É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C

944 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo estabelece um conjunto de procedimentos operacionais padrão (SOPs) para rastrear e isolar com eficiência as bactérias intestinais capazes de clivar os glicosídeos C.

Resumo

Os glicosídeos C são comumente encontrados em plantas medicinais e exibem extensa diversidade estrutural, juntamente com várias bioatividades, incluindo atividades antibacterianas, anti-inflamatórias, antivirais, antioxidantes e antineoplásicas. Nos glicosídeos C, o carbono anomérico da porção de açúcar está diretamente conectado a uma aglicona por meio de ligações carbono-carbono. Em comparação com os O-glicosídeos, os C-glicosídeos são estruturalmente estáveis e resistentes a ácidos e enzimas. Consequentemente, eles são tipicamente inquebráveis, resultando em baixa capacidade de absorção e baixa biodisponibilidade. Curiosamente, algumas bactérias intestinais podem clivar as ligações glicosídicas CC, fornecendo uma abordagem biológica específica e ecológica para degradar os glicosídeos C. Neste estudo, um conjunto de procedimentos operacionais padrão (POPs) foi desenvolvido para triagem de bactérias intestinais capazes de clivar ligações glicosídicas C-C com base no modelo de biotransformação de compostos naturais. Os POPs incluem a preparação e enriquecimento de bactérias intestinais, triagem orientada para a atividade e validação da atividade em um meio de origem de baixo carbono. Essa metodologia fornece uma referência fundamental para pesquisadores que desejam isolar e estudar essas bactérias funcionais especializadas.

Introdução

Os glicosídeos C são um grupo de compostos caracterizados pela ligação direta de grupos glicosil a agliconas por meio de ligações CC1. Na natureza, orientina, vitexina, puerarina e seus derivados são comumente identificados como C-glicosídeos2. Esses compostos são freqüentemente encontrados em plantas medicinais como Trollius chinensis3 e em animais como Styela plicata4. Estudos demonstraram que esses compostos fornecem benefícios à saúde e exibem várias bioatividades, incluindo antibacteriano 5,6,7, anti-inflamatório 8,9,10,11,12, antiviral 3,12,13, antioxidante 14,15,16 e atividades antineoplásicas17.

Devido à ligação dos grupos glicosil ao esqueleto por meio de ligações CC, esses compostos exibem alta estabilidade e resistência à hidrólise ácida e enzimática18, levando a baixa capacidade de absorção e baixa biodisponibilidade19. Essa limitação afeta o desenvolvimento e a utilização de C-glicosídeos. No entanto, drogas contendo glicosídeos C, muitas vezes administradas por via oral, são desglicosiladas por enzimas específicas, produzindo agliconas bioativas mais potentes 20,21,22,23. Embora as próprias enzimas do hospedeiro sejam incapazes de desglicosilar os glicosídeos C, as bactérias intestinais foram relatadas para metabolizar certos tipos. Por exemplo, algumas bactérias intestinais convertem a mangiferina em noratirario, que exibe maior potência como agente antidiabético ou antineoplásico24. Apesar desses achados, apenas um número limitado de bactérias capazes de clivar glicosídeos C foi caracterizado, e os mecanismos subjacentes permanecem pouco compreendidos. A triagem eficiente e padronizada dessas bactérias aumentará a compreensão de suas funções e acelerará o desenvolvimento de glicosídeos C.

O método de triagem foi desenvolvido e refinado ao longo do tempo em um sistema maduro. As principais abordagens incluem enriquecimento, triagem orientada a atividades e validação de atividades em meios de origem de baixo carbono. Este método facilita o isolamento de cepas-alvo puras, bem como a identificação de espécies, dados genômicos e características de microrganismos-alvo. Usando este sistema, as bactérias intestinais capazes de clivar os glicosídeos C podem ser efetivamente rastreadas e isoladas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os experimentos conduzidos aderiram aos regulamentos locais, nacionais e internacionais de contenção de biossegurança apropriados aos riscos específicos de biossegurança associados a cada cepa. Amostras fecais foram coletadas de voluntários saudáveis que não haviam tomado nenhum medicamento por pelo menos uma semana. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Construção de modelo de transformação bacteriana intestinal humana in vitro

  1. Preparação do Meio Anaeróbio Geral (GAM)25
    1. Preparação da Solução A
      1. Combine 10,0 g de triptona, 10,0 g de peptona de proteose, 3,0 g de peptona de soja, 13,5 g de soro digestivo em pó, 1,2 g de extrato de fígado em pó, 2,2 g de extrato de carne bovina e 5,0 g de extrato de levedura em um balão Erlenmeyer de 500 mL.
      2. Adicione 500 mL de água destilada e mexa sob aquecimento até que as substâncias estejam completamente dissolvidas.
    2. Preparação da Solução B
      1. Prepare a solução B seguindo o mesmo procedimento da solução A, exceto combinar 3,0 g de glicose, 5,0 g de amido solúvel, 2,5 g de hidrogenofosfato dipotássico e 3,0 g de cloreto de sódio em um balão Erlenmeyer de 250 mL.
    3. Preparação da Solução C
      1. Preparar a solução C seguindo o mesmo procedimento que as soluções A e B, excepto combinar 0,3 g de cloridrato de L-cisteína e 0,3 g de tioglicolato de sódio num balão Erlenmeyer de 100 ml.
      2. Misture as três soluções em um frasco Erlenmeyer de 1000 mL, ajuste o pH para 7,2 usando uma solução de hidróxido de sódio a 10% e adicione água destilada para perfazer um volume final de 1000 mL.
      3. Distribuir o meio em balões de Erlenmeyer de 250 ml e autoclave a 121 °C durante 30 min. Arrefecer à temperatura ambiente e conservar a 4 °C.
    4. Preparação do meio anaeróbio geral sólido
      1. Adicione 1%-2% de ágar ao meio líquido GAM e aqueça até dissolver completamente. Distribuir em balões de Erlenmeyer de 250 ml e autoclave a 121 °C durante 30 min.
    5. Preparação de meio fonte de baixo carbono
      1. Prepare o meio de origem de baixo carbono usando o mesmo procedimento do GAM, mas omita o extrato de levedura, a glicose e o amido solúvel.
  2. Preparação da flora intestinal humana mista
    1. Colete 1-2 g de fezes humanas frescas em um tubo de coleta de fezes estéreis descartáveis cheio de gás nitrogênio. Sele o tubo imediatamente. Adicione 5 mL de meio GAM, selo e cultura a 37 ° C por 24 h em uma incubadora anaeróbica estéril.
      NOTA: Use um medidor de oxigênio para monitorar os níveis de oxigênio da incubadora anaeróbica e substitua o gás nitrogênio conforme necessário para manter as condições anaeróbicas.
  3. Ativação da flora intestinal humana mista
    1. Após 24 h, transfira 0,5 mL da suspensão bacteriana intestinal humana para um novo tubo de microcentrífuga contendo 4,5 mL de meio GAM fresco.
    2. Selar e incubar a 37 °C durante 24 h em condições anaeróbias para obter uma flora intestinal humana mista ativa.
  4. Preparação de soluções de referência
    1. Pesar 5 mg de orientina e luteolina e dissolva-os separadamente em 1 mL de DMSO para preparar soluções de referência de orientina e luteolina a uma concentração de 5 mg / mL.
  5. Triagem da flora intestinal ativa capaz de clivar os glicosídeos C
    1. Misturar 260 μL de flora intestinal ativada com 6 ml de meio-fonte fresco de baixo carbono contendo 40 μl de solução de referência de orientina e incubar a 37 °C.
    2. Inclua um grupo controle (6 mL de meio-fonte de baixo carbono, 40 μL de solução de referência de orientina e 260 μL de solução salina normal) e um grupo em branco (6 mL de meio-fonte de baixo carbono, 40 μL de solução salina normal e 260 μL de flora intestinal ativada).
      NOTA: Realize todos os testes em triplicata em uma incubadora anaeróbica.
  6. Pré-tratamento de soluções de transformação
    1. Após 24 h e 48 h, pipetar 1 mL das soluções de reação em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 13.400 x g por 15 min em temperatura ambiente para remover as bactérias.
    2. Adicione 200 μL do sobrenadante a 600 μL de metanol, misture e centrifugue a 13.400 x g por 15 min em temperatura ambiente para remover proteínas.
  7. Detecção de produtos de transformação
    1. Filtrar o sobrenadante com uma membrana microporosa de 0,22 μm e analisar o filtrado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Realizar a análise de HPLC em um instrumento equipado com uma coluna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
    2. Manter a temperatura do forno de coluna a 40 °C, com um caudal de 1 ml/min. Use acetonitrila como fase móvel A e ácido fórmico a 0,1% em água purificada como fase móvel B.
      NOTA: Empregue um sistema de gradiente linear da seguinte forma: 5% -55% A em 0-20 min, 55% -95% A em 20-25 min, 95% -5% A em 25-30 min e 5% A em 30-32 min.

2. Isolamento de cepas únicas da flora bacteriana intestinal humana

  1. Ativação da flora bacteriana intestinal humana mista
    1. Ativar a flora bacteriana intestinal humana mista capaz de clivar a orientina, conforme descrito no passo 1.3, para obter a solução ativada da flora bacteriana intestinal humana.
  2. Preparação de chapas GAM sólidas
    1. Dissolva o meio GAM sólido preparado por aquecimento e despeje-o em placas de Petri estéreis descartáveis em uma incubadora anaeróbica. Deixe o meio solidificar para preparar placas GAM sólidas.
  3. Triagem preliminar de cepas únicas da flora bacteriana intestinal humana
    1. Pipete 100 μL da solução bacteriana ativada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução salina normal.
    2. Inocular um volume adequado da solução bacteriana numa placa de Petri utilizando um anel de inoculação descartável. Feche o prato e incuba-o em uma incubadora anaeróbica.
  4. Observação da morfologia da colônia
    1. Após 48 h de incubação a 37 °C, observar o tamanho, a morfologia e a cor das colônias na placa.
  5. Seleção de colônias individuais para obtenção de cepas únicas
    1. Selecione colônias bacterianas únicas distintas e cultive-as em tubos de microcentrífuga de 10 mL contendo 4,5 mL de meio GAM fresco. Incubar em condições anaeróbias a 37 °C durante 24 h para obter estirpes únicas.
  6. Verificação da atividade de cepa única
    1. Verifique a atividade de cepas individuais conforme descrito nas etapas 1.5, 1.6 e 1.7. Realizar a verificação da atividade usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e marcação de placas25.
  7. Purificação de estirpes únicas da flora bacteriana intestinal humana
    1. Purifique a cepa única ativa conforme descrito na etapa 2.1. Verifique sua atividade por meio de experimentos de transformação com orientina, seguindo os procedimentos descritos nas etapas 1.5, 1.6 e 1.7.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Amostras fecais de dez voluntários saudáveis foram rastreadas usando experimentos de transformação, resultando em uma amostra demonstrando atividade na orientina desglicosilante. Esse achado confirmou a viabilidade da triagem de amostras ativas. A amostra ativa foi isolada pelo método de marcação em placas. Com base na morfologia e características das colônias, aproximadamente 18 colônias bacterianas únicas com coloração amarela ou branca, formas variadas e bordas irregulares foram selecionadas para análise posterior. En...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O procedimento operacional padrão (SOP) para triagem de bactérias intestinais humanas capazes de clivar glicosídeos C foi estabelecido. Usando esses procedimentos, uma cepa ativa pura foi obtida com sucesso e sua propriedade de desglicosilação foi confirmada por meio de testes de transformação. O SOP consiste na preparação e enriquecimento de bactérias intestinais, triagem orientada para a atividade e validação da atividade em um meio de origem de baixo carbono.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 82374134.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
F2408R205 de ThermoFisher FisherAcetonitrila
Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTDYQX- II
Extrato de carnePequim Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
Soro digestivo em póPequim Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
Dipotássio Fosfato de hidrogênioBeijing Chemical WorksM26298AR
Tubo de coleta de fezes estéreis descartáveisLang Fu Co., LTD5 mL
Departamento de Água Destiladade Biofarmacêutica, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TubeBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 mL / 1,5 mL
Eppendorf CentrífugaEppendorf AG5418
GlicoseBeijing Chemical WorksGC205003AR
Cromatógrafo Líquido de Alto DesempenhoShimadzu CorporationLC-20
Esterilizador a vapor de alta pressãoSanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 < / sub>Coluna cromatográficaAgela Technologies Co., LTD4,6 mm e vezes; 250 mm, 5 e micro; m
Cloridrato de L-cisteínaBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Extrato de fígado em póBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
LuteolinaInstitutos Nacionais de Controle> 98%
Agitador MagnéticoIka Werke Co., LTDRCT básico
MetanolThermo Fisher Scientific20240901312AR
Millipore Filter MembraneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0,22 µ L &vezes; 50 mm
OrientinYishiming (Pequim) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
PeptonaPequim Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Placa de PetriPequim Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
Cloreto de sódioPequim Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
Tioglicolatode sódioShanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019AR
Amido SolúvelBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
Peptona de SojaBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptoneAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTDBiotecnologia
Co. de Pequim Abxing doextrato do fermento01-014BR
Incubadora anaeróbica científica da bovina de Pequim de Alimentos e Medicamentos de KQ-500DE, LTD

Referências

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Clivagem de C-GlicosídeosTriagem BacterianaIsolamento BacterianoMeio de Baixo Teor de CarbonoIncubação AnaeróbicaCromatografia Líquida de Alta PerformanceFlora Intestinal HumanaMorfologia de ColôniasAtividade de Deglicosilação
Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.