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Artigo de método

Microbiota de jardins de formigas Attine: visualizando uma paisagem microbiana por microscopia eletrônica de varredura

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DOI:

10.3791/67334

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4 de outubro de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

Neste artigo

Resumo

Propomos um protocolo otimizado de Microscopia Eletrônica de Varredura para visualização de amostras altamente heterogêneas e delicadas contendo biomassa vegetal e fúngica, juntamente com microbiota e biofilme. Este protocolo permite descrever as dimensões espaciais da organização da microbiota.

Resumo

Em ecossistemas de macroescala, como florestas tropicais ou recifes de coral, a localização espacial dos organismos é a base de nossa compreensão da ecologia da comunidade. No mundo microbiano, da mesma forma, os ecossistemas em microescala estão longe de ser uma mistura aleatória e homogênea de organismos e habitats. Acessar a distribuição espacial dos micróbios é fundamental para entender o funcionamento e a ecologia da microbiota, pois as espécies coabitantes são mais propensas a interagir e influenciar a fisiologia umas das outras.

Um ecossistema microbiano entre reinos está no centro das colônias de formigas produtoras de fungos, que cultivam fungos basidiomicetos como recurso nutricional. As formigas Attine procuram diversos substratos (principalmente à base de plantas), metabolizados pelo fungo cultivado enquanto formam uma estrutura esponjosa, um "jardim microbiano" que atua como um intestino externo. O jardim é uma malha entrelaçada de hifas fúngicas que crescem metabolizando o substrato, abrindo nichos para que uma microbiota característica e adaptada se estabeleça. Acredita-se que a microbiota contribua para a degradação do substrato e o crescimento de fungos, embora sua organização espacial ainda não tenha sido determinada.

Aqui, descrevemos como empregamos a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para investigar, com detalhes sem precedentes, a organização espacial da microbiota e do biofilme em diferentes sistemas de fungicultura de formigas produtoras de fungos. A imagem de MEV forneceu uma descrição da estrutura e organização espacial da microbiota. O MEV revelou que a microbiota comumente se reúne em biofilmes, uma estrutura generalizada das paisagens microbianas na fungicultura. Apresentamos os protocolos empregados para fixar, desidratar, secar, revestir por pulverização catódica e criar imagens de uma comunidade tão complexa. Esses protocolos foram otimizados para lidar com amostras delicadas e heterogêneas, compreendendo biomassa vegetal e fúngica, bem como a microbiota e o biofilme.

Introdução

Os ecossistemas são compostos por organismos interconectados por processos em uma localização geográfica específica (ou seja, o meio ambiente). Os organismos interagem com seu ambiente ao longo do tempo, a partir do qual emergem padrões espaciais complexos e heterogêneos. A padronização espacial determina a diversidade e a estabilidade ecológica e, em última análise, o funcionamento do ecossistema 1,2,3,4. Em ecossistemas de macroescala, como pântanos, savanas, recifes de coral e ecossistemas áridos, os padrões espaciais estão correlacionados com o fluxo e a concentração de recursos. Permitir a otimização de recursos, a heterogeneidade espacial e a padronização resultam em ecossistemas mais resilientes do que os homogêneos2. A localização espacial dos organismos na base da ecologia da comunidade também é traduzida para o mundo microbiano.

Os ecossistemas microbianos, longe de organismos misturados de forma aleatória e homogênea em microhabitats, exibem padrões espaciais que definem grande parte de seu funcionamento 5,6,7. Das colunas de Winogradsky à microbiota associada ao ambiente e ao hospedeiro, esses ecossistemas são organizados de forma heterogênea no espaço, com arranjos espaciais que provocam diferentes respostas fenotípicas. As espécies coabitantes são mais propensas a interagir e influenciar a fisiologia umas das outras. Assim, a organização espacial da comunidade, mais do que sua composição per se, delimita propriedades ecossistêmicas e nichos ecológicos 5,7,8. Ilustrando esses conceitos, as mudanças na padronização espacial parecem correlacionadas à progressão patológica de placas dentárias, cárie, doenças gengivais 9,10, doença inflamatória intestinal11, infecções pulmonares de fibrose cística, infecções crônicas de feridas12,13, câncer colorretal e adenomas14.

No âmbito da biogeografia microbiana (o estudo da distribuição e padronização da biodiversidade no espaço e no tempo em microescala), o conhecimento dos ecossistemas microbianos é amplamente beneficiado pela compreensão de seus padrões espaciais 6,13,15,16,17. Analisamos os padrões espaciais de um ecossistema microbiano construído por insetos, encontrado no centro das carismáticas colônias de formigas attine (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Lá reside um "jardim microbiano", centrado em torno de um fungo basidiomiceto na tribo Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) ou na família Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales) 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . O jardim é uma estrutura esponjosa que emerge de uma malha entrelaçada de hifas que cresce metabolizando o substrato principalmente vegetal incorporado pelas formigas (Figura 1). Estes podem incluir, de acordo com os gêneros atinos: partes secas de plantas, excrementos e carcaças de insetos, folhas recém-cortadas, sementes e partes florais23,24. Análogo a um intestino herbívoro externo, o jardim converte enzimaticamente e quimicamente polímeros recalcitrantes em recursos nutricionais lábeis, fornecendo às formigas aminoácidos essenciais, lipídios e açúcares solúveis 21,25,26,27,28.

Análises ultraestruturais, enzimáticas e transcriptômicas realizadas para jardins dos gêneros de corte de folhas Atta e Acromyrmex sugerem que esses ambientes estruturam um continuum de degradação do substrato e manchas nutricionais 26,29,30,31,32. As partes jovens do jardim tendem a ser mais escuras devido ao substrato recém-incorporado após serem fragmentadas. Esses substratos adicionados recentemente são frequentemente colonizados pelas bordas, que foram cortadas por formigas operárias e inoculadas com aglomerados miceliais. Irradiando das bordas cortadas, as hifas fúngicas se espalham sobre o substrato 29,32,33. A abundância de hifas aumenta à medida que a degradação do substrato progride, resultando em regiões esbranquiçadas e metabolicamente ativas 30,31,32. Regiões mais antigas, com substrato mais degradado e microbiota abundante29,32, tendem a apresentar tons acastanhados e maior umidade. Os trabalhadores removem fragmentos dessa região, separando-os em pilhas de resíduos, onde também retiram substratos que prejudicam o simbionte fúngico 34,35,36. As pilhas de resíduos, embora fisicamente separadas do jardim, são um local de degradação contínua do substrato e ciclagem de nutrientes pela abundante microbiota habitante 29,32,37,38,39.

Uma microbiota composta principalmente por Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas e Serratia, também habita o jardim, aparentemente sendo compartilhada por diversos sistemas de fungicultura attine. Codificando vias metabólicas que poderiam complementar o metabolismo fúngico, a microbiota participa potencialmente das respostas fisiológicas do jardim 40,41,42,43,44. Não apenas os dados metagenômicos indicaram que a microbiota estava lá41,42, mas também a análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) da fungicultura de formigas cortadeiras mostrou principalmente bactérias em forma de bastonete sobre o substrato da planta32. Embora as bactérias (incluindo cepas celulolíticas) tenham sido isoladas de todo o jardim, elas foram visualizadas apenas em partes mais antigas do jardim e em pilhas de resíduos, bem como no pellet inicial carregado pelas rainhas fundadoras 29,32. Também era incerto se a microbiota poderia formar biofilmes in vivo (ou seja, no jardim e nos resíduos), conforme sugerido por sua capacidade metabólica42 e observado in vitro44.

Aqui, empregamos o SEM para compreender melhor a organização espacial da microbiota nas regiões do jardim, detalhando as interações físicas microbiota-substrato e microbiota-hifas. Ao fornecer imagens com maior profundidade focal, o MEV permite observações de estruturas microscópicas tridimensionais em alta resolução, permitindo uma análise completa dos padrões espaciais da microbiota do jardim. Detalhamos as etapas para fixar, desidratar, secar, revestir e criar imagens de amostras fúngicas heterogêneas e delicadas. Ao remover a etapa de pós-fixação com tetróxido de ósmio (OsO4) e reduzir o tempo de desidratação, simplificamos os protocolos 32,33,45 para preparação de amostras de jardim e resíduos para análise de MEV. Este protocolo adaptado preserva os padrões estruturais das hifas, bem como a organização espacial da microbiota e do biofilme, e pode ser aplicado a outros ecossistemas microbianos delicados e biofilmes.

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Figura 1: Jardins microbianos Attine. O jardim é uma estrutura esponjosa resultante de uma malha entrelaçada de hifas que cresce metabolizando o substrato principalmente vegetal incorporado pelas formigas. Também habitando o jardim está a microbiota, que codifica vias metabólicas que podem complementar o metabolismo fúngico. Dados metagenômicos e análises prévias de Microscopia Eletrônica de Varredura indicaram sua presença, embora tivéssemos pouco conhecimento de sua organização espacial e interações físicas com o substrato e as hifas fúngicas. Empregamos o MEV para desvendar a organização e padronização espacial da microbiota e do biofilme. Ilustrações de Mariana Barcoto (jardim e microbiota adaptados de Barcoto e Rodrigues 94), e fotos de Mariana Barcoto e Enzo Sorrentino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Amostragem de colônias de campo

NOTA: Ao coletar colônias de formigas, certifique-se de que todas as permissões exigidas pela legislação local sejam obtidas antes da coleta. No nosso caso, o alvará de coleta #74585 foi emitido pelo Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Quando as amostras vierem de uma colônia de laboratório, vá para a seção 2.

  1. Localize e marque a colônia. Escave uma trincheira ao redor da área do ninho até que a câmara do jardim fique exposta (Figura 2A).
    NOTA: Algumas espécies de attine podem construir suas colônias sob a serapilheira ou dentro de troncos podres. Nesses casos, gire cuidadosamente a cama ou quebre cuidadosamente as toras para coletar as amostras. Para obter informações detalhadas sobre localização, coleta e manutenção de colônias vivas de diversas espécies de formigas attinas, consulte Sosa-Calvo et al.46.
  2. Abra a câmara do jardim lateralmente para evitar que o solo caia na superfície do jardim. Colete cuidadosamente amostras de jardim usando uma pinça entomológica, uma colher ou uma escumadeira de cozinha, dependendo do tamanho do jardim.
    NOTA: Certifique-se de esterilizar as ferramentas antes de recolhê-las. Ao coletar jardins de formigas cortadeiras, use luvas de tecido grosso para evitar (ou pelo menos atenuar) as picadas das operárias. Para outras espécies de attine, luvas de tecido são opcionais.
  3. Transfira as amostras do jardim para um recipiente de plástico limpo contendo uma camada de gesso para equilibrar a umidade do jardim. Depois de transferir o jardim e as formigas, feche hermeticamente o recipiente para evitar a secagem da amostra. Armazene amostras de jardim a 23-25 °C até o processamento.
  4. Feche a vala com solo removido anteriormente.

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Figura 2: Protocolo de preparo da amostra. (A) Amostragem de colônias de campo. (B) Processamento de amostras. (C) Breves fundamentos e fluxo de trabalho para preparação de amostras: 1. Fixação: para fortalecer e preservar a estrutura da amostra. 2. Desidratação: o teor de água das amostras é trocado por etanol. 3. Secagem do ponto crítico: o CO2 líquido substitui o etanol e é evaporado. 4. Montagem: amostra exibida para análise. 5. Revestimento por pulverização catódica com ouro: evite o carregamento da amostra. 6. Imagem. Ilustrações e fotos de Mariana Barcoto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Reagentes

NOTA: Lembre-se de que as seguintes soluções devem ser preparadas com antecedência.

  1. Prepare o tampão de cacodilato de sódio 0,2 M. Para isso, dissolver 42,8 g de cacodilato de sódio em 800 mL de água destilada, mexendo até a dissolução e estabilização do pH em 7,2 (se necessário, ajustar o pH com ácido clorídrico). Completar o volume da solução para 1 l adicionando água destilada. Conservar a solução a 4 °C (durante ~1 mês).
    CUIDADO: O glutaraldeído e o paraformaldeído são tóxicos e devem ser manuseados dentro de uma capela de exaustão. Use luvas de nitrilo e óculos de proteção o tempo todo ao manusear esses reagentes.
  2. Prepare o fixador de Karnovsky (modificado de Karnovsky)47. Para isso, adicione 10 mL de solução aquosa de glutaraldeído a 25% e 10 mL de solução aquosa de paraformaldeído a 20% a 25 mL de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e misture. Adicione 1 mL de cloreto de cálcio 0,1 M (CaCl2) e complete o volume para 100 mL adicionando água destilada. Conservar a solução a 4 °C (até 1 mês).
    CUIDADO: O fixador de Karnovsky é prejudicial quando inalado e pode causar irritação na pele e nos olhos. Assim, evite respirar vapores, usando apenas ao ar livre ou em uma área bem ventilada. Use luvas de nitrilo e óculos de proteção o tempo todo ao manusear a solução.
  3. Usando etanol absoluto (grau analítico), prepare soluções de etanol a 30%, 50%, 70% e 90% em água destilada; 100% de etanol também é necessário.

3. Fixação da amostra

NOTA: Os fixadores endurecem e preservam as amostras, mantendo as características morfológicas. Os aldeídos (como o paraformaldeído e o glutaraldeído) são fixadores não coagulantes do tipo reticulação, induzindo ligações cruzadas dentro e entre proteínas e ácidos nucléicos48.

  1. Remova operárias, ovos, pupas e larvas das amostras de jardim usando fórceps entomológicos (Figura 2B). Separe fragmentos de jardim não maiores que 5 mm3. Adicione os fragmentos a um tubo de 2 mL (Figura 2C).
  2. Nos tubos que contêm as amostras, use uma pipeta de vidro Pasteur para adicionar ~ 1 mL de solução fixadora de Karnovsky (certifique-se de que a amostra esteja completamente coberta). Misturar com agitação suave para ajudar a amostra a mergulhar e incubar a 4 °C durante pelo menos 24 h antes de continuar o processamento da amostra (figura 2C.1).
    NOTA: Quando as seguintes etapas de desidratação não forem realizadas imediatamente após a fixação, o protocolo pode ser pausado nesta etapa e as amostras podem ser armazenadas por ~ 1 ano a 4 ° C.
    Sugerimos o uso de uma pipeta de vidro Pasteur, pois é composta por um material inerte e é mais fácil de limpar para reutilização posterior. O material do jardim é altamente hidrofóbico, tendendo a flutuar sobre a superfície da solução fixadora. Geralmente, leva até 5 minutos para ficar completamente embebido no fixador. Certifique-se de que o fixador cubra os fragmentos do jardim, pois seu volume tende a ser reduzido à medida que entra nos poros da amostra. Verificamos empiricamente que, depois que a amostra foi encharcada e molhada, seus componentes (em particular, o delicado micélio fúngico) tornaram-se suscetíveis a quebrar quando misturados ainda mais. Assim, recomendamos evitar ao máximo agitar as amostras.

4. Desidratação da amostra

NOTA: A série de lavagem de etanol troca gradualmente a água em amostras por etanol. É importante começar com uma solução de etanol de baixa concentração (veja abaixo) para evitar danos excessivos ou colapso dessas amostras delicadas49.

  1. Remova completamente a solução fixadora de Karnovsky usando uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra (Figura 2C.1).
    NOTA: Descarte o fixador de Karnovsky em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos.
  2. Imediatamente após a remoção do fixador, adicionar 1 mL de etanol a 30%, tomando cuidado para não romper a amostra, e incubar por 10 min em temperatura ambiente (Figura 2C.2).
    NOTA: As amostras precisam sempre ser embebidas em solução. Certifique-se de substituir rapidamente as soluções durante a série de lavagem gradual do etanol. Como o jardim perde seu aspecto poroso e se agrega no fundo do tubo, 1 mL de etanol tende a ser suficiente para cobrir a amostra (quando a amostra não é maior que 5 mm3). No entanto, se as amostras não estiverem completamente cobertas, adicione etanol até que a amostra esteja completamente coberta.
  3. Remova completamente o etanol a 30% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 30% adequadamente.
    NOTA: Para toda a série de lavagem gradual do etanol, descarte o etanol em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos.
  4. Adicione 1 mL de etanol a 50% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 50% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 50% adequadamente.
  5. Adicione 1 mL de etanol a 70% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 70% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol 70% corretamente.
    NOTA: Na etapa de lavagem com etanol a 70%, o usuário pode pausar o protocolo, se necessário, pois os tubos de amostra podem ser armazenados durante a noite a 4 °C, quando o material não será processado imediatamente.
  6. Adicione 1 mL de etanol a 90% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol a 90% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não interromper a amostra. Descarte o etanol a 90% adequadamente.
  7. Adicione 1 mL de etanol 100% e incube por 10 min em temperatura ambiente. Remova completamente o etanol 100% com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não atrapalhar a amostra. Descarte o etanol 100% corretamente.
  8. Usando uma pinça e/ou uma espátula, transfira cuidadosamente as amostras para recipientes de amostra para o secador de ponto crítico (CPD), contendo etiquetas de identificação de amostra (feitas anteriormente em papel e lápis). Para evitar o ressecamento das amostras, essa transferência é realizada com o recipiente colocado em uma placa de Petri coberta com etanol 100%.
  9. Coloque as tampas nos recipientes e mergulhe-os em um copo de vidro graduado contendo 100% de etanol suficiente para submergir os recipientes. Cubra o copo de vidro e incube por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, descarte adequadamente o etanol 100%.
  10. Transfira os recipientes de amostra para outro copo de vidro graduado contendo etanol 100% suficiente para submergir os recipientes. Cubra o copo de vidro e incube por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, transfira os recipientes de amostras para o secador de ponto crítico.
    NOTA: Após a série de lavagens, pipetas e copos de vidro devem ser abundantemente enxaguados com água destilada, e essa água residual deve ser descartada em um recipiente devidamente rotulado para gerenciamento de resíduos químicos tóxicos. Após o enxágue, os itens de vidro podem ser lavados com detergente neutro, enxaguados com água da torneira e secos ao ar.

5. Secagem do ponto crítico

NOTA: Um secador de ponto crítico troca o etanol nas amostras por dióxido de carbono líquido (CO2), que evapora da amostra em temperatura e pressão mais altas. Siga as instruções do fabricante para tais procedimentos.

  1. Ligue o equipamento.
  2. Abra a câmara, coloque os recipientes de amostra dentro e adicione etanol 100% até cobrir os recipientes. Feche a câmara.
  3. Ative a opção Cool e aguarde até que a temperatura atinja 10 °C.
  4. Abra a válvula do cilindro de CO2 e ative a opção Agitador .
  5. Ative a opção CO2 in , sempre verificando a câmara para verificar quanto CO2 já a encheu. Quando a câmara estiver quase cheia, desative a opção CO2 in e ative a opção Exchange , mantendo-a ativada até que haja CO2 suficiente apenas para cobrir os recipientes. Certifique-se de que os recipientes estejam sempre cobertos com CO2 (ou seja, desative a opção Troca antes que todo o CO2 saia da câmara). Repita a etapa 5.5 6x.
  6. Ative o CO2 uma última vez e encha a câmara até que os recipientes estejam cobertos.
  7. Ative a opção Aquecer e desative a opção Agitador . Feche a válvula do cilindro de CO2.
  8. Aguarde até que a temperatura suba para 35 °C; em seguida, ative a opção Gas out .
    NOTA: A cerca de 30 °C, a câmara atinge pressões de 70-80 bar, atingindo o ponto crítico, onde o líquido desaparece.
  9. Quando a pressão da câmara atinge 1 bar, todo o conteúdo de gás foi removido. Abra a câmara e remova os recipientes.
  10. Desligue o equipamento.

6. Montagem

  1. Prepare suportes de amostra SEM (ou seja, canhotos de alumínio; Figura 2C.4).
    1. Enrole os tocos com um pedaço de papel alumínio, cobrindo apenas a parte superior, para facilitar a limpeza do topo após a análise.
    2. Identifique os canhotos escrevendo o código/número da amostra na parte inferior do suporte, garantindo a identificação do que é colocado na parte superior.
    3. Cubra a parte superior com fita de carbono dupla face. Coloque os tocos em um porta-amostras.
  2. Abra a tampa do recipiente de amostra e transfira cuidadosamente a amostra seca para uma placa de Petri de vidro usando uma pinça e uma espátula.
    NOTA: Jardins secos de pontos críticos tendem a se aglomerar formando amostras altamente compactadas que devem ser cuidadosamente separadas como fragmentos não maiores que 1 mm3de tamanho.
  3. Coloque cuidadosamente os fragmentos na superfície pegajosa do toco coberto com fita. Uma vez que o fragmento do jardim toca a fita, é muito difícil (re)movê-lo, portanto, tome cuidado para não colocá-lo em locais ou posições indesejadas. Adicione até nove fragmentos por esboço.
  4. Repita as etapas 6.2 e 6.3 para cada amostra.

7. Revestimento por pulverização catódica com ouro

NOTA: O revestimento da amostra é necessário para evitar seu carregamento. Siga as instruções do fabricante para ajustar as configurações, como a pressão do gás de operação (0.5 × 10-1 mm Hg de pressão do gás neste protocolo), o tempo de pulverização catódica (220 s), a espessura da camada de ouro (~120 Å), a corrente (50 mA) e o voltage alimentação. A pulverização catódica tende a seguir um fluxo de trabalho comum, embora os equipamentos de diferentes fabricantes possam operar de maneira ligeiramente diferente.

  1. Abra o braço articulado e coloque os tocos na mesa de amostras.
  2. Feche o braço alvo articulado e verifique se a proteção contra estilhaços da câmara de vácuo de vidro está devidamente encaixada.
  3. Abra a válvula do cilindro de argônio e ligue o interruptor de alimentação principal.
  4. Siga o vácuo subindo no visor do equipamento até atingir a marca de 0.5 × 10-1 mm Hg no visor; em seguida, ative o Enxágue. Repita a operação 5x.
  5. Ligue o sistema de circulação de água, ative a opção HV On e abra a tampa da película dourada. Confirme se a cor do plasma é rosada. Para seguir este protocolo, configure 220 s de pulverização catódica com tensão de 50 mA, que depositará uma camada de ouro de ~ 120 Å (12 nm).
  6. HV On é desligado automaticamente. Desligue o sistema de circulação de água e feche a tampa da película de ouro.
  7. Desligue o interruptor de alimentação principal, permitindo que o ar entre na câmara de vácuo. Para amostras de jardim e resíduos, repita as etapas 7.1-7.7 3x.
    NOTA: Se a imagem não ocorrer imediatamente após a preparação da amostra, armazene os stubs em um recipiente hermético cheio de uma camada de sílica para evitar a reidratação das amostras.

8. Exames por imagem

NOTA: Siga as instruções do fabricante para ajustar as configurações de SEM, como diâmetro da abertura objetiva, tensão operacional, alinhamento do sistema de feixe de elétrons, alinhamento axial e estigmatizadores.

  1. Coloque os tocos no porta-amostras, anotando a posição de cada amostra.
    NOTA: Use luvas ao inserir ou remover o sample porta-luvas e mantenha-o o mais limpo possível.
  2. Inicie o software de operação na área de trabalho.
  3. Selecione as configurações do instrumento. Visualize amostras de jardim com o diâmetro de abertura da objetiva de 30 μm (ou seja, no segundo estágio), operando em alto vácuo, detectando sinais de elétrons secundários (SED), acelerando a tensão de 20 kV, distância de trabalho de 15 - 20 mm, corrente da sonda de 40,0 (no modo de alta corrente) e variando a ampliação de acordo com a amostra.
  4. Seguindo as instruções de navegação, pressione o ícone Vent e aguarde a ventilação da câmara de amostra. Uma barra de progresso indica o status do vácuo.
  5. Quando a pressão atmosférica for atingida, abra a câmara de amostra e insira cuidadosamente o porta-amostras.
  6. Feche suavemente a porta da câmara e pressione o ícone Evac para evacuar o instrumento, seguindo o status do vácuo através da barra de progresso. O sistema de navegação mostrará a posição do estágio móvel e fornecerá um gráfico de suporte quando o movimento for concluído. Pressione o ícone Câmera para gravar uma foto do suporte para obter uma visão superior que ajudará a navegar entre as amostras durante a geração de imagens.
  7. Pressione o ícone Observação para ligar o canhão de elétrons e aguarde a formação da imagem. Use a interface manual do usuário (controle manual) para mover manualmente o eixo Z para a altura adequada (com base na altura da amostra e na distância de trabalho determinada).
    NOTA: Para prolongar a vida útil do filamento de tungstênio, pause a função Observação sempre que não estiver criando imagens ativamente.
  8. Use as opções mostradas na tela ou o controle manual para alterar a taxa de varredura e a posição da imagem. Mova o palco para obter uma visão completa da amostra, empregando a função RDC para se concentrar em áreas específicas. Ao observar uma estrutura alvo (ou interessante), ajuste a ampliação, o foco, o brilho, o contraste e a estigmatização de acordo. Corrija a estigmatização usando a interface manual do usuário para mover o palco para as direções X e Y.
    1. Ajuste a ampliação entre 100x e 700x para visualizar aspectos gerais do jardim (como densidade de hifas, substrato e padrões de colonização).
    2. Ajuste a ampliação entre 700x e 1.500x para visualizar os padrões espaciais da microbiota.
    3. Ajuste a ampliação entre 1.500x e 3.000x para observar as interações físicas da microbiota e do biofilme.
    4. Ajuste a ampliação entre 3.000x e 4.000x para focar em aglomerados microbianos específicos.
  9. Para salvar uma imagem, use a função Congelar , clique no ícone Foto e configure o caminho do arquivo. Como padrão, analise pelo menos três fragmentos de jardim, criando imagens de cada um em todas as faixas de ampliação mencionadas na etapa 8.8. Isso resulta em pelo menos 12 imagens por amostra, embora mais imagens possam suportar descrições mais detalhadas. Sugerimos que 15-25 imagens por amostra, variando todas as ampliações na etapa 8.8, tendem a fornecer detalhes finos para a descrição da amostra.
    NOTA: Rastejar e salvar uma imagem leva alguns segundos durante os quais qualquer vibração na mesa flutuante SEM deve ser evitada.
  10. Depois de terminar a imagem, pressione a opção Ventilar para ventilar a câmara, seguindo o status do vácuo através da barra de progresso. Remova cuidadosamente o suporte, feche suavemente a porta da câmara e pressione Evac para evacuar a câmara.
  11. Assim que a evacuação estiver concluída, saia do software de operação.
  12. Ajuste o brilho e o contraste para melhorar a visualização usando um editor de imagens.

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Resultados

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para visualizar os componentes do jardim attine e amostras de resíduos, como hifas fúngicas, substrato, microbiota e biofilmes. O SEM melhorou nossa compreensão de como o jardim e os resíduos sustentam os padrões estruturais da microbiota (Figura 3). Em jardins attine, as hifas fúngicas são estruturas semelhantes a galhos que cobrem porções da superfície do substrato. Como as hifas fúngicas tendem a ser muito sensíveis à desidratação e ruptura, o ...

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Discussão

O SEM usa um feixe de elétrons para escanear a amostra, gerando uma imagem ampliada dela de forma que se possa visualizar microestruturas tridimensionais em alta resolução. Como o SEM opera sob alto vácuo, é necessária a remoção de até/mais de 99% da água das amostras. Dentro da câmara de vácuo MEV, amostras parcialmente hidratadas podem desidratar e colapsar, além de espalhar elétrons. Para imagens de alta resolução em MEV, a preparação da amostra deve incluir procedimentos para remover...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro (Processo #2019/03746-0). O MOB agradece a bolsa de doutorado recebida da FAPESP (processo 2021/08013-0) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanças 001. A AR também agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de pesquisa (#305269/2018). Os autores gostariam de agradecer a Marcia Regina de Moura Aouada e Antonio Teruyoshi Yabuki por ajudarem nos testes piloto para preparação de amostras, a Renato Barbosa Salaroli pela assistência técnica e a Enzo Sorrentino por ajudar na sessão de fotos. Este estudo foi realizado sob a autorização de acesso ao patrimônio genético # SISGen AA39A6D.

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Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 2 mLAxygenMCT-200-C-BRAPara fixar e desidratar amostras
Cloreto de cálcio anidroMerckC4901CaCl2 anidro para preparar Karnovsky' Secador de
ponto críticoLeicaEM CPD 300Para secagem de ponto crítico
Fita condutora de carbono dupla face, 12 mm (L) X 5 M (C)Microscopia Eletrônica Ciências77819-12Para montagem de amostras
Pinça entomológicaNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Álcool etílico (=etanol), puro (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Para desidratação
FórcepsNão há fornecedorPara manipular amostras de jardim
Copo de vidroNenhum fornecedorPara desidratação
Placa de Petri de vidroNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Pipeta de vidroNenhum fornecedorPara fixar e desidratar amostras
Glutaraldeído (glutaraldeído aquoso EM grau 25%)Microscopia eletrônica Ciências16220Para preparar Karnovsky' s fixador
Alvo de ouro Ted Pella, Inc.8071Para revestir com ouro
Ácido clorídricoSigma-Aldrich320331Para ajustar soluções pH
Editor de imagensPhotoshopqualquer versãoPara ajustar imagens
Paraformaldeído (Paraformaldeído 20% Solução Aquosa EM Grau)Microscopia Eletrônica Ciências15713Para preparar Karnovsky' Fixador de
PropilenoNão há fornecedorPara manter colônias de formigas vivas
Microscópio Eletrônico de VarreduraJEOL IT300 SEMPara imagem de amostras 
Cacodilato de sódio trihidratadoSigma-AldrichC0250Para preparar tampão de cacodilato de sódio
EspátulaNenhum fornecedorPara manipular amostras de jardim
Recipientes de amostras com 15 mm de diâmetro x 10 mm de alturaTed Pella, Inc.4591Para secagem de ponto crítico
Revestidor de pulverização catódicaBaltec SCD 050Para revestir com ouro
Stub (montagem de alumínio, pino de extremidade plana) 12,7 mm x 8 mm Ciências de Microscopia Eletrônica75520Para montagem de amostras
específico específico específico específico específico específico específico

Referências

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