O Laboratório Flutuante: Procedimento Operacional Padrão para Coleta e Filtragem de Amostras de Água do Mar de Balsas em Operação para Análise de DNA Ambiental

Resumo

Aqui, apresentamos um novo protocolo para recuperar o eDNA marinho por meio da coleta e filtragem de amostras de água do mar de balsas em operação e outras embarcações comerciais.

Resumo

As ferramentas genéticas para recuperar informações de traços de DNA ambiental estão bem estabelecidas para caracterização de biodiversidade direcionada e taxonomicamente ampla. No entanto, no contexto marinho, a coleta de amostras de eDNA de áreas de difícil acesso, como em águas abissais ou offshore, ainda pode ser uma limitação. O uso de balsas programadas ou navios comerciais cruzando grandes extensões de mar aberto pode constituir plataformas oportunistas valiosas para a coleta de amostras ambientais. As vantagens são inúmeras, desde a possibilidade de recolha de dados em qualquer condição meteorológica e a qualquer hora do dia até à repetibilidade ao longo do tempo, sendo os percursos constantes, e com uma redução total de custos e emissões de combustível. Trabalhos anteriores mostraram que a abordagem é possível e bem-sucedida. No entanto, o processo de aquisição de amostras das barrigas dessas grandes embarcações marítimas pode não ser imediato. Este trabalho ilustra em todos os detalhes como a coleta e filtragem da água do mar de grandes navios pode ser preparada, organizada e realizada.

Introdução

Nas últimas décadas, a análise de DNA ambiental (eDNA), nomeadamente a deteção de material genético deixado por organismos no ambiente, tem crescido rapidamente como uma ferramenta de monitorização promissora para comunidades de animais de água doce e marinha. Esta técnica molecular oferece a possibilidade de identificar simultaneamente vários táxons dentro de uma única amostra (abordagem de metabarcode), permitindo a detecção das comunidades biológicas que habitam ou cruzam a área amostrada 1,2,3,4,5.

Atualmente, o verdadeiro desafio é chegar aos pontos de amostragem, pois muitas vezes é econômica e/ou logisticamente inviável coletar amostras em grandes escalas geográficas, resultando em áreas pelágicas geralmente subamostradas em comparação com áreas costeiras mais acessíveis⁶. O uso de balsas ou outras embarcações comerciais permite transectos de amostragem altamente replicáveis, pois seguem rotas de navegação específicas que normalmente são constantes ao longo da temporada e cobrem grandes áreas ^7,8. Além disso, a utilização de rotas de balsa como meio de amostragem permite a coleta de amostras a qualquer hora do dia e durante todas as estações, independentemente das condições climáticas e do mar, além de apresentar inúmeras outras vantagens (Figura 1 suplementar). Estudos preliminares comprovaram sua viabilidade e precisão para avaliar índices de biodiversidade ^9,10. Amostras de água podem ser coletadas da sala de máquinas da balsa por meio de um tubo de derivação que intercepta a água de resfriamento marinho a montante dos motores. O LIFE-CONCEPTU MARIS (Conservação de Territórios do Mar Celácico e Pelágico no Mediterrâneo: Gerenciando Ações para sua Recuperação em Sustentabilidade) é o primeiro projeto em que esta prova de conceito foi colocada em prática em larga escala: visa a coleta de 500 amostras (ao longo de dois anos) e envolve o envolvimento de não uma, mas de várias empresas de balsas e várias transportadoras, permitindo destacar quaisquer questões críticas e refinar estratégias de amostragem para melhor se adaptar aos mais diversos contextos que possam ser encontrados a bordo. Descrevemos abaixo as características do projeto para seu componente relacionado à coleta em larga escala de amostras de DNA ambiental marinho (para a descrição do projeto, visite https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

A decisão de realizar uma campanha de amostragem utilizando um ferry programado implica algumas ações que devem ser tomadas antes da amostragem propriamente dita, que é o aspecto diretamente abordado neste trabalho. Aqui, mencionamos brevemente as ações que devem preceder a amostragem a bordo de qualquer embarcação comercial.

Este é um aspecto que não deve ser negligenciado e que determina o sucesso da campanha de coleta. As companhias de navegação são entidades comerciais e não de investigação e, por conseguinte, não estão, nem são obrigadas a estar, familiarizadas com as finalidades e objetivos da investigação científica que se pretende realizar a bordo. Isso implica uma fase inicial importante e delicada em que os objetivos do projeto científico proposto, que pode ser multidisciplinar, devem ser transmitidos e motivados pela alta administração da própria empresa de navegação. No caso específico do projeto CONCEPTU MARIS, isso foi possível graças a uma relação de décadas em que as companhias de navegação já estavam envolvidas em projetos de monitoramento visual (por exemplo, Transectos de Linha Fixa [FLT]⁷), o que determinou uma relação de estima mútua necessária para poder obter a luz verde para o acesso às casas de máquinas indispensáveis para a abordagem de amostragem abrangida por este trabalho.

O tipo de regime de amostragem adotado no projeto CONCEPTU MARIS é duplo: as amostras são colhidas tanto em estações de amostragem fixas (FSS, ver abaixo) como por ocasião dos avistamentos de cetáceos "raros". Estas representam as espécies menos avistadas durante os transectos FTL¹¹, a saber: golfinho comum (Delphinus delphis), baleia-de-bico-de-cuvier (Ziphius cavirostris), baleia-piloto (Globicephala melas), golfinho-de-risso (Grampus griseus), cachalote (Physeter macrocephalus) e baleia-comum (Balaenoptera physalus). Uma amostra adicional de água é coletada apenas quando o avistamento das espécies raras relatadas pela equipe de censo visual (equipe FLT) ocorre mais de meia hora antes ou depois de um dos FSSs. As amostragens realizadas em conjunto com os avistamentos serão necessariamente todas diurnas.

As estações fixas de amostragem (FSSs), cuja geoposição permanece invariável ao longo dos cruzeiros, são previamente identificadas e acordadas com toda a equipe de trabalho. As posições geográficas dos FSSs são selecionadas de acordo com 1) a presença de um local de interesse biológico com base em dados observacionais/bibliográficos anteriores; 2) prioridade dada aos pontos que indicam mudanças de habitat nos mapas batimétricos (por exemplo, borda da plataforma continental); 3) cobertura homogênea das rotas marítimas designadas, selecionando assim locais de amostragem aproximadamente equidistantes (cerca de 35-45 milhas náuticas de distância), a fim de cobrir toda a rota e prever a coleta de amostras noturnas.

A fim de garantir que as amostras adjacentes são colhidas em diferentes momentos do dia e que há tempo suficiente entre duas amostras consecutivas para completar o processamento da amostra, é aconselhável colher amostras de FSS adjacentes, uma na viagem de ida e outra na viagem de volta. Isto significa que, se os FSS forem numerados de acordo com a ordem cronológica em que são amostrados, não aparecerão por ordem consecutiva no mapa. Por exemplo, se forem selecionados 6 FSS, 3 serão amostrados na viagem de ida e 3 na viagem de volta. "Sua ordem ao longo da rota no mapa será PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, com as três estações de amostragem em itálico (FSS4, FSS5 e FSS6) sendo pesquisadas na viagem de volta (ver Figura 1).

Cada FSS tem um número de identificação único (ou seja, nenhum dos FSS identificados em rotas diferentes compartilha o mesmo número de identificação). A numeração é atribuída na primeira vez que um FSS é amostrado e a numeração consecutiva se seguirá. Portanto, no final do projeto, os FSSs de baixo número serão aqueles que foram testados por vários anos ou para os quais os dados mais antigos estão disponíveis.

Cada amostra consiste em cerca de 13 L de água do mar coletada em cada estação de amostragem. A água do mar é decantada diretamente do tubo de derivação do ferry para contentores "Bag-in-the-Box" (BiB), ou seja, sacos de plástico laminados de folha estéril, até ao processamento da amostra (ver abaixo). As características e vantagens do Sistema de Amostragem Bag-in-Box (BiBSS) são ilustradas em detalhes por Valsecchi et al. (2021)⁹ e também são relatadas aqui na Figura 2 por conveniência.

Protocolo

1. Preparando-se no laboratório

1. Lista de verificação de equipamentos
   1. Consulte a lista de verificação dos itens a serem levados a bordo para coleta e filtragem de amostras. É mostrado no Arquivo Suplementar 1. Cada item e seu uso serão explicados nas seções abaixo.
   2. Imprima uma cópia do Arquivo Suplementar 1 e preencha-o antes da partida para a campanha de amostragem.
2. Preparando o sistema de amostragem Bag-in-Box
   1. Preparar os sacos em caixa no laboratório, se possível sob a hotte, antes de embarcar. Sele as três aberturas (a do saco, parte da tampa que fecha o saco e a saída da torneira) com filme de vedação (Figura 3, Tabela de Materiais).
   2. Enrole bem os sacos, com a tampa destacada e selada por dentro, e feche-os com fita adesiva para evitar a reabertura durante o transporte (Figura 3).
   3. Realize esta operação certificando-se de não deixar entrar ar na bolsa durante a manobra de selagem acima mencionada, tanto (i) para evitar possíveis contaminações transportadas pelo ar que entra na bolsa quanto (ii) para evitar que a bolsa dobrada fique mais volumosa (se contiver ar).

2. Preparando-se a bordo

1. Coordenação com os membros da tripulação
   1. Assim que estiver a bordo, partilhe os pontos de amostragem selecionados com o capitão e a sua tripulação, de modo a que sejam indicadas as horas em que o ferry estará mais próximo de cada ponto selecionado como "Estação Fixa de Amostragem" (FSS).
   2. Anote o tempo de amostragem para cada FSS e a velocidade de cruzeiro atual (ou média, se disponível) do ferry para essa rota: isto permite estimar a extensão (km) do troço de mar amostrado.
   3. Como a balsa nunca passa exatamente no mesmo ponto, corrija as coordenadas de cada coleta de amostra de água do mar após a amostragem real.
      NOTA: O intervalo exato de amostragem é o dado mais importante para uma identificação fiel da área marítima realmente amostrada; portanto, é útil imprimir um mapa dos pontos aproximados onde relatar as coordenadas reais de amostragem (por exemplo, no Arquivo Suplementar 2).
   4. Se a empresa conceder acesso à casa de máquinas, peça para ser escoltado até a sala.
   5. Use o equipamento de proteção individual (EPI) antes de entrar na casa de máquinas. Aqui, o ambiente é inóspito (barulho ensurdecedor e altas temperaturas) e cheio de pontos potencialmente insidiosos (escadas íngremes, grandes vãos no chão). Uma vez obtida a permissão para entrar na sala de máquinas, equipe-se com todos os equipamentos de segurança essenciais, como sapatos de segurança, capacete e fones de ouvido de proteção auditiva.
   6. Se a superfície filtrante for fornecida pela transportadora (geralmente é aconselhável ter sua própria mesa dobrável), verifique se essa área pode ser higienizada entre as amostras usando uma solução de alvejante a 10%.
2. Instalando-se na sala de máquinas
   1. Como existem várias entradas de água do mar nos navios, identifique-se com o gerente da casa de máquinas, o que permite um caminho mínimo para a entrada de água através das tubulações do navio para minimizar a contaminação da amostra de água com substâncias e organismos que podem ser encontrados nas tubulações.
   2. Uma vez identificado o ponto/entrada mais adequado para a coleta da água do mar que entra, pergunte à equipe se a torneira de coleta de amostras pode ser mantida ligeiramente aberta durante toda a duração do cruzeiro, a fim de enxaguar continuamente o tubo usado para coleta de amostras com água "local". Descarte a água do mar que flui incessantemente da torneira no porão.

3. Coleta de amostras de água (na sala de máquinas)

NOTA: A Figura 4 mostra as fases da coleta de amostras de água do mar.

1. Preparação para coleta de água
   1. Traga todo o equipamento necessário (primeira parte da lista de verificação do Arquivo Suplementar 1 ) para a sala de máquinas. Chegue à casa de máquinas pelo menos 15 minutos antes do tempo de amostragem planejado para esterilizar a área onde os BiBs são manuseados usando uma solução de alvejante a 10%.
   2. Se a torneira dedicada não tiver sido deixada aberta durante todo o cruzeiro, abra-a para a coleta de amostras de água do mar e deixe a água correr por pelo menos 5 minutos (a água é descartada no porão) antes da retirada real (Figura 4A).
   3. Prepare a estação de filtragem.
      NOTA: Existem várias medidas na configuração da estação de filtragem que podem melhorar significativamente a eficiência da filtração (consulte a etapa 4.3): 1) use frascos de vácuo de alta capacidade (balão de 2 L, 4 L ou 5 L, dependendo do volume a ser retirado). Isso, além de economizar o tempo necessário para esvaziar o frasco entre 1 L e o seguinte, minimiza o manuseio do cilindro de filtração e, portanto, qualquer contaminação; 2) pode-se usar vários frascos de filtro dispostos em série, uma medida que permite a filtragem simultânea de várias amostras (bolsas). Esta medida é recomendada em regimes de amostragem apertados, onde existe o risco de não ter o tempo necessário para processar os sacos antes de chegar ao porto de atracação.
   4. Utilizar um marcador permanente para preparar e rotular a Barra de Reservas, escrevendo-lhe: 1) o código de identificação alfanumérico único da amostra em ambos os lados da Barra de Barras (importante, especialmente se as Barras de Amêndoas não forem processadas imediatamente a bordo e forem filtradas em terra) 2) a data; 3) a hora exata de começar a encher o BiB.
2. Captação de água
   1. Remova o filme de vedação da abertura do BiB e comece a enchê-lo até ficar completamente cheio (cerca de 13 L) (Figura 4B).
   2. Quando o saco estiver quase cheio, remova o filme de vedação da tampa, mas não da abertura da torneira: mantenha o filme de vedação ao redor da torneira de segurança seguro (aba de plástico vermelha) até a filtração (Figura 4C). Feche o babador com a tampa, pressionando-o firmemente até fechar completamente.
   3. Anote a hora exata em que a coleta de amostras é concluída: permite calcular a duração total (minutos) da coleta de amostras.
3. Após a coleta de água
   1. Escreva com o marcador permanente no BiB a hora exata em que a coleta de amostras é concluída e relate todos os dados no formulário de coleta/filtragem de amostras (Arquivo Suplementar 2).
   2. Transfira o BiB preenchido para a sala de armazenamento ou para a área de filtragem (um espaço dedicado na própria casa de máquinas ou em uma cabine).
   3. Transfira todos os dados no formulário de coleta/filtragem de amostras (Arquivo Suplementar 2).
      NOTA: O Arquivo Suplementar 2 mostra a folha de coleta/filtragem de amostras a ser preenchida a bordo em todas as suas partes.
      1. Para a parte relativa à colheita da amostra (verde), indicar as horas de início e de fim da recolha de água do mar na casa das máquinas.
      2. Secundariamente, após consulta dos membros da tripulação ou registros GPS, insira as coordenadas geográficas relativas ao início e ao fim da amostragem e da velocidade de cruzeiro. Isso permite que você calcule posteriormente o comprimento do segmento de mar amostrado.
         NOTA: No que diz respeito à parte relativa à filtragem (azul), será indicado se a filtração ocorre a bordo ou posteriormente em terra: os tempos de filtragem serão indicados para cada um dos 3 filtros.

4. Filtragem de amostras de água do mar

1. Prepare-se para filtração
   NOTA: A partir deste ponto, o processo de filtração pode ser gerenciado de acordo com diferentes protocolos com base nos objetivos específicos do projeto de pesquisa. O protocolo aqui descrito permite a filtragem eficiente de uma grande quantidade de água do mar (mais de 10 litros) diretamente a bordo, evitando as restrições de volume inerentes a outros kits ou protocolos comerciais comumente usados. Sempre que possível, filtre as amostras de água a bordo: a filtração pode ser efectuada na própria casa das máquinas ou numa cabina, de preferência localizada perto da casa das máquinas. É sempre desejável filtrar amostras de água do mar imediatamente após a coleta, tanto para limitar a degradação do eDNA quanto por conveniência, evitando assim o desembarque com grandes volumes de água do mar a serem processados. Se não for possível, as amostras podem ser armazenadas nos recipientes Bag-in-Box e transportadas para serem filtradas posteriormente.
   1. No espaço previsto dedicado à filtragem a bordo (na casa das máquinas ou numa cabina dedicada), prepare-se com tudo o que está listado na segunda parte da lista de verificação no Processo Suplementar 1 e monte o sistema de filtragem conforme indicado na figura 5.
   2. Prepare o cilindro de filtração (Tabela de Materiais) conforme mostrado na Figura 6 e na Figura 7. Use um novo cilindro para cada estação, um novo par de pinças descartáveis ou um par de pinças esterilizadas.
      NOTA: Um único cilindro pode ser usado várias vezes para filtrar amostras do mesmo local. No entanto, ele precisa ser esterilizado com alvejante a 10%, seguido de enxágue com água doce, antes de ser deixado secar ao ar no laboratório e, em seguida, embalado individualmente para ser armazenado até a próxima campanha.
   3. Antes de iniciar a filtração, preencha o registo de dados de recolha/filtração da amostra (Suplemento File 2). Isso é necessário tanto para acompanhar o número de litros processados quanto para medir o tempo de filtragem (indicativo da quantidade de partículas na amostra). Assim que a bomba de vácuo for ativada, inicie o temporizador para medir o tempo de filtragem.
2. Filtragem a bordo
   1. Para minimizar o risco de contaminação (especialmente quando vários sacos são processados simultaneamente, veja abaixo), isole o fluxo de água a ser filtrada do ambiente circundante colocando uma luva isolante - saco plástico - entre a torneira e o cilindro filtrante (ver Figura 7).
      NOTA: Esta é uma precaução importante, pois a sensibilidade das tecnologias usadas para a análise do DNA ambiental torna a abordagem particularmente suscetível à contaminação ambiental (do operador ou contaminação cruzada entre amostras).
   2. Ative a bomba de vácuo e filtre até 4 L de água para cada filtro. Mantenha o cilindro sempre cheio durante a filtragem para evitar a entrada de ar no sistema e retardar o processo de filtração.
      NOTA: Quanto à escolha da porosidade da membrana, esta depende do objetivo da pesquisa, dos grupos taxonômicos alvo e da quantidade de água que se pretende processar. Essa questão foi tratada em trabalhos anteriores ^9,12.  em que filtros de diferentes porosidades foram comparados. Para o estudo de vertebrados e a escolha de processar 4 litros de água por filtro, uma membrana com porosidade de 0,45 μm provou ser a melhor solução, permitindo processar grandes volumes de água sem causar desordem do filtro devido à saturação dos poros.
   3. Quando o nível da água filtrada dentro do frasco atingir a marca de nível de 4 L, desligue a bomba de vácuo e pare o temporizador, relatando o valor do tempo de filtragem no registro de dados.
      NOTA: De cada BiB de 12/13 L, serão obtidas 3 réplicas técnicas, de 4 L cada (denominadas A, B e C).
   4. Neste ponto, usando a pinça (e, se necessário, um palito estéril para ajudar a levantar a borda do filtro), recupere o primeiro filtro (filtro A) do cilindro, conforme mostrado na Figura 8, evitando possíveis danos ao filtro.
   5. Dobre o filtro ao meio (com o lado que reteve o material biológico dobrado sobre si mesmo) e envolva-o em papel alumínio, escrevendo imediatamente o número da amostra e o ID da réplica do filtro (por exemplo, 15A) na embalagem. Guarde-o no freezer a bordo até o desembarque.
   6. Monte um novo filtro (filtro B) dentro do cilindro de filtração para processar outra amostra de 4 L (Figura 9). Esvaziar o balão e recomeçar a filtrar o segundo replicado até que 4 L estejam completamente filtrados. Recupere o filtro B conforme explicado e repita as mesmas etapas para o filtro C.
3. Boas práticas
   1. Para encurtar os tempos de filtragem, use um grande frasco de vácuo capaz de acomodar toda a água filtrada processada através de um único filtro (portanto, neste caso, pelo menos 4 L de capacidade).
   2. Reduza consideravelmente os tempos de filtragem filtrando vários sacos simultaneamente, organizando o aparelho de filtragem em paralelo (ou seja, vários frascos de vácuo servidos por uma única bomba).
      NOTA: Na campanha CONCEPTU MARIS, ambas as estratégias foram adotadas (Figura 10). Observe que maximizar a eficiência da filtragem é muito importante, pois o número de amostras coletadas ao longo de uma rota pode ser grande. É, portanto, necessário processar os sacos em um curto espaço de tempo para evitar o acúmulo de amostras com o risco de ter que desembarcar os sacos se não houver tempo suficiente para processá-los a bordo.
   3. A fim de monitorizar a incidência de falsos positivos (contaminação), incluir no procedimento de filtragem, pelo menos uma vez por cruzeiro, um "saco em branco", filtrando em paralelo com as amostras um saco cheio de água potável retirada de garrafas seladas. Esta amostra de controle não requer réplicas e trate-a como o resto das amostras e inclua-a na execução do NGS.
4. Armazenamento e transporte de filtros
   1. Após a filtração, armazenar todos os filtros entre -4 °C e -20 °C até processamento laboratorial adicional.
   2. Colete as amostras do freezer a bordo imediatamente antes do desembarque e prepare-as para transporte em baixas temperaturas usando refrigeradores transportáveis, conforme mostrado na Figura 11.
      NOTA: Se as amostras não forem filtradas a bordo, os sacos de água do mar são transportados com mais segurança se mantidos na vertical com a tampa presa na parte superior, apoiada aos pares dentro de sacos de compras dentro de caixas de plástico para facilitar o transporte (Figura 12).

Resultados

Executando o protocolo conforme descrito, um número de filtros igual ao número de FSS multiplicado por 3 réplicas será coletado pelo operador. Cada filtro retém traços biológicos (DNA ambiental) em um dos dois lados. As etapas analíticas subsequentes à extração do eDNA dependem fortemente da questão, alvo e objetivo da pesquisa. Por exemplo, no estudo piloto de Valsecchi et ^al.9, o protocolo de coleta de eDNA descrito permitiu o desenho de um levantamento replicável e sistemático da megafauna mari...

Discussão

Como as etapas do protocolo são simples e diretas, há algumas considerações relevantes a serem consideradas ao trabalhar em balsas comerciais. O tubo de derivação de água de resfriamento geralmente está localizado na área da casa de máquinas, cujo acesso pode ser restrito ou sujeito a autorização prévia. Portanto, certificar-se de ter essa autorização, juntamente com os equipamentos de proteção individual adequados, é fundamental (Figura 4). Além disso, a co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membranas filtrantes de 4,7 cm de diâmetro	Biosigma S.p.A.	https://www.biosigma.com/	Membranas filtrantes de 0,45 μ m porosidade, embalados individualmente
Balão de vácuo de 4/5 L	Duran	https://www.duran-bottle-system.com/	5 L frasco de vidro com rolha
Almofadas de papel absorvente	Advantec MFS, Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	Almofadas absorventes de papel de filtro, tamanho 47 mm.
Bag-in-Box (BiB)	G.M.V. Agricenter S.r.l.	https://www.gmvagricenter.it/	Sacos de 10 litros na caixa com torneira
Cilindros filtrantes	Cilindros de monitor Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#	Biostart 100, com 0,45 μ Membrana M incluída
Filme de vedação	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc& utm_campaign=all+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f& utm_term=%2Fproduct%2F	4 polegadas x 125 pés rolo de filme de vedação de laboratório
Bomba de vácuo	KNF Grupo	https://knf.com/en/us	Bomba de vácuo portátil de laboratório N. 96