Aqui, descrevemos um protocolo para separar células vitelinos, células da granulosa e teca em folículos pré-ovulatórios aviários. Esse manuseio preciso permite investigações críticas sobre o papel dessas camadas na função reprodutiva, auxiliando na compreensão do desenvolvimento folicular, regulação hormonal e pesquisa de doenças para melhorar o rendimento agrícola e insights biomédicos.
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Artigo de método
Separação de camadas de células do folículo pré-ovulatório da granulosa e da teca aviária para aplicações a jusante
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Galinhas poedeiras (galinhas poedeiras) e matrizes (reprodutores de frangos produtores de carne) são cruciais para o suprimento mundial de alimentos como uma fonte confiável de proteína. Eles também são um modelo animal emergente para o estudo de doenças reprodutivas humanas. À medida que o campo da pesquisa avícola se desenvolve, a saúde e a função do ovário de galinhas poedeiras e matrizes de corte serão um importante ponto de estudo para pesquisadores agrícolas e biomédicos. Um dos desafios apresentados por esse interesse emergente é a necessidade de técnicas replicáveis que todos os pesquisadores possam empregar na coleta de espécimes ovarianos. Em particular, um processo visual detalhado deve ser estabelecido para definir a separação adequada das camadas especializadas da granulosa e das células da teca dos folículos de galinha para obter concordância e consistência entre os pesquisadores.
Este estudo descreve a extração de folículos pré-ovulatórios e tecido ovariano em galinhas leghorn brancas em idade reprodutiva precoce. A separação desses folículos é realizada em condições frias e líquidas para congelar a gema para facilitar a manipulação e evitar que o próprio peso do folículo rasgue as camadas celulares durante o processo de separação. Uma vez concluída a separação, as camadas celulares desejadas podem ser digeridas para abordagens de cultura de tecidos ou podem ser criopreservadas para análises genômicas e proteômicas.
Introdução
As galinhas produtoras de ovos são um componente-chave da cadeia mundial de abastecimento alimentar e são um modelo animal em evolução para o estudo da fertilidade e do câncer de ovário. A galinha tem uma longa história de uso em laboratório, desde estudos in ovo de vacinas contra influenza1 até o estudo do crescimento de tumores cancerígenos2, e é um animal chave para obter informações sobre o desenvolvimento gonadal 3,4,5. Compreender o papel do sistema reprodutivo de uma galinha, em ....
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Protocolo
Todos os animais utilizados neste estudo foram mantidos e sacrificados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware (Protocolo IACUC 110R).
1. Preparação
- Esterilização
- Autoclave tigelas de vidro de 5 onças usando autoclavagem por deslocamento por gravidade (121 °C por 20 min) cobertas com papel alumínio com fita de autoclave no topo para manter e indicar esterilidade.
NOTA: Será necessária uma tigela para cada folículo em que a separação está sendo realizada. - Ferramentas de dissecção....
- Autoclave tigelas de vidro de 5 onças usando autoclavagem por deslocamento por gravidade (121 °C por 20 min) cobertas com papel alumínio com fita de autoclave no topo para manter e indicar esterilidade.
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Resultados
Este protocolo produz a separação das camadas de células da granulosa e da tecal do folículo ovariano (Figura 5 e Figura 6). Essas camadas podem então ser preparadas para exame histológico para confirmar a separação bem-sucedida. Essas imagens histológicas, revisadas e capturadas por um patologista veterinário certificado (EMB), demonstram claramente a separação eficaz das camadas da granulosa e da teca para os folículos pré-ovulatórios F1 e F5 (
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Discussão
Este estudo descreve o procedimento para a separação distinta das camadas de células da granulosa e da tecal dos folículos pré-ovulatórios em aves. Diferentemente do método existente estabelecido por Gilbert et al. em 1977, as adaptações feitas nesse método permitem um ambiente mais controlado ao separar manualmente a camada de células da granulosa da camada de teca de todos os folículos pré-ovulatórios15. Além disso, permite que os pesquisadores visualizem a cama.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a relatar.
Agradecimentos
Somos gratos a Milos Markis (AviServe) pela assistência na criação de animais, Nicole Guarino (Universidade de Delaware) pela assistência na preparação do manuscrito, Evelyn Weaver e Ramesh Ramachandran (Universidade Estadual da Pensilvânia) pela assistência na demonstração do procedimento e preparação do manuscrito. A Figura 2A e a Figura 3 foram criadas usando BioRender.com usando uma licença institucional patrocinada pelo Escritório de Pesquisa da Universidade de Delaware. Este trabalho foi apoiado pelo Laboratório de Patologia Comparativa UD CANR. O KME é apoiado pelo subsídio USDA NIFA 2023-67011....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3,5 pol. Pequenas Tigelas de Vidro, 5 oz | Amazon | B0BXP5PJTN | Tigelas de vidro autoclaváveis de pelo menos 3,5 pol. de diâmetro |
| Folha de Alumínio | Tigelas de autoclave | Costco | 720 |
| Almofadas de treinamento para animais de estimação Amazon, Regular, 100-Count | Amazon | B0B58WTPFS | Para uso como almofadas necrospy, qualquer almofada absorvente funcionará |
| Fita de Autoclave | Fisherbrand | 15-901-111 | |
| Cole-Parmer Iluminadores de Fibra Óptica LED | Cole-Parmer | EW-41723-02 | |
| Pinça de Ponta Curva Muito Fina | Não Serrilhado | Fisherbrand | 16-100-123 |
| Leica | Fina S6E | ||
| Fisherbrand | 12-000-155 | Não Serrilhados | |
| com Tampa Conjunto de 17 Transparente/Verde Micro-ondas Freezer Seguro para Lava-Louças | Amazon | B09QGZCRDB | Use qualquer recipiente que possa conter gelo E uma tigela de vidro pequena de 3,5 pol. |
| Pinças/Pinças de Ponta Muito Fina Cônicas de Alta Precisão 45 Graus Curvadas | Fisherbrand | 12-000-125 | Não Serrilhadas |
| Pinça/Pinça de Ponta Muito Fina de Alta Precisão | Fisherbrand | 16-100-120 | Isopropanol Não Serrilhado |
| A426P-4 | da Fisherbrand | ||
| , Estéril, Tampa de Rosca, Resistente a Vazamentos, 120 mL | McKesson | 16-9526 | 4 oz. / 120 cc, graduado |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10x), pH 7.6 | ThermoFisher | J62692. K7 | Precisará ser transformado em 1x |
| Frasco de Spray | Cole-Parmer | EW-06091-01 | Estéreis de Isopropanol 70% |
| #22 | Bolsas de Esterilização Cirúrgicas Cincinnati Surgical | 122 | |
| 10" x 16" | Amazon | B07MFB455C | |
| Pinças de Ponta Ultrafina Cônicas Fisherbrand | Fisherbrand | 16-100-121 | de Biópsia de Espuma Não Serrilhadas |
| , Retangulares | Fisherbrand | 22-038-221 | |
| Solução de Formalina, 10% (Histológica) | Fisher Chemical | SF98-4 | |
| de processamento/incorporação de tecidos com tampa | Simport M490-2 | Z672122 |
Referências
- Finter, N. B., Liu, O. C., Henle, W. Studies on host-virus interactions in the chick embryo-influenza virus system. X. An experimental analysis of the von Magnus phenomenon. J Exp Med. 101 (5), 461-478 (1955).
- Fredrickson, T. N. Ovarian tumors of th....
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Reimpressões e permissões
