbiota, que codifica vias metabólicas que podem complementar o metabolismo fúngico. Dados metagenômicos e análises prévias de Microscopia Eletrônica de Varredura indicaram sua presença, embora tivéssemos pouco conhecimento de sua organização espacial e interações físicas com o substrato e as hifas fúngicas. Empregamos o MEV para desvendar a organização e padronização espacial da microbiota e do biofilme. Ilustrações de Mariana Barcoto (jardim e microbiota adaptados de Barcoto e Rodrigues 94), e fotos de Mariana Barcoto e Enzo Sorrentino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

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1. Amostragem de colônias de campo

NOTA: Ao coletar colônias de formigas, certifique-se de que todas as permissões exigidas pela legislação local sejam obtidas antes da coleta. No nosso caso, o alvará de coleta #74585 foi emitido pelo Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Quando as amostras vierem de uma colônia de laboratório, vá para a seção 2.

  1. Localize e marque a colônia. Escave uma trincheira ao redor da área do ninho até que a câmara do jardim fique exposta (Figura 2A).
    NOTA: Algumas espécies de attine podem construir suas colônias sob a serapilheira ou dentro de troncos podres. Nesses casos, gire cuidadosamente a cama ou quebre cuidadosamente as toras para coletar as amostras. Para obter informações detalhadas sobre localização, coleta e manutenção de colônias vivas de diversas espécies de formigas attinas, consulte Sosa-Calvo et al.46.
  2. Abra a câmara do jardim lateralmente para evitar que o solo caia na superfície do jardim. Colete cuidadosamente amostras de jardim usando uma pinça entomológica, uma colher ou uma escumadeira de cozinha, dependendo do tamanho do jardim.
    NOTA: Certifique-se de esterilizar as ferramentas antes de recolhê-las. Ao coletar jardins de formigas cortadeiras, use luvas de tecido grosso para evitar (ou pelo menos atenuar) as picadas das operárias. Para outras espécies de attine, luvas de tecido são opcionais.
  3. Transfira as amostras do jardim para um recipiente de plástico limpo contendo uma camada de gesso para equilibrar a umidade do jardim. Depois de transferir o jardim e as formigas, feche hermeticamente o recipiente para evitar a secagem da amostra. Armazene amostras de jardim a 23-25 °C até o processamento.
  4. Feche a vala com solo removido anteriormente.

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Figura 2: Protocolo de preparo da amostra. (A) Amostragem de colônias de campo. (B) Processamento de amostras. (C) Breves fundamentos e fluxo de trabalho para preparação de amostras: 1. Fixação: para fortalecer e preservar a estrutura da amostra. 2. Desidratação: o teor de água das amostras é trocado por etanol. 3. Secagem do ponto crítico: o CO2 líquido substitui o etanol e é evaporado. 4. Montagem: amostra exibida para análise. 5. Revestimento por pulverização catódica com ouro: evite o carregamento da amostra. 6. Imagem. Ilustrações e fotos de Mariana Barcoto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Reagentes

NOTA: Lembre-se de que as seguintes soluções devem ser preparadas com antecedência.

  1. Prepare o tampão de cacodilato de sódio 0,2 M. Para isso, dissolver 42,8 g de cacodilato de sódio em 800 mL de água destilada, mexendo até a dissolução e estabilização do pH em 7,2 (se necessário, ajustar o pH com ácido clorídrico). Completar o volume da solução para 1 l adicionando água destilada. Conservar a solução a 4 °C (durante ~1 mês).
    CUIDADO: O glutaraldeído e o paraformaldeído são tóxicos e devem ser manuseados dentro de uma capela de exaustão. Use luvas de nitrilo e óculos de proteção o tempo todo ao manusear esses reagentes.
  2. Prepare o fixador de Karnovsky (modificado de Karnovsky)47. Para isso, adicione 10 mL de solução aquosa de glutaraldeído a 25% e 10 mL de solução aquosa de paraformaldeído a 20% a 25 mL de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e misture. Adicione 1 mL de cloreto de cálcio 0,1 M (CaCl2) e complete o volume para 100 mL adicionando água destilada. Conservar a solução a 4 °C (até 1 mês).
    CUIDADO: O fixador de Karnovsky é prejudicial quando inalado e pode causar irritação na pele e nos olhos. Assim, evite respirar vapores, usando apenas ao ar livre ou em uma área bem ventilada. Use luvas de nitrilo e óculos de proteção o tempo todo ao manusear a solução.
  3. Usando etanol absoluto (grau analítico), prepare soluções de etanol a 30%, 50%, 70% e 90% em água destilada; 100% de etanol também é necessário.

3. Fixação da amostra

NOTA: Os fixadores endurecem e preservam as amostras, mantendo as características morfológicas. Os aldeídos (como o paraformaldeído e o glutaraldeído) são fixadores não coagulantes do tipo reticulação, induzindo ligações cruzadas dentro e entre proteínas e ácidos nucléicos48.

  1. Remova operárias, ovos, pupas e larvas das amostras de jardim usando fórceps entomológicos (Figura 2B). Separe fragmentos de jardim não maiores que 5 mm3. Adicione os fragmentos a um tubo de 2 mL (Figura 2C).
  2. Nos tubos que contêm as amostras, use uma pipeta de vidro Pasteur para adicionar ~ 1 mL de solução fixadora de Karnovsky (certifique-se de que a amostra esteja completamente coberta). Misturar com agitação suave para ajudar a amostra a mergulhar e incubar a 4 °C durante pelo menos 24 h antes de continuar o processamento da amostra (figura 2C.1).
    NOTA: Quando as seguintes etapas de desidratação não forem realizadas imediatamente após a fixação, o protocolo pode ser pausado nesta etapa e as amostras podem ser armazenadas por ~ 1 ano a 4 ° C.
    Sugerimos o uso de uma pipeta de vidro Pasteur, pois é composta por um material inerte e é mais fácil de limpar para reutilização posterior. O material do jardim é altamente hidrofóbico, tendendo a flutuar sobre a superfície da solução fixadora. Geralmente, leva até 5 minutos para ficar completamente embebido no fixador. Certifique-se de que o fixador cubra os fragmentos do jardim, pois seu volume tende a ser reduzido à medida que entra nos poros da amostra. Verificamos empiricamente que, depois que a amostra foi encharcada e molhada, seus componentes (em particular, o delicado micélio fúngico) tornaram-se suscetíveis a quebrar quando misturados ainda mais. Assim, recomendamos evitar ao máximo agitar as amostras.

4. Desidratação da amostra

NOTA: A série de lavagem de etanol troca gradualmente a água em amostras por etanol. É importante começar com uma solução de etanol de baixa concentração (veja abaixo) para evitar danos excessivos ou colapso dessas amostras delicadas49.

  1. Remova completamente a solução fixadora de Karnovsky usando uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra (Figura 2C.1).
    NOTA: Descarte o fixador de Karnovsky em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos.
  2. Imediatamente após a remoção do fixador, adicionar 1 mL de etanol a 30%, tomando cuidado para não romper a amostra, e incubar por 10 min em temperatura ambiente (Figura 2C.2).
    NOTA: As amostras precisam sempre ser embebidas em solução. Certifique-se de substituir rapidamente as soluções durante a série de lavagem gradual do etanol. Como o jardim perde seu aspecto poroso e se agrega no fundo do tubo, 1 mL de etanol tende a ser suficiente para cobrir a amostra (quando a amostra não é maior que 5 mm3). No entanto, se as amostras não estiverem completamente cobertas, adicione etanol até que a amostra esteja completamente coberta.
  3. Remova completamente o etanol a 30% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 30% adequadamente.
    NOTA: Para toda a série de lavagem gradual do etanol, descarte o etanol em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos.
  4. Adicione 1 mL de etanol a 50% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 50% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 50% adequadamente.
  5. Adicione 1 mL de etanol a 70% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 70% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol 70% corretamente.
    NOTA: Na etapa de lavagem com etanol a 70%, o usuário pode pausar o protocolo, se necessário, pois os tubos de amostra podem ser armazenados durante a noite a 4 °C, quando o material não será processado imediatamente.
  6. Adicione 1 mL de etanol a 90% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 90% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 90% adequadamente.
  7. Adicione 1 mL de etanol 100% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol 100% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não atrapalhar a amostra. Descarte o etanol 100% corretamente.
  8. Usando uma pinça e/ou uma espátula, transfira cuidadosamente as amostras para recipientes de amostra para o secador de ponto crítico (CPD), contendo etiquetas de identificação de amostra (feitas anteriormente em papel e lápis). Para evitar o ressecamento das amostras, essa transferência é realizada com o recipiente colocado em uma placa de Petri coberta com etanol 100%.
  9. Coloque as tampas nos recipientes e mergulhe-os em um copo de vidro graduado contendo 100% de etanol suficiente para submergir os recipientes. Cubra o copo de vidro e incube por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, descarte adequadamente o etanol 100%.
  10. Transfira os recipientes de amostra para outro copo de vidro graduado contendo etanol 100% suficiente para submergir os recipientes. Cubra o copo de vidro e incube por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, transfira os recipientes de amostras para o secador de ponto crítico.
    NOTA: Após a série de lavagens, pipetas e copos de vidro devem ser abundantemente enxaguados com água destilada, e essa água residual deve ser descartada em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos. Após o enxágue, os itens de vidro podem ser lavados com detergente neutro, enxaguados com água da torneira e secos ao ar.

5. Secagem do ponto crítico

NOTA: Um secador de ponto crítico troca o etanol nas amostras por dióxido de carbono líquido (CO2), que evapora da amostra em temperatura e pressão mais altas. Siga as instruções do fabricante para tais procedimentos.

  1. Ligue o equipamento.
  2. Abra a câmara, coloque os recipientes de amostra dentro e adicione etanol 100% até cobrir os recipientes. Feche a câmara.
  3. Ative a opção Cool e aguarde até que a temperatura atinja 10 °C.
  4. Abra a válvula do cilindro de CO2 e ative a opção Agitador .
  5. Ative a opção CO2 in , sempre verificando a câmara para verificar quanto CO2 já a encheu. Quando a câmara estiver quase cheia, desative a opção CO2 in e ative a opção Exchange , mantendo-a ativada até que haja CO2 suficiente apenas para cobrir os recipientes. Certifique-se de que os recipientes estejam sempre cobertos com CO2 (ou seja, desative a opção Troca antes que todo o CO2 saia da câmara). Repita a etapa 5.5 6x.
  6. Ative o CO2 uma última vez e encha a câmara até que os recipientes estejam cobertos.
  7. Ative a opção Aquecer e desative a opção Agitador . Feche a válvula do cilindro de CO2.
  8. Aguarde até que a temperatura suba para 35 °C; em seguida, ative a opção Gas out .
    NOTA: A cerca de 30 °C, a câmara atinge pressões de 70-80 bar, atingindo o ponto crítico, onde o líquido desaparece.
  9. Quando a pressão da câmara atinge 1 bar, todo o conteúdo de gás foi removido. Abra a câmara e remova os recipientes.
  10. Desligue o equipamento.

6. Montagem

  1. Prepare suportes de amostra SEM (ou seja, canhotos de alumínio; Figura 2C.4).
    1. Enrole os tocos com um pedaço de papel alumínio, cobrindo apenas a parte superior, para facilitar a limpeza do topo após a análise.
    2. Identifique os canhotos escrevendo o código/número da amostra na parte inferior do suporte, garantindo a identificação do que é colocado na parte superior.
    3. Cubra a parte superior com fita de carbono dupla face. Coloque os tocos em um porta-amostras.
  2. Abra a tampa do recipiente de amostra e transfira cuidadosamente a amostra seca para uma placa de Petri de vidro usando uma pinça e uma espátula.
    NOTA: Jardins secos de pontos críticos tendem a se aglomerar formando amostras altamente compactadas que devem ser cuidadosamente separadas como fragmentos não maiores que 1 mm3de tamanho.
  3. Coloque cuidadosamente os fragmentos na superfície pegajosa do toco coberto com fita. Uma vez que o fragmento do jardim toca a fita, é muito difícil (re)movê-lo, portanto, tome cuidado para não colocá-lo em locais ou posições indesejadas. Adicione até nove fragmentos por esboço.
  4. Repita as etapas 6.2 e 6.3 para cada amostra.

7. Revestimento por pulverização catódica com ouro

NOTA: O revestimento da amostra é necessário para evitar seu carregamento. Siga as instruções do fabricante para ajustar as configurações, como a pressão do gás de operação (0.5 × 10-1 mm Hg de pressão do gás neste protocolo), o tempo de pulverização catódica (220 s), a espessura da camada de ouro (~120 Å), a corrente (50 mA) e o voltage alimentação. A pulverização catódica tende a seguir um fluxo de trabalho comum, embora os equipamentos de diferentes fabricantes possam operar de maneira ligeiramente diferente.

  1. Abra o braço articulado e coloque os tocos na mesa de amostras.
  2. Feche o braço alvo articulado e verifique se a proteção contra estilhaços da câmara de vácuo de vidro está devidamente encaixada.
  3. Abra a válvula do cilindro de argônio e ligue o interruptor de alimentação principal.
  4. Siga o vácuo subindo no visor do equipamento até atingir a marca de 0.5 × 10-1 mm Hg no visor; em seguida, ative o Enxágue. Repita a operação 5x.
  5. Ligue o sistema de circulação de água, ative a opção HV On e abra a tampa da película dourada. Confirme se a cor do plasma é rosada. Para seguir este protocolo, configure 220 s de pulverização catódica com tensão de 50 mA, que depositará uma camada de ouro de ~ 120 Å (12 nm).
  6. HV On é desligado automaticamente. Desligue o sistema de circulação de água e feche a tampa da película de ouro.
  7. Desligue o interruptor de alimentação principal, permitindo que o ar entre na câmara de vácuo. Para amostras de jardim e resíduos, repita as etapas 7.1-7.7 3x.
    NOTA: Se a imagem não ocorrer imediatamente após a preparação da amostra, armazene os stubs em um recipiente hermético cheio de uma camada de sílica para evitar a reidratação das amostras.

8. Exames por imagem

NOTA: Siga as instruções do fabricante para ajustar as configurações de SEM, como diâmetro da abertura objetiva, tensão operacional, alinhamento do sistema de feixe de elétrons, alinhamento axial e estigmatizadores.

  1. Coloque os tocos no porta-amostras, anotando a posição de cada amostra.
    NOTA: Use luvas ao inserir ou remover o sample porta-luvas e mantenha-o o mais limpo possível.
  2. Inicie o software de operação na área de trabalho.
  3. Selecione as configurações do instrumento. Visualize amostras de jardim com o diâmetro de abertura da objetiva de 30 μm (ou seja, no segundo estágio), operando em alto vácuo, detectando sinais de elétrons secundários (SED), acelerando a tensão de 20 kV, distância de trabalho de 15 - 20 mm, corrente da sonda de 40,0 (no modo de alta corrente) e variando a ampliação de acordo com a amostra.
  4. Seguindo as instruções de navegação, pressione o ícone Vent e aguarde a ventilação da câmara de amostra. Uma barra de progresso indica o status do vácuo.
  5. Quando a pressão atmosférica for atingida, abra a câmara de amostra e insira cuidadosamente o porta-amostras.
  6. Feche suavemente a porta da câmara e pressione o ícone Evac para evacuar o instrumento, seguindo o status do vácuo através da barra de progresso. O sistema de navegação mostrará a posição do estágio móvel e fornecerá um gráfico de suporte quando o movimento for concluído. Pressione o ícone Câmera para gravar uma foto do suporte para obter uma visão superior que ajudará a navegar entre as amostras durante a geração de imagens.
  7. Pressione o ícone Observação para ligar o canhão de elétrons e aguarde a formação da imagem. Use a interface manual do usuário (controle manual) para mover manualmente o eixo Z para a altura adequada (com base na altura da amostra e na distância de trabalho determinada).
    NOTA: Para prolongar a vida útil do filamento de tungstênio, pause a função Observação sempre que não estiver criando imagens ativamente.
  8. Use as opções mostradas na tela ou o controle manual para alterar a taxa de varredura e a posição da imagem. Mova o palco para obter uma visão completa da amostra, empregando a função RDC para se concentrar em áreas específicas. Ao observar uma estrutura alvo (ou interessante), ajuste a ampliação, o foco, o brilho, o contraste e a estigmatização de acordo. Corrija a estigmatização usando a interface manual do usuário para mover o palco para as direções X e Y.
    1. Ajuste a ampliação entre 100x e 700x para visualizar aspectos gerais do jardim (como densidade de hifas, substrato e padrões de colonização).
    2. Ajuste a ampliação entre 700x e 1.500x para visualizar os padrões espaciais da microbiota.
    3. Ajuste a ampliação entre 1.500x e 3.000x para observar as interações físicas da microbiota e do biofilme.
    4. Ajuste a ampliação entre 3.000x e 4.000x para focar em aglomerados microbianos específicos.
  9. Para salvar uma imagem, use a função Congelar , clique no ícone Foto e configure o caminho do arquivo. Como padrão, analise pelo menos três fragmentos de jardim, criando imagens de cada um em todas as faixas de ampliação mencionadas na etapa 8.8. Isso resulta em pelo menos 12 imagens por amostra, embora mais imagens possam suportar descrições mais detalhadas. Sugerimos que 15-25 imagens por amostra, variando todas as ampliações na etapa 8.8, tendem a fornecer detalhes finos para a descrição da amostra.
    NOTA: Rastejar e salvar uma imagem leva alguns segundos durante os quais qualquer vibração na mesa flutuante SEM deve ser evitada.
  10. Depois de terminar a imagem, pressione a opção Ventilar para ventilar a câmara, seguindo o status do vácuo através da barra de progresso. Remova cuidadosamente o suporte, feche suavemente a porta da câmara e pressione Evac para evacuar a câmara.
  11. Assim que a evacuação estiver concluída, saia do software de operação.
  12. Ajuste o brilho e o contraste para melhorar a visualização usando um editor de imagens.

Resultados

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Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para visualizar os componentes do jardim attine e amostras de resíduos, como hifas fúngicas, substrato, microbiota e biofilmes. O SEM melhorou nossa compreensão de como o jardim e os resíduos sustentam os padrões estruturais da microbiota (Figura 3). Em jardins attine, as hifas fúngicas são estruturas semelhantes a galhos que cobrem porções da superfície do substrato. Como as hifas fúngicas tendem a ser muito sensíveis à desidratação e ruptura, o usuário pode ser guiado pelo aspecto das hifas para avaliar os resultados da preparação da amostra. Como também observado em trabalhos anteriores 32,33,45, as hifas apresentam aspecto tubular; hifas intactas em forma de tubo indicam uma preparação eficaz da amostra (Figura 3A e Figura 4C). Quando as hifas são em forma de fita, esse achatamento é possivelmente um artefato da técnica (Figura 4C).

As superfícies do substrato vegetal podem ser reconhecidas pela cutícula e camadas epidérmicas, bem como estômatos e tricomas. Tais estruturas são mais reconhecíveis quando os substratos ainda não estão colonizados pelas hifas fúngicas e pela microbiota (Figura 3A e Figura 4C). Quando o substrato é colonizado, a microbiota e / ou hifas fúngicas cobrem sua superfície de tal forma que estruturas específicas da planta não são facilmente discerníveis ( Figura 3A ). A microbiota pode colonizar as hifas fúngicas ou o substrato, cada um deles em organização espacial aparentemente distinta. Na Figura 3, esses padrões espaciais foram ilustrados esquematicamente e encaixotados nas respectivas imagens de MEV, onde foram identificados; isso pode facilitar a ligação entre os resultados do SEM e sua interpretação.

A microbiota colonizadora de hifal é menos comumente observada e, quando encontrada, é composta por bastonetes ou células cocóides que ocorrem isoladamente ou em pequenos grupos ligados à superfície das hifas. A matriz exopolissacarídica de biofilme (EPS), parecendo uma estrutura de "tecido de renda", pode ser observada ao redor das hifas em pequenos aglomerados (Figura 3A). Bastante mais comum é a microbiota colonizadora de substrato, encontrada em jardins de diferentes espécies de formigas attinas. Os padrões de colonização parecem definidos, até certo ponto, pelos estágios de deterioração do substrato. Assim, ao colonizar substratos ainda não degradados, a microbiota pode ocorrer como células individuais ou se reunir em pequenos grupos. A microbiota pode estratificar o substrato quando apresenta sinais microscópicos de deterioração (ou seja, quando as camadas cuticulares/epidérmicas da planta e outras estruturas vegetais não são discerníveis e sulcos e reentrâncias são abundantes).

Nesses "tapetes microbianos", a morfologia das células é mais reconhecível quando a matriz EPS está ausente. Nos casos em que as células microbianas estão embutidas na matriz EPS, sua morfologia não é facilmente distinguível. De acordo com sua organização espacial, caracterizamos os biofilmes como "espalhados" ou "tridimensionais". Quando o biofilme é espalhado, as células microbianas e a matriz EPS cobrem intermitentemente a superfície do substrato, formando uma camada plana de 1-3 células de espessura ( Figura 3B ). Quando o biofilme é tridimensional, as células microbianas e a matriz EPS se acumulam, formando aglomerados com várias espessuras celulares. Regiões de jardim constituídas por substratos deteriorados (como jardim antigo e resíduos) abrigam a microbiota em seus sulcos e reentrâncias, onde formam comunidades espessas (Figura 3C). Particularmente, os substratos extensivamente degradados em amostras de resíduos abrigam uma microbiota abundante, a mais diversa morfologicamente entre todas as regiões. As leveduras adicionam mais complexidade a essa comunidade, interagindo fisicamente com os procariontes por meio de biofilme. Em amostras de resíduos de Atta sexdens e Acromyrmex sp., as matrizes EPS foram observadas formando uma malha fibrilar conspícua em torno de procariontes em forma de bastonete e cocóides, bem como leveduras fusiformes e esféricas (Figura 3C).

Resultante de uma malha entrelaçada de hifas, a estrutura esponjosa do jardim requer pulverização catódica adicional para revestir a amostra de maneira mais uniforme. Tais etapas evitam o espalhamento de elétrons que distorce a imagem e dificulta sua resolução (Figura 4A). As etapas de preparação das amostras preservaram a maior parte da estrutura do jardim, revelando a distribuição espacial e a organização da microbiota. Vale reiterar, no entanto, que estruturas como hifas fúngicas e matriz EPS são muito sensíveis à desidratação e muito difíceis de preservar, especialmente para MEV. A estrutura das hifas estava relativamente bem preservada, mas é razoável considerar que o biofilme visualizado em algumas amostras de jardim pode não ter alguns componentes estruturais da matriz EPS. Embora a camada mais externa lisa de polissacarídeos que envolve a microbiota tenha sido preservada em algumas amostras (Figura 3A, B), algumas delas tinham características morfológicas da microbiota preservadas, mas não tinham matriz EPS. No entanto, não está claro se a matriz EPS estava realmente ausente ou se foi removida durante a preparação da amostra.

Por um lado, a remoção da camada lisa do biofilme prejudica a compreensão da estrutura precisa do biofilme. Por outro lado, revela a morfologia, organização espacial e interações físicas das células que habitam sob a camada, que é nosso principal foco de pesquisa. Estudos anteriores relataram a preservação das hifas fúngicas e da matriz do biofilme, empregando vapor de tetróxido de ósmio (OsO4) como fixador primário 44,50,51,52,53,54. Em seguida, realizamos um experimento comparativo fixando amostras frescas de jardim com vapor de OsO4, que aparentemente preservou o aspecto liso dos biofilmes (Figura 4B). Este método, no entanto, causou extenso achatamento das hifas e da microbiota. Esse achatamento resultou na perda de aspectos espaciais gerais do jardim descritos anteriormente 29,33,32,45, limitando estudos adicionais sobre os padrões estruturais do jardim. A fixação com OsO4 dificultou a distinção da morfologia e distribuição microbiana e a diferenciação das estruturas celulares dos artefatos técnicos, complicando assim a interpretação dos dados.

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Figura 3: Padrões arquitetônicos da microbiota. A microbiota coloniza as hifas fúngicas e o substrato em organização espacial distinta. Tais padrões espaciais foram esquematicamente ilustrados e encaixotados nas respectivas imagens de MEV onde foram identificados (delimitados na figura por quadrados brancos): (A) A microbiota colonizadora de hifal é composta por isolados ou pequenos grupos de células, com matriz exopolissacarídica de biofilme detectável em algumas amostras. (B) A microbiota colonizadora do substrato se espalha por todo o substrato, com a matriz EPS cobrindo as células de tal forma que sua morfologia não é facilmente distinguível. (C) Microbiota colonizadora de substrato formando grupos tridimensionais, constituindo biofilmes mono ou multimorfológicos, em alguns casos evidenciando a matriz EPS. Ilustrações de Mariana Barcoto. Abreviatura: EPS = matriz exopolissacarídica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagem infrutífera. Imagens de baixa qualidade que geram resultados ineficazes e/ou dificultam a interpretação dos padrões arquitetônicos. (A) O espalhamento de elétrons distorce a imagem, dificultando sua resolução e, consequentemente, a identificação da morfologia. Isso foi observado com frequência em amostras revestidas por pulverização catódica apenas uma vez e foi reduzido por revestimento adicional. (B) A fixação de amostras frescas de jardim com vapor de tetróxido de ósmio (OsO4) como fixador primário 44,50,51,52,53,54 aparentemente preservou o aspecto liso dos biofilmes. No entanto, causou extenso achatamento de hifas e microbiota, danificando os padrões arquitetônicos do jardim. (C) A preparação da amostra usando o fixador de Karnovsky produziu imagens de maior qualidade quando comparada às preparações usando OsO4, preservando a maior parte da estrutura das hifas, distribuição da microbiota e padrões espaciais dos jardins. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O SEM usa um feixe de elétrons para escanear a amostra, gerando uma imagem ampliada dela de forma que se possa visualizar microestruturas tridimensionais em alta resolução. Como o SEM opera sob alto vácuo, é necessária a remoção de até/mais de 99% da água das amostras. Dentro da câmara de vácuo MEV, amostras parcialmente hidratadas podem desidratar e colapsar, além de espalhar elétrons. Para imagens de alta resolução em MEV, a preparação da amostra deve incluir procedimentos para remover a água, mantendo as mudanças no volume e na morfologia no mínimo, bem como revestimento para evitar o carregamento durante a imagem 55,56,57.

Primeiro, a amostra é fixada quimicamente por reticulação de suas proteínas e ácidos nucléicos, obtida por diversas técnicas. Um método amplamente utilizado envolve a combinação de glutaraldeído e formaldeído (ou paraformaldeído) em um tampão, como piperazina-1,4-bis [ácido 2-etanossulfônico] (PIPES); Ácido N-[2-hidroxietil]-piperazina-N′-2-etanossulfônico (HEPES); solução salina tamponada com fosfato (PBS); ou cacodilato de sódio. A fixação química fortalece a amostra, preservando sua estrutura para secagem. Dependendo de sua natureza, as amostras podem precisar de uma fixação secundária (em tetróxido de ósmio) e até mesmo de uma fixação terciária (em acetato de uranila). Em segundo lugar, as amostras devem ser desidratadas. Como a secagem ao ar causa um colapso extenso de estruturas finas, uma técnica alternativa comum é a secagem em pontos críticos (CPD). Na DPC, a amostra não é submetida à tensão superficial, impedindo a formação de artefatos. Por um lado, a água atinge o ponto crítico a 228,5 bar e 374 °C, o que destruiria facilmente a amostra. Por outro lado, o ponto crítico de CO2 é de 73,8 bar e 31 °C, justificando seu uso como fluido de transição. Ao aumentar a temperatura, o CO2 é convertido em forma gasosa e removido da amostra 58,59,60,61,62,63. Em terceiro lugar, amostras não condutoras devem ser revestidas para evitar sua carga e aumentar o rendimento de elétrons secundários, o que consequentemente contribui para a obtenção de sinais de imagem nítidos64.

O protocolo aqui apresentado combina procedimentos para preservação de amostras à base de fungos 32,33,45,65,66,67,68 e biofilmes 69,70, porém simplificando o processo removendo as etapas de pós-fixação e reduzindo o tempo de desidratação. No entanto, preservou a delicada estrutura do jardim, detalhando ainda mais as interações físicas da microbiota e revelando a estrutura espacial do biofilme. A montagem espacial da microbiota é essencial tanto para estabelecer interações quanto para definir seus padrões regulatórios. A distribuição espacial molda a dinâmica social microbiana, da qual podem emergir propriedades intrínsecas. Estes são necessários para lidar com a variabilidade e complexidade enfrentadas nos ecossistemas microbianos 71,72,73. Nossos achados reforçam a microbiota integrando padrões estruturais de jardim, apoiando sua suposta participação nas respostas fisiológicas 32,42,43,44. Fornecemos evidências in situ de que os biofilmes são relevantes para interações microbianas na fungicultura attina42,44. Os biofilmes são sistemas multicelulares complexos e heterogêneos, onde microrganismos embutidos em uma matriz EPS auto-secretada formam redes sociais. Cooperativa e/ou antagônicamente, as interações dentro do biofilme determinam a abertura, ocupação e modificação de nichos 71,72,73,74. O SEM permitiu uma maior compreensão da organização espacial da microbiota nas regiões do jardim, detalhando as interações físicas microbiota-substrato e microbiota-hifas, ao mesmo tempo em que simplificou os métodos para pesquisas futuras nesta área.

A pesquisa sobre a microbiota do jardim está recebendo atenção crescente, em particular, com foco nos processos que podem moldar a composição dessas comunidades únicas75,76, bem como sua função e interações 42,43,44. As interações bactéria-fúngica da cultura podem auxiliar o fungo na solubilização de fosfato, produção de sideróforos e degradação de celulose e quitina. Tais interações, que podem ocorrer como um continuum mutualismo-antagonismo, podem regular o funcionamento do jardim44. A abordagem metodológica que apresentamos aqui permite olhar, in situ, para a dimensão estrutural em que as interações poderiam ocorrer. Enfatiza que, como a maioria dos ecossistemas microbianos já estudados, os jardins attine são padronizados, heterogeneamente organizados no espaço 5,7,8. O SEM já forneceu uma perspectiva espacial in situ sobre a dinâmica da microbiota em diversas comunidades associadas ao hospedeiro, como cianoesponjas77, pele de baleia jubarte78, cogumelos66, cnidários79, intestino humano80, líquenes81, contribuindo também para descrever a plastisfera (um novo ecossistema derivado antropogenicamente) 82 . Cada um desses estudos, no entanto, empregou um método passo a passo ligeiramente distinto para a preparação da amostra.

As amostras de jardim são altamente delicadas e heterogêneas, com hifas fúngicas adaptadas para não perder água26, além de um conjunto diversificado de substratos incorporados24, a microbiota e seu biofilme. No entanto, o protocolo de preparo de amostras que adaptamos preservou a maioria dessas estruturas e nos permitiu expandir a caracterização da estrutura espacial da microbiota. Consideramos a fixação com a solução de Karnovsky a etapa crítica do protocolo, pois o aspecto tridimensional de uma amostra tão delicada pode entrar em colapso e/ou achatar neste ponto. Amostras complexas à base de fungos são geralmente preparadas para MEV por fixação com glutaraldeído e pós-fixação com OsO4 65,66,67,68. A combinação de aldeídos (paraformaldeído e glutaraldeído), no entanto, foi relatada para melhorar a preservação do biofilme para SEM69,70. Os métodos de preservação de biofilmes também podem incluir 0,15% de azul de alciano ou 0,15% de vermelho de rutênio para o fixador de Karnovsky inicial, bem como 1% de ácido tânico para 1% de ósmio para pós-fixação. Fixação de jardins attine e resíduos com Karnovsky e pós-fixação com OsO4 bactérias preservadas em amostras antigas de jardins e resíduos, embora não evidenciando o biofilme32. Como nossas amostras tinham a estrutura do jardim, microbiota e biofilmes preservados sem a etapa de pós-fixação de ósmio empregada em protocolos anteriores 32,33,69,70, preferimos simplificar o protocolo removendo essa etapa. OsO4 é um agente oxidante usado para fixar (especialmente) componentes celulares lipídicos83. Por ser altamente corrosiva, a OsO4 pode causar queimaduras graves quando em contato com a pele e mucosas, além de danificar o trato respiratório ou gastrointestinal quando inalada ou ingerida84,85. Ao remover a pós-fixação do OsO4, o protocolo consequentemente reduz o número de regentes tóxicos a serem manipulados.

Sugerimos também a série de lavagem com etanol em vez do uso de acetona, que pode ser muito dura para amostras delicadas86. A série de lavagem com etanol com etapas de 10 minutos também simplifica os protocolos SEM anteriores45 sem prejudicar a resolução da imagem. Além disso, verificamos empiricamente que etapas adicionais de pulverização catódica renderizaram imagens de alta qualidade, o que foi consistente para amostras de jardim de todas as espécies que testamos. Essas etapas adicionais possivelmente revestiram as amostras de maneira mais uniforme, já que o espalhamento de elétrons foi muito mais frequente em amostras revestidas apenas uma vez ( Figura 4A ). Assim, encorajamos trabalhos futuros testando aditivos e condições que possam renderizar um protocolo aprimorado para visualização de biofilme em amostras de jardim.

O MEV é uma ferramenta poderosa para detalhar a morfologia celular da microbiota e o arranjo espacial do EPS em superfícies, revelando a topografia e a textura de amostras de jardim em alta resolução e ampliação70,87. No entanto, não fornece discriminação taxonômica para os membros da comunidade e, consequentemente, não temos distinção de quem está onde. Além disso, apesar da grande profundidade focal do SEM, ele não informa sobre as características tridimensionais da amostra. Para uma descrição completa do jardim microbiano attine, incluindo biogeografia taxonômica e resolução espacial tridimensional, a análise SEM pode ser considerada um primeiro procedimento em técnicas de imagem passo a passo para amostras de jardim. Para resolução taxonômica, o SEM pode ser acoplado à hibridização in situ fluorescente (FISH) 88 , 89 e suas variantes, como FISH de alta resolução filogenética (HiPR-FISH) 90 , marcação combinatória e imagem espectral FISH (CLASI-FISH) 9 , 91 e projeções 3-D92 . A análise da microestrutura tridimensional pode ser mais detalhada por microtomografia de raios-X (μCT de raios-X)93. Até agora, o MEV nos permitiu observar em detalhes a organização espacial da microbiota ao redor das hifas e na superfície do substrato, sulcos e reentrâncias. Esse padrão microbiano está construindo nosso conhecimento sobre supostas interações microbianas em jardins attine. Acreditamos que as etapas de preparação que apresentamos podem ser amplamente aplicadas para refinar estudos sobre a organização espacial microbiana em outros ecossistemas microbianos delicados.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro (Processo #2019/03746-0). O MOB agradece a bolsa de doutorado recebida da FAPESP (processo 2021/08013-0) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanças 001. A AR também agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de pesquisa (#305269/2018). Os autores gostariam de agradecer a Marcia Regina de Moura Aouada e Antonio Teruyoshi Yabuki por ajudarem nos testes piloto para preparação de amostras, a Renato Barbosa Salaroli pela assistência técnica e a Enzo Sorrentino por ajudar na sessão de fotos. Este estudo foi realizado sob a autorização de acesso ao patrimônio genético # SISGen AA39A6D.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 2 mLAxygenMCT-200-C-BRAPara fixar e desidratar amostras
Cloreto de cálcio anidroMerckC4901CaCl2 anidro para preparar Karnovsky' Secador de
ponto críticoLeicaEM CPD 300Para secagem de ponto crítico
Fita condutora de carbono dupla face, 12 mm (L) X 5 M (C)Microscopia Eletrônica Ciências77819-12Para montagem de amostras
Pinça entomológicaNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Álcool etílico (=etanol), puro (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Para desidratação
FórcepsNão há fornecedorPara manipular amostras de jardim
Copo de vidroNenhum fornecedorPara desidratação
Placa de Petri de vidroNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Pipeta de vidroNenhum fornecedorPara fixar e desidratar amostras
Glutaraldeído (glutaraldeído aquoso EM grau 25%)Microscopia eletrônica Ciências16220Para preparar Karnovsky' s fixador
Alvo de ouro Ted Pella, Inc.8071Para revestir com ouro
Ácido clorídricoSigma-Aldrich320331Para ajustar soluções pH
Editor de imagensPhotoshopqualquer versãoPara ajustar imagens
Paraformaldeído (Paraformaldeído 20% Solução Aquosa EM Grau)Microscopia Eletrônica Ciências15713Para preparar Karnovsky' Fixador de
PropilenoNão há fornecedorPara manter colônias de formigas vivas
Microscópio Eletrônico de VarreduraJEOL IT300 SEMPara imagem de amostras 
Cacodilato de sódio trihidratadoSigma-AldrichC0250Para preparar tampão de cacodilato de sódio
EspátulaNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Recipientes de amostras com 15 mm de diâmetro x 10 mm de alturaTed Pella, Inc.4591Para secagem de ponto crítico
Revestidor de pulverização catódicaBaltec SCD 050Para revestir com ouro
Stub (montagem de alumínio, pino de extremidade plana) 12,7 mm x 8 mm Ciências de Microscopia Eletrônica75520Para montagem de amostras
específico específico específico específico específico específico específico

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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