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Induzindo a entrada de juvenis de dispersão de terceiro estágio de Bursaphelenchus xylophilus na criptobiose por meio da regulação osmótica

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DOI:

10.3791/67350

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27 de dezembro de 2024

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um método para induzir a dispersão de juvenis de terceiro estágio (juvenis pré-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus em criptobiose por meio da regulação osmótica de íons cloreto de potássio (KCl). Este método pode fornecer suporte técnico para pesquisas sobre os mecanismos de resistência ao estresse de B. xylophilus.

Resumo

A criptobiose é um estado em que os organismos perdem quase toda a sua água interna e entram na anidrobiose sob estresse ambiental extremo. Os juvenis de terceiro estágio de dispersão (juvenis pré-dauer, figure-abstract-1) de Bursaphelenchus xylophilus podem entrar em criptobiose por desidratação e reviver após a reidratação quando as condições ambientais melhoram. A regulação osmótica é crucial para sua sobrevivência nesse processo. Neste estudo, espécimes de B. xylophilus foram coletados de Pinus massoniana morta devido à doença da murcha do pinheiro em Ningbo, província de figure-abstract-2 Zhejiang, China. Após a imersão em solução figure-abstract-3 de cloreto de potássio (KCl) a 8%, B. xylophilus entrou em um estado criptobiótico após desidratação gradual devido ao aumento da pressão osmótica externa pela evaporação natural da água. figure-abstract-4 B. xylophilus poderia resistir ao estresse de baixa temperatura a -20 ° C. figure-abstract-5 B. xylophilus poderia reviver após a reidratação, com uma taxa de sobrevivência de 92,1%. Este processo pode regular a entrada de figure-abstract-6 B. xylophilus na criptobiose, permitindo-lhes resistir a ambientes extremos. Este método descrito em nosso estudo é simples e confiável, fornecendo suporte técnico para o estudo dos mecanismos de resistência ao estresse de B. xylophilus.

Introdução

A doença da murcha do pinheiro é uma das doenças florestais mais graves da China1. O nematóide da madeira do pinheiro Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) representa uma ameaça significativa para espécies de pinheiros como Pinus massoniana (P. massoniana) ao se reproduzir dentro do hospedeiro, levando a um rápido murchamento e morte. Em condições ambientais desfavoráveis após a morte do hospedeiro, os juvenis reprodutivos de B. xylophilus podem entrar em juvenis pré-dauer (figure-introduction-1). Esses juvenis procuram insetos vetores para continuar sua transferência e disseminação, causando extensas mortes de florestas de pinheiros2.

A criptobiose é um estado em que os organismos perdem quase toda a sua água interna e entram em anidrobiose sob estresse ambiental extremo3. Nesse processo, os organismos desidratam gradualmente, resultando em movimento interrompido, metabolismo reduzido e um ciclo de vida suspenso4. Em condições adequadas, eles podem se recuperar após a reidratação. A criptobiose permite que os organismos resistam a ambientes extremos, como baixas temperaturas, e prolonguem sua vida útil5. Nematóides que sobreviveram na criptobiose por 30.000 anos foram encontrados no permafrost antártico6.

Estudos anteriores mostraram que os nematóides podem se adaptar a vários estressores abióticos - como baixa temperatura, seca e alta pressão osmótica - durante a desidratação, ajustando sua permeabilidade superficial7. Além disso, os nematóides podem enrolar seus corpos para diminuir a área de superfície e minimizar a taxa de perda de água. Por exemplo, Caenorhabditis elegans regula o equilíbrio osmótico, permitindo que íons e pequenas moléculas passem livremente por sua cutícula, enquanto moléculas maiores não podem8. figure-introduction-2 B. xylophilus também exibe criptobiose. Durante os estágios de desidratação e reidratação da criptobiose, a regulação osmótica é essencial para controlar a troca de substâncias pela cutícula, tornando-a fundamental para entrar ou se recuperar da criptobiose9.

O presente estudo apresenta um método para induzir criptobiose em figure-introduction-3 B. xylophilus por meio de regulação osmótica. Este método é simples, eficiente e altamente confiável, fornecendo suporte técnico para a pesquisa dos mecanismos de resistência ao estresse de figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protocolo

1. Coleção de figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Coleta de discos infectados de P. massoniana
    NOTA: Todos os procedimentos cumpriram as Medidas Administrativas para Área Epidêmica da Doença da Murcha do Pinheiro e Madeira Infectada e outros regulamentos aplicáveis. Uma floresta de P. massoniana infectada por B. xylophilus no condado de Xiangshan, cidade de Ningbo, província de Zhejiang, foi selecionada como local de amostragem. P. massoniana, que morreu de doença da murcha do pinheiro, foi derrubada dentro do local da amostra.
    1. Colete toras redondas (5 cm de espessura) das seções superior, intermediária e inferior do tronco principal das árvores derrubadas.
    2. Corte as toras redondas coletadas de P. massoniana em fatias de 0,5-1 cm de espessura e, em seguida, corte-as em pequenas tiras de 2-3 cm de comprimento.
    3. Coloque as pequenas tiras de madeira em sacos lacrados e guarde-as em laboratório para uso posterior.
  2. Extração de figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Prenda um tubo de borracha na extremidade estreita de um funil de vidro de gargalo longo com um diâmetro aproximado de 15 cm. Prenda o tubo de borracha com uma torneira. Coloque o funil montado em um suporte de funil.
    2. Enrole as pequenas tiras de madeira completamente em uma única camada de papel de seda e coloque-as no funil. Adicione água destilada ao funil até que todas as tiras de madeira estejam submersas.
      NOTA: Depois de ficar em repouso por 12-24 h, os nematóides migraram para fora das tiras de madeira e se estabeleceram no fundo do funil10. O papel de seda impediu que os detritos de madeira se depositassem, permitindo a passagem dos nematóides.
    3. Solte lentamente a torneira no fundo do funil e deixe vazar 2000-5000 μL da mistura para uma placa de Petri (5 cm de diâmetro) para exame microscópico e identificação morfológica.
    4. Identifique figure-protocol-3 B. xylophilus observando características como estiletes, bulbos esofágicos medianos, gotículas lipídicas e formas de cauda "semelhantes a dedos"11.
    5. Sob um microscópio, transfira o indivíduo figure-protocol-4 B. xylophilus para uma lâmina aspirando 10 μL de líquido junto com um nematóide usando uma pipeta de 10 μL de cada vez. Repita este processo 30 vezes para coletar aproximadamente 300 μL da mistura contendo nematóides.
    6. Após a extração de figure-protocol-5 B. xylophilus, esterilize as tiras de madeira restantes e os materiais de madeira infectados para evitar mais contaminação.

2. Controle do processo de regulação osmótica

  1. Preparação da mistura de regulação osmótica
    1. Prepare uma solução aquosa de KCl a 8%.
    2. Usando uma pipeta, adicione 10 μL da solução aquosa de KCl a 8% à lâmina contendo a mistura de figure-protocol-6 B. xylophilus, produzindo aproximadamente 310 μL de uma mistura dos nematóides e da solução de KCl.
  2. Regulação do aumento da pressão osmótica e desidratação de figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Coloque a lâmina no microscópio stage, permitindo que a água evapore naturalmente. Isso aumentaria gradualmente a pressão osmótica do ambiente circundante, fazendo com que os nematóides se desidratassem em aproximadamente 30-60 min.
      NOTA: O operador só precisa esperar que a água evapore naturalmente até que os cristais de KCL precipitem e observar o estado dos nematóides ao microscópio. Demora cerca de 30-60 min para que 310 μL da mistura evaporem naturalmente até que os cristais de KCL precipitem.
    2. Observe o processo de desidratação (por exemplo, ondulação corporal, agregação, etc.) de figure-protocol-8 B. xylophilus ao microscópio. Quando a água evapora completamente e os cristais de KCl precipitam, figure-protocol-9 B. xylophilus para de se mover e entra em criptobiose.
  3. Tratamento por estresse em baixa temperatura do criptobiótico figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Colocar o criptobiótico figure-protocol-11 B. xylophilus num ambiente de temperatura constante de -20 °C durante 24 h.
  4. Regulação da diminuição da pressão osmótica e reidratação de figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Adicionar cerca de 300 μL de água destilada à volta dos juvenis submetidos a tratamento a baixa temperatura por pipeta. O processo de reidratação, com duração de cerca de 30-60 min, diminui gradualmente a pressão osmótica do ambiente circundante.
    2. Observe o processo de reidratação de figure-protocol-13 B. xylophilus (por exemplo, alongamento do corpo, retomada do movimento, etc.) ao microscópio. Calcule a taxa de sobrevivência após 24 h.

Resultados

Na solução de KCl a 8%, à medida que a água evaporava, B. xylophilus inicialmente exibiu uma "ondulação" perceptível, figure-results-1 mantendo-se móvel (Figura 1A). Uma vez que a água evaporou completamente, os nematóides pararam de se mover e se enrolaram, com superfícies deprimidas e gotículas lipídicas acumuladas (Figura 1B), indicando sua entrada no estado criptobiótico. Após a adição de água destilada ao ambiente circundante, os nematóides se reidrataram e reviveram (Figura 1C). Depois que a água evaporar, os cristais KCL aparecerão (Figura 1D). A Figura 1E mostra as características morfológicas de figure-results-2 B. xylophilus.

Um experimento de desidratação demonstrou que, em uma solução inicial de KCl a 8%, a evaporação da água fez com figure-results-3 que B. xylophilus perdesse água. Após a desidratação, figure-results-4 B. xylophilus foi submetido a estresse de baixa temperatura a -20 °C por 24 h; a taxa média de sobrevivência foi de 92,1%11. Em comparação com uma taxa de sobrevivência de 0% no grupo controle que não havia entrado em um estado criptobiótico, os dados acima sugeriram que a desidratação poderia aumentar significativamente a taxa de sobrevivência de figure-results-5 B. xylophilus em condições de baixa temperatura.

Durante a fase de reidratação após a criptobiose de figure-results-6 B. xylophilus, observamos que 100% dos nematóides exibiram "bolhas" in vivo ao serem transferidos da solução de KCl a 40% para água destilada (Figura 2).

figure-results-7
Figura 1: O processo de desidratação-criptobiose-reidratação de figure-results-8 B. xylophilus. Esta imagem ilustra o processo de criptobiose em figure-results-9 B. xylophilus, incluindo o estágio de (A) desidratação, (B) estágio de criptobiose, (C) estágio de reidratação, (D) estágio de cristalização KCL e (E) figure-results-10 B. xylophilus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-11
Figura 2: Acúmulo de grânulos de gordura em B. xylophilus não revividofigure-results-12. Esta imagem mostra o estado de figure-results-13 B. xylophilus após a reidratação, caracterizado pela presença de grânulos de gordura em forma de bolha in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste estudo, figure-discussion-1 B. xylophilus foi coletado de P. massoniana morta em Ningbo, província de Zhejiang. Deve-se notar que figure-discussion-2 B. xylophilus foi selecionado de uma população mista com diferentes instares. Especificamente, foram escolhidas toras redondas com alta densidade de B. xylophilus, seguidas pela triagem de figure-discussion-3 B. xylophilus. Durante o inverno, quando a temperatura mínima diária na província de Liaoning é de cerca de -20 °C, um grande número de B. xylophilus de um único ínstar figure-discussion-4 pode ser obtido de Pinus tabuliformis morto, o que simplificou o processo de seleção neste experimento12.

Durante o processo criptobiótico, a lenta taxa de desidratação dos nematóides beneficia sua sobrevivência e evita danos estruturais às suas proteínas13. O tempo de desidratação é crítico na determinação da taxa de sobrevivência de figure-discussion-5 B. xylophilus. Neste estudo, foi utilizada uma solução de KCl na concentração inicial de 8%, e sua concentração foi aumentada gradualmente com a evaporação natural da água, permitindo que figure-discussion-6 B. xylophilus se desidratasse lentamente e entrasse em criptobiose. Se a água evaporar muito rapidamente ou os nematóides forem colocados diretamente em uma solução de KCl de alta concentração, sua taxa de sobrevivência diminui significativamente.

O método descrito neste estudo apresenta várias vantagens. Os materiais experimentais são de fácil acesso, necessitando apenas de solução de KCl e água destilada para regular a desidratação e reidratação de figure-discussion-7 B. xylophilus. Os procedimentos são simples: a desidratação ocorreu por evaporação natural e a reidratação foi obtida pela adição de água destilada. Todo o processo pode ser concluído em 2 h. Este método apresenta altas taxas de sucesso e sobrevivência, com a maior parte de figure-discussion-8 B. xylophilus entrando em criptobiose após desidratação e a maioria revivendo após reidratação, respectivamente11.

O método proposto é aplicável para regular o estado criptobiótico de B. xylophilus e dos juvenis de figure-discussion-9 dispersão do quarto estágio (figure-discussion-10)14. No entanto, pode não ser eficaz para a propagação de B. xylophilus.

Nos últimos anos, a doença da murcha do pinheiro causada por B. xylophilus se expandiu do sul da China para as áreas do norte. figure-discussion-11 B. xylophilus, que habita os pinheiros nessas regiões mais frias do norte, tende a exibir maior resistência ao frio15. O método proposto pode induzir criptobiose em figure-discussion-12 B. xylophilus, aumentando sua resistência ao frio e à seca. Coletivamente, este método pode fornecer suporte técnico para o estudo dos mecanismos de resistência ao estresse de B. xylophilus e do mecanismo de transmissão da doença da murcha do pinheiro.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Fundo de Pesquisa Basal da Instituição Científica Central de Interesse Público do Laboratório Estadual de Genética e Melhoramento de Árvores (número de concessão CAFYBB2020ZY001-2), projetos de pesquisa empresarial (202404016-4320) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC 32271896).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corrediça de vidroBiolândiaGS7101-752575 mm e tempos; 25 mm e vezes; 1 milímetro
Funil de vidro de pescoço compridoTecnologia Experimental Nanjing KangluodaN/A150 milímetros
MicroscópioPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
Placa de PetriTecnologia Experimental Nanjing Kangluoda  TB-62493579274550 mm e vezes; 50 milímetros
PinchcockTecnologia Experimental Nanjing Kangluoda  TB-62497331174336 mm e tempos; 11 mm  &vezes; 55 milímetros
PipetaEppendorf312300001210– 100 µ L
Cloreto de potássio (KCL)Solarbio Ciências da VidaPág. 9921500 gramas
Tubo de borrachaTecnologia Experimental Nanjing KangluodaTB-6249234570947 mm e vezes; 5 milímetros
EsterilizadorBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Papel de seda Impressão de coração para coraçãoM322,5 cm &vezes; 21,5 cm

Referências

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