Artigo de método

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 de setembro de 2024

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo explica como medir o efeito da variação genética associada a distúrbios do neurodesenvolvimento na atividade da enzima desubiquitilante, combinando a purificação de proteínas recombinantes com ensaios de clivagem da cadeia de ubiquitina.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os distúrbios do neurodesenvolvimento (NDDs) estão associados a deficiências na função do sistema nervoso, mas muitas vezes permanecem pouco compreendidos no nível molecular. Distúrbios discretos causados por genes únicos fornecem modelos para investigar os mecanismos que impulsionam o neurodesenvolvimento atípico. Variantes de genes que codificam proteínas da família da enzima desubiquitilante (DUB) estão associadas a vários NDDs, mas há necessidade de determinar os mecanismos patogênicos dos distúrbios impulsionados por essas variantes genéticas. O impacto das variantes genéticas na atividade do DUB pode ser determinado experimentalmente usando um ensaio de clivagem de ubiquitina in vitro independente do substrato. Este ensaio não requer conhecimento de substratos a jusante para medir diretamente a atividade catalítica. Aqui, o protocolo para determinar o impacto das variantes genéticas na atividade enzimática é modelado usando a DUB Ubiquitina Specific Protease 27, ligada ao X (USP27X), que é mutada na deficiência intelectual ligada ao X 105 (XLID105). Este pipeline experimental pode ser usado para esclarecer os mecanismos subjacentes aos distúrbios do neurodesenvolvimento impulsionados por variantes nos genes DUB.

Introdução

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Os transtornos do neurodesenvolvimento (NDDs) surgem de diversas etiologias com determinantes ambientais ou genéticos que impulsionam o desenvolvimento atípico do sistema nervoso1. O teste genético de sequenciamento de última geração relacionou um número crescente de variantes em genes relacionados ao sistema de ubiquitina com NDDs genéticos2. O sistema ubiquitina catalisa a ligação do pequeno modificador de proteína ubiquitina a resíduos principalmente de lisina em substratos proteicos para impulsionar mudanças no comportamento celular, incluindo localização, estabilidade, interações proteína-proteína ou atividade3. A ubiquitilação é mediada pelas enzimas E1 ativadora, conjugação E2 e E3 ligase4 e é reversível pela atividade de enzimas desubiquitilantes (DUBs) que catalisam a clivagem e remoção de ubiquitina de substratos proteicos5. A ubiquitina pode ser ligada ao substrato como um monômero (monoubiquitilação) ou cadeias poliméricas (poliubiquitilação) que são formadas em qualquer um dos sete resíduos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) ou o resíduo M1 da ubiquitina. Essas diferentes topologias de cadeia de ubiquitina e suas combinações criam um código celular que é fundamental para a transdução de sinal6.

DUBs como USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B e OTUD5 foram associados a NDDs 2,7,8,9,10,11. Para a maioria dos NDDs, os mecanismos moleculares que impulsionam a patogênese permanecem experimentalmente indefinidos. Alguns dos DUBs que conduzem distúrbios descritos recentemente são mal compreendidos e carecem de leituras celulares conhecidas que possam ser usadas para avaliar o impacto da variação genética na função das proteínas. In vitro, os ensaios de clivagem da cadeia de ubiquitina superam essa limitação como leituras de atividade de DUB independentes do substrato que podem medir o impacto das variantes genéticas na atividade enzimática12.

Ensaios de clivagem de ubiquitina in vitro têm sido usados desde a década de 1980. Esses ensaios usando substratos radiomarcados permitiram a descoberta dos primeiros DUBs, incluindo isopeptidase, identificada por sua capacidade de desubiquitilar histona H2A13, e ubiquitina carboxila terminal hidrolase (UCH), identificada por sua capacidade de hidrolisar ubiquitina a partir de uma variedade de conjugados químicos14 , 15 , 16. Além disso, proteínas ou peptídeos de comprimento total poliubiquitilados radiomarcados foram usados para identificar isopeptidase T e vários UCHs e proteases específicas de ubiquitina (UBPs) de eritrócitos e músculo esquelético, respectivamente 17,18,19,20. Cadeias de ubiquitina de comprimento e tipo de ligação definidos (tetra-ubiquitina ligada a K48) foram usadas pela primeira vez para medir a atividade DUB da isopeptidase T21. Desde então, este ensaio tornou-se o padrão-ouro para medir a atividade de DUB em análises mutacionais22 , 23 . O refinamento deste ensaio atualmente permite a visualização da clivagem da ubiquitina por meio de eletroforese e colorações convencionais de gel, como azul de Coomassie, laranja SYPRO, rubi e prata ou detecção fluorescente ou baseada em immunoblotting12,24. Aspectos moleculares da atividade de DUB, como comprimento mínimo da cadeia e especificidade de ligação 25,26,27,28, podem ser esclarecidos usando cadeias de ubiquitina de diferentes comprimentos (por exemplo, di-, tri-, tetra-ubiquitina) e ligações (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, linear) em ensaios funcionais. As variantes associadas ao NDD podem levar a defeitos de atividade de DUB específicos do tipo de ligação da cadeia de ubiquitina11.

Um ensaio de clivagem de di-ubiquitina usando proteínas DUB recombinantes purificadas pode medir diretamente o impacto das variantes de NDD na atividade de DUB. O USP27X, que é mutado no transtorno de deficiência intelectual ligado ao NDD X 105 (XLID105)7,28, modela o processo aqui apresentado. Essa abordagem permite determinar como a atividade do DUB é interrompida por variantes genéticas em NDDs associados ao DUB existentes e desconhecidos.

Protocolo

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O protocolo a seguir pode ser adaptado para proteínas recombinantes usando várias marcas de afinidade expressas em diferentes cepas de células competentes. Dependendo da proteína que está sendo expressa, as condições de cultura e expressão noturna podem exigir a otimização do OD600 na indução de expressão, tempo de expressão, temperatura de expressão e concentração de IPTG. Uma visão geral do protocolo é ilustrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Transformação de células competentes de E. coli de Rosetta 2 com o plasmídeo de expressão GST-USP27X recombinante

NOTA: Para manter a esterilidade da cultura bacteriana, execute as etapas em que os recipientes de mídia são abertos sob uma chama de bico de Bunsen. Para permitir a transferência ideal de oxigênio, execute a agitação da cultura bacteriana em um agitador de bancada com temperatura controlada com uma órbita de 19 mm a 50 mm e uma velocidade de 200 rpm29.

  1. Descongele 20 μL de células de E. coli de Rosetta 2 quimicamente competentes em gelo imediatamente antes do uso. Adicione 1-10 ng do plasmídeo de expressão pGEX6P1-USP27X (codificando para N-terminal Glutationa-S-transferase (GST)30 - marcado com USP27X e contendo resistência à ampicilina) e incube 5 min no gelo.
  2. Choque térmico durante 30 s a 42 °C em banho seco. Incube no gelo por 2 min.
  3. Adicione 80 μL de meio SOC à temperatura ambiente (RT). Incubar durante 60 min a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm.
  4. Placa 50 μL de cultura em uma placa de ágar LB suplementada com 25 μg/L de cloranfenicol e 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C com a tampa virada para baixo numa incubadora com temperatura controlada.

2. Expressão bacteriana durante a noite da proteína recombinante do plasmídeo de expressão

NOTAS: Para manter a esterilidade da cultura bacteriana, execute as etapas em que os recipientes de mídia são abertos sob uma chama de bico de Bunsen. Para permitir a transferência ideal de oxigênio, execute a agitação da cultura bacteriana em um agitador de bancada com temperatura controlada com uma órbita de 19 mm a 50 mm e uma velocidade de 200 rpm29. Meça a cultura OD600 usando um espectrofotômetro.

  1. Prepare 1 L de meio Terrific Broth (TB) adicionando 47,6 g de pó de TB a 1 L de água ultrapura com 0,4% de glicerol em um frasco de cultura de 2 L. Autoclave média por 30 min e esfriar para RT.
  2. Escolha uma única colônia de bactérias transformadas e adicione a 10 mL de meio LB estéril suplementado com 25 μg / L de cloranfenicol e 50 μg / L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm.
  3. Adicione 10 mL de cultura durante a noite a 1 L de meio TB suplementado com 25 μg/L de cloranfenicol e 50 μg/L de ampicilina (proporção de 1:100 da cultura inicial para a cultura de expressão). Incubar a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm em órbita até que a cultura OD600 esteja compreendida entre 0,5-0,6.
  4. Adicione 50 μM de IPTG à cultura para induzir a expressão, resfrie a 16 ° C e incube por 20 h a 16 ° C com rotação de 200 rpm.
  5. Células de pellets de cultura de expressão por centrifugação por 20 min a ≥3.000 x g e 4 °C. Conservar o pellet a -80 °C durante, pelo menos, 1 h.
    NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde (de preferência na mesma semana). O pellet pode ser armazenado a longo prazo a -80 °C.

3. Purificação de proteínas por coluna de afinidade gravidade-fluxo

NOTA: A resina, ligação, lavagem, eluição e tampões de armazenamento apropriados para cada purificação dependerão da proteína recombinante que está sendo purificada. Colete amostras do pellet celular, sobrenadante, fluxo, frações de lavagem e frações de eluição no tampão SDS-PAGE. Realize a coloração SDS-PAGE e Coomassie para as amostras para avaliar o sucesso da purificação. Efectuar a purificação a 4 °C e manusear as fracções no gelo. A clivagem de marcadores de proteína pode ser realizada dentro ou fora da coluna usando a protease apropriada para atingir o local de clivagem específico da protease relevante.

  1. Prenda a coluna de fluxo de gravidade vazia no suporte de retorta e encha-a com resina de glutationa agarose. Use 2-3 mL de resina para purificar um pellet celular coletado de 1 L de cultura de expressão.
  2. Lavar a coluna com um volume de leito de resina de etanol a 20%. Lave a coluna 3 vezes com um volume de leito de resina de tampão MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Pare a coluna para que a resina permaneça coberta com tampão para evitar o ressecamento durante a preparação do pellet celular.
  3. Descongelar o sedimento celular a 4 °C. Adicione 30 mL de tampão MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lisozima e um comprimido inibidor de protease) ao pellet descongelado. Lisar durante 30 min a 4 °C com uma rotação suave de ponta a ponta.
  4. Sonicar as células lisadas num tubo de centrifugação de 50 ml ou num copo metálico sobre gelo até que o lisado flua livremente quando dispensado a partir de uma ponta de pipeta. Centrifugue por 30 min a 4 °C e ≥20.000 x g para limpar o sobrenadante.
    NOTA: Determine as configurações do sonicador empiricamente. Defina o sonicador de modo que o tempo total de 120 s seja suficiente para reduzir o lisado viscoso a um líquido transparente e de fluxo livre.
  5. Transvase o sobrenadante para um copo e coloque o lisado limpo na coluna. Execute o lisado através da coluna por fluxo por gravidade enquanto coleta o fluxo. Carregue a coluna com o fluxo coletado e passe-o pela coluna.
  6. Lave a coluna com pelo menos dois volumes de leito de resina de tampão de lavagem MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 vezes. Colete o fluxo de lavagem em frações de 5 mL. Adicione 1 μL de cada fração a 100 μL de reagente de Bradford para verificar visualmente a presença de proteínas. Lave até que a proteína não ligada não esteja mais presente na última lavagem, adicionando etapas de lavagem adicionais, se necessário.
  7. Recupere a proteína executando o tampão de eluição MS500 (tampão MS500 suplementado com 10 mM de glutationa e 10 mM de NaOH) através da coluna, coletando 5 mL de frações de eluição. Verifique a presença de proteínas adicionando 1 μL de eluato a 100 μL de reagente de Bradford. Pare de coletar frações quando o reagente de Bradford não indicar mais que as proteínas estão presentes.
  8. Realize a troca de tampão por precipitação e centrifugação. Precipitar a proteína adicionando 2 volumes de 4 M de sulfato de amónio ao eluído, invertendo suavemente até ficar turvo e, em seguida, centrifugando durante 30 min a 4 °C e ≥20.000 x g e novamente durante mais 5 min. Remover o sobrenadante após cada centrifugação sem perturbar o sedimento proteico.
  9. Dissolva e armazene proteínas em MS500 suplementado com 25% de glicerol. Armazene pellets de proteína ou proteína em tampão de armazenamento a -80 °C.

4. Ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

NOTA: Selecione o comprimento da cadeia de ubiquitina e os tipos de ligação com base na especificidade do DUB descrita em relatórios anteriores31 ou determinada empiricamente. Se necessário, este protocolo pode ser usado para testar a atividade do DUB de tipo selvagem de interesse em um painel de cadeias de ubiquitina comercialmente disponíveis de comprimento e tipo de ligação definidos. Uma quantidade de cadeia de di-ubiquitina de 375-750 ng e uma concentração de DUB de 1-2 μM podem ser usadas como pontos de partida para o ensaio27.

  1. Prepare 10x tampão de ativação DUB (500 mM de Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl e 100 mM de TCEP).
  2. Para cada ponto de tempo para cada DUB, prepare 10 μL no total de 2 μM de GST-USP27X purificado em 1x tampão de ativação DUB (mistura DUB). Prepare mastermixes e divida-os em pontos de tempo.
  3. Incube a mistura DUB por 10 min em RT.
  4. Adicione 7 μL de buffer de carregamento SDS-PAGE ao tempo 0 antes de adicionar cadeias de ubiquitina para evitar que a reação de desubiquitilação comece.
  5. Para cada ponto de tempo para cada DUB, adicione 375 ng de cadeias de di-ubiquitina K-63 diluídas em 10 μL 1x tampão de ativação de DUB. O volume total é de 20 μL por reação.
  6. Incubar os tubos a 30 °C, parando cada ponto de tempo com 7 μL de tampão de carga SDS-PAGE.
  7. Realize SDS-PAGE com um gel de gradiente de 4% a 12% e immunoblot 7,32 para ubiquitina e USP27X para analisar a mudança na presença de mono-ubiquitina em pontos de tempo selecionados.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema do desenho do estudo. (A) Transformação de células de E. coli competentes com plasmídeo de expressão de proteína recombinante. (B) Expressão bacteriana noturna da proteína deubiquitilase recombinante. (C) Purificação de proteínas da deubiquitilase recombinante usando uma coluna de afinidade gravidade-fluxo. (D) Ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro para avaliar a atividade desubiquitilante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

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Para determinar o impacto das variantes associadas ao XLID105 na atividade catalítica do USP27X, as proteínas USP27X do tipo selvagem marcadas com GST e as proteínas F313V, Y381H e S404N USP27X associadas ao XLID105 foram purificadas de bactérias. Essas variantes estão localizadas dentro do domínio catalítico USP do USP27X (Figura 2A). Como o USP27X foi relatado anteriormente como clivando as cadeias de ubiquitina K6331, o USP27X do tipo selvagem e as proteínas F313V, Y381H e S404N USP27X associadas ao XLID105 foram incubadas com cadeias de di-ubiquitina ligadas a K63 por 1 h. Essas amostras foram separadas via SDS-PAGE32, e as proteínas ubiquitina e USP27X foram analisadas via immunoblotting. O USP27X do tipo selvagem induz clivagem de di-ubiquitina, gerando mono-ubiquitina (Figura 2B e Figura Suplementar 1). XLID105 proteínas variantes F313V, Y381H e S404N USP27X associadas a não clivaram essas cadeias. Como as variantes F313V, Y381H e S404N interrompem a atividade catalítica do USP27X, a interrupção funcional do USP27X parece ser o principal mecanismo subjacente ao XLID1057. Quantificação adicional e experimentos complementares foram relatados anteriormente7.

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Figura 2: Impacto das variantes XLID105 na atividade desubiquitilante do USP27X. (A) Diagrama da estrutura da proteína USP27X humana, mostrando o número de resíduos e a localização das variantes XLID105 avaliadas no domínio USP (roxo). (B) As variantes USP27X e XLID105 do tipo selvagem marcadas com GST (F313V, Y381H e S404N) foram incubadas com cadeias de di-ubiquitina K63 pelos tempos indicados. A análise de immunoblot foi realizada usando anticorpos anti-GST (USP27X) e ubiquitina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Borrões não cortados da Figura 2B. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Este artigo apresenta um protocolo para a expressão e purificação de DUBs USP27X recombinantes e um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro para comparar a atividade desubiquitilante de proteínas USP27X do tipo selvagem e variantes associadas a NDD. Este ensaio determinou que as variantes associadas ao XLID105 interrompem a atividade catalítica do USP27X7. Essa visão mecanicista nos ajudou a definir XLID105 como um transtorno de ruptura funcional USP27X.

Este protocolo pode ser adaptado a outros DUBs associados a doenças genéticas com mecanismos moleculares pouco compreendidos. A otimização do protocolo de expressão e purificação para um DUB específico de interesse é crucial. Se nenhum protocolo específico tiver sido descrito para um determinado DUB de interesse, o método descrito aqui pode atuar como ponto de partida. Ao otimizar um protocolo de expressão e purificação de proteínas, as etapas críticas incluem a seleção dos parâmetros apropriados para (1) o sistema de expressão (por exemplo, cepas de bactérias, células de insetos ou células de mamíferos), (2) os vetores de expressão, (3) a etiqueta e a resina de afinidade a serem usadas, (4) as condições de cultivo, (5) as quantidades de cultura e (6) a necessidade de purificação adicional (por exemplo, por exclusão de tamanho ou cromatografia de troca iônica). Recomendações específicas para esses e outros aspectos do método foram discutidas33.

O ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro é uma maneira simples de medir a atividade desubiquitilante de DUBs do tipo selvagem ou mutante. Uma análise dependente do tempo da clivagem da ubiquitina pode fornecer informações sobre os efeitos da variação genética na cinética enzimática do DUB, permitindo a determinação de parâmetros como K, m e Vmax. Isso permitiria distinguir entre defeitos no sítio ativo do DUB que prejudicam a catálise (Vmax reduzido) e aqueles que prejudicam o reconhecimento do substrato (Km aumentado). A versatilidade deste ensaio decorre da variedade de cadeias de ubiquitina que podem ser usadas para fornecer informações mecanicistas distintas sobre um DUB de interesse. Cadeias de ubiquitina de diferentes comprimentos e topologias de ligação estão disponíveis comercialmente, tornando este ensaio acessível a não especialistas. DUBs específicos têm propriedades únicas para cinética enzimática, reconhecimento de ligação e clivagem. As etapas críticas para este ensaio incluem (1) definir uma concentração de trabalho do DUB, (2) determinar o tempo de reação ideal, (3) escolher o tipo e o comprimento da ligação da cadeia de ubiquitina e (4) selecionar um método de detecção.

Os ensaios de clivagem da cadeia de ubiquitina medem o impacto das variantes de NDD na atividade de DUB 7,11, ajudando a identificar variantes que interrompem a atividade de DUB e impulsionam o desenvolvimento atípico. Este ensaio pode ser usado em uma variedade de situações em que a variação genética impulsiona a patologia, incluindo câncer e neurodegeneração. Como um ensaio independente do substrato, não é necessária a identificação prévia de um substrato proteico ubiquitilado específico. No entanto, o ensaio é limitado a medir as mudanças na atividade de clivagem da cadeia de ubiquitina e não pode avaliar os efeitos das variantes nas funções do DUB, como interações proteína-proteína, localização subcelular e modificações pós-traducionais. A identificação das amplas vias de sinalização onde um DUB de interesse opera é necessária para desenvolver ensaios específicos para abordar como essas variantes impulsionam NDDs discretos.

Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelos fundos iniciais da Sanford Research para o FB e pela R01CA233700 de subsídios do NIH para o MJS. A arte foi feita por Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). Agradecemos ao Dr. Greg Findlay (Universidade de Dundee) pelo plasmídeo GST-USP27X.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amersham Protran 0,45 NC 200 mm &vezes; 200 mm 25/PKCytiva10600041
Sulfato de amônioFisher ScientificAC205872500
AmpicilinaFisher ScientificBP1760 25
Anti-Ubiquitina (Camundongo monoclonal)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Ovino policlonal)MRC-PPU Reagentes e ServiçosCat# S902A Terceiro sangramento(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Frascos de Cultura Defletores 2 LFisher Scientific10-042-5N
Bradford ReagentMillipore SigmaB6916-500ML
CloranfenicolGold BiotechnologyC-105-25
Completo, comprimidos inibidores de proteaseMillipore Sigma
Econo-Coluna 1.5 &vezes; 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
GlicerolGenesee Scientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 1mm 12 well gelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropil-b-D-Tiogalactopiranosídeo)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Anticorpo Secundário IgG Anti-Cabra de BurroLI-COR BiosciencesCat# 926-32214WB: 1:10000)
IRDye 800CW Anticorpo Secundário IgG Anti-Rato de BurroLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp Digital Dry BathFisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinaSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LBAgar Genesee Scientific11-119
LB CaldoGenesee Scientific11-118
LysozymeGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Agitador Orbital de BancadaThermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Running BufferBoston Bioproducts IncBP-177
Mini Tube RotatorFisher Scientific88-861-051
NuPage LDS Sample buffer 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odisseia  Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 humano USP27XMRC-PPU Reagentes e ServiçosDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 humano USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 humano USP27X S404NAddgene225717Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 humano USP27X Y381HAddgene225716Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila)Gold BiotechnologyP-470-10
Polissorbato 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Células CompetentesMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
Cloreto de sódioGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus CentrífugaThermo Fisher Scientific46910
TCEP (Cloridrato de fosfina Tris-(carboxietil)Gold BiotechnologyTCEP10
Pó de Caldo FantásticoGenesee Scientific18-225
Base TrisGenesee Scientific18-146
Módulo XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot Thermo Fisher ScientificEI0002
5056489001(

Referências

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