Análise por Citometria de Fluxo da Expressão de Fatores Tecidusuais em Plaquetas Humanas

Resumo

Este artigo descreve o protocolo para quantificar a porcentagem de plaquetas positivas para o Fator Tissular (TF) usando citometria de fluxo sanguíneo total, avaliando a proteína: (1) intracelularmente em condições de repouso, e (2) na superfície celular, tanto em repouso quanto em condições ativadas. Também é fornecida orientação para avaliar plaquetas TF-positivas em plasma rico em plaquetas.

Resumo

Um subconjunto de plaquetas humanas circulantes armazena o Fator Tissular (TF) intracelularmente, o principal ativador da cascata de coagulação sanguínea e da formação do trombo. Após a ativação das plaquetas, a TF é exposta na membrana celular, onde se liga à FVII, levando à geração de trombina. Considerando que (1) os níveis de plaquetas TF-positivas aumentam em vários contextos clínicos, contribuindo para o fenótipo protrombótico do paciente, e (2) diferentes medicamentos podem modular a expressão da TF associada a plaquetas, um método padronizado para avaliar plaquetas TF-positivas é valioso, pois sua avaliação já foi controversa no passado. Aqui, delineamos um protocolo para medir a porcentagem de plaquetas TF-positivas usando citometria de fluxo no sangue total e no plasma rico em plaquetas (PRP)/lavado. Esse protocolo visa fornecer instruções detalhadas para quantificar a porcentagem de plaquetas TF-positivas avaliando a proteína (1) intracelularmente em condições de repouso e (2) na superfície celular, tanto em repouso quanto em condições ativadas. A primeira seção fornece informações essenciais para realizar corretamente a retirada de sangue, garantindo que os procedimentos pré-analíticos não afetem os resultados. Em seguida, o protocolo foca nos procedimentos de preparação e marcação de amostras para análise de citometria de fluxo. São detalhados os passos para estimulação celular, marcação, fixação e permeabilização — quando necessário — detalhados. Por fim, são descritas instruções para configurações de citometria de fluxo para identificar corretamente a população plaquetária e analisar eventos TF-positivos. Por fim, o método inclui o procedimento para preparar PRP caso as plaquetas TF-positivas sejam medidas em plaquetas isoladas. Como apenas um subconjunto de plaquetas contém TF, é importante garantir que essas plaquetas não sejam perdidas durante as etapas de centrifugação necessárias para obter PRP.

Introdução

O Fator Tecidular (TF), uma glicoproteína transmembrana e ativador-chave da cascata de coagulação sanguínea, é expresso por um subconjunto, ~20%-30%, das plaquetas humanas^{circulantes 1}, especialmente aquelas com tamanho² maior. Ao serem ativados por agonistas plaquetários clássicos como adenosina difosfato (ADP) e trombina, as plaquetas expõem TF funcionalmente ativo em sua superfície de forma dependente da concentração, permitindo que ele se ligue ao fator VII/VIIa, levando finalmente à geração^{de trombina} 1,3,4,5,6. Notavelmente, em condições patológicas como doença arterial coronariana (CAD⁾⁷, infecção por síndrome respiratória aguda grave-coronavírus-2 (SARS-CoV-2^{) 8}, enxaqueca com aura associada ao forame oval patenteado (MHA-PFO⁾⁹, câncer¹⁰ e sepse¹¹, o número de plaquetas TF-positivas aumenta significativamente, contribuindo para o maior risco trombótico observado nesses ambientes clínicos.

Apesar dessas evidências convincentes, a detecção de plaquetas TF-positivas continua sendo um tema de debate dentro da comunidade^{científica 6,12,13}. Desafios metodológicos, incluindo variáveis pré-analíticas, preparação da amostra e especificidade de anticorpos, foram sugeridos como possíveis razões para os resultados contraditórios relatados na^literatura 2,4,12,14. Portanto, é crucial estabelecer um ensaio padronizado baseado em um protocolo bem definido para medir a TF em plaquetas humanas.

Nesse contexto, a citometria de fluxo sanguíneo total é a única tecnologia que permite a análise de plaquetas TF-positivas com manuseio mínimo da amostra, o que é crucial para evitar a perda desse subconjunto plaquetário.

Neste artigo, propomos um protocolo para medir a TF associada a plaquetas usando citometria de fluxo sanguíneo total, avaliando a proteína (1) intracelularmente em condições de repouso e (2) na superfície celular tanto em repouso quanto em condições ativadas. Instruções também são fornecidas caso seja necessária a avaliação de plaquetas TF-positivas em plasma rico em plaquetas (PRP).

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Ético da Instituição (nº 70/24, CE 18.06.24), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores de sangue. O protocolo guiará o usuário por sete etapas principais (Figura 1). O primeiro passo aborda o procedimento para a realização da coleta de sangue. As etapas 2 e 3 descrevem o protocolo de titulação de anticorpos e a preparação da amostra para a análise da expressão intracelular de TF usando um anticorpo monoclonal (mAb) marcado com αCD142/HTF1 com ficoeritrina (PE). A Etapa 4 descreve o protocolo para avaliar a proteína exposta na superfície das plaquetas usando um método indireto de coloração com αCD142/HTF1 mAb. Devido ao obstáculo estérico do fluorocromo, o mAb marcado com PE usado para coloração intracelular não se liga ao domínio catalítico da proteína exposta à superfície. Portanto, é proposto um protocolo para coloração indireta com um mAb secundário marcado com Alexa Fluor 633. Os passos 5 e 6 detalham as fases da análise de citometria de fluxo. A etapa final descreve o procedimento para preparar plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar a perda da subpopulação de plaquetas de grande porte. Detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Abstinência de sangue

NOTA: A coleta de sangue humano deve ser realizada somente após obter a aprovação do Comitê Ético.

1. Colete amostras de sangue por amostragem venosa periférica ou por cânula por agulha de um braço não afetado por infusões venosas periféricas, preferencialmente da veia antecubital.
   1. Para amostragem venosa periférica, aplique o torniquete e, após inserir uma agulha borboleta G19 na veia, remova-a para evitar a ativação plaquetária (Figura 2).
      NOTA: Não use uma agulha borboleta menor que G21 para evitar a ativação plaquetária.
   2. Para amostragem venosa com agulha-cânula, não aplique o torniquete em nenhum momento durante a amostragem. Se necessário, lave a amostra com solução salina a 0,9% antes de retirá-la. Sempre descarte os primeiros 5 mL de sangue antes de começar a preencher os tubos.
2. Extrai 2 mL de sangue em um aspirador EDTA (para uso na contagem de células sanguíneas). Misture suavemente o tubo três vezes para garantir a mistura completa de sangue e anticoagulante.
3. Colete sangue em um vacainer de citrato de sódio 0,129 M para análise da expressão de TF associada a plaquetas. Encha cuidadosamente o vácuo até o nível indicado para manter a proporção correta de sangue/anticoagulante. Inverta suavemente os tubos cinco vezes para garantir uma mistura completa do sangue com o anticoagulante, prevenindo a formação de coágulos e hemólise das amostras.
   NOTA: Recomenda-se o uso do anticoagulante citrato 0,129 M para otimizar a detecção da TF associada a plaquetas com o clone HTF1 do αCD142 mAb. Se for necessário isolar plaquetas do sangue total, extraia um segundo vacainer de citrato de sódio 0,129 M para preparação de plasma rico em plaquetas (PRP).
4. Mantenha os aspiradores em posição vertical em um suporte para tubo. Não os agite em placas giratórias ou inclináveis, e evite sistemas pneumáticos de transporte. Não refrigere as amostras de sangue para evitar a ativação das plaquetas.
   NOTA: As amostras de sangue devem ser processadas preferencialmente dentro de 15 minutos após a retirada se outro marcador de ativação plaquetária associado a grânulos for medido junto com a TF. Caso contrário, as amostras devem ser processadas no máximo 3 horas após a coleta (Figura 3).

2. Titulação do anticorpo anti-TF (para avaliação intracelular da TF)

NOTA: A determinação da TF armazenada intracelularmente é realizada usando o mab PE-αCD142/HTF1.

1. Titulação de anticorpos usando esferas
   NOTA: O uso de esferas permite definir a quantidade correta de anticorpo a ser usada (ou seja, a concentração de anticorpos que produz a maior separação dos picos de fluorescência entre amostras positivas e negativas). Essa análise é realizada usando duas amostras, uma verdadeiramente positiva e outra verdadeiramente negativa. A concentração de anticorpos não é reportada pelo fabricante (veja Tabela de Materiais), então a titulação de anticorpos é realizada usando cinco pontos de diluição.
   1. Centrifuge o anticorpo a 17.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Para preparar os cinco pontos de diluição de anticorpos, pipete-se 40 μL de anticorpo no tubo 1 e 20 μL de PBS nos tubos 2 a 5. Faça quatro diluições consecutivas em série 1:2 transferindo 20 μL do tubo 1 para o tubo 2 e depois para frente.
   2. Prepare um tubo de ensaio para cada volume de anticorpos a ser testado. Adicione uma gota de contas negativas e uma gota de contas positivas em cada tubo de ensaio. Adicione 20 μL de cada diluição de anticorpos ao tubo de ensaio e entre em vórtice imediatamente. Incube no escuro em temperatura ambiente por 20 minutos.
   3. Adicione 1 mL de PBS 1x sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo e vórtice.
   4. Adquira as amostras no citômetro de fluxo conforme as instruções do fabricante e registre um arquivo de dados de 10.000 eventos na porta "esferas". A concentração ideal de anticorpos é aquela que proporciona a maior separação entre picos positivos e negativos.
2. Titulação de anticorpos em plaquetas
   NOTA: Como regra, a concentração ótima de anticorpos identificada usando as esferas deve ser verificada nas células a serem coradas — neste caso, plaquetas no sangue total.
   1. Fixação
      1. Inverta suavemente o vacainer de citrato de sódio cinco vezes para misturar bem o sangue e o anticoagulante. Transfira 50 μL de sangue para um tubo de 1,5 mL, adicione 950 μL de paraformaldeído (PFA) a 1%, misture suavemente e incube a amostra por 90 minutos em temperatura ambiente.
      2. Centrifuge a amostra a 1.500 x g por 5 minutos, com freio, em temperatura ambiente.
      3. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet pipetando suavemente 1 mL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg^{++, pH} 7,4.
   2. Permeabilização
      1. Prepare um tubo para cada volume de anticorpos a ser testado (teste o volume identificado com a titulação das esferas junto com uma diluição maior e uma menor, por exemplo, 10 μL, 5 μL, 2,5 μL se o volume identificado for 5 μL) e um tubo para o controle de Fluorescência Menos Um (FMO).
      2. Dispense 100 μL de sangue fixo em cada tubo e centrifuge-o a 1.500 x g por 5 minutos, com freio, em temperatura ambiente.
      3. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 100 μL de 0,1% de Triton-PBS para permeabilizar as amostras e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
   3. Coloração
      1. Centrifuge o anticorpo a 17.000 x g por 5 minutos a 4 °C. Adicione os volumes de anticorpos necessários a cada tubo de ensaio conforme determinado em 2.2.2.1 e misture.
      2. Incube as amostras por 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente.
      3. Adicione 300 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo e misture. Adquira as amostras no citômetro de fluxo (veja o passo 5).
      4. Calcule o índice de coloração de acordo com a seguinte^{fórmula 15}:
                                
         onde,_{MFI pos} é a Intensidade Média de Fluorescência dos eventos positivos, MFI_negativo é o dos eventos negativos, e SD é o Desvio Padrão da população negativa.
      5. Escolha a menor concentração de anticorpos que forneça o maior índice de coloração.
         NOTA: Nas condições experimentais atuais, o maior índice de coloração para o PE-αCD142/HTF1 mAb é alcançado usando 5 μL de anticorpo.

3. Preparação de amostra para análise de citometria de fluxo da expressão intracelular de TF

1. Fixação do sangue total e permeabilização
   1. Para a análise intracelular de TF, fixe e permeabilize o sangue total conforme o procedimento descrito na etapa 2.
2. Procedimento de tingimento
   NOTA: No protocolo a seguir, a população plaquetária é identificada por meio da coloração αCD61-PerCP. Outros marcadores populacionais podem ser usados a critério do operador.
   1. Prepare um tubo para o controle de Fluorescência Menos Um (FMO) e um tubo para a coloração TF. Adicione 100 μL de sangue total fixo e permeabilizado a cada tubo junto com os anticorpos listados na Tabela 1.
   2. Incube as amostras por 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente.
   3. Adicione 300 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo e misture. Armazene as amostras coradas no escuro até a análise de citometria de fluxo (veja passo 5).
      NOTA: Para calcular a matriz de compensação, prepare as amostras conforme descrito na Tabela 2.

4. Preparação da amostra para análise de citometria de fluxo da expressão de TF associada à superfície celular em plaquetas em repouso e ativadas

NOTA: Para a detecção de TF associada à superfície celular, use αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) não marcado e IgG anti-camundongo Alexa Fluor 633 (2 mg/ml) como anticorpo secundário para detecção de sinais. A adenosina 5'-difosfato (ADP) é usada como agonista plaquetário para induzir a exposição da TF na superfície celular. Um anticorpo marcado com PE é usado como marcador populacional de plaquetas para minimizar o transbordamento, que será verificado por compensação de sinal.

1. Coloração TF
   1. Diluir αCD142/HTF1 mAb 1:100 em 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, para obter uma concentração de trabalho de 10 μg/mL. Dilua Alexa Fluor 633 anti-camundongo IgG 1:10 em 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, para obter uma concentração de trabalho de 200 μg/mL.
   2. Prepare os três tubos de amostra e dispense 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, conforme indicado na Tabela 3.
   3. Dispense 7,5 μL de αCD142/HTF1 mAb diluído e adicione 5 μL de ADP (200 μM) para obter uma concentração final de 10 μM de ADP. Inverta suavemente o vácuo de citrato 5 vezes para misturar bem o sangue e o anticoagulante, depois dispense 5 μL de sangue total em cada tubo. Misture as amostras com cuidado.
   4. Incube as amostras por 20 minutos em temperatura ambiente.
2. Fixação de exemplo
   1. Fixe cada amostra adicionando 300 μL de paraformaldeído a 1% (PFA) e incube as amostras por 1 hora em temperatura ambiente.
      NOTA: Amostras marcadas fixadas com PFA a 1% e armazenadas a 4 °C permanecem estáveis por até 4 dias.
   2. Adicione 300 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, em cada tubo e centrifuge a 1500 x g por 5 min com freio em temperatura ambiente.
   3. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 95 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, pipeteando suavemente.
3. Coloração com o anticorpo secundário
   1. Dispense 5 μL de Alexa Fluor 633 IgG diluído e incube as amostras por 15 minutos no escuro em temperatura ambiente.
   2. Adicione 300 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, em cada tubo e centrifuge a 1500 x g por 5 min com freio em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 95 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Dispense 5 μL de αCD41-PE em cada tubo (veja a Tabela 4). Incube as amostras por 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente.
   4. Adicione 300 μL de 1x PBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺, pH 7,4, a cada tubo e misture.
   5. Armazene as amostras coradas no escuro até a análise de citometria de fluxo (veja o passo 6).
      NOTA: Para calcular a matriz de compensação, prepare as amostras de acordo com os Passos 4.1-4.3 e conforme descrito nas Tabelas 5 e 6.

5. Análise de citometria de fluxo da expressão intracelular de TF

NOTA: O procedimento a seguir refere-se a aquisições em um citômetro de fluxo de referência; Assim, os cenários e gráficos relatados devem ser considerados representativos. O protocolo pode ser aplicado a qualquer citômetro de fluxo de alta sensibilidade e nova geração. Ligue o citômetro de fluxo bem antes da aquisição da amostra para garantir a estabilidade do laser. Lave cuidadosamente a fluidica e a célula de fluxo, pois as plaquetas são pequenas, e qualquer detrito celular pode interferir na visualização da população de plaquetas no gráfico de pontos da área de dispersão frontal/área de dispersão lateral (FSC-A/SSC-A). Realize controle de qualidade com esferas de controle de qualidade conforme as instruções do fabricante e lave novamente os fluidos para remover quaisquer esferas residuais.

1. Configuração da aquisição
   1. Crie um gráfico de pontos FSC-A/SSC-A em escala logarítmica exibindo Todos os Eventos (Figura 4A). Crie um gráfico de pontos CD61-A/SSC-A em escala logarítmica exibindo Todos os Eventos (Figura 4B).
   2. Ajuste o ganho de PE (Y-585) e PerCP (B690) de acordo com o controle diário de qualidade. Defina o limiar aproximadamente para 2000 no SSC-H e para 1000 no PerCP (B690-H) para visualizar a população plaquetária. Coloque a vazão para BAIXA.
   3. Desenhe uma região entre 10³ e 10⁵ chamada "CD61⁺" para identificar a população de plaquetas.
   4. Adquira controles de coloração única para calcular a matriz de compensação e então adquira as amostras. Registre um arquivo de dados de 10.000 eventos dentro da porta "CD61⁺" (Figura 4D,E). Comece a gravar 5-10 segundos após o início da coleta da amostra.

6. Análise de citometria de fluxo da expressão superficial de TF

1. Faça um gráfico de pontos FSC-A/SSC-A em escala logarítmica exibindo Todos os Eventos (Figura 5A) e um gráfico de pontos CD41-A/SSC-A em escala logarítmica exibindo Todos os Eventos (Figura 5B).
2. Ajuste o ganho do Alexa Fluor 633 e o ganho do PE (Y-585) de acordo com o controle diário de qualidade, defina o limite aproximadamente para 1000 no SSC-H e para 2500 no PE (Y585-H) para visualizar a população plaquetária, conforme mostrado na Figura 5B. Coloque a vazão para BAIXA.
3. Desenhe uma região entre 10⁴ e 10⁵ chamada "CD41⁺" para identificar a população de plaquetas.
4. Adquira controles de coloração única para calcular a matriz de compensação e então adquira as amostras. Registre um arquivo de dados de 10.000 eventos dentro do portão "CD41⁺" (Figura 5D,E). Comece a gravar 5-10 segundos após o início da coleta da amostra.

7. Análise de plaquetas TF-positivas em plasma rico em plaquetas

1. Preparação de plasma rico em plaquetas (PRP)
   NOTA: O isolamento de plaquetas deve ser realizado em temperatura ambiente para evitar a ativação celular. Certifique-se de que a temperatura dos reagentes e instrumentos esteja entre 18 °C e 22 °C. Evite pipetear rapidamente e agitar vigorosamente durante todo o procedimento.
   1. Misture suavemente o vacainer de citrato de sódio 0,129 M 5 vezes e meça a contagem de plaquetas duas vezes em um contador de glóbulos sanguíneos para calcular a porcentagem de plaquetas recuperadas.
      NOTA: Use o valor médio das duas determinações como concentração plaquetária.
   2. Centrifuge o vacainer de citrato de sódio de 0,129 M a 100 x g por 10 min, sem freio, em temperatura ambiente (Figura 6). Colete o PRP obtido, transfira-o para um tubo de polipropileno de 10 mL e registre o volume coletado.
      NOTA: Não use tubos de poliestireno para evitar ativação plaquetária.
   3. Conte plaquetas duas vezes no PRP usando um contador de células sanguíneas e calcule a porcentagem de recuperação plaquetária da seguinte forma:
      
      NOTA: Se a recuperação for inferior a 65%, a população de plaquetas não é totalmente representativa da do sangue total. Considere descartar a preparação.
2. Preparação de amostra para análise de citometria de fluxo da expressão intracelular e TF associada à superfície em PRP
   1. Para analisar a expressão intracelular e de TF associada à superfície no PRP, utilize o mesmo protocolo descrito para análise do sangue total (veja os passos 3-6).

Resultados

Um resumo da análise de expressão de TF associada a plaquetas é descrito no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Os passos incluem: (1) Coleta de Sangue: Colete sangue da veia periférica humana, preferencialmente da veia antecubital, usando uma agulha borboleta G19 ou uma cânula de agulha sem torniquete e com vacainers contendo anticoagulantes. (2) Processamento de Amostras: Processar as amostras de acordo com o tipo de avaliação de TF a ser realizada. (3) Marcagem da Amostras: Rotule as amostras com anticorpos específicos. (4) Análise de Citometria de Fluxo: Analisar as amostras para detectar TF de superfície e intracelular.

Durante a retirada de sangue, deve-se prestar atenção especial para evitar a ativação plaquetária. Para isso, duas precauções são observadas: remover o torniquete logo após inserir a agulha na veia e descartar o sangue no primeiro aspirador extraído. Sem o uso do torniquete, a população de plaquetas, exibida em um gráfico de pontos FSC-A/SSC-A, tem uma forma típica, como mostrado na Figura 2A. Por outro lado, com o uso do torniquete, as propriedades físicas da população de plaquetas resultam em uma forma alongada que se assemelha à morfologia observada após estimulação com um agonista plaquetário clássico, como ADP (Figura 2B,C).

Experimentos realizados para avaliar a estabilidade da expressão da TF associada a plaquetas ao longo do tempo mostraram que ela permaneceu estável por 3 horas a partir da coleta de sangue (Figura 3). Ao combinar a medição da expressão da TF com a de um marcador de ativação plaquetária, como a P-selectina, recomenda-se processar a amostra de sangue o mais rápido possível para evitar a desgranulação plaquetária.

Para a análise da TF armazenada intracelularmente, o sangue total é fixado em PFA de 1%, permeabilizado com PBS-Triton e então corado com um anticorpo marcado com PE. A população de plaquetas é identificada em um gráfico logarítmic FSC-A/SSC-A (Figura 4 A,D) e por coloração αCD61 mAb (Figura 4 B,E). Resultados da análise da TF intracelular em sujeitos saudáveis (n = 377) indicaram que a TF está presente em 26,8% ± 4,8% das plaquetas circulantes (Figura 4F).

A análise por citometria de fluxo da expressão de TF associada à superfície foi realizada em condições de repouso e após estimulação celular com ADP 10 μM. A população total de plaquetas, marcada com αCD41 mAb, foi identificada em um gráfico logarítmico FSC-A/SSC-A (Figura 5A,B). Os resultados mostraram que, em sujeitos saudáveis (n = 377), a TF é expressa por 2,8% ± 1,4% das plaquetas em repouso (Figura 5D-F) e aumenta até 24,5% ± 5,8% após a ativação (Figura 5G-I). TF é expressa pelo subconjunto de plaquetas com o maior tamanho (Figura 5D,G, pontos verdes). Além disso, a análise por citometria de fluxo de imagem destaca que o sinal TF está associado apenas a eventos positivos αCD61 e não a eventos positivos a αCD45 (Figura 7).

Como mencionado anteriormente, a TF é armazenada em um subconjunto de plaquetas caracterizadas pelo maior tamanho dentro de toda a população. Portanto, é importante não perder essa fração de plaquetas durante a preparação do PRP. Seguindo as indicações fornecidas na seção de método (passo 7), é possível isolar uma população de plaquetas dentro do PRP que seja representativa daquela presente no sangue total. Como mostrado na Figura 6, o gráfico de pontos da citometria de fluxo da população plaquetária obtida por centrifugação de 100 x g de sangue total é muito semelhante ao do sangue total em termos de distribuição de FSC (Figura 6 A,B). Em contraste, usando uma força maior e tempo de centrifugação mais longo, como frequentemente relatado na literatura^{12, 14, 16}, a população de plaquetas recuperadas apresenta uma FSC menor em comparação com a do sangue total (Figura 6C), sugerindo a perda das plaquetas de maior tamanho, que são aquelas altamente TF-positivas.

Figura 1: Diagrama esquemático para análise de expressão TF associada a plaquetas e isolamento plaquetário. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Gráficos representativos de densidade da população de plaquetas analisados por citometria do fluxo sanguíneo total. (A) População de plaquetas analisada em uma amostra de sangue coletada sem torniquete ou (B) com torniquete. (C) A população de plaquetas estimulada com ADP é relatada para comparação. WBC: Glóbulos Brancos; RBC: Glóbulos Vermelhos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Estabilidade da expressão de TF associada à superfície celular ao longo do tempo. A expressão da TF associada a plaquetas em repouso foi analisada em 4 pontos diferentes após a retirada de sangue, relatada no eixo x da seguinte forma: T0 = imediatamente após a coleta de sangue; T1 = 1 h após a coleta de sangue; T2 = 2 h após a coleta de sangue; T3 = 3 h após a coleta de sangue. Os dados são reportados como média ± DS, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Análise representativa de citometria de fluxo de TF armazenada intracelularmente. A população de plaquetas (vermelho) no sangue total é identificada no gráfico de pontos FSC/SSC-A (A,D) e por coloração αCD61 mAb (B,E). A expressão da TF é analisada usando um mAb PE- αCD142/HTF1 (pontos verdes). Gráficos histogramáticos são usados para identificar eventos negativos (C) e positivos (F). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Análise de citometria de fluxo representativa de plaquetas TF-positivas associadas à superfície. O sangue total fresco é marcado com αCD142/HTF1 mAb, depois fixado com 1% de PFA e marcado com o mAb secundário e o αCD41 mAb. A população de plaquetas (vermelho) no sangue total é identificada no gráfico de pontos FSC/SSC-A (A,D,G) e pela coloração αCD41 mAb (B,E,H). A expressão da TF em condição de repouso (D-F) e após estimulação de ADP (G-I) é quantificada por meio da marcação com αCD142/HTF1 mAb (pontos verdes). Gráficos histogramáticos representativos de amostras negativas (C) e positivas (F,I) são reportados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Efeito de diferentes forças de centrifugação na preparação de PRP. (A-C) Análise de citometria de fluxo da população de plaquetas no sangue total, PRP preparado a 100 x g e a 350 x g. A faixa de referência da população de plaquetas no FSC-H/SSC-H é indicada por linhas pontilhadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Avaliação da expressão de TF em plaquetas e leucócitos por citometria de fluxo por imagem. Imagens representativas de canais de campo claro (BF, cinza), Fator Tecidular (TF, verde), αCD61 (vermelho), αCD45 (cinza), coloração de núcleos com Hoechst (magenta) e a imagem composta (fusão), adquirida com ampliação de 60x, são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

ID do tubo de amostra	Sangue total fixo/permanente (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tabela 1: Protocolo de coloração para análise de citometria de fluxo da expressão intracelular de TF.

ID do tubo de amostra	Sangue total fixo/permanente (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Sem manchas	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tabela 2: Controle por uma única coloração para a matriz de compensação da expressão intracelular de TF.

ID do tubo de amostra	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangue total fresco (μL)	PFA 1% (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Descanso	87.5	7.5	-	5	300
ADP ativado	82.5	7.5	5	5	300

Tabela 3: Protocolo de coloração para análise de citometria de fluxo da expressão superficial de TF.

ID do tubo de amostra	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Descanso	90	5	5
ADP ativado	90	5	5

Tabela 4: Protocolo secundário de coloração de anticorpos para análise de TF associada à superfície.

ID do tubo de amostra	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Sangue total fresco (μL)	PFA 1% (μL)
Sem manchas	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tabela 5: Preparação da matriz de compensação para análise intracelular de TF.

ID do tubo de amostra	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Sem manchas	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tabela 6: Preparação da matriz de compensação para análise TF associada à superfície.

Discussão

Este manuscrito relata protocolos detalhados para a avaliação de plaquetas TF-positivas por citometria de fluxo sanguíneo total, levando em conta a análise da proteína expressa tanto dentro quanto na superfície das plaquetas.

Nos últimos 20 anos, a presença de TF nas plaquetas humanas foi bem^estabelecida 1,2,3,4,5,17,18. Um subconjunto de plaquetas, que representa 20%-30% da população total de^{plaquetas circulantes 2}, expressa a proteína, reforçando o conceito de heterogeneidade plaquetária que está se tornando cada vez mais relevante no^{campo 19,20}. Vale mencionar que as plaquetas TF-positivas possuem um volume médio alto de plaquetas, como já demonstrado anteriormente pela citometria de fluxo de imagem^{altamente sensível 2}. É de extrema importância considerar essa característica, especialmente quando a expressão da TF precisa ser analisada em plaquetas isoladas dos outros componentes das células sanguíneas. É possível, de fato, que a etapa de centrifugação usada para isolamento de plaquetas possa resultar na perda de plaquetas^{de grande porte 2}. Essa questão pré-analítica provavelmente é um dos principais fatores da controvérsia – que durou até alguns anos atrás – sobre a presença de TF nas^{plaquetas 7, 12 e 13}. A citometria do fluxo sanguíneo total é uma abordagem extremamente útil nesse sentido, permitindo a análise de todos os subconjuntos de plaquetas sem a necessidade de isolá-los.

Um segundo motivo que fomentou a discussão sobre a presença de TF nas plaquetas foi a escolha do anticorpo anti-TF humano usado na análise. Existem muitos anticorpos comercialmente disponíveis que têm sido usados para avaliação de TF associada a plaquetas e que reconhecem diferentes epítopos da proteína. Alguns anticorpos, como os clones TF9-10H10 3,21,22 e ^{VIC7 1,3}, se ligam a uma região não funcional da TF sem afetar a ligação do FVII/FVIIa. Outros anticorpos, incluindo os clones^{VD8 1,2,3} e^{HTF11 18} – estes últimos usados nos protocolos atuais – reconhecem o sítio catalítico da proteína, competindo com o FVII/FVIIa pela ligação à TF, bloqueando assim sua função procoagulante. É importante notar que, dependendo do estado de glicosilação do domínio extracelular e da conformação do sítio catalítico da TF²³, que pode ser modificada em condições específicas (como ativação celular ou doença), alguns desses anticorpos podem ser diferencialmente capazes de reconhecer, por citometria de fluxo, a expressão superficial da TF associada a plaquetas. Além disso, as condições de coloração, ou seja, se a amostra a ser analisada é fresca, fixa e/ou permeabilizada, podem afetar a conformação do epítopo e, assim, a ligação^{antígeno-anticorpo 14}.

Outra consideração que merece atenção é a escolha do fluorocromo ligado ao anticorpo. Como a TF é expressa por apenas 20%-30% da população de plaquetas, fluorocromos de baixa emissão, juntamente com o uso de citometros de fluxo de baixa sensibilidade, podem não ser adequados para discriminar sinais positivos baixos. Por essa razão, anticorpos marcados com fluorocromos brilhantes, como PE ou APC, são preferíveis. É importante notar, no entanto, que o grande tamanho de um fluorocromo como o PE pode dificultar a ligação do anticorpo marcado à proteína²⁴. Para superar esse problema, no protocolo atual, a coloração superficial com TF foi realizada como uma marcação indireta com um αCD142/HTF1 mAb não conjugado, depois revelada por meio do uso de um anticorpo secundário. A obstrução estérica da PE não afeta a ligação do αCD142/HTF1 mAb ao TF armazenado intracelularmente, onde o local catalítico é mais acessível à ligação de anticorpos. É claro que a avaliação da expressão superficial da TF associada a plaquetas por marcação direta, em comparação com a indireta, seria preferível — se possível — para reduzir o tempo de processamento da amostra. Essa abordagem, no entanto, deve levar em conta as questões críticas mencionadas acima e relacionadas à capacidade de ligação dos vários anticorpos comercialmente disponíveis contra a TF plaquetária, devido à conformação da própria proteína, ou às condições de coloração, bem como ao obstáculo estérico dos diferentes fluorocromos utilizados. Portanto, para evitar resultados falsos negativos, a marcação direta da TF associada a plaquetas expressas na superfície requer um processo obrigatório de otimização cuidadosa. Esses aspectos são tema de um estudo em andamento com o objetivo de avaliar a eficiência da coloração direta com os diferentes clones de anticorpos comercialmente disponíveis marcados com fluorocromos em uso completo.

Vários estudos mostraram que a expressão da TF é elevada em várias condições patológicas caracterizadas por alto risco trombótico 8,9,10,11,17. Recentemente, foram apresentadas evidências de que níveis de plaquetas TF-positivas, quantificados com precisão por análise de citometria de fluxo, podem identificar pacientes cardiovasculares que, apesar de uma resposta ótima ao tratamento medicamentoso com aspirina e antagonistas P2Y₁₂, mantêm alto risco trombótico²⁵. De fato, a TF associada a plaquetas é funcionalmente ativa e, portanto, potencialmente capaz de suportar a geração^{de trombina 1,3,4}. Nesse contexto, a capacidade de realizar análise de citometria de fluxo em alguns microlitros de sangue é uma vantagem significativa que permite que a análise TF associada a plaquetas seja estendida ao ambiente clínico. Para isso, vale mencionar que a validação da medição de TF associada a plaquetas por citometria de fluxo tem sido o objetivo de um projeto internacional que recentemente coordenamos, com o apoio da Sociedade Internacional de Hemostáse e Trombose, para fornecer orientações metodológicas para sua avaliação.

Ao contrário de outros marcadores clássicos de ativação plaquetária, como a P-selectina e os agregados plaquetários-leucócitos, que precisam ser analisados imediatamente após a coleta de sangue para evitar artefatos, a expressão da TF é muito mais estável. Na verdade, a amostra de sangue pode ser processada em poucas horas após a retirada sem qualquer alteração significativa na expressão da plaqueta-TF; Além disso, a possibilidade de fixar a amostra e marcá-la/processá-la posteriormente torna essa análise adequada para muitos hospitais/laboratórios. É notável que, embora o protocolo descrito neste manuscrito seja relativamente simples de executar, a técnica de citometria de fluxo ainda requer treinamento técnico especializado. Por essa razão, a tecnologia está avançando para o desenvolvimento de citometros cada vez mais simples destinados a ensaios de ponto de atendimento.

Em conclusão, o protocolo proposto fornece métodos para a análise correta da TF associada a plaquetas, enfatizando as vantagens de uma técnica baseada em análise de citometria de fluxo para sua determinação. Além disso, destaca as variáveis pré-analíticas que podem influenciar a análise dessa proteína, enfatizando as medidas a serem tomadas para evitá-las.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenosina 5'-difosfato (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Agonista de plaquetas
Alexa Fluor 633 cabra α-mouse IgG	Invitrogen	A21052	Anticorpo secundário
Biotubo 10 mL	Biosigma	BSP048	Para coleta de PRP
Agulha Borboleta G19	Solução PIC	02044019030010	Para retirada de sangue
CytExpert Software	Beckman Coulter		Análise de dados de citometria de fluxo
Cytoflex S	Beckman Coulter		Citômetro de fluxo
Tubos Eppendorf 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	Fixação sanguínea
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Citômetro de fluxo de imagem
Kaluza Software	Beckman Coulter		Análise de dados de citometria de fluxo
Paraformaldeído	Antibióticos e ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Para consertar sangue e plaquetas
PerCP-& alfa; CD45	BD	345809	Marcador populacional de leucócitos
PerCP-& alfa; CD61	BD	347408	Marcador de palotecária
PE-α CD142	BD	550312	Anticorpo anti-fator tecidual humano
PE-α CD41	Beckman Coulter	A07781	Marcador de palotecária
Soro tampão de fosfato (PBS) 1x sem cálcio e magnésio	Gibco	10010-015	Para anticorpos e diluição da amostra
Pontas de pipeta 10 & micro; L	Gilson & nbsp;	F161630	Para preparar amostras
Pontas de pipeta 1000 & micro; L	Gilson	F161670	Para preparar amostras
Pontas de pipeta 200 & micro; L	Gilson	F161930	Para preparar amostras
Tubo de fundo redondo 5 mL	Corning	352052	Para aquisição de citômetro de fluxo
Cloreto de sódio 0,9 %	BD	306575	Para lavar a cânula de agulha após a retirada de sangue
Sysmex XN-450	Dasit		Analisador de células sanguíneas
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Para permeabilizar a membrana das células sanguíneas
Tubos de citrato de vácuo 0,129M	BD	363079	Para coleta de sangue
Tubos Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Para coleta de sangue
Adaptador Luer de múltiplas amostras Vacutainer	BD	367300	Para retirada de sangue
Porta-vacainer de um uso	BD	364815	Para retirada de sangue
Kit de contas de captura de anticorpos Versacomp	Beckman Coulter	B22804	Titulação de anticorpos
α CD142 (clone HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Anticorpo anti-fator tecidual humano