Artigo de método

Análise Comparativa de Cariótipos de Populações de Ervas Lycoris aurea Usando Bandas de Fluorocromo e 45S e 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

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29 de novembro de 2024

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1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo investiga a distribuição da heterocromatina em oito populações de Lycoris aurea (L′Her) Herb, usando coloração combinada dos cromossomos PI e DAPI, hibridização in situ fluorescente (FISH) com regiões do gene 18S-5.8-26S rRNA (regiões 45S rDNA) e sondas de DNA ribossômico 5S.

Resumo

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Para entender a variação do cariótipo em oito populações, cariótipos detalhados foram meticulosamente estabelecidos usando medições cromossômicas, bandas de fluorescência e sinais de rDNA FISH. O número de sítios 45S rDNA varia de um a cinco pares por população, sendo o número mais comum por cariótipo quatro pares. O locus 45S rDNA está predominantemente localizado nos braços curtos e nas regiões terminais dos cromossomos, enquanto o locus 5S rDNA é encontrado principalmente no braço curto e nas regiões terminais ou proximais. As populações HBWF, HNXN, HBBD e HNZX mostraram uma distribuição semelhante de sítios de rDNA 45S, assim como GXTL, HBFC e SCLS, indicando uma estreita relação entre populações com distribuições de sítios de rDNA 45S semelhantes. Os cariótipos de todas as populações estudadas são simétricos, compreendendo centrômeros estáveis e metaestáveis ou centrômeros exclusivamente estáveis. Os gráficos de dispersão de MCA e CVCL distinguem efetivamente suas estruturas cariotípicas. A análise inclui seis parâmetros quantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Além disso, os resultados indicam que o PCoA baseado nesses seis parâmetros é um método robusto para determinar as relações do cariótipo biológico entre as oito populações. O número de cromossomos nas populações de Lycoris é x = 6-8. Com base no estudo e na literatura atuais, a diferenciação genômica dessas populações é discutida em termos de tamanho do genoma, heterocromatina, sítios de rDNA 45S e 5S e assimetria de cariótipo.

Introdução

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Lycoris é uma família que inclui várias plantas hortícolas importantes1. Lycoris aurea (L'Hér.) Erva. é uma planta medicinal tradicional chinesa com uma longa história. A análise fitoquímica mostrou que Lycoris aurea (L'Her.) A erva contém galantamina e outros alcalóides, que podem aumentar a sensibilidade à acetilcolina e têm o potencial de tratar a doença de Alzheimer como inibidores da colinesterase.

Em plantas superiores, a análise do cariótipo é crucial para integrar mapas genéticos e físicos, com implicações práticas significativas para a biologia vegetal. Essa análise permite a caracterização do genoma em nível cromossômico, esclarecimento das relações taxonômicas celulares entre populações, identificação de aberrações genéticas e compreensão das tendências de evolução cromossômica 3,4,5. Normalmente, uma descrição de cariótipo inclui número de cromossomos, comprimentos cromossômicos absolutos e relativos, localizações de constrição primária e secundária, distribuição de fragmentos heterocromáticos, números e localizações de locais de rDNA e outras características da sequência de DNA, bem como assimetria de cariótipo 6,7,8. Entre os parâmetros cariotípicos, a assimetria é determinada por variações no comprimento cromossômico (assimetria intercromossômica) e na posição do centrômero (assimetria intracromossômica). A assimetria cariotípica é uma característica significativa que reflete a morfologia cromossômica e é amplamente utilizada na taxonomia de células vegetais 9,10,11,12.

Muitas vezes, a ausência de marcadores cromossômicos limita a análise do cariótipo e impede a identificação de cromossomos individuais. Nos últimos anos, a coloração de Giemsa, a banda de fluorescência e a hibridização in situ de fluorescência (FISH) tornaram-se populares na análise de cromossomos de plantas. Métodos de coloração fluorescente dupla, como a coloração CMA (cromomicina A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenilindo) e a coloração PI (iodeto de propila) / DAPI (conhecida como coloração CPD), revelam regiões heterocromáticas ricas em GC e ricas em AT nos cromossomos 4,13. Durante a metáfase ou paquiteno da mitose vegetal, sequências repetidas de DNA ou longos segmentos de DNA podem gerar sinais específicos em populações de plantas por meio da hibridização FISH 14,15,16.

Bandas fluorescentes e sinais FISH fornecem marcadores úteis para a identificação de cromossomos. Medindo o comprimento do cromossomo, analisando as características da banda de fluorescência e comparando as diferenças do sinal FISH, cariótipos citogenéticos moleculares detalhados de diferentes germoplasmas ou populações de plantas podem ser construídos. Esses cariótipos exibem efetivamente a morfologia cromossômica em vários germoplasmas ou populações, permitindo comparações da distribuição da heterocromatina e localização da sequência de DNA e incentivando pesquisas futuras 4,8,17. As comparações de cariótipos citogenéticos moleculares podem oferecer informações valiosas sobre as relações filogenéticas e a evolução cromossômica de populações relacionadas 8,14,18,19.

O gênero Lycoris , um grupo diversificado e intrigante dentro da família Amaryllis, é conhecido por seus bulbos perenes. Composto por aproximadamente 20 espécies, 15 das quais são endêmicas da China, apresenta uma rica biodiversidade. Este gênero é encontrado exclusivamente em regiões temperadas e subtropicais quentes do leste da Ásia, incluindo sudoeste da China, sul da Coréia e Japão, com algumas populações que se estendem ao norte da Índia e Nepal20. Os primeiros estudos citogenéticos envolveram principalmente a contagem de cromossomos para estabelecer o número cromossômico básico do gênero e descrever a morfologia cromossômica em populações específicas, concentrando-se principalmente em Lycoris radiata21. O número total de cromossomos observados neste gênero varia de 12 a 33 ou 44, representando níveis diplóides, diplóides anormais, triploides, tetraplóides e aneuploides, respectivamente. Os números cromossômicos básicos, x, são 6, 7, 8 e 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, uma espécie notável dentro do gênero Lycoris , é amplamente distribuída por toda a China22. Ele prospera em ambientes relaxados e úmidos e se reproduz através de pequenos bulbos. Essas lâmpadas, contendo licorina e galantamina - dois compostos medicinais importantes - têm sido usadas na medicina tradicional chinesa há séculos. Lycoris aurea também cativa os horticultores com suas impressionantes flores vermelhas no outono e folhas perenes no inverno. No entanto, a semelhança morfológica entre todos os Lycoris aurea (L'Hér.) estudados As populações de ervas apresentam um desafio significativo para a identificação cromossômica usando métodos citológicos convencionais.

A clonagem de FISH, fosmídeo ou BAC (cromossomos artificiais bacterianos) com sequências repetitivas de DNA e sondas de oligonucleotídeos em cromossomos metafásicos ou paquidérmicos tem sido usada para análise de cariótipo23,24,25, análise citogenética comparativa26,27, construção de mapa citogenético28,29 e ensaios cromossômicos específicos30. Recentemente, a técnica FISH tem sido aplicada à análise cromossômica de populações de Lycoris 31. Embora o número de cromossomos e o cariótipo variem nas populações de Lycoris, o número total de cromossomos permanece constante, com três tipos básicos observados: o cromossomo do centrômero central (M-), o cromossomo do centrômero distal (T-) e o cromossomo do centrômero proximal (A-). Além disso, diversas formas e tamanhos cromossômicos são observados em populações naturais32.

A hibridização in situ de fluorescência de RNA (FISH) é útil para detectar alterações cromossômicas, como fusão de centrômeros, inversão, amplificação de genes e deleção de fragmentos. A tecnologia de hibridização in situ fluorescente (RNA-FISH) permite a análise visual de alta resolução dos cromossomos para detectar e identificar múltiplas alterações complexas, incluindo a fusão de regiões centrais cromossômicas, formação de novas estruturas cromossômicas, reversão de regiões cromossômicas, amplificação de genes ou fragmentos de genes e perda de sequência gênica em regiões cromossômicas específicas33. Cinco dos 500 clones mostraram fortes sinais de FISH na região do centrômero do cromossomo do centrômero central (M-), mas não no cromossomo do centrômero distal (T-) 34 . O padrão único de distribuição de sinal FISH em cada cromossomo permitiu a identificação de cromossomos individuais, o que anteriormente era um desafio em populações de Lycoris usando métodos tradicionais de coloração31. Atualmente, existem poucos estudos sobre a citogenética molecular de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, enfatizando a necessidade urgente de mais pesquisas neste campo.

Neste estudo, oito cromossomos metafásicos bem diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) As populações de ervas foram preparadas usando métodos de imersão enzimática e secagem por chama (EMF). A coloração CPD e as sondas 45S e 5S rDNA foram usadas para identificação de FISH. Cariótipos citogenéticos moleculares detalhados dessas populações foram construídos usando dados combinados de medições cromossômicas, bandas fluorescentes e sinais FISH de rDNA 45S e 5S. Seis diferentes índices de assimetria cariotípica foram calculados para cada população para identificar relações cariotípicas entre eles. A avaliação dos dados do cariótipo citogenético molecular forneceu informações significativas sobre a diferenciação genômica e as relações evolutivas das oito populações, potencialmente remodelando a compreensão dos cromossomos de Lycoris .

Protocolo

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Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão detalhados na Tabela de Materiais, enquanto as sondas empregadas são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

1. Preparação dos cromossomos apicais

  1. Crie raízes pela hidroponia. Após a retirada da parte aérea do bulbo, coloque-o em uma garrafa cônica cheia de água, repondo a água a cada 3 dias, seguindo o método descrito por Song et al.35.
  2. Extirpar as pontas das raízes em crescimento ativo quando atingirem aproximadamente 1,0-2,0 cm de comprimento e tratá-las com α-bromonaftaleno saturado a 28 °C por 1,0 h.
  3. Corte as pontas das raízes em cerca de 1 cm e coloque-as em uma mistura recém-preparada de metanol e ácido acético glacial em uma proporção de volume de 3:1 à temperatura ambiente (cerca de 20-25 °C) por 2-3 h. Em seguida, armazene-os em geladeira a 4 °C, conforme descrito por She et al.36.
  4. Lave bem as pontas das raízes fixas (2-3 mm) em água bidestilada
  5. Prepare uma mistura de celulase e pectina hidrolase em tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,01 mM a pH 4,5, com celulase e pectina hidrolase cada uma a 1%. Coloque as pontas das raízes pré-tratadas na mistura e digerir a 28 °C durante 1,0-1,5 h.
  6. Lave as pontas das raízes digeridas com água bidestilada
  7. Seque as lâminas sobre a chama de uma lâmpada de álcool até que a névoa de água desapareça. Sob um microscópio de contraste de fase, selecione lâminas com mais de cinco fases divididas e sem cromossomos sobrepostos. Armazene as lâminas a -20 °C para uso futuro.

2. Coloração CPD

  1. Prepare uma solução de CPD adicionando PI e DAPI a um atenuador antifluorescência a 30% (v/v), onde a concentração de PI é de 0,6 μg·mL-1 e a concentração de DAPI é de 3 μg·mL-1.
  2. Secar a lâmina cromossómica a 65 °C durante 30 min.
  3. Adicione 100 μL de diluente RNase A (a solução de armazenamento de RNase A diluída 100 vezes com 2x SSC (citrato de sódio salino), resultando em uma concentração final de 100 μg / mL) por lâmina cromossômica. Cubra a lâmina e aqueça-a em uma câmara úmida a 37 °C por 30-60 min.
  4. Lave a lâmina cromossômica com 2x SSC em temperatura ambiente por três intervalos de 5 min cada.
  5. Lave a lâmina cromossômica em temperatura ambiente por 1-2 min.
  6. Adicione 200 μL de diluente de pepsina (a solução de armazenamento de pepsina diluída 100 vezes com 0,01 N HCl para atingir uma concentração final de 5 μg / mL) por lâmina cromossômica. Cubra a lâmina e incube-a em uma câmara úmida a 37 ° C por 5-20 min.
  7. Lave as seções cromossômicas com água ultrapura em temperatura ambiente por 2 min, seguida de lavagem com 2 xSSC em temperatura ambiente por dois intervalos de 5 min cada.
  8. Fixe as lâminas com metanol: solução de ácido acético glacial (3:1) por 10 min.
  9. Lave com 2x SSC em temperatura ambiente por três intervalos de 5 min cada.
  10. Trate com etanol 70%, 95% e 100% a -20 °C por 5 min cada e depois seque em temperatura ambiente.
  11. Pegue as lâminas cromossômicas tratadas e secas, adicione 30 μL de solução de coloração CPD a cada lâmina, cubra com uma lamínula de 24 mm x 50 mm e pinte no escuro por mais de 30 min. O material cromossômico extenso deve ser corado durante a noite.
  12. Observe as lâminas cromossômicas sob um microscópio de fluorescência, usando um filtro de excitação verde (WG) para coloração PI e um filtro ultravioleta (UV) para coloração DAPI. Capture imagens com o software compatível.
    1. Ajuste o tempo de exposição através dos dois filtros para obter intensidades de fluorescência vermelha e azul semelhantes durante a captura de imagem. A imagem CPD é obtida a partir das imagens em tons de cinza coradas com PI e DAPI. As medidas cromossômicas e o processamento das imagens foram realizados no software Adobe Photoshop.

3. Hibridização in situ de fluorescência

  1. Prepare a solução híbrida: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) e 50% de sulfato de glucano (4 μL). Após a preparação, centrifugue a solução híbrida (2500 x g, 5-10 min, à temperatura ambiente) e coloque-a sobre gelo.
  2. Coloque as lâminas digitalizadas no forno a 65 °C por 30-60 min.
  3. Remova as lâminas cozidas, adicione 100 μL de solução de desnaturação FAD a 70%, cubra com uma lamínula e desnature em um forno de hibridização molecular a 85 ° C por 2,5 min.
  4. Remova a lamínula e mergulhe imediatamente as lâminas em etanol frio 70%, 90% e 100%, desidratando sucessivamente por 5 min cada.
  5. Remova as lâminas e deixe-as secar em temperatura ambiente por mais de 30 min.
  6. Adicione 20 μL de solução híbrida à lâmina, coloque suavemente a lamínula por cima até que o líquido esteja completamente difundido e deixe-a em temperatura ambiente por 10 min para umedecer a área coberta da lâmina.
  7. Colocar as lâminas numa placa híbrida embebida em 2× SSC (a placa híbrida deve ser uma placa de Petri grande com uma tampa envolvida em folha de estanho para facilitar a operação ao abrigo da luz) e incubar a 37 °C durante a noite (durante pelo menos 6 h).
  8. Contra-corar os cromossomos montando-os com 3 μg · mL-1 DAPI em uma solução a 30% (v / v) de Vectashield H-100. Capture a imagem usando um software compatível, com a fluorescência azul do DAPI excitada pela luz roxa do filtro e a fluorescência vermelha do PI excitada pela luz verde, respectivamente.
    NOTA: A hibridização de FISH foi realizada usando sondas de rDNA 45S e 5S em lâminas previamente coradas com CPD, seguindo o método descrito por She et al.36.

4. Análise de cariótipo

  1. Selecione cinco células mitóticas metafásicas para cada população em que os cromossomos estejam bem dispersos (sem sobreposição) e moderadamente condensados (os cromossomos não devem ser agregados ao máximo, mas as extremidades não devem ser agrupadas), seguindo a metodologia descrita por She et al.4.
  2. Determine o comprimento absoluto de cada cromossomo selecionando cinco cromossomos com a maior concentração durante a divisão celular.
  3. Meça meticulosamente e com precisão o comprimento do braço longo (L) e do braço curto (S) de cada cromossomo, bem como o tamanho de cada banda de pigmento fluorescente no cromossomo.
  4. Calcule os seguintes parâmetros: (1) comprimento relativo do cromossomo (RL, porcentagem haplóide); (2) relação braço (AR = L/S, braço longo/braço curto); (3) comprimento total do cromossomo haploide (TCL; comprimento do cariótipo); (4) comprimento cromossômico médio (C); (5) tamanho da banda de fluorescência (a porcentagem da banda de fluorescência em relação ao comprimento do cromossomo); (6) distância do centrômero ao sítio do rDNA; (7) índice médio de centrômero (IC, calculado como o comprimento do braço curto de cada cromossomo dividido pelo comprimento total desse cromossomo, calculando a média desses valores); (8) quatro indicadores diferentes de assimetria do cariótipo, incluindo o índice de centrômero (CVCI), coeficiente de variação (CV), coeficiente de variação do comprimento do cromossomo (CVCL), coeficiente de assimetria média do centrômero (MCA) e categoria de assimetria de Stebbins.
    NOTA: Consulte os métodos de Paszko10 e Peruzzi et al.11 para calcular o índice de assimetria. Classifique os cromossomos com diferentes proporções de braço de acordo com os cinco métodos de classificação de Levan. Organizar os cromossomas de Lycoris aurea (L'Hér.) Erva em ordem decrescente de comprimento, conforme descrito no protocolo de Han et al.37.
  5. Garantir a precisão e exatidão da metodologia desenhando padrões de cariótipo cromossômico com base em dados de medição cromossômica combinados com informações de banda de fluorescência e a posição e tamanho do rDNA-FISH.
  6. Visualizar as relações assimétricas do cariótipo das oito populações é uma etapa fundamental que fornece insights claros. Isso é conseguido por meio de gráficos de dispersão bidimensionais, que são usados para obter seu MCA e CVCL.
  7. Realizar a análise de coordenadas principais (PCoA) usando o coeficiente de similaridade de Gower, um componente crucial, seguindo os métodos de She et al.38.
  8. Calcule seis parâmetros quantitativos (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) para determinar os cariótipos citogenéticos das oito populações.
  9. Realize análises estatísticas usando um programa de análise e visualização de dados para gerar o dendrograma baseado em UPGMA e o gráfico de dispersão de PCoA.

Resultados

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Empregando o método meticuloso de imersão enzimática e secagem por chama (EMF), cromossomos metafásicos dispersos e bem diferenciados de Lycoris aurea (L'Hér.) Herb foram obtidos, e o cariótipo cromossômico citogenético de Lycoris aurea foi construído (Figura 1). Os cromossomos metafásicos com maior grau de condensação são inadequados para análise de cariótipo devido às diferenças morfológicas reduzidas. No entanto, como o comprimento total dos cromossomos haplóides (TCL) é comparável entre as populações, é possível distinguir os cariótipos de diferentes populações de Lycoris aurea comparando as diferenças nos valores de TCL. As características cariódicas e o conteúdo de DNA nuclear de oito populações de Lycoris aurea são mostrados na Tabela 1. A distribuição das bandas de fluorescência e as localizações dos sítios 45S e 5S rDNA são apresentadas na Tabela 2. A Figura 2 exibe as medições dos cromossomos junto com as características de bandas de fluorescência e a localização e tamanho dos sinais FISH de rDNA 45S e 5S.

Os números cromossômicos diplóides são os seguintes: 2n = 16 = 8m + 8t para GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t para HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t para GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t para HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t para HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t para HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t para HBWF e 2n + 1 = 15 = 7m + 8t para SCLS (Tabela 1). Conforme descrito no protocolo de She et al.4, os cromossomos metafásicos das oito populações de L. aurea são pequenos, com comprimentos cromossômicos médios variando de 1,01 μm (HNZX) a 2,08 μm (GZDS) e um TCL variando de 16,14 μm (HNZX) a 29,13 μm (GZDS). Os TCLs das oito populações se correlacionam com o conteúdo de DNA nuclear relatado (Tabela 1). A menor faixa de comprimento relativo (RRL) é observada em HNXN (1,52-3,81), enquanto a maior é observada em GZDS (2,73-5,86). As populações HNXN e GZDS exibiram a menor e a maior variação no comprimento cromossômico, respectivamente. O índice médio do centrômero (IC) do genoma variou entre 61,02 ± 5,63 (população HBFC) e 70,70 ± 4,63 (população HBWF). A população HBFC apresentou a menor mudança no índice de centrômero, enquanto a população HBWF exibiu as mudanças mais extensas.

Os cariótipos são compostos por cromossomos metacêntricos (m) e telocêntricos (t) (Tabela 1; Figura 2), representando as formas cromossômicas mais comuns entre as oito populações estudadas. Os oito diferentes índices de assimetria do cariótipo são fornecidos na Tabela 1. Dentre esses índices, o coeficiente de variação do índice de centrômero (IVCV) e a assimetria média do centrômero (ACM) caracterizam a assimetria intracromossômica, enquanto o coeficiente de variação do comprimento cromossômico (CVCL) mede a assimetria intercromossômica. Os intervalos para ICVC e ACM são os seguintes: ICVC = 10,97 (HBBD) a 18,25 (HBWF) e MCA = 28,85 (HNZX) a 39,30 (HBWF). Esses valores indicam consistentemente que o HBBD tem a menor assimetria intracromossômica e o HBWF tem a maior assimetria intracromossômica. O intervalo para CVCL é de 14,98 (GZDS) a 23,32 (HBWF), sugerindo que GZDS exibe o cariótipo menos assimétrico, enquanto HBWF exibe o cariótipo mais assimétrico entre as oito populações. De acordo com os princípios de classificação de Stebbins9, esses cariótipos pertencem à classe 1B, indicando que todas as populações estudadas possuem cariótipos relativamente simétricos.

As relações de assimetria cariotípica entre os oito Lycoris aurea (L'Hérit.) As populações de ervas são ilustradas usando gráficos de dispersão bidimensionais de CVCI versus CVCL e MCA versus CVCL (Figura 3). A estrutura cariotípica dessas populações, conforme revelado pelos três pares de parâmetros - CVCI, CVCL e MCA - tem implicações significativas. Esses parâmetros demonstram assimetrias cariótipos semelhantes. Os resultados dos gráficos de dispersão destacam o impacto potencial da pesquisa, mostrando que a população HNXN tem o cariótipo mais simétrico, enquanto as populações HBFC e HBWF exibem as assimetrias mais intracromossômicas e intercromossômicas, respectivamente (Figura 3).

Este estudo categorizou meticulosamente as oito populações de Lycoris aurea em três grupos principais com base no diagrama de árvore UPGMA com cinco parâmetros de cariótipo (Figura 4). O primeiro cluster, representado pela população SCLS, forma um clado independente. O segundo grupo é composto por HNXN e HBWF. O terceiro cluster é dividido em dois subgrupos: um contém apenas a população HBFC, enquanto o outro inclui as populações HBWF, GZDS e GXTL, com a população HBBD e GZDS agrupadas em um ramo menor. As relações cariológicas entre as populações estudadas, reveladas pela análise de coordenadas principais (PCoA), são ilustradas na Figura 5. O gráfico de dispersão do PCoA indica que as oito populações podem ser divididas em dois grupos com nível de confiança de 68,36%. O primeiro grupo inclui HBWF, HBBD e GXTL, com as três primeiras populações agrupadas. O segundo grupo é composto por HBFC, HNXN, HNZX e SCLS, onde o HBFC ocupa a posição intermediária entre os dois grupos, e o SCLS é posicionado mais isolado (Figura 5).

A coloração reversa CPD (combinação de iodeto de propídio e DAPI) e DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) são técnicas padrão usadas para observar a estrutura nuclear e a distribuição da cromatina. Os resultados deste estudo revelaram fenômenos aparentes de heterocromatina entre oito populações de Lycoris aurea (L'Hérit.) Erva (Figura 1 e Figura 2; Tabela 2). Os resultados da hibridização FISH para cada população indicaram que todas as regiões cromossômicas correspondem aos loci 45S e 5S rDNA. As características das bandas de CPD são ilustradas na Figura 1A,C,E,G,I,K,M,O.

Nas populações HBFC e HBBD, bandas de CPD foram observadas nas regiões centromérica e pericentromérica (Figura 1G,K; Figura 2D, F). No entanto, certos cromossomos não exibiram bandas de CPD: o 3º e o 8º cromossomos em SCLS, o 1º cromossomo em HNXN, o 1º cromossomo em HNZX, o 1º cromossomo em HBWF, o 2º cromossomo em GZDS e o 2º cromossomo em GXTL (Figura 1A,C,E,I,J,M,O; Figura 2A-C,E,G,H). Notavelmente, as bandas de CPD também foram encontradas nos terminais dos braços curtos dos pares cromossômicos 5, 6 e 7 em SCLS e HNXN, nos pares 4, 5, 6, 7 e 8 em HNZX e nos pares 5, 6 e 7 em HBFC. Além disso, as bandas de CPD estavam presentes nas extremidades curtas dos cromossomos 4, 5, 6, 7 e 8 em HBWF, nas extremidades curtas dos cromossomos 5, 6 e 7 em HBBD e nas extremidades curtas dos cromossomos 5, 6, 7 e 8 em GXTL (Figura 1A e Figura 2A).

Após a hibridização FISH, a coloração reversa DAPI formou bandas fluorescentes brilhantes ao redor das partículas cêntricas dos cromossomos 5, 6 e 7 em GZDS. Essas bandas, denominadas bandas DAPI+ pós-FISH, indicam que essas regiões de heterocromatina contêm um alto número de pares de bases A-T (Figura 2G). A faixa de bandas de CPD (peri)centroméricas observadas nas oito populações foi de 25,00% a 57,14% (Tabela 2), enquanto a quantidade total de bandas de CPD terminais variou de 40,00% a 71,43% (Tabela 2). Na população GZDS, as bandas pós-FISH DAPI+ correlacionaram-se com o comprimento do cariótipo, representando 42,86% do total. Os tamanhos das bandas CPD de rDNA, bandas de CPD não rDNA e bandas DAPI+ após FISH diferiram significativamente entre os vários pares de cromossomos de Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb (Figura 2; Tabela 2).

A técnica FISH foi usada para inserir sondas de rDNA 45S e 5S em cromossomos corados com CPD, conforme ilustrado na Figura 1. O resumo do número e localização dos sítios 45S e 5S rDNA nas oito populações de Lycoris aurea (L'Hérit.) A erva é apresentada na Tabela 2 e representada na Figura 2. Notavelmente, diferenças significativas no número, tamanho e localização dos loci de rDNA entre as oito populações destacam a importância desses achados. No total, havia 30 loci de rDNA 45S nas oito populações. Destes, 4 loci (13,33%) estavam situados na região do centrômero central, 9 (30,00%) na região do centrômero próximo ao centro e 17 (56,67%) nas regiões terminais de seus respectivos braços cromossômicos (Figura 2; Tabela 2).

Na população GXTL, um sinal de locus de rDNA 45S foi encontrado na região do centrômero do braço curto do cromossomo 4, enquanto quatro sinais adicionais foram localizados na região do centrômero dos braços longos dos cromossomos 5, 6, 7 e 8 (Figura 1P; Figura 2G). Na população HBFC, um locus de rDNA 45S foi posicionado na região do centrômero no braço curto do cromossomo 4, com três loci encontrados em regiões de heterocromatina pericentromérica nos braços curtos dos cromossomos 5, 6 e 8 (Figura 1H; Figura 2D). Na população GZDS, um locus 45S estava localizado na região do centrômero do braço curto do cromossomo 4 metacêntrico (Figura 1N; Figura 2G). No HNZX, cinco loci de rDNA 45S foram observados nas áreas terminais dos braços curtos dos pares cromossômicos 4, 5, 6, 7 e 8 (Figura 1H; Figura 2D). A distribuição dos sítios 45S no HBBD (Figura 1J; Figura 2E) e HNXN (Figura 1L; Figura 2F) foi semelhante, com um locus na região do centrômero do braço curto do cromossomo 4 e três loci na região do centrômero dos braços curtos dos cromossomos 5, 6 e 7.

No HBWF, cinco sinais de loci de rDNA 45S apareceram nas regiões do centrômero do braço curto dos pares cromossômicos 4, 5, 6, 7 e 8 (Figura 1N; Figura 2G). No SCLS, um sinal de locus de rDNA 45S foi encontrado nas regiões do centrômero do braço curto dos pares cromossômicos 1 e 2, bem como nas regiões pericentroméricas dos braços curtos dos pares cromossômicos 5 e 6 (Figura 1P; Figura 2H). Para os loci de rDNA 5S, um total de nove foram identificados nos oito táxons, sendo 3 (33,33%) localizados nas regiões proximais, 3 (33,33%) nas regiões pericentroméricas e 3 (33,33%) nas regiões terminais dos respectivos braços cromossômicos (Figura 2; Tabela 2). No GXTL, um sinal de locus 5S rDNA apareceu perto da extremidade terminal do braço longo do par cromossômico 6 (Figura 1P; Figura 2G). A distribuição dos sítios 5S foi semelhante no HBFC (Figura 1H; Figura 2D) e GZDS (Figura 1N; Figura 2G), ambos contendo um locus 5S rDNA na região proximal do braço curto do cromossomo 7. Em HNZX, um locus 5S rDNA foi encontrado perto da extremidade terminal do braço longo do cromossomo 8 (Figura 1H; Figura 2D), enquanto no HBBD, um locus 5S rDNA foi identificado no cromossomo 7 (Figura 1J; Figura 2E). No HBWF, dois loci de rDNA 5S apareceram perto da extremidade terminal dos braços longos dos cromossomos 4 e 8, mais dois no braço longo do cromossomo 7, um na região do centrômero e um perto do final (Figura 1N; Figura 2G).

A combinação de sinais FISH de rDNA 45S e 5S, juntamente com as características do segmento terminal de CPD, distinguiu efetivamente todos os cromossomos mitóticos de diferentes populações de Lycoris aurea (L'Hérit.) Erva. Nas populações SCLS, HBFC, HBBD, GZDS e GXTL, o cromossomo 1 exibiu fortes sinais de CPD na região centromérica. O cromossomo 2 exibiu fortes sinais de CPD na região centromérica, com exceção de GZDS e GXTL. O cromossomo 3 mostrou um forte sinal de CPD na região centromérica, exceto para SCLS. O cromossomo 4 exibiu consistentemente fortes sinais de CPD na região centromérica. Para os cromossomos 5, 6 e 7, fortes sinais de CPD foram observados nas extremidades dos braços curtos. O cromossomo 4 também mostrou fortes sinais de rDNA 45S no final do braço curto, enquanto os cromossomos 5 e 6 apresentaram fortes sinais 45S em suas regiões terminais, exceto em GZDS. Notavelmente, um forte sinal DAPI estava presente na população GZDS. Além disso, um sinal fraco de rDNA 5S apareceu na região proximal do cromossomo 7 nas populações HBFC, HBWF, HBBD e GZDS.

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Figura 1: Cromossomos mitóticos de oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas. Exame de cromossomos metafásicos mitóticos de oito diferentes Lycoris aurea (L' Herit.) As populações de ervas são mostradas, incluindo a população SCLS (A, B), população HNXN (C, D), população HNZX (E, F), população HBFC (G, H), população HBWF (I, J) e população HBBD (K, L). A hibridização de GZDS (M,N) e GXTL (O,P) foi realizada usando FISH com sondas de rDNA 45S marcadas com biotina e 5S marcadas com digoxina após a coloração com CPD. As imagens resultantes dos cromossomos após a coloração CPD exibem sinais de rDNA 45S (verde) e 5S (vermelho). O DNA total foi tingido reversamente com corante DAPI, resultando em uma cor azul. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Diagramas de cariótipo cromossômico de oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas. O diagrama de padrão cromossômico para oito populações de Lycoris aurea (L' Herit.) Herb revela características de banda de fluorescência, juntamente com a localização e o tamanho dos sinais 45S e 5S rDNA FISH. As populações SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL são representadas por (A-H), respectivamente. A escala ordenada indica o comprimento relativo do cromossomo (a porcentagem desse cromossomo no genoma haplóide) e o número na parte superior indica o número de série do cromossomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Gráficos de dispersão para oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas com base em três parâmetros de cariótipo. (A) O índice CVCI é plotado em relação ao índice CVCL. (B) O índice MCA é plotado em relação ao índice CVCL. As populações SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: O dendrograma UPGMA de oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas. O dendrograma UPGMA é baseado nos parâmetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL e CVCI para os oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: PCoA dos oito Lycoris aurea (L' Hér.) Variedades de ervas com base em seis parâmetros de cariótipo. O PCoA é baseado nos parâmetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL e CVCI, representando SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS e GXTL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Nomes de oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Distribuição de bandas de fluorocromo e sítios de rDNA nos oito Lycoris aurea (L' Hér.) Populações de ervas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: As sondas empregadas neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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A preparação de Lycoris aurea (L'Hér.) Os cromossomos da raiz da erva envolvem várias etapas críticas: (1) cultivar raízes via hidroponia, (2) tratar as pontas das raízes com α-bromonaftaleno saturado, (3) fixar as raízes usando uma solução de ácido álcool-acético, (4) realizar hidrólise enzimática nas pontas das raízes com uma solução enzimática e (5) esmagar completamente as raízes digeridas e secar as lâminas sobre uma chama de lâmpada de álcool.

A medição cromossômica precisa é essencial para a análise do cariótipo em estudos citogenéticos. Os cromossomos devem exibir condensação perceptível e limites claramente definidos; caso contrário, o cálculo preciso dos parâmetros cromossômicos torna-se um desafio5. Pesquisas citogenéticas anteriores mostraram que a diferenciação morfológica dos cromossomos mitóticos depende do grau de condensação 4,36. Quando a condensação é insuficiente, as extremidades dos braços cromossômicos ainda podem estar desaglutinadas, levando a limites cromossômicos pouco claros. No entanto, quando os cromossomos atingem a condensação máxima, as diferenças morfológicas entre os cromossomos diminuem. Portanto, a seleção de cromossomos com condensação moderada é crucial para a identificação e medição de cromossomos, especialmente em populações com menos cromossomos.

A marcação da sonda é crucial para a hibridização in situ FISH bem-sucedida, particularmente para a solução de sonda 5S rDNA. Devido à curta sequência de rDNA 5S, a concentração de sequências-alvo marcadas por PCR é tipicamente baixa, levando a sinais de hibridização fracos. A síntese direta de sondas marcadas com fluoresceína, no entanto, produz sinais de hibridização mais fortes e simplifica o processo. Para a solução de sonda de rDNA 45S, sequências parciais das regiões codificadoras de rRNA 5.8S, 18S e 25S de Arabidopsis thaliana foram marcadas nas extremidades 5' e 3' com 6-carboxi-tetrametil rodamina (TAMRA) e depois misturadas. A solução de sonda de fluoresceína 5S rDNA foi obtida usando sequências de nucleotídeos 1-59 e 60-118 da região codificadora do gene Arabidopsis 5S rRNA, com cada sequência marcada na extremidade 5' com fluoresceína 6-carboxila (6-FAM) e, em seguida, misturada.

Neste estudo, aproveitamos as diferenças entre os corantes DAPI e PI na ligação ao DNA e os combinamos para obter bandas fluorescentes claras. Os corantes PI (iodeto de propídio) podem penetrar nas membranas celulares e se ligar a moléculas de DNA dentro das células. Em contraste, o DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo) liga-se preferencialmente a regiões de DNA ricas em AT, fornecendo coloração clara e de alto contraste. Devido a essas propriedades complementares, DAPI e PI são frequentemente usados juntos, conhecidos como coloração CPD, para coletar informações sobre o núcleo e o citoplasma simultaneamente. As diferenças na presença, localização e tamanho das bandas CPD e DAPI+ revelaram diferenciação significativa da heterocromatina nas oito populações de Lycoris aurea. A coloração CPD mostrou regiões heterocromatinas ricas em conteúdo de GC tanto nas regiões centroméricas e pericentroméricas quanto nos cromossomos telocêntricos.

O estudo da assimetria cariotípica é uma abordagem taxonômica citogenética popular, acessível e amplamente utilizada que incorpora uma variedade de parâmetros e indicadores, incluindo medidas qualitativas e quantitativas, parâmetros de classificação de Stebbins e vários índices quantitativos (por exemplo, Paszko10; Peruzzi et al.11). Entre estes, a razão R e o CVCL são usados para medir a assimetria cromossômica, enquanto o CVCI e o MCA representam indicadores-chave da assimetria cromossômica. Notavelmente, o CVCL é considerado um parâmetro estatístico robusto para estimar a assimetria intercromossômica10, e a Métrica para Assimetria Cromossômica (MCA) é reconhecida como uma medida eficaz para avaliar a assimetria intracromossômica11. Para melhor representar as assimetrias cariotípicas entre as populações, recomenda-se um gráfico de dispersão bidimensional, com dois estimadores de assimetria colocados nos eixos x e y, respectivamente, onde cada amostra é representada como um ponto11,12. Os resultados mostraram que os gráficos de dispersão bidimensionais de CVCL vs. CVCI, bem como MCA vs. CVCL, ilustram efetivamente as relações de assimetria cariotípica entre as oito populações distintas de Lycoris aurea (L'Herit.) Herb, apoiando a confiabilidade desses índices na avaliação da assimetria cromossômica.

Para comparar cariótipos e reconstruir relações cariológicas entre as oito populações, este estudo aplicou a metodologia proposta por Peruzzi et al.11, utilizando os parâmetros x, 2n, TCL, MCA, CVCL e IVCC. Os resultados revelaram que as populações HBWF, GZDS, HBBD e GXTL estavam intimamente relacionadas, com HBFC posicionado entre esses grupos. Consequentemente, o PCoA baseado nesses seis parâmetros provou ser um método altamente eficaz para diferenciar as relações entre as oito populações. No entanto, certos padrões complexos também emergiram da árvore evolutiva molecular construída. Por exemplo, enquanto HNZX parecia intimamente relacionado ao HBWF na árvore filogenética molecular, ele estava mais distantemente relacionado no gráfico de dispersão de PCoA. Essa complexidade destaca a importância de empregar várias abordagens quantitativas para prever tendências na evolução do cariótipo dentro de Lycoris, complementando as características de classificação molecular.

As plantas para este estudo foram amostradas no centro e oeste da China, incluindo o condado de Tianlin, província de Guangxi (GXTL), condado de Fang, província de Hubei (HBFC), condado de Dushan, província de Guizhou (GZDS), condado de Zixing, província de Hunan (HNZX), condado de Badong, província de Hubei (HBBD), condado de Xinning, província de Hunan (HNXN), condado de Wufeng, província de Hubei (HBWF) e condado de Lushan, província de Sichuan (SCLS). Um espécime de voucher foi preservado no Herbário da Universidade de Huaihua. Este estudo descobriu que a combinação de sinais FISH de rDNA 45S e 5S e características do segmento terminal de CPD distinguiu efetivamente todos os cromossomos mitóticos de diferentes populações de Lycoris aurea (L′Herit.) Erva. O protocolo aqui apresentado tem como objetivo investigar a distribuição da heterocromatina entre diferentes populações de Lycoris aurea (L′Herit.) Erva. A coloração reversa CPD (uma combinação de PI e DAPI) e DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) são técnicas estabelecidas para observar a estrutura nuclear e a distribuição da cromatina. A marcação fluorescente direta das regiões do gene 18S-5.8-26S rRNA (regiões 45S rDNA) e do DNA ribossômico 5S para hibridização cromossômica FISH é direta e fornece sinais robustos de hibridização. Essa distinção qualitativa será cada vez mais valiosa na análise de várias populações.

Este método é mais adequado para espécies de plantas capazes de cultivo rápido da ponta da raiz, pois a cultura da ponta da raiz é necessária durante a mitose ativa. Devido à curta sequência 5S, o estudo usou a sequência de nucleotídeos 1-118bp da região codificadora do gene 5S rRNA de Arabidopsis thaliana como a sonda 5S rDNA. Devido à sua sequência curta e sinal fraco, este método é eficaz apenas para identificar espécies com bases relativamente conservadas na região 1-118bp do gene 5S rRNA. A seleção de cromossomos metafásicos com condensação moderada é crucial para o sucesso do método. A condensação cromossômica está intimamente relacionada ao momento da colheita das raízes, duração do pré-tratamento e cozimento por chama. Portanto, a técnica requer controle preciso sobre cada etapa para garantir o sucesso experimental.

Divulgações

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Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da China (32070367).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ÁlcoolSangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1&vezes; Fornecedor verificado - TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081&vezes;, 10&vezes;
2 vezes; Fornecedor verificado - SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092 vezes, 20 vezes;
45S  rDNASangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.TAMRA é adicionado a ambas as extremidades (5 'e 3' extremidades)
4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  rDNASangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.5 'final mais 6-FAM (FITC)
Software Adobe PhotoshopAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naftalenoSangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.A602718Saturação
Agente anti-burnoutSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Incubadora bioquímicaShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CelulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
de ácido cítricoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
de formamida deionizada (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000,7
Sulfato de dextranoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
USA/Abbott ThermoBriteS500-24
Microscópio de fluorescênciaOlympus  China  Co.ltdBX60
Ácido acético glacialSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Xangai)H399657500 mL
Máquina de geloDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica microscópio biológicoAlemanha Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Álcool metílicoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617de 500 mL
Versão7.35
FornoMolecular Devices Thermo Scientific™ Heratherm™THM # 51028152
PectinaseSangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.A00429710 g
de PepsinaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Iodeto de propídio (PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
de DNA de esperma de salmão (ssDNA)Aladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
de citrato de sódioAladdin Reagent Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica for Windows 10.0 para análise estatística
Instrumento de hibridização in situ de fluorescência de Software MetMorph

Referências

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